DE3920043C2 - Fluoreszenzmikroskop - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einem Interferenz-Sperrfilter im Beobachtungsstrahlengang gemäß dem Oberbegriff des Anspruches 1. Ein derartiges Fluoreszenzmikroskop ist aus der DE 23 34 724 B2 bekannt.

Fluoreszenzmikroskope sind in der Regel so aufgebaut, daß im Beleuchtungsstrahlengang ein Erregerfilter angeordnet ist, welches die für die Anregung des Präparats erforderliche Wellenlänge aus dem Spektrum der verwendeten Lichtquelle ausfiltert. In Auflichtmikroskopen folgt auf das Erregerfilter ein Farbteiler, d. h. ein dichroitischer Spiegel, der die Anregungsstrahlung in den Beobachtungsstrahlengang verlustfrei einkoppelt und die vom Präparat emittierte, längerwellige Fluoreszenzstrahlung ungehindert passieren läßt. Weiterhin ist im Beobachtungsstrahlengang zwischen dem Farbteiler und dem Tubus ein Sperrfilter angeordnet, das noch vorhandene Anteile der Anregungsstrahlung und zum Teil auch bestimmte Spektralbereiche der Fluoreszenzemission unterdrückt. Eine Übersicht über die gebräuchlichsten Fluoreszenzverfahren und dafür geeigente Ausrüstungen gibt die Firmenschrift K 41-005-d Druckvermerk CM-H-III/85 der Anmelderin mit dem Titel "Was man von der Fluoreszenz-Mikroskopie wissen sollte". Neben den dort angeführten Methoden gewinnen neue Fluoreszenztechniken mit Farbstoffemissionen im langwelligen Spektralgebiet zunehmend an Bedeutung.

Als Anregungs- und Sperrfilter werden in größerem Umfang Interferenzfilter verwendet, da diese sich durch eine große Kantensteilheit auszeichnen und deshalb Anregungs- und Fluoreszenzstrahlung scharf trennen. Weiterhin geht der Trend dahin, aus Gründen der Präparatschonung sowie möglichst geringer Autofluoreszenz des Untergrundes Fluoreszenzfarbstoffe zu verwenden, deren Anregung und Emission im längerwelligen Teil des sichtbaren Spektralbereiches bzw. im nahen Infrarot liegen.

Verwendet man nun ein Interferenzsperrfilter, das beispielsweise als Langpaßfilter ausgebildet ist und dessen Absorptionskante im langwelligen sichbaren Spektralbereich liegt, so tritt folgender störender Effekt auf:

Licht, das direkt in die Okulare des Mikroskops oder durch Reflexion am Auge des Beobachters in die Okulare einfällt, wird von dem Sperrfilter im Beobachtungsstrahlengang an dessen Rückseite praktisch total reflektiert und überlagert im Sehfeld das in der Regel ohnehin schwache Fluoreszenzlicht. Der Untergrund des Sehfeldes, der im Idealfalle völlig schwarz sein sollte, wird hierdurch in äußerst störender Weise aufgehellt. Entsprechend ist der Kontrast des beispielsweise mittels einer Kamera aufgenommenen Fluoreszenzbildes nicht optimal.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese störende Aufhellung des Bildfeldes zu vermeiden, bzw. in die Okulare des Mikroskops einfallendes Falschlicht wirkungsvoll zu unterdrücken.

Diese Aufgabe wird durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst.

Infolge der Kombination eines Interferenzfilters im Beobachtungsstrahlengang mit einem zusätzlichen Absorptionsfilter wird das durch die Okulare einfallende Falschlicht wirkungsvoll unterdrückt. Auf die nachzuweisende Fluoreszenzstrahlung hat dieses zusätzliche Filter keine nachteilige Wirkung, wenn die Kantenlagen der beiden Filter so aufeinander abgestimmt sind, daß die Kantenlage des absorbierenden Filters etwas kurzwelliger als die des Interferenz­ filters ist.

Zwar ist aus der US 39 47 092 ein Fluoreszenzmikroskop bekannt, dessen dichroitischer Teilerspiegel aus zwei verschiedenen Filtertypen, einem Farbglas und einem Interferenzfilter zusammengesetzt ist. Dort dient das Farbglas jedoch dazu, das Reflexionsband des Interferenzfilters einzuschränken. Das Problem von in die Okulare einfallendem Falschlicht ist dort nicht angesprochen und läßt sich mit einem objektivseitig vor dem Teilerspiegel angeordneten Farbglas auch nicht lösen.

Zweckmäßig besitzt das absorbierende Filter die Eigenschaften eines Langpaßfilters, welches das Falschlicht im gesamten sichtbaren Spektralbereich auf der kürzerwelligen Seite der Fluoreszenzstrahlung unterdrückt. Der gleiche Effekt läßt sich aber auch durch ein Bandpaßfilter erreichen, das hinsichtlich seiner Transmission auf den Wellenlängenbereich der Fluoreszenzstrahlung abgestimmt ist.

Als absorbierendes Filter ist vorteilhaft ein Farbglas oder eine Filterfolie verwendet. Es ist jedoch auch möglich, eine Küvette mit einer absorbierenden Lösung für diesen Zweck einzusetzen.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Absorptionsfilter und das Interferenzfilter zu einer Baueinheit zusammengefaßt sind. Dies läßt sich entweder dadurch erreichen, daß die beiden Filter miteinander verkittet werden, oder die Interferenzschichten direkt auf das Farbglas aufgedampft werden. Die Filterkombination kann dann ohne weiteres in dem betreffenden Filterschieber des Mikroskops untergebracht werden.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels anhand der Fig. 1-4 der beigefügten Zeichnungen.

Fig. 1 ist eine Prinzipskizze, in der die wesentlichen Komponenten im Auflichtstrahlengang eines Fluoreszenzmikroskops dargestellt sind;

Fig. 2 ist eine vereinfachte Prinzipskizze des Strahlverlaufs im Mikroskop nach Fig. 1;

Fig. 3 zeigt das anstelle des Sperrfilters (7) im Mikroskop nach Fig. 1 bzw. Fig. 2 einzusetzende Sperrfilter gemäß der Erfindung;

Fig. 4 ist ein Diagramm, in dem die Kennlinien des Filters aus Fig. 3 zusammen mit dem Absorptions- und Emissionsspektrum eines Präparats beispielhaft dargestellt sind.

Von dem in Fig. 1 dargestellten Mikroskop ist der Ein­ fachheit halber nur der Auflichtbeleuchtungsstrahlengang sowie der Beobachtungsstrahlengang skizziert. Das zu unter­ suchende Objekt (2) befindet sich auf dem am Stativ (1) des Mikroskop befestigten Präparattisch (14). Die Erreger­ strahlung wird von einer nicht dargestellten Lichtquelle­ ausgehend über den mit (4) bezeichneten Auflicht- Beleuchtungsstrahlengang geführt. Ein Anregungsfilter (6) filtert den für die Erregung des Präparats gewünschten Spektralbereich aus der Anregungsstrahlung aus. Auf das filter (6) folgt ein dichroitischer Teilerspiegel (5), über den die Anregungsstrahlung in den Beobachtungsstrahlengang eingekoppelt wird, und ein Objektiv (13) am Revolver (3) des Mikroskops, das die Anregungsstrahlung auf das Präparat (2) fokussiert.

Im Beobachtungsstrahlengang ist oberhalb des Teilerspiegels (5) ein Sperrfilter (7) angeordnet. Auf das Sperrfilter (7) folgt ein Tellerprisma (8), das den Beobachtungsstrahlengang einmal in den Okulartubus (11) und zum anderen in den Photo­ tubus (9) mit der daran angesetzten Kamera (10) aufteilt. Eines der beiden Okulare des Okulartubus (11) ist mit (12) bezeichnet.

Die Durchlaßcharakteristik des Anregungsfilters (6) ist in der Darstellung nach Fig. 4 durch die mit IA bezeichnete Kurve repräsentiert. Sie deckt sich im wesentlichen mit der Absorptionscharakteristik A des Fluoreszenz-Farbstoffes. Ent­ sprechend wird vom Filter (6) nur Strahlung in diesem Wellen­ längenbereich durchgelassen. Dies ist in Fig. 2 durch den Strahl mit kleinerem Durchmesser ausgedrückt, der durch das Filter (6) hindurchtritt und am Teilerspiegel (5) in Richtung auf das Objektiv reflektiert wird.

Neben der vom Präparat ausgehenden Fluoreszenzstrahlung ge­ langt jedoch auch noch ein Teil der Anregungsstrahlung sowie Autofluoreszenz des Untergrundes in den Beobachtungsstrahlen­ gang und wird nicht vollständig durch den Teilerspiegel (5) zurückreflektiert. Zur Unterdrückung dieses restlichen An­ regungslichtes dient das Filter (7) mit der in Fig. 4 als IF bezeichneten Transmissionscharakteristik. Dieses Filter (7) ist ein Interferenzfilter und hat die spektralen Eigen­ schaften eines Langpaß- oder Bandpaßfilters, indem es den Spektralbereich der mit E bezeichneten Fluoreszenzemission des Präparats zwar ungehindert passieren läßt, alle kürzer­ welligen Strahlanteile, insbesondere also das restliche An­ regungslicht reflektiert. Der bisher beschriebene Aufbau des Fluoreszenzmikroskops ist an sich bekannt.

In Fig. 2 ist auch vereinfacht skizziert, wie das durch die Okulare einfallende Falschlicht FL über das Teilerprisma (8) auf die Rückseite des Interferenzfilters (7) hin umge­ lenkt wird. Auch dieses Licht aus dem sichtbaren Spektralbe­ reich wird nun von dem Interferenzfilter (7) entsprechend seiner Filtercharakteristik IF reflektiert und gelangt rückwärts zurück in den Okularstrahlengang und in den Photo­ tubus, wo es die Fluoreszenzstrahlung überlagert und den Kontrast mindert.

Dem wird gemäß der Erfindung folgendermaßen begegnet:

Anstelle des einfachen Interferenzfiltes (7) ist das in Fig. 3 gezeigte kombinierte Filter (17) in den Beobachtungs­ strahlengang des Mikroskops eingesetzt. Dieses Filter (17) besteht aus einem transparenten Träger (19) aus Glas, auf den neben den Interferenzschichten (20) ein absorbierendes Farb­ filter (18) auf der den Okularen zugewandten Seite aufge­ bracht ist, das zusätzlich außen noch mit einer (nicht darge­ stellten) Entspiegelungsschicht versehen sein kann. Dieses Filter (18) besitzt die in Fig. 4 mit FG bezeichnete Charakteristik eines Kantenfilters. Im Vergleich zudem aus den Schichten (20) bestehenden Interferenzfilter ist die Absorptionskante der Farbschicht (18) etwas zum kürzer­ welligen hin verschoben, so daß die nachzuweisende Fluoreszenzstrahlung durch das Absorptionsfilter nicht ge­ schwächt wird. Die Kantensteilheit des Farbfilters ist üblicherweise geringer als die Steilheit des Interferenz­ filters.

Nach Durchführung der beschriebenen Maßnahme wird das durch die Okulare einfallendes Falschlicht beim Auffallen auf die Rückseite des Sperrfilters in der Absorptionsschicht (18) vollständig absorbiert. Das Falschlicht wird somit wirkungsvoll vom Sehfeld in den Okularen und von der Bildebene der angesetzten Kamera (10) des Mikroskops ferngehalten.

In einem konkreten Beispiel wurden für das zusammengesetzte Sperrfilter (17) ein Interferenzfilter mit der Bezeichnung LP 590 und ein Farbglasfilter mit der Bezeichnung OG 570 (Fa. Schott, Mainz) miteinander kombiniert, um die Fluoreszenz­ strahlung von Rhodamin bei einer Wellenlänge von 590 nm bis ca. 650 nm gegen die Anregungsstrahlung bei einer Wellenlänge von 546 nm zu diskriminieren und gleichzeitig das von den Okularen einfallende Außenlicht (Falschlicht) zu absorbieren.

Claims (5)

1. Fluoreszenzmikroskop,

• - mit einem Strahlengang zur Anregung einer Probe (2) zur Emission von Fluoreszenzstrahlung,
• - mit einem Objektiv (13), welches das von der Probe (2) herkommende Licht zwei Okularen (12) zuführt
• - und mit einem zwischen dem Objektiv (13) und den Okularen (12) angeordneten Interferenzsperrfilter (7), das den Wellenlängenbereich (IA) der Anregungsstrahlung sowie kürzere Wellenlängen sperrt, dadurch gekennzeichnet,
• - daß auf der den Okularen (12) zugewandten Seite des Interferenzsperrfilters (7) ein Absorptionsfilter (18) vorgesehen ist, das den Wellenlängenbereich (E) der Fluoreszenzstrahlung transmittiert und den relativ hierzu kürzerwelligen Bereich absorbiert
• - und somit Störlicht, das durch die Okulare (12) hindurch auf die Rückseite des Interferenzsperrfilters (7) einfällt, in diesem kürzerwelligen Bereich schwächt.

2. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionsfilter (18) als Kantenfilter mit einer Kantenlage unmittelbar auf der kürzerwelligen Seite der Fluoreszenzstrahlung ausgebildet ist.

3. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferenzsperrfilter (7) als Langpaßfilter oder als Bandpaßfilter ausgebildet ist.

4. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionsfilter (18) zusammen mit dem Interferenzsperrfilter (7) zu einer baulichen Einheit zusammengefaßt ist.

5. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionsfilter (18) alternativ als Farbglas oder als Filterfolie oder als Küvette mit einer absorbierenden Lösung ausgebildet ist.