DE3888509T2

DE3888509T2 - Peptidstrukturen, sie enthaltende Immunogene und deren Anwendung zur Kontrolle der Fertilität.

Info

Publication number: DE3888509T2
Application number: DE3888509T
Authority: DE
Inventors: Dominique Bellet; Jean-Michel Bidart; Claude Bohuon
Original assignee: Lafon Pharma SA
Current assignee: Lafon Pharma SA
Priority date: 1987-11-26
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1994-10-06
Anticipated expiration: 2008-11-26
Also published as: FR2623715B1; JPH01301696A; EG18596A; JP2509312B2; IL88381A0; TNSN88129A1; EP0323769B1; NO885231L; MA21448A1; IL88381A; PT89053A; IE883545L; CN1034208A; DE3888509D1; US5496551A; PT89053B; ATE102957T1; AU617716B2; FR2623715A1; ES2052762T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidstrukturen und diese Peptidstrukturen enthaltende synthetische Immunogene und deren Verwendung, insbesondere als Impfstoffe bei einem Verfahren zur Steuerung der Fertilität bei Menschen und Tieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Anti-hCG-Impfstoffe und Anti-LH-Impfstoffe.
Das menschliche Chorlongonadotropin-Hormon (hCG) ist Teil der Glykoproteinhormone. Vier dieser Hormone besitzen eine enge Strukturverwandtschaft und sind neben hCG, das luteinisierende Hormon oder Lutropin (hLH), Follitropin (hFSH) und Thyrotropin (hTSH) und umfassen jeweils α- und β-Untereinheiten, die über nicht-kovalente Bindungen verbunden sind. Die α-Untereinheit ist bei den vier Hormonen identisch und die β-Untereinheiten zeigen eine starke Homologie der Struktur. Insbesondere umfassen β-hCG und β-hLH 82% ähnlicher Reste und β-hCG unterscheidet sich von β-hLH im wesentlichen durch die 30 Reste des C-terminalen Endes.
Diese Homologie zwischen den Sequenzen besteht auch bei anderen Arten und die Bereiche, die im Verlaufe der Entwicklung stark beibehalten werden, sind nicht nur für das gleiche Hormon bei den verschiedenen Arten (LH) erkennbar, sondern auch zwischen den Hormonen (CG/LH).
Es sei im weiteren daran erinnert, daß die CG-Hormone nur bei den höchstentwickelten Säugern auftreten und daß bei den anderen Tieren die Funktion der CG-Hormone durch die LH-Hormone ersetzt wird.
Es ist bekannt, daß hCG eine wichtige Rolle bei der Auslösung und der Entwicklung der Schwangerschaft spielt. Obwohl die biologische Rolle des hCG noch nicht vollständig bekannt ist, scheint seine wesentliche Rolle das Signal zu sein, das von dem befruchteten Ei zum Gelbkörper gesandt wird, damit dieser eine Synthese von Steroidhormonen aufrechterhält. Zur Ausübung einer biologischen Wirkung muß hCG sich zunächst an die in dem Eierstock vorhandenen Rezeptoren, im wesentlichen im Bereich des Gelbkörpers, binden.
Es wurde bereits versucht, die Funktion des hCG zu inhibieren, um in dieser Weise eine immunologische Geburtenkontrolle zu ermöglichen. Hierzu wurden Impfstoffe vorgeschlagen, die dazu geeignet sind, die Bildung von Anti-hCG- Antikörpern zu induzieren.
Diesbezüglich sei auf das französische Patent 7 415 780 verwiesen, welches einen Impfstoff beschreibt, der als Antigen ein chemisch modifiziertes Polypeptid enthält und insbesondere chemisch modifiziertes hCG oder β-hCG.
Weiterhin ist auf die französische Patentschrift 7 523 673 zu verweisen, die einen Impfstoff beschreibt, der als Antigen ein C-terminales Fragment von β-hCG (das 30 bis 38 Aminosäurereste umfaßt) enthält. Dieses Fragment wurde ausgewählt, um Kreuzreaktionen mit nahe verwandten Hormonen und insbesondere hLH zu vermeiden.
In dem Artikel von Vernon Stevens, der in Immunology Today (Vol. 7(1986), 369) erschienen ist, findet sich eine Bilanz der Versuche bezüglich der Anti-hCG- Impfstoffe. Dieser Artikel berichtet insbesondere über die ersten durchgeführten Versuche, bei denen als Immunogen die Sequenz 109-145 von β-hCG, gekuppelt mit Diphtherie-Anatoxin, verwendet wurde. Der Autor kommt jedoch zu dem Schluß, daß es erforderlich ist, neue Anti-hCG-Impfstoffe zu entwickeln.
Es hat sich insbesondere erwiesen, daß die Immunogenizität dieses Impfstoffs gering ist und es nicht ermöglicht, einen ausreichenden Antikörper-Gehalt zu erzielen.
Die Weltgesundheitsorganisation ist in einem Bericht von 1985 (Special Program of Research Development and Research Training in Human Reproduction) zu dem Schluß gekommen, daß es erforderlich ist, neue Immunogene zu finden.
Es ist darüber hinaus festzustellen, daß Aushu Vashishtha et Coll. im Rahmen des 3rd International Congress of Reproduction Immunology, Toronto 1.-5. Juli 1986, über die Verwendung eines mit Tetanus-Anatoxin konjugierten Peptids als Immunogen berichtet haben, wobei dieses Peptid die Sequenz 21-31 von β-hCG und die Sequenz 104-115 β-hCG-Tyr umfaßt, welche beiden Sequenzen über eine Disulfidbrücke verbunden sind.
Weiterhin berichtet ein Artikel von Jean Michel Bidart und Coll. in Molecular Immunology 24 (1987), 339 von zwei immuno-dominierenden Bereichen in dem β-hCG, d. h. dem Bereich 110-116 und dem Bereich 134-139.
Es hat sich nunmehr gezeigt, daß man eine starke immunogene Aktivität erzielt, wenn man einerseits einen stark Immunogenen Bereich des β-hCG, d. h. den Bereich in der Gegend des Rests 112 des β-hCG und insbesondere den Bereich 106-116 von β-hCG, und andererseits eine Aminosäuresequenz, die einen Lysinrest enthält, wie man sie bei Sequenzen findet, die in starkem Maße im Verlaufe der Entwicklung der α-Untereinheiten beibehalten werden, kombiniert und daß es in dieser Weise möglich ist, einen Anti-hCG-Impfstoff zu erhalten.
Es hat sich nunmehr gezeigt, daß diese Erkenntnis auch auf andere Glykoproteinhormone erstreckt werden kann und insbesondere luteinisierende Hormone, die eine wichtige Rolle bei der Reproduktion mehrerer Tierarten (Katzen, Hunde etc.) spielen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Peptidstruktur umfassend die Kombination aus
der Sequenz 106-116 von β-hCG und
einer Sequenz von mindestens fünf Aminosäuren, die mindestens einen Lysinrest umfaßt.
Die Sequenz 106-116 von β-hCG ist die Sequenz HPLTCDDPRFQ*.
Die Sequenz aus mindestens fünf Aminosäuren, die mindestens einen Lysinrest umfaßt, kann insbesondere eine Sequenz eines α-CG sein, die mindestens einen Lysinrest enthält, insbesondere die Sequenz 46-55 von α-hCG, die Sequenz 45-49 von α-hCG, die Sequenz 43-55 von α-hCG oder die Sequenz 41-58 oder 59 von α-hCG.
Es sind jedoch auch andere Sequenzen möglich, vorausgesetzt, daß sie mindestens einen Lysinrest umfassen. Es kann sich insbesondere um eine inverse Sequenz einer α-hCG-Sequenz handeln, die mindestens einen Lysinrest enthält, oder auch eine Sequenz, die neben einem Lysinrest irgendeine Folge von Aminosäuren umfaßt.
In der erfindungsgemäßen Peptidstruktur können die beiden Sequenzen in Form einer linearen Kette vereinigt sein, wobei in diesem Fall der Lysinrest mit Vorteil durch mindestens vier Aminosäuren von der Sequenz 106-116 von β-hCG getrennt ist. Bei dieser linearen Verkettung können die Sequenzen in irgendeiner Reihenfolge kombiniert sein, d. h. man kann die Kette (Sequenz enthaltend Lysin)
- (Sequenz 106-116 β-hCG) oder die Kette (Sequenz 106-116 β-hCG) - (Sequenz enthaltend Lysin) vorliegen haben.
Darüber hinaus können bei der linearen Verkettung die beiden Sequenzen durch eine Zwischensequenz oder einen "Spacer" getrennt sein, die bzw. der 1 bis 10 Aminosäuren umfaßt.
Die beiden Sequenzen können auch durch eine intermolekulare oder auch eine intramolekulare Bindung vereinigt sein. So können die beiden Sequenzen über eine Bindung zwischen der -COOH-Gruppe eines der beiden Asparaginsäurereste und die freie NH&sub2;-Gruppe des Lysinrests verbunden sein. In diesem Fall besitzt die intramolekulare Bindung der Peptidstruktur die Form einer Schlinge.
Zur Verstärkung des Immunogenen Verhaltens kuppelt man mit Vorteil die Peptidstruktur in an sich bekannter Weise mit einem Träger.
* Bezüglich der Bedeutung der Symbole der Aminosäuren sei auf den Anhang verwiesen.
Die Erfindung betrifft daher auch ein synthetisches Immunogen umfassend eine erfindungsgemäße Peptidstruktur, die an einen Träger gekuppelt ist.
Die Träger können insbesondere Protein-Träger sein und insbesondere:
1) Die Anatoxine:
- von Tetanus und dessen Fraktion II, hergestellt nach dem Verfahren von Covey et Coll., Amer. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 8 (1985), 43.
- von Diphtherie und Keuchhusten.
2) Anti-Diarrhoe-Impfstoffe (gegen Rotavirus, Cholera, Shigellae, E. Coli und Salmonellen).
3) Poliomyelitis-Virus und Gelbflebervirus, die durch Hitze und durch Bestrahlung inaktiviert worden sind.
4) Membranproteine des Sporozoiten von P. Falciparum.
5) KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).
Die Kupplung kann mit Hilfe eines Kupplungsmittels, wie Glutaraldehyd, eines Carbodiimids oder bisdiazotiertem Benzidin bewirkt werden.
Der Glutaraldehyd ermöglicht eine Kupplung zwischen dem Protein und dem Lysinrest der Sequenz, die mindestens einen Lysinrest enthält.
Die Carbodiimide ermöglichen eine Kupplung zwischen dem Protein und dem Asparaginsäurerest der Sequenz 106-116 eine β-CG oder eines β-LH (beispielsweise existieren in der Sequenz 106-116 von β-hCG Asparaginsäurereste in den Positionen 111 und 112).
Das bisdiazotierte Benzidin benötigt zur Kupplung die Anwesenheit eines Tyrosinrests an dem Peptid. Zu diesem Zweck ist der Tyrosinrest mit Vorteil an ein Ende der Kette angefügt.
Das synthetische Immunogen kann auch nach der MAP-Technik (Multiple Antigenic Peptide) gebildet sein, die von D. Posnett et al. beschrieben worden ist (J. Biol. Chem. 263(1988), 17-19). In diesem Fall erfolgt die Peptidsynthese an einer zuvor gebildeten Polylysin-Matrix. Dieses Verfahren ermöglicht die Bildung eines "Polymeren" des Peptids, welches eine für ein Immunogen ausreichend hohe Molmasse besitzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Antifertilitäts-Impfstoff umfassend eine erfindungsgemäße Peptidstruktur oder vorzugsweise ein erfindungsgemäßes synthetisches Immunogen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen Anti-hCG-Impfstoff enthaltend eine Peptidstruktur umfassend mindestens
- die Sequenz 106-116 von β-hCG
- eine Sequenz aus mindestens 5 Aminosäuren, die mindestens einen Lysinrest umfaßt
oder ein synthetisches Immunogen umfassend eine solche Peptidstruktur, die an einen Träger gebunden ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Das an seinen Träger gebundene synthetische Immunogen wird vorzugsweise nach dem Vermischen mit Immunlsierungs-Adjuvantien verabreicht. Man kann das Antigen beispielsweise mit dem n-Butylester (Murabutid) des Muramyldipeptids (MDP; N-Acetyl-glucosamin-3-yl-acetyl-L-alanyl-D-isoglutamin), das in einer Salzlösung verdünnt ist, vermischen. Die Mischung kann anschließend mit einem gleich großen VoluWen Squalen in Gegenwart von Arlacel (Trägermaterial) emulgiert werden. Es ist weiterhin möglich, andere Adjuvantien zu verwenden, wie MDP-Analoge, Bakterienfraktionen, wie die Streptokokken-Präparate (OK 432) oder Biostim (0 1K2) oder Präparate von modifizierten Lipopolysacchariden (LPS), von Peptidoglykanen (N-Opaca) oder von Proteoglykanen (K-Pneumoniae). Als Trägermaterialien sind die Wasser-in-Öl-Emulsionen den Öl-in-Wasser-Emulsion gegenüber bevorzugt.
Man kann das synthetische Immunogen auch in Form von biologisch abbaubaren Teilchen verabreichen, wie Mikrokapseln oder Mikrokügelchen, Liposompräparaten und Nanoteilchen. In diesem Fall ist das Immunogen in das Teilchen eingeschlossen. Diese Maßnahmen dienen dazu, die Wirkungsdauer des Impfstoffs zu verlängern.
Die Verabreichung des Impfstoffs erfolgt auf parenteralem Wege (im Fall der Impfstoffe in Form von Suspensionen) und gegebenenfalls auf oralem Wege (im Fall von Impfstoffen, die in Teilchenform gegeben werden). Beispielsweise kann man die Emulsion durch intramuskuläre Injektion in den Trizeps-Muskel verabreichen. Die für jede Injektion verwendete Immunogen-Menge variiert und hängt von der Immunreaktion jedes einzelnen Individuums ab. In der Praxis wendet man Dosierungen von 50-1.000 ug pro Injektion, d. h. 1-20 kg/kg Körpergewicht an. Es werden mehrere Injektionen durchgeführt bis zur Erzielung eines ausreichenden Antikörper-Titers; jede Wiederholung wird durch eine Zeitdauer von 4 bis 6 Wochen von der folgenden getrennt. Man überprüft die Anwesenheit von gegen hCG und gegen eventuell vorhandenes Trägerprotein gerichtete Antikörper fünf Tage nach der zweiten Wiederholung der Impfung und dann sechs Monate nach der Impfung.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können darüber hinaus andere Peptide oder andere Immunogene enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Steuerung der Fertilität, welches darin besteht, an die betreffende Frau einen erfindungsgemäßen Impfstoff zu verabreichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Geburtenkontrolle, welches darin besteht, an die Frau einen Impfstoff zu verabreichen, der eine Peptidstruktur enthält, die mindestens
- die Sequenz 106-116 von β-hCG und
- eine Sequenz von mindestens 5 Aminosäuren, die mindestens einen Lysinrest umfaßt,
oder ein synthetisches Immunogen umfassend eine solche Peptidstruktur, die mit einem Träger gekuppelt ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Darüber hinaus können die Peptidstrukturen, welche mindestens
- die Sequenz 106-116 von β-hCG und
- eine Sequenz von mindestens 5 Aminosäuren, die mindestens einen Lysinrest umfaßt,
dazu verwendet werden, die hCG-Rezeptoren zu blockieren und die Entwicklung der Schwangerschaft zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge auch eine Zubereitung zur Unterbrechung der Schwangerschaft, welche als Wirkstoff eine Peptidstruktur enthält, die mindestens
- die Sequenz 106-116 von β-hCG und
- eine Sequenz von mindestens 5 Aminosäuren, die mindestens einen Lysinrest enthält, umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Peptidstrukturen können in klassischer Weise durch Peptidsynthese in flüssiger oder fester Phase durch aufeinanderfolgende Kupplung der verschiedenen einzubauenden Aminosäuren (von dem N-terminalen Ende zu dem C-terminalen Ende in der flüssigen Phase oder vom C-terminalen Ende zum N-terminalen Ende in der festen Phase) hergestellt werden, wobei die N- terminalen Enden und die reaktiven Seitenketten zuvor durch geeignete Gruppen blockiert werden, was weitgehend bekannt ist.
Man kann verschiedene Kupplungsmethoden anwenden:
1. Kupplung der Reste durch ein Carbodiimid (beispielsweise N-Cyclohexyl-N'-morpholinoethylcarbodiimid (CMECDI), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-Ethyl-N'-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid (EDC)) mit oder ohne die Anwendung eines Katalysators (beispielsweise 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT)) oder des anderen Kupplungsmittels (beispielsweise 2-N-Ethoxycarbonyl-ethoxy-1,2- dihydrochinolin (EEDQ)).
2. Verwendung von Aminosäuren in Form von vorgebildeten symmetrischen Anhydriden.
3. Verwendung der Aminosäuren in Form von aktivierten Estern (beispielsweise p-Nitrophenylester, HOBT-Ester) und Kupplung über DCC.
Es ist jedoch bevorzugt, die Methode der Synthese in fester Phase anzuwenden, d. h. die Merrifield-Technik.
Gemäß dieser Technik verwendet man ein poröses polymeres Harz. Auf dieses Harz werden mit Hilfe unterschiedlicher Methoden funktionelle Gruppen aufgepfropft. Dann wird die erste Aminosäure über ihre terminale Carbonsäuregruppe aufgepfropft, wobei die terminale Aminogruppe durch eine unter bestimmten Bedingungen labile Schutzgruppe geschützt wird. Die Seitenketten werden ihrerseits geschützt und bleiben es bis zum Ende der Synthese.
Nach der Abspaltung der Schutzgruppe von der terminalen Aminogruppe der an dem Harz fixierten Aminosäure einerseits und der Aktivierung der Carbonsäurefunktion der zu kuppelnden Aminosäure andererseits wird die Bildung der Peptidbindung bewerkstelligt. Nach dem Waschen und dem Entfernen der Reaktionsprodukte kann eine erneute Abspaltung der Schutzgruppen durchgeführt werden, um eine neue aktivierte Aminosäure zu binden.
Als letzte Stufe erfolgt die Abspaltung des Peptids gleichzeitig mit dem oder nach dem Abspalten der verschiedenen Schutzgruppen von den Seitenketten.
In dem Fall, da als Schutzgruppe für die Aminogruppe die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (t·Boc) verwendet wird, kann diese durch Behandeln des Harzes mit Trifluoressigsäure eliminiert werden.
Dann werden die Schutzgruppen, die gegen die Einwirkung von Trifluoressigsäure resistent sind, abgespalten, d. h. die Tosylgruppe im Fall des Arginins und des Histidins, die Benzylgruppe im Fall der Asparaginsäure und die Benzyloxycarbonylgruppe (Z) im Fall des Lysins.
Nachdem die Totalsynthese der Kette erfolgt ist, eliminiert man die Schutzgruppen der verschiedenen Aminosäuren, insbesondere mit einer schwach konzentrierten Fluorwasserstoffsäure in einer p-Kresol/Dimethylsulfid-Mischung, wonach man das Peptid von dem Harz ablöst, beispielsweise durch Anwendung einer starken Konzentration von Fluorwasserstoffsäure.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

I- Herstellung der Peptidstrukturen

1) Herstellung des Peptids (Sequenz 46-55 von α-hCG) - (Sequenz 106- 116 von β-hCG) (TMLVQKNVTSHPLTCDDPRFQ).

Man bewirkt die Synthese in einer automatischen Synthesevorrichtung (Applied Biosystem Model 410A).
Die Aminogruppe der Aminosäuren wurde durch eine t-Boc-Gruppe geschützt und die Abspaltung erfolgte mit Trifluoressigsäure.
Die endgültige Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte mit einer Mischung, die 6,5 ml Dimethylsulfid, 1 g p-Cresol und 1 ml HF pro 1 g des Harz-Peptids enthält, während 1 Stunde bei 0ºC. Die Abspaltung des Peptids erfolgte bei 0ºC mit 10 ml HF und 1 g p-Cresol pro 1 g des von den Schutzgruppen befreiten Harz-Peptids.
Das in dieser Weise erhaltene Peptid wird anschließend durch Ausschluß Chromatographie gereinigt. Es wird nach der sauren Hydrolyse durch HPLC-Austauschchromatographie und Nachweis mit Ninhydrin analysiert. Dabei konnte die Sequenz bestätigt werden.
In der folgenden Tabelle I sind die Struktur des in dieser Weise erhaltenen Peptids sowie andere in analoger Weise hergestellte Peptide angegeben. TABELLE I Peptid des Typs Sequenz mit einem Lysinrest - Sequenz 106-116 β-hCG Sequenz mit Lysinrest Sequenz

2) Herstellung eines Peptids mit Tyrosinrest.

Das folgende Peptid wurde hergestellt, um es dann durch KLH-Kupplung über Benzidin an den Tyrosinrest zu kuppeln. Dieses Peptid ist am C-terminalen Ende in der -CONH&sub2;-Form geschützt
TMLVQKNVTSHPLTCDDPRFQYG-CONH&sub2;.

3) Herstellung eines Peptids des MAP-Typs.

Man bereitete nach der von Posnett et al. beschriebenen Methode (loc. clt.) das Peptid des MAP-Typs der folgenden Formel:
in der P&sub1; = TMLVQKNVTSHPLTCDDPRFQ (Mimotop 1).

II - Herstellung von synthetischen Immunogenen

1) Kupplung mit Tetanus-Anatoxin

Die Mimotop-Peptidstrukturen wurden mit Tetanus-Anatoxin gekuppelt unter Verwendung von einerseits Glutaraldehyd und andererseits eines Carbodiimids als Kupplungsmittel.

a. Kupplung mit Glutaraldehyd

Dieses Kupplungsmittel wurde ausgewählt, um eine Bindung zwischen der ξ-NH&sub2;-Gruppe des Lysinrests und den ξ-NH&sub2;-Gruppen des Trägerproteins zu bewirken.
Das Reaktionsschema ist das folgende:
R&sub1;-NH&sub2;+OCH-(CH&sub2;)&sub3;-CHO+NH&sub2;-R&sub2; → R&sub1;-N=CH-(CH&sub2;)&sub3;-CH=N-R&sub2;
Man bringt das Peptid und das Protein in einem Verhältnis 50/l in einem 0,1M Bicarbonat, 0,15M NaCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,5 in Kontakt.
Dann gibt man tropfenweise Glutaraldehyd (den man 1/10 in dem gleichen Pufferverdünnt hat) in der Weise zu, daß sich ein Glutaraldehyd/Peptid-Verhältnis von 50 ergibt.
Man läßt während 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen (wobei sich die Lösung ohne Ausfällung gelb färbt).
Dann bewirkt man eine Ausschlußchromatographie über eine Sephadex G25-Säule.
Man erhält in dieser Weise die Peptidstruktur Mimotop 1 mit einem Peptid/Trägerprotein-Verhältnis von 24.

b) Kupplung mit einem wasserlöslichen Carbodiimid-Derivat

Dieses Mittel wurde ausgewählt, um eine überwiegende Bindung zwischen der β-COOH-Gruppe eines Rests mit freier Säuregruppe (Asparaginsäure: 111 oder 112) und den NH&sub2;-Resten des Trägerproteins zu ermöglichen.
Man verwendet CMECDI als Carbodiimid.
Man löst 6 mg des oben definierten Peptids in 0,5 ml des Phosphat/NaCl- Puffers. Zu dieser Lösung gibt man 0,2 ml der Lösung von CMECDI-p-Methyltoluolsulfonat (10 mg/ml). Nach dem Rühren gibt man 5 mg des Trägerproteins (Tetanus-Anatoxin gelöst in einer Konzentration von 6 mg/ml) zu der Mischung aus dem Peptid und dem Kupplungsmittel und inkubiert während 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren. Das Konjugat aus dem Peptid und dem Trägerprotein wird anschließend durch eine Ausschlußchromatographie gereinigt und der Nachweis des Konjugats erfolgt über eine Bestimmung der Proteine mit Hilfe des Lowry-Tests. Das Peptid/Trägerprotein-Molverhältnls wird mit Hilfe einer Aminosäureanalyse nach der sauren Hydrolyse bestimmt. Mit dem Mimotop 1 beträgt dieses Verhältnis 44 Mol Peptid pro Mol Trägerprotein.

2) Kupplung mit KLH

Man löst Benzidin (18,8 mg) in 1,8 ml 0,2M Chlorwasserstoffsäure unter langsamem Erhitzen auf 25ºC bis 30ºC, um eine schnelle und vollständige Auflösung zu erzielen, wonach man auf 0ºC ab kühlt und bei dieser Temperatur hält.
Man gibt dann tropfenweise 200 ul einer bei 0ºC gehaltenen Natriumnitritlösung in einer Konzentration von 14 mg/200 ul zu.
Man läßt die Reaktion während etwa 3 Minuten bei 0ºC ablaufen, wonach man das in dieser Weise gebildete bisdiazotierte Benzidin unmittelbar verwendet.
Man vermischt bei 0ºC die folgenden beiden Lösungen:
- 10 mg KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin; M.M: 6,5 · 10&sup6;), d. h. 1,5 m Mol in 750 ul des 0,16 M Boratpuffers mit einem pH-Wert von 9,1, der 0,15 M Natriumchlorid enthält (wobei man die unlösliche Fraktion des KLH vor der Verwendung der Lösung beseitigt).
- 3 mMol Peptid (d. h. 8 mg des unter I 2 definierten Peptids) in 750 ul des gleichen Boratpuffers mit einem pH-Wert von 9,1, wie oben beschrieben worden ist.
Man gibt dann tropfenweise unter Rühren 100 ul der Lösung des bisdiazotierten Benzidins zu.
Nach einer Reaktionsdauer von lediglich einer Minute bewirkt man eine Gelfiltration über Sephadex G.25M (Pharmacia-Säule PD 10 : 50 mm Länge und 15 mm Durchmesser), die zuvor mit 0,15M Natriumchlorid äquilibriert worden ist, welches auch als eluierende Phase verwendet wird.
Man gewinnt Fraktionen von 1 ml. Die Fraktionen 3 und 4 (0,6 ml) werden nach der Durchführung eines Ninhydrin-Tests an 10 ul einer jeden Fraktion aufbewahrt. Diese beiden vereinigten Fraktionen enthalten das an KLH gekuppelte Peptid. Man entnimmt 100 ul für eine saure Hydrolyse (6N HCl + 0,1% Phenol) bei 110ºC während 18 Stunden. Nach dem Bestimmen der Aminosäuren berechnet man das reelle Verhältnis, d. h. hier R = 1520, was 3,75 mg/ml (6 mg/ 1,6 ml) entspricht.

III - Immunisierung

Man bewirkt eine Immunisierung von mindestens zwei Kaninchen (Fauve de Bourgogne) mit jedem Immunogen.

Protokoll der Immunisierung

1.1. Herstellung des Immunogens für eine Immunisierung

Man verdünnt 200 ug Äquivalente des Peptids (d. h. für die Struktur Mimotop 1 133 ul der Peptid/Trägerprotein-Proteinlösung für die Kupplung mit Glutaraldehyd und 167 ul für die Kupplung mit CME-CDI) in 500 ul des 0,1M Phosphat 0,15M NaCl-Puffers pH = 7,4.
Zuvor hat man zu diesen beiden Proteinlösungen 500 ul des vollständigen oder unvollständigen Freund'schen Adjuvans, in Abhängigkeit von dem Injektionsweg, zugesetzt.
Man hat anschließend die Mischung emulgiert und die Injektion durchgeführt.

1.2. Kalenderablauf der Injektion

Tag 0: Man entnimmt eine Blutprobe (Kontrolle). Man injiziert die Proteinlösung + vollständiges Freund'sches Adjuvans (Gesamtvolumen 1 ml) über die Haut an 10 bis 20 Injektionsstellen (im Bereich des Rückens).
Tag 10: Subkutane Injektion der Proteinlösung + unvollständiges Freund'sches Adjuvans (Gesamtvolumen 1 ml). Eine einzige Injektion.
Tag 20: Subkutane Injektion der Proteinlösung + unvollständiges Freund'sches Adjuvans (Gesamtvolumen 1 ml).
Tag 22: Entnahme einer Blutprobe und Überprüfung der Anwesenheit und des Titers der Antikörper.
Tag 30: Identische Wiederholung des Maßnahmen von Tag 20.
Tag 33: Identische Entnahme wie am Tag 22.

1.3. Ergebnisse der Immunisierung

Die Methode zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern, die gegen die Hormone und deren Untereinheiten gerichtet sind, und ihre Spezifität basiert auf der radiolmmunologischen Bestimmung (RIA). Die Hormone (hCG, hLH) und deren Untereinheiten (β-hCG, α-hCG) werden mit einem radioaktiven Element (NaI125) unter Verwendung des Verfahrens von P.J. Fracker und J.C. Speck, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 (1978), 849, markiert. Man inkubiert das zu prüfende Antiserum mit den verschiedenen markierten Molekülen (Tracern), verdünnt das Antiserum mit einem geeigneten Puffer und gibt eine konstante Menge des Tracers zu jeder Verdünnung. In Gegenwart von Antikörpern in dem Serum bildet sich ein Komplex aus dem Antigen (mit markiertem Molekül) und den Antikörpern, der mit Polyethylenglykol ausgefällt werden kann. Die Menge der ausgefällten Radioaktivität ist proportional der Menge der Antikörper. Die Spezifität dieser Antikörper wird in der folgenden Weise untersucht: Zu einer konstanten Verdünnung des Antiserums gibt man eine konstante Menge von hCG-I125 und wachsende Mengen der zu untersuchenden Moleküle (hCG, β-hCG, α-hCG, hLH . . . ). Die Spezifität des Antikörpers ist durch das Molekül gegeben, welches bei der geringsten Konzentration eine signifikante Verdrängung der Antigen-Antikörper-Bindung ergibt (2 Ergebnisse der Immunisierungen am Kaninchen).
In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse angegeben, die mit den Immunseren erhaltenen worden sind, die am Tag 22 entnommen worden sind und aus der Immunisierung mit Immunogenen stammen, die durch eine an Tetanus- Anatoxin gekuppelte erfindungsgemäße Peptidstruktur gebildet sind: TABELLE II Kupplung Anzahl der Tiere Anzahl der positiven Antworten mit der Sequenz
* α-Kupplung = Kupplung mit Glutaraldehyd, β-Kupplung durch Carbodiimid.
Diese Tabelle II verdeutlicht die guten Ergebnisse, die man mit dem Mimotop 1 erhält, mit einer wirksamen Immunisierung in fast sämtlichen Fällen gegenüber hCG und der Abwesenheit einer Kreuzreaktivität mit hLH.
Im folgenden sind die Ergebnisse der mittleren Bindungsaktivität der erhaltenen Antisera gegen das Mimotop 1 an hCG und seine Untereinheiten (Mittelwert und Standardabweichung) (Prozentsatz nach dem Verdünnen um 1/10) angegeben. TABELLE III Position der Kupplung Anzahl der Tiere Bindung an * t = 1,51 ** t = 0,18 Signifikant für p < 0,05 bei t> 1,81
Die Bindungsaktivitäten gemessen gegenüber hCG und dessen β-Untereinheit zeigen, daß die Kupplung des Peptids an die α-Sequenz eine Bindung der erhaltenen Antisera mit dem Mimotop 1 ergibt, die größer ist als die mit hCG.

IV - Biologische Aktivität der Antisera

Es wurde die Neutralisation des biologischen Effekts von hCG durch ein Kaninchenantiserum bei weiblichen Ratten durch Messung der Inhibierung der Ovulation bestimmt.
Hierzu wurde zwei weibliche Ratten pro Gruppe folgendes injiziert: 1) Das Präimmun-Serum, 2) das gegen das Mimotop 1a gerichtete Immunserum, das am Kaninchen erhalten worden ist, 3) physiologisches Serum. Acht Stunden später wurden 500 mI.E. hCG verabreicht. Die Tiere wurden nach Ablauf von 4 Stunden getötet und es wurde an jedem Eierstock das Vorhandensein (+) oder die Abwesenheit (-) von hämorrhagischen Follikeln bestimmt. Präimmun-Serum Antiserum Physiologisches Serum Eierstöcke Weibliche Ratte
Diese Ergebnisse verdeutlichen eine antagonistische Wirkung der Antimimotop 1-Antisera auf die Bildung von Eierstock-Follikeln.

Anhang

Symbole der Aminosäuren

A Ala Alanin
C Cys Cystein
D Asp Asparaginsäure
E Glu Glutaminsäure
F Phe Phenylalanin
G GIy Glycin
H His Histidin
I Ile Isoleucin
K Lys Lysin
L Leu Leucin
M Met Methionin
N Asn Asparagin
P Pro Prolin
Q Gln Glutamin
R Arg Arginin
S Ser Serin
T Thr Threonin
V Val Valin
W Trp Tryptophan
Y Tyr Tyrosin

Claims

1. Peptidstruktur umfassend die Kombination aus

- der Sequenz 106-116 von β-hCG und

- einer Sequenz von mindestens 5 Aminosäuren, die mindestens einen Lysinrest umfaßt.

2. Peptidstruktur nach Anspruch 1, umfassend

- die Sequenz 106-116 von β-hCG

- eine Sequenz von mindestens 5 Aminosäuren eines α-CG, die mindestens einen Lysinrest umfaßt.

3. Peptidstruktur nach Anspruch 2, umfassend

- die Sequenz 106-116 von β-hCG

- die Sequenz 46-55 von α-hCG.

4. Peptidstruktur nach Anspruch 2, umfassend

- die Sequenz 106-116 von β-hCG

- die Sequenz 45-49 von α-hCG.

5. Peptidstruktur nach Anspruch 2, umfassend

- die Sequenz 106-116 von β-hCG

- die Sequenz 43-55 von α-hCG.

6. Peptidstruktur nach den Ansprüchen 1 bis 5, worin die beiden Sequenzen in Form einer linearen Kette vereinigt sind.

7. Peptidstruktur nach Anspruch 6, worin der Lysinrest durch mindestens 4 Aminosäuren von der Sequenz 106-116 von β-CG oder von β-LH getrennt ist.

8. Peptidstruktur nach Anspruch 6, umfassend die mindestens einen Lysinrest enthaltende lineare Kettensequenz - Sequenz 106-116 von β-hCG.

9. Peptidstruktur nach Anspruch 8, enthaltend die lineare Kettensequenz 46-55 von α-hCGH - Sequenz 106-116 von β-hCG.

10. Synthetisches Immunogen umfassend eine Peptidstruktur nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die an einen Träger gekuppelt ist.

11. Synthetisches Immunogen nach Anspruch 10, worin der Träger Tetanus- Anatoxin ist.

12. Synthetisches Immunogen nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin der Träger mit einem Lysinrest der Sequenz gekuppelt ist, die mindestens einen Lysinrest umfaßt.

13. Synthetisches Immunogen nach Anspruch 12, worin die Kupplung durch Glutaraldehyd bewirkt worden ist.

14. Synthetisches Immunogen nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin der Träger mit einer der Aminosäuren der Sequenz 106-116 von β-hCG gekuppelt ist.

15. Synthetisches Immunogen nach Anspruch 14, worin der Träger mit einem der Asparaginsäurereste der Sequenz 106-116 von β-hCG gekuppelt ist.

16. Synthetisches Immunogen nach Anspruch 10, umfassend eine Peptidstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekuppelt an eine Polylysin-Matrix.

17. Antifertilitäts-Impfstoff enthaltend eine Peptidstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein synthetisches Immunogen nach einem der Ansprüche 10 bis 16 und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.

18. Anti-hCG-Impfstoff enthaltend eine Peptidstruktur nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein synthetisches Immunogen umfassend eine an einen Träger gekuppelte solche Peptidstruktur und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

19. Anti-hCG-Impfstoff nach Anspruch 18 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Geburtenkontrolle.