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DE3886450T2 - Aus Nukleinsäuren von menschlichen Papillomaviren bestehende Hybridisierungsproben und Methoden für deren Anwendung. - Google Patents

Aus Nukleinsäuren von menschlichen Papillomaviren bestehende Hybridisierungsproben und Methoden für deren Anwendung.

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Publication number
DE3886450T2
DE3886450T2 DE19883886450 DE3886450T DE3886450T2 DE 3886450 T2 DE3886450 T2 DE 3886450T2 DE 19883886450 DE19883886450 DE 19883886450 DE 3886450 T DE3886450 T DE 3886450T DE 3886450 T2 DE3886450 T2 DE 3886450T2
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DE
Germany
Prior art keywords
hpv
dna
fragments
rna
marker
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Expired - Lifetime
Application number
DE19883886450
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English (en)
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DE3886450D1 (de
Inventor
Attila T Lorincz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen Gaithersburg LLC
Original Assignee
Qiagen Gaithersburg LLC
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Priority claimed from US07/059,987 external-priority patent/US4849331A/en
Priority claimed from US07/059,897 external-priority patent/US4849334A/en
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Publication of DE3886450T2 publication Critical patent/DE3886450T2/de
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäurehybridisierungssonden für menschliche Papillomavirus-Typen und insbesondere für menschlichen Papillomavirus-Typ 35 (nachstehend "HPV 35"); menschlichen Papillomavirus-Typ 43 (nachstehend "HPV 43"); menschlichen Papillomavirus-Typ 44 (nachstehend "HPV 44"); menschlichen Papillomavirus-Typ 56 (nachstehend "HPV 56") sowie Verfahrer zur Verwendung derselben.
    • Hintergrund der Erfindung (A) Menschliche Papillomavirus-Typen
  • Menschliche Papillomaviren (nachstehend "HPV") sind als eine Ursache verschiedener Epithelläsionen, wie Warzen, Kondylome und Dysplasien, erkannt worden (vgl. L. Gissmann, Cancer Surv., Bd. 3 (1984), S. 161; H. Pfister, Biochem. Pharmacol., Bd. 99 (1983), S. 111; M. Durst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 3812 und M. Boshart et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 1151). Man nimmt an, daß Dysplasien des Zervix (die auch als zervikale intraepitheliale Neoplasien (CIN) bekannt sind) frühe Ereignisse bei der Ausbreitung von zervikalem Krebs sind, wobei die Ausbreitung von leichter Dysplasie (CIN I) über mäßige Dysplasie (CIN II), über schwere Dysplasie und Karzinome in situ (zusammenfassend CIN III) zu invasivem Krebs erfolgt.
  • Lorincz et al. beschreiben in "Characterization of Human Papillomaviruses in Cervical Neoplasias and Their Detection in Routine Clinical Screening", erschienen in: Viral Ethiology of Cervical Cancer Conference, 14.-17. April 1982, Gold Spring Harbor, Bd. 0, Nr. 0, S. 225-238, daß eine Sequenz, die als HPV 35 bezeichnet wird, aus einem Karzinom kloniert wurde. Von dem Klon wird angegeben, daß er zwei nicht-überlappende BamHI-Fragmente aufweist. Der vorstehend genannte Artikel stellt keine ausreichende Offenbarung bereit, wie HPV 35 erhalten wird, und er gibt keine Hinweise auf die Verwendung davon.
  • Untersuchungen über den Zusammenhang von HPV-Typen mit Dysplasien des Zervix und Krebs des Zervix haben gezeigt, daß die HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33 mit einem hohen Prozentsatz an Genitalläsionen verbunden sind (vgl. L. Gissmann, Cancer Surv., Bd. 3 (1984), S. 161; H. Pfister, Biochem. Pharmacol., Bd. 99 (1983), S. 111; M. Durst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 3812; M. Boshart et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 1151; E.-M. de Villiers et al., J. Virol., Bd. 40 (1981), S. 932; L. Gissmann et al., J. Virol., Bd. 44 (1982), S. 393; A.T. Lorincz et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 225 und S. Beaudenon, Nature, Bd. 321 (1986), S. 246).
  • HPVs werden aufgrund der Ähnlichkeit ihrer DNA-Sequenzen in Typen eingeteilt. Zwei HPVs werden taxonomisch als zum gleichen Typ gehörig klassifiziert, wenn ihre DNAs zu mehr a3s 50 % einer Kreuzhybridisierung unterliegen, wobei die Messung durch Hybridisierung in Lösung unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen erfolgt, die als ungefähr 25ºC unterhalb der Schmelztemperatur einer vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA (einfach geschrieben als Tm-25ºC) und anschließende Chromatographie auf Hydroxylapatit zur Trennung doppelsträngiger DNA von einzelsträngiger DNA definiert sind (vgl. J.R. Coggin et al., Cancer Res., Bd. 39 (1979), S. 39). Die Schmelztemperatur (Tm) einer vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA kann unter Anwendung der folgenden allgemein anerkannten Formel genau vorhergesagt werden:
  • Tm = 16,6 x log[Na&spplus;] + 0,41 x % G C + 81,1 - 0,72 x (%) (Vol./Vol.) Formamid
  • Die vorstehende Formel stellt ein bequemes Mittel zur Festlegung eines Referenzpunktes zur Bestimmung nicht- stringenter und stringenter Hybridisierungsbedingungen für verschiedene DNAs in Lösungen mit verschiedenen Salz- und Formamid-Konzentrationen ohne die Notwendigkeit einer empirischen Messung von Tm für jede einzelne DNA unter jeder Hybridisierungsbedingung bereit.
  • Wenn weniger als 50 % der entsprechenden HPV-DNAs zur Kreuzhybridisierung in Lösung unter mäßig stringenten Bedingungen fähig sind, wobei vollständig oder teilweise doppelsträngige Strukturen gebildet werden, was durch die Fähigkeit zur Bindung an Hydroxylapatit gemessen und definiert wird, dann sind die HPV-DNAs nicht ausreichend verwandt, um taxonomisch als zum gleichen Typ gehörig klassifiziert zu werden. Ein Grenzwert von 50 % Kreuzhybridisierung unter Anwendung dieses Verfahrens wird als allseits anerkanntes Kriterium für die Zuordnung eines neuartigen HPV-Typs zu Nomenklaturzwecken verwendet. Dieses Verfahren für die Messung des Grads der Kreuzhybridisierung zwischen HPV-DNAs ist historisch als das Verfahren herangezogen worden, das verwendet werden soll, um zu bestimmen, ob zwei HPV-DNAs verschiedene isolierte Materialien eines gemeinsamen Typs oder isolierte Materialien von verschiedenen Typen darstellen. Die Verwendung dieses Kriteriums geht zeitlich der Einführung eines klinischen Kriteriums für die Bestimmung und Definition von HPV-Typen voraus. Wie nachstehend ausführlicher erläutert wird, basiert das klinische Kriterium für die Bestimmung und Definition von HPV-Typen auf der epidemiologischen Verteilung von HPV-Typen unter Genitalläsionen.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Messung des Grads der Kreuzhybridisierung basiert auf einer Bewertung des Ausmaßes der Bildung von vollständig oder teilweise doppelsträngigen DNA-Molekülen nach der Hybridisierungsreaktion. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß eine Umwandlung von 50 % der DNAs in vollständig oder teilweise doppelsträngige DNA-Moleküle nicht bedeutet, daß die Nucleotidsequenzen der DNAs zu 50 % homolog sind.
  • Wie vorstehend erläutert wurde, können HPVs auch aufgrund eines klinischen Kriteriums in Typen eingeteilt werden. Das heißt, es ist beobachtet worden, daß HPVs unterschiedlicher Typen, wie sie durch das vorstehend erläuterte Kriterium des Grads der Kreuzhybridisierung definiert sind, verschiedene epidemiologische Verteilungen unter Genitalläsionen verschiedener Schwere und unter verschiedenen geographischen Populationen zeigen.
  • Zum Beispiel sind HPV 6 und HPV 11 hauptsächlich mit gutartigen Läsionen, wie exophytischen Kondylomen, und zu einem geringeren Ausmaß mit flachen Kondylomen verbunden (vgl. L. Gissmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 560). HPV 6 und HPV 11 werden auch in bestimmten seltenen Typen von bösartigen Epitheitumoren nachgewiesen (vgl. K.R. Zachow et al., Nature, Bd. 300 (1982), S. 771 und R.F. Rando, J. Virol., Bd. 57 (1986), S. 353). Im Gegensatz dazu werden HPV 16, HPV 18, HPV 31 und HPV 33 mit unterschiedlicher Häufigkeit in zervikalen und anderen anogenitalen Krebsen sowie ihren Vorläuferläsionen nachgewiesen (vgl. M. Durst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 3812: M. Boshart et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 115; A.T. Lorincz et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 225 und S. Beaudenon, Nature, Bd. 321 (1986), 246). Man nimmt an, daß die Verteilung von HPV 16, HPV 18, HPV 31 und HPV 33 ein größeres Risiko von oder eine raschere Ausbreitung zu zervikalem Krebs, der aus irit HPV 16, HPV 18, HPV 31 und HPV 33 infizierten Genitalläsionen hervorgeht, im Vergleich zu mit HPV 6 und HPV 11 infizierten Läsionen widerspiegelt. Infolgedessen hat die Bestimmung von HPV-Typen klinisch-diagnostischen Wert, d.h., es handelt sich um einen wichtigen Faktor bei der Bewertung des Risikos der Entwicklung von Krebs bei Patienten, bei denen Anzeichen für eine HPV-Infektion vorliegen. Auf der Grundlage des bewerteten Risikos einer Entwicklung von Krebs können geeignete therapeutische Behandlungen ausgewählt werden.
  • Außerdem ist HPV 16 in Europa stärker vorherrschend als in Afrika (M. Durst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 3812), während HPV 18 in Afrika stärker vorherrschend ist als in Europa (M. Boshart et al., EMBO J., Bd. 3 (1984) , S. 1115).
  • Dementsprechend werden in dieser Anmeldung zwei HPVs als zum gleichen Typ gehörig betrachtet, wenn sie entweder (1) das vorstehend erläuterte Kriterium für den Grad der Kreuzhybridisierung erfüllen oder wenn sie (2) im wesentlichen die gleiche epidemiologische Verteilung der Kreuzhybridisierung unter Genitalläsionen zeigen und wenn sie beide mit den gleichen Genitalläsionen, die die epidemiologische Verteilung umfassen, kreuzhybridisieren. Es ist festgestellt worden, daß ein nennenswerter Prozentsatz von zervikalem Krebs und Genitalläsionen, die die Möglichkeit zur Entwicklung zu zervikalem Krebs aufweisen, "neue" HPV- Typen enthalten, die keinem der bekannten HPV-Typen entsprechen. Im Licht des bekannten Zusammenhangs spezifischer HPV-Typen mit Genitalläsionen, die ein hohes Risiko zur Entwicklung von zervikalem Krebs aufweisen, erlaubt die Fähigkeit, diese "neuen" HPV-Typen nachzuweisen und einzuteilen, die Feststellung des Risikos von zervikalem Krebs, der mit diesen "neuen" HPV-Typen verbunden ist, bei patienten, die Anzeichen einer HPV-Infektion zeigen und die möglicherweise mit diesen "neuen" HPV-Typen infiziert sind.
    • (B) Klonierung von HPV-Typen
  • Trotz lange zurückreichender Anstrengungen ist es nicht möglich, HPV in Zellkultur in vitro zu vermehren. Rekombinante DNA-Klonierungstechniken haben es jedoch möglich gemacht, DNA vieler HPV-Typen, wie der HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33 zu isolieren und zu reinigen (vgl. M. Durst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 3812; M. Boshart et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 1151; E.-M. de Villiers et al., J. Virol., Bd. 40 (1981), S. 932; L. Gissmann et al., J. Virol., Bd. 44 (1982) S. 393; A.T. Lorincz et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 225; und S. Beaudenon, Nature, Bd. 321 (1986), S. 246). Die meisten Erkenntnisse im Hinblick auf HPVs sind aus Untersuchungen der DNA-Sequenz bei derartigen rekombinanten DNAs und der Verwendung dieser DNAs zur Herstellung von Nucleinsäurehybridisierungssonden für den Nachweis von HPV in Gewebeproben abgeleitet worden.
    • (C) Hybridisierungssonden
  • Wie vorstehend erläutert wurde, wird HPV-DNA als Hybridisierungssonde zur Unterscheidung von HPV-Typen eingesetzt. Zwei HPV-DNAs von verschiedenen Typen können leicht durch Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die als ungefähr 10ºC unterhalb der Schmelztemperatur eines vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA-Hybrids (einfach geschrieben als Tm- 10ºC) definiert sind, unter Verwendung derartiger Hybridisierungssonden unterschieden werden. Auf ähnliche Weise kann eine HPV-DNA eines Typs leicht von einer HPV-RNA eines anderen Typs durch Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die als ungefähr 10ºC unterhalb der Schmelztemperatur eines vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA-RNA-Hybrids (einfach geschrieben als Tm- 10ºC) definiert sind, unter Verwendung derartiger Hybridisierungssonden unterschieden werden Ferner können zwei HPV-RNAs verschiedener Typen leicht durch Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die als ungefähr 10ºC unterhalb der Schmelztemperatur eines vollständig basengepaarten doppelsträngigen RNA-RNA-Hybrids (einfach geschrieben als Tm-10ºC) definiert sind, unter Verwendung derartiger Hybridisierungssonden unterschieden werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß HPV-DNAs oder -RNAs, die unter Anwendung des vorstehenden Kriteriums als zu verschiedenen Typen gehörig bezeichnet werden, in der Tat in bis zu 80 % ihrer Nucleotidsequenzen übereinstimmen können.
  • Ferner können zwei HPV-DNAs verschiedener Typen unter nicht- stringenten Hybridisierungsbedingungen, die als ungefähr 35ºC oder mehr unterhalb der Schmelztemperatur eines vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA-DNA-Hybrids (einfach geschrieben als Tm-35ºC oder mehr) definiert sind, unter Verwendung derartiger Hybridisierungssonden kreuzhybridisieren. In ähnlicher Weise kann eine HPV-DNA eines Typs mit einer HPV-RNA eines anderen Typs durch Hybridisierung unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen, die als ungefähr 35ºC oder mehr unterhalb der Schmelztemperatur eines vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA-RNA-Hybrids (einfach geschrieben als Tm-35ºC) definiert sind, unter Verwendung derartiger Hybridisierungssonden kreuzhybridisieren. Ferner können zwei HPV-RNAs verschiedener Typen unter nicht- stringenten Hybridisierungsbedingungen, die als ungefähr 35ºC oder mehr unterhalb der Schmelztemperatur eines vollständig basengepaarten doppelsträngigen RNA-RNA-Hybrids (einfach geschrieben als Tm-35ºC) oder mehr) definiert sind, unter Verwendung derartiger Hybridisierungssonden kreuzhybridisieren (vgl. L.M. Anderson et al., Nucleic Acid Hybridization, S. 73-111, B.D. Hames und S.J. Higgins (Hrsg.), I.R.L. Press, Qxford, England und Washington, D.C., USA (1985))
  • Die Schmelztemperaturen von DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA- Hybriden der gleichen Nucleotidsequenzen können in verschiedenen chemischen Umgebungen verschieden sein. Die Einflüsse verschiedener Verbindungen auf die relativen Schmelztemperaturen dieser verschiedenen Hybride sind für mehrere Mittel untersucht worden. Zum Beispiel ist es bekannt, daß die Erhöhung der Konzentration an Formamid DNA- DNA-Hybride in abgestufter Weise stärker destabilisiert als DNA-RNA-Hybride, so daß bei hohen Konzentrationen an Formamid, wie 80 % (Vol./Vol.), ein DNA-RNA-Hybrid möglicherweise eine wesentlich höhere Schmelztemperatur als ein DNA-DNA-Hybrid der gleichen Nucleotidsequenz aufweist.
  • Wie vorstehend erläutert wurde, kann die Schmelztemperatur eines DNA-DNA-Hybrids vorhergesagt werden, wie in: L.M. Anderson et al., Nucleic Acid Hybridization, S. 73-111, B.D. Hames und S.J. Higgins (Hrsg.), I.R.L. Press, Oxford, England und Washington, D.G., USA (1985), beschrieben wird. Ferner kann die Schmelztemperatur eines DNA-DNA-Hybrids empirisch bestimmt werden, wie in: P. Howley et al., J. Biochem., Bd. 254 (1979), 5.4876, beschrieben wird. Die Schmelztemperatur eines DNA-RNA-Hybrids und eines RNA-RNA-Hybrids kann ebenfalls auf bekannte Weise bestimmt werden.
  • Es ist also möglich, eine Gewebeprobe auf das Vorhandensein von HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen und/oder eines besonderen HPV-DNA- oder -RNA-Typs durch Nucleinsäurehybridisierung zu untersuchen, und zwar abhängig davon, welche Bedingungen, d.h. stringente oder nicht- stringente Bedingungen, bei der Hybridisierung angewandt werden.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, festzustellen, ob zervikale Krebse und Genitalläsionen, die die Möglichkeit zur Entwicklung zu zervikalem Krebs aufweisen, einen "neuen" HPV-Typ / mehrere "neue" HPV-Typen enthalten und, wenn dies der Fall ist, diesen/diese hypothetischen "neuen" HPV-Typen zu klonieren.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Nucleinsäurehybridisierungssonden bereitzustellen, die spezifisch für HPV-Typen im allgemeinen und für den "neuen" HPV-Typ / die "neuen" HPV-Typen im besonderen sind.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis von HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen und der DNA oder RNA des/der "neuen" HPV-Typen im besonderen in einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, insbesondere in einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, bereitzustellen, um das Risiko der Entwicklung von zervikalem Krebs zu bestimmen.
  • Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehend vorgelegten ausführlichen Beschreibung der Erfindung deutlich.
  • Es ist erfindungsgemäß festgestellt worden, daß es sich bei "neuen" HPV-Typen, die in der Erfindung kloniert wurden, um neuartige HPV-Typen handelt, die als HPV 35, HPV 43, HPV 44 und HPV 56 bezeichnet werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform sind also die vorstehend genannten Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch eine rekombinante DNA von HPV 35, HPV 43, HPV 44 oder HPV 56 gelöst worden, wobei die DNA einen Klonierungsvektor und im wesentlichen die gesamte HPV 35-DNA oder Fragmente davon; im wesentlichen die gesamte HPV 43-DNA oder Fragmente davon; im wesentlichen die gesamte HPV 44-DNA oder Fragmente davon; bzw. im wesentlichen die gesamte HPV 56-DNA oder Fragmente davon umfaßt.
  • Gemäß weiterer Ausführungsformen sind die vorstehend beschriebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch im wesentliche reine HPV 35-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; im wesentlichen reine HPV 43-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; im wesentlichen reine HPV 44-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; und im wesentlichen reine HPV 56-DNA oder -RNA oder Fragmente davon und durch Nucleinsäurehybridisierungssonden für HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen und HPV 35-DNA oder -RNA, HPV 43-DNA oder -RNA, HPV 44-DNA oder -RNA bzw. HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen, die die vorstehend beschriebenen DNAs oder RNAs, die mit einem nachweisbaren Marker markiert sind, umfassen, gelöst worden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die vorstehend beschriebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zum Nachweis von HPV-DNA oder -RNA gelöst worden, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt
  • (1) Ausführung einer Hybridisierung unter nicht-stringenten Bedingungen mit
  • (a) einem aus der folgenden Gruppe ausgewählten Mitglied:
  • (i) mit einem Marker markierte HPV 35-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 43-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 44-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 56-DNA oder Fragmente davon und
  • (ii) mit einem Marker markierte HPV 35-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 43-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 44-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 56-RNA oder Fragmente davon,
  • (b) und einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, und
  • (2) Untersuchung auf das Auftreten von Kreuzhybridisierung, um HPV-DNA oder -RNA in der Probe nachzuweisen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die vorstehend beschriebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zum Nachweis von HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA, HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA gelöst, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
  • (1) Durchführung einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit
  • (a) einem aus der folgenden Gruppe ausgewählten Mitglied:
  • (i) mit einem Marker markierte HPV 35-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 43-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 44-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 56-DNA oder Fragmente davon und
  • (ii) mit einem Marker markierte HPV 35-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 43-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 44-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 56-RNA oder Fragmente davon,
  • (b) und einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, und
  • (2) Untersuchung des Auftretens einer Kreuzhybridisierung, um HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA in der Probe nachzuweisen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die vorstehend beschriebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zum Nachweis von HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA, HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA gelöst, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
  • (1) Durchführung einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit
  • (a) einer ersten Fraktion von DNA oder RNA, die jeweils aus einer Genitalläsion aus einer Reihe von Genitalläsionen stammt, wobei die Reihe ein epidemiologisches Fortschreiten zu zervikalem Krebs zeigt, und
  • (b) einem aus der folgenden Gruppe ausgewählten Mitglied:
  • (i) mit einem Marker markierte HPV 35-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 43-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 44-DNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 56-DNA oder Fragmente davon und
  • (ii) mit einem Marker markierte HPV 35-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 43-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 44-RNA oder Fragmente davon, mit einem Marker markierte HPV 56-RNA oder Fragmente davon;
  • (2) Durchführung einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit
  • (a) einer zweiten Fraktion von DNA oder RNA, die aus jeder Genitalläsion der Reihe von Genitalläsionen stammt, und
  • (b) einer unbekannten Probe von DNA, die aus einer Genitalläsion stammt, die mit einem Marker markiert ist;
  • (3) Vergleich der epidemiologischen Verteilung der in Stufe (1) erhaltenen Kreuzhybridisierung mit der in Stufe (2) erhaltenen Kreuzhybridisierung und der Kreuzhybridisierung der DNA aus jeder Läsion, die die epidemiologische Verteilung umfaßt, um HPV 35-DNA oder - RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA in der Probe nachzuweisen.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Fig. 1 verdeutlicht die Restriktionsnucleasekarte von HPV 35- DNA. Die nachfolgenden Abkürzungen werden zur Darstellung der Restriktionsenzymstellen verwendet: B1 - BamHI; E5 - EcoRV, H3 - HindIII; P1 - PstI; P2 - PvuII; und S1 - SphI.
  • Fig. 2 zeigt Regionen mit teilweiser Homologie zwischen HPV 6- und HPV 35-DNA, die durch Nucleinsäurehybridisierung unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen bestimmt wurden Die Pfeile verbinden Regionen, die Homologie zeigen. Der gepunktete Pfeil zeigt eine Region an, die nur eine schwache Homologie aufweist. Das kleinste BamHI-bis-PstI-Fragment von HPV 6 hybridisierte nicht mit HPV 35. Jede der Karten in Fig. 2 ist so angeordnet, daß die Enden der linearen Karte der relativen Position der HpaI-Stelle von HPV 6 entsprechen. Die Positionen der offenen Leserahmen, die für HPV 6 abgeleitet wurden, sind oberhalb der Homologiekarte gezeigt.
  • Fig. 3 verdeutlicht graphisch die Verteilung von HPV-Typen in verschiedenen Läsionen auf der Grundlage der Daten in Tabelle 1. Da die Daten für HPV 31 und HPV 33 ähnlich sind, wurden nur die Daten von HPV 31 in Fig. 3 berücksichtigt.
  • Fig. 4 verdeutlicht die Restriktionsnucleasekarte von HPV 43- DNA.
  • Fig. 5 zeigt Regionen mit teilweiser Homologie zwischen HPV 6- und HPV 43-DNA, die durch Nucleinsäurehybridisierung unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen bestimmt wurden. Die Pfeile verbinden Regionen, die Homologie zeigen. Jede der Karten in Fig. 5 ist so angeordnet, daß die Enden der linearen Karte der relativen Position der HpaI-Stelle von HPV 6 entsprechen. Die Positionen der offenen Leserahmen, die für HPV 6 abgeleitet wurden, sind oberhalb der Homologiekarte gezeigt.
  • Fig. 6 verdeutlicht graphisch die Verteilung von HPV-Typen in verschiedenen Läsionen auf der Grundlage der Daten in Tabelle 2. Da die Daten für HPV 31 und HPV 33 ähnlich sind, wurden nur die Daten für HPV 31 in Fig. 6 berücksichtigt.
  • Fig. 7 verdeutlicht die Restriktionsnucleasekarte von HPV 44- DNA.
  • Fig. 8 zeigt Regionen mit teilweise Homologie zwischen HPV 6 - und HPV 44-DNA, die durch Nucleinsäurehybridisierung unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen bestimmt wurden. Die Pfeile verbinden Regionen, die Homologie zeigen. Die gepunkteten Pfeile zeigen Regionen an, die nur eine schwache Homologie aufweisen. Jede der Karten in Fig. 8 ist so angeordnet, daß die Enden der linearen Karte der relativen Position der HpaI-Stelle von HPV 6 entsprechen. Die Positionen der offenen Leserahmen, die für HPV 6 abgeleitet wurden, sind oberhalb der Homologiekarte gezeigt.
  • Fig. 9 verdeutlicht graphisch die Verteilung von HPV-Typen in verschiedenen Läsionen auf der Grundlage der Daten in Tabelle 3. Da die Daten für HPV 31 und HPV 33 ähnlich sind, wurden nur die Daten für HPV 31 in Fig. 9 berücksichtigt.
  • Fig. 10 verdeutlicht die Restriktionsnucleasekarte von HPV 56-DNA.
  • Fig. 11 zeigt Regionen mit teilweiser Homologie zwischen HPV 6- und HPV 56-DNA, die durch Nucleinsäurehybridisierung unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen bestimmt wurden. Die Pfeile verbinden Regionen, die Homologie zeigen. Jede der Karten in Fig. 11 ist so angeordnet, daß die Enden der linearen Karte der relativen Position der HpaI-Stelle von HPV 6 entsprechen. Die Positionen der offenen Leserahmen, die für HPV 6 abgeleitet wurden, sind oberhalb der Homologiekarte gezeigt.
  • Fig. 12 verdeutlicht graphisch die Verteilung von HPV-Typen in verschiedenen Läsionen auf der Grundlage der Daten in Tabelle 4. Da die Daten für HPV 31 und HPV 33 ähnlich sind, wurden nur die Daten für HPV 31 in Fig. 12 berücksichtigt.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bisher unbekannte HPV-Typen sind erfindungsgemäß aufgefunden und als HPV 35, HPV 43, HPV 44 und HPV 56 bezeichnet worden. HPV 35, HPV 43, HPV 44 und HPV 56 sind erfindungsgemäß zum ersten Mal kloniert worden, wodurch die Herstellung von Nucleinsäurehybridisierungssonden zum Nachweis von HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen und HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA, HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen in einer unbekannten Probe von DNA oder RNA und insbesondere in einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus Genitalläsionen stammt, ermöglicht wird.
  • HPV 35 wurde aus einer in Washington, D.G., erhaltenen Biopsieprobe eines zervikalen Adenokarzinoms isoliert und kloniert.
  • HPV 43 wurde aus einer aus Michigan erhaltenen Biopsieprobe eines Vulvagewebes, das bei der histopathologischen Untersuchung nur Hyperkeratose zeigte, isoliert und kloniert.
  • HPV 44 wurde aus einer aus Michigan erhaltenen Biopsieprobe eines Vulvakondyloms isoliert und kloniert.
  • HPV 56 wurde aus einer aus Washington, D.C., Hauptstadtbereich, erhaltenen Biopsieprobe eines Vulvakondyloms isoliert und kloniert.
  • Bei dem speziellen Klonierungsvektor, der in den hier vorgelegten Beispielen eingesetzt wurde, um zunächst HPV 35, HPV 43, HPV 44 und HPV 56 zu klonieren, um die Klone 1A und 1B von HPV 35, die Klone 1A und 1B von HPV 43, den Klon 1 von HPV 44 und die Klone 1A und 1B von HPV 56 herzustellen, handelte es sich um lambda L47.
  • Die HPV 35-DNA aus den HPV 35-Klonen 1A und 1B wurde in pBR322 (ATCC Nr. 37017) subkloniert, um die HPV 35-Klone 2A und 2B herzustellen. Die HPV 35-Klone 2A und 2B sind bei der American Type Culture Collection unter ATCC Nr. 40330 bzw. 40331 hinterlegt worden.
  • Die HPV 43-DNA aus den HPV 43-Klonen 1A und 1B wurde in pT713 (GIBGO/BRL, Gaithersburg, MD) subkloniert, um die HPV 43- Klone 2A und 2B herzustellen. Die HPV 43-Klone 2A und 2B sind bei der American Type Culture Collection unter ATCC Nr. 40338 bzw. 40339 hinterlegt worden.
  • Die HPV 44-DNA aus dem HPV 44-Klon 1 wurde in pT713 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) subkloniert, um den HPV 44-Klon 2 herzustellen. Der HPV 44-Klon 2 ist bei der American Type Gulture Gollection unter ATGG Nr. 40353 hinterlegt worden.
  • Die HPV 56-DNA aus den HPV 56-Klonen 1A und 1B wurde in pT713 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) subkloniert, um die HPV 56- Klone 2A und 2B herzustellen. Die HPV 56-Klone 2A und 2B sind bei der American Type Culture Collection unter ATCG Nr. 40341 bzw. 40379 hinterlegt worden.
  • Die HPV 35-DNA kann als Ganzes aus den HPV 35-Klonen 2A und 2B unter Verwendung der BamHI-Restriktionsendonuclease ausgeschnitten und in beliebige bekannte prokaryontische und eukaryontische Klonierungsvektoren subkloniert werden.
  • Die HPV 43-DNA kann als Ganzes aus dem HPV 43-Klon 2A unter Verwendung der HindIII-Restriktionsendonuclease und aus dem Klon 2B unter Verwendung der BamHI-Restriktionsendonuclease ausgeschnitten und in beliebige bekannte prokaryontische und eukaryontische Klonierungsvektoren subkloniert werden.
  • Die HPV 44-DNA kann als Ganzes aus dem HPV 44-Klon 2 unter Verwendung der BamHI-Restriktionsendonuclease ausgeschnitten und in beliebige bekannte prokaryontische und eukaryontische Klonierungsvektoren subkloniert werden.
  • Die HPV 56-DNA kann als Ganzes aus dem HPV 56-Klon 2A unter Verwendung der EcoRI-Restriktionsendonuclease und aus dem Klon 28 unter Verwendung der BamHI-Restriktionsendonuclease ausgeschnitten und in beliebige bekannte prokaryontische und eukaryontische Klonierungsvektoren subkloniert werden.
  • Der besondere Klonierungsvektor, der zum Subklonieren von HPV 35, HPV 43, HPV 44 oder HPV 56 verwendet wird, ist nicht kritisch, und es kann sich um einen beliebigen bekannten prokaryontischen Klonierungsvektor, wie pUC11, von lambda abgeleitete Vektoren, wie lambda Charon oder von M13 abgeleitete Bakteriophagen (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Gold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York (1982) und W.A.M. Loenen et al., Gene, Bd. 20 (1980), S. 249) oder um einen beliebigen bekannten eukaryontischen Klonierungsvektor, wie pZIP-Neo SV [X1] oder pBKTK-1 handeln (vgl. P.H. Poueels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Amsterdam (1985)).
  • Fragmente von HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA oder HPV 56- DNA können auf ähnliche Weise aus den HPV 35-Klonen 2A und 28, den HPV 43-Klonen 2A und 2B, dem HPV 44-Klon 2 bzw. den HPV 56-Klonen 2A und 2B unter Verwendung anderer bekannter Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten und in die vorstehend beschriebenen Klonierungsvektoren kloniert werden. In ähnlicher Weise kann die HPV 35-DNA aus den HPV 35-Klonen 2A und 2B, die HPV 43-DNA aus den HPV 43-Klonen 2A und 2B, die HPV 44-DNA aus dem HPV 44-Klon oder die HPV 56-DNA aus den HPV 56-Klonen 2A und 2B ausgeschnitten, ligiert und in die vorstehend beschriebenen Klonierungsvektoren kloniert werden, um einen Vektor zu erhalten, der im wesentlichen das gesamte HPV 35-Genom; im wesentlichen das gesamte HPV 43- Genom; im wesentlichen das gesamt HPV 44-Genom bzw. im wesentlichen das gesamte HPV 56-Genom enthält.
  • Die Klonierung von HPV 35-DNA oder Fragmenten davon; von HPV 43-DNA oder Fragmenten davon; von HPV 44-DNA oder Fragmenten davon; oder von HPV 56-DNA oder Fragmenten davon erlaubt die vergleichsweise einfache Herstellung großer Mengen von HPV 35-DNA oder Fragmenten davon; HPV 43-DNA oder Fragmenten davon, HPV 44-DNA oder Fragmenten davon bzw. HPV 56-DNA oder Fragmenten davon zur Verwendung bei der Herstellung von Nucleinsäurehybridisierungssonden für HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen und für HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA bzw. HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen.
  • Außerdem können HPV 35-DNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-DNA oder Fragmente davon in andere bekannte Klonierungsvektoren subkloniert werden, um die Vorteile spezieller Eigenschaften der besonderen Klonierungsvektoren auszunutzen, die in vitro die Synthese von RNA erleichtern, die homolog zu HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA oder HPV 56-DNA ist, die in den Klonierungsvektor inseriert ist (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York (1982)). Beispiele für diese Klonierungsvektoren umfassen pT7l2 und pT7l3, die jeweils im Handel erhältlich sind von GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD. HPV 35-DNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-DNA oder Fragmente davon können in diese Klonierungsvektoren subkloniert werden, so daß die HPV 35-DNA oder die Fragmente davon; die HPV 43-DNA oder die Fragmente davon; die HPV 44-DNA oder die Fragmente davon oder die HPV 56-DNA oder die Fragmente davon als wirksame Matrizen für phagencodierte RNA-Polymerasen, z.B. T7, T3 oder Sp6, dienen können. Unter Verwendung derartiger Klonierungsvektoren und derartiger RNA-Polymerasen kann HPV 35-RNA, HPV 43-RNA, HPV 44-RNA oder HPV 56-RNA, die komplementär zu einem der Stränge von HPV 35-DNA oder Fragmenten davon; HPV 43-DNA oder Fragmenten davon; HPV 44-DNA oder Fragmenten davon; bzw. HPV 56-DNA oder Fragmenten davon ist, durch in vitro- Transkription unter Anwendung von dem Fachmann bekannter Verfahren synthetisiert werden.
  • Die speziellen bakteriellen oder eukaryontischen Wirte zum Züchten der Klonierungsvektoren, die HPV 35-DNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder Fragmente davon oder HPV 56-DNA oder Fragmente davon enthalten, hängen von dem eingesetzten Klonierungsvektor ab. Zum Beispiel umfaßt ein typischer Wirt zum Züchten von HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA oder HPV 56-DNA, die in lambda L47 kloniert ist, E. coli NM538 (A.M. Frischanf et al., J. Mol. Biol., Bd. 170 (1983), S. 827). Weitere Wirte, wie E. coli HB101 (H.W. Boyer et al., J. Mol. Biol., Bd. 41 (1969), S. 459), können eingesetzt werden, wenn pBR322 oder pUC11 als Klonierungsvektoren verwendet werden. Ein typischer Wirt zum Züchten von HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA oder HPV 56- DNA, die in pZIP-Neo SV [X1] kloniert ist, ist die Affenzellinie Cos, während ein typischer Wirt zum Züchten von HPV-DNA, die in pBKTK-1 kloniert ist, eine beliebige einer Reihe bekannter Säugerzellinien ist (vgl. P.H. Poueels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Amsterdam (1985).
  • Die Hybridisierung der erfindungsgemäßen Sonden an HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen oder an HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen hängt von den angewandten Hybridisierungsbedingungen ab. Das heißt, unter nicht- stringenten Hybridisierungsbedingungen können HPV 35-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-DNA oder -RNA oder Fragmente davon als Hybridisierungssonden für HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen eingesetzt werden. Andererseits können unter stringenten Hybridisierungsbedingungen HPV 35-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder RNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder -RNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-DNA oder -RNA oder Fragmente davon als Hybridisierungssonden für HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA- oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen eingesetzt werden.
  • Wie vorstehend erläutert wurde, sind die DNAs und RNAs verschiedener Typen von HPV fähig, unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen, d.h. ungefähr 35ºC oder mehr unterhalb der Schmelztemperatur einer vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA mit einer Basenzusammensetzung, die der von HPV-DNAs oder -RNAs als allgemeiner Gruppe entspricht, eine Kreuzhybridisierung einzugehen.
  • Ferner ist es möglich, eine unbekannte Probe von DNA oder RNA auf das Vorhandensein eines besonderen HPV-Typs zu untersuchen und diesen Typ durch Durchführung einer Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, d.h. ungefähr 10ºC unterhalb der Schmelztemperatur einer vollständig basengepaarten doppelsträngigen DNA mit einer Basenzusammensetzung, die der von HPV-DNAs oder RNAs als allgemeiner Gruppe entspricht, zu identifizieren.
  • Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Hybridisierung unter nicht-stringenten Bedingungen durchgeführt, indem zuerst unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und anschließend unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen gewaschen wird.
  • Außerdem wird bei den erfindungsgemäßen Verfahren die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt, indem zuerst unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und anschließend unter stringenten Hybridisierungsbedingungen gewaschen wird, oder indem zuerst unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und anschließend unter stringenten Hybridisierungsbedingungen gewaschen wird. Bei dem ersten Verfahren, d.h. zuerst Hybridisieren unter nicht-stringenten Hybrid isierungsbedingungen und anschließend Waschen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, sind Hybride, die sich zwischen DNAs oder RNAs verschiedener Typen bilden, instabil, während Hybride, die sich zwischen DNAs und RNAs des gleichen Typs bilden, stabil sind.
  • Um zu bestimmen, ob eine unbekannte Probe von DNA oder RNA vom gleichen oder einem anderen HPV-Typ als die eingesetzte Hybridisierungssonde ist, wird die Hybridisierung vorzugsweise unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt, und anschließend wird unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen gewaschen. Nach Untersuchung auf das Vorhandensein von Hybriden werden die nachgewiesenen Hybride unter stringenten Hybridisierungsbedingungen gewaschen. Bei diesem Verfahren wird die Menge an Hybriden, die nach der Hybridisierung unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen verbleibt, bestimmt, und mit der Menge an Hybriden, die nach dem Waschen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen vorhanden sind, verglichen. Wenn das Waschen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu keiner oder einer minimalen Verringerung der Menge an gebildeten Hybriden führt, dann zeigt dies an, daß die ursprünglich gebildeten Hybride, d.h. die Hybride, die unter nicht-stringenten Bedingungen gebildet wurden, zwischen DNAs oder RNAs des gleichen Typs gebildet wurden. Umgekehrt zeigt ein Verschwinden der Hybride oder eine starke Verringerung der Menge an Hybriden, die nach dem Waschen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verbleiben, an, daß die ursprünglich gebildeten Hybride, d.h. die Hybride, die unter nicht-stringenten HYbridisierungsbedingungen gebildet wurden, zwischen DNAs oder RNAs verschiedener Typen gebildet wurden.
  • Die Fähigkeit von HPV-DNA oder -RNA, an eine unbekannte Probe von DNA oder RNA unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu binden, zeigt einen hohen Grad an Nucleotidsequenzhomologie an. Andererseits zeigt die Fähigkeit von HPV-DNA oder -RNA, an eine unbekannte Probe von DNA oder RNA nur unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen zu binden, einen geringen oder mäßigen Grad an Nucleotidsequenzhomologie an. Der genaue Grad an Nucleotidsequenzhomologie kann nur durch direkte Sequenzierung der unbekannten DNA und Vergleich mit der bekannten Sequenz von HPV-DNA bestimmt werden.
  • In Fällen, bei denen der Nachweis von HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen in einer unbekannten Probe von DNA oder RNA und insbesondere in einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, durchgeführt wird, ist es in der Praxis von Vorteil, eine Hybridisierungssonden- Zusammensetzung zu verwenden, die ein Gemisch an Hybridisierungssonden umfaßt. Diese Hybridisierungssonden umfassen Sonden mit Sequenzen, die repräsentativ für alle oder die meisten Typen sind, von denen mag vermutet, daß sie in der unbekannten Probe von DNA oder RNA vorhanden sind. Ein Hybridisierungssonden-Gemisch von DNA- oder RNA-Sequenzen, die repräsentativ für die HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 43, 44 und 56 sind, ist besonders vorteilhaft, wenn die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus einer Genitalläsion stammt, da es bei diesen HPV-Typen besonders wahrscheinlich ist, daß sie in Genitalläsionen aufgefunden werden. Andere bekannte HPV-Typen werden selten oder niemals in Genitalläsionen aufgefunden. Zum Beispiel werden die HPV- Typen 1, 2 und 4 im allgemeinen in anderen Typen von Läsionen, d.h. in kutanen Warzen (vgl. C.A. Heilman et al., J. Virol., Bd. 360 (1980), S. 395) aufgefunden, und daher ist ein Hybridisierungssonden-Gemisch von DNA- oder RNA- Sequenzen, das die HPV-Typen 1, 2 und 4 enthält, möglicherweise vorteilhaft, wenn die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus einer kutanen Warze stammt, aber es ist nicht geeignet, wenn die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus Genitalläsionen stammt.
  • Beispiele von Sequenzen für die HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33, die im Hybridisierungssonden-Gemisch eingesetzt werden können, sind in: L. Gissmann, Cancer Surv., Bd. 3 (1984), S. 161; H. Pfister, Biochem. Pharmacol., Bd. 99 (1983), S. 111; M. Durst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 3812; M. Boshart et al., EMBO J., Bd. 3 (1984) S. 1151; A.T. Lorincz et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 225 und S. Beaudenon, Nature, Bd. 321 (1986), S. 246, beschrieben. Ferner sind Beispiele für Sequenzen der HPV-Typen 1, 2 und 4, die im Hybridisierungssonden-Gemisch eingesetzt werden können, einem Fachmann bekannt (vgl. C.A. Heilman et al., J. Virol., Bd. 360 (1980), S. 395). So können also mit der Offenbarung dieser Anmeldung im Hinblick auf HPV 35, HPV 43, HPV 44 und HPV 56 und mit den Kenntnissen eines Fachmanns im Hinblick auf die HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33 und andere HPV-Typen, wie die HPV-Typen 1, 2 und 4 Hybridisierungssonden-Gemische leicht hergestellt werden.
  • Bei den Hybridisierungssonden-Gemischen ist der besondere Prozentsatz an DNAs oder RNAs jedes HPV-Typs erfindungsgemäß nicht kritisch. Im allgemeinen werden ungefähr gleiche molare Mengen an DNAs oder RNAs jedes HPV-Typs in dem Gemisch eingesetzt.
  • Die Nucleinsäurehybridisierung als Mittel zum Nachweis und zur Einteilung von HPV kann in Lösung, wie vorstehend beschrieben wurde (vgl. J.R. Loggins et al., Cancer Res., Bd. 39 (1979) S. 545) oder auf einem festen Träger (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) oder in situ (vgl. D.J. Brigati et al., Virol., Bd. 126 (1983), S. 32 und A.M. Beckmann et al., J Med. Virol., Bd. 16 (1985), S. 265) durchgeführt werden.
  • Die Hybridisierung auf einem festen Träger kann unter Anwendung einer Anzahl verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Ein derartiges Verfahren beinhaltet die Reinigung der gesamten unbekannten DNAs oder RNAs, ihre Immobilisierung auf einem festen Träger in einzelsträngiger Form und die nachfolgende Hybridisierung mit markierter HPV 35-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon; markierter HPV 43-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon; markierter HPV 44-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon; oder markierter HPV 56-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon.
  • Alternativ dazu können die gereinigten unbekannten DNAs mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen verdaut werden, und die resultierenden DNA-Fragmente in den Proben können durch Elektrophorese getrennt werden. Die DNA-Fragmente können anschließend auf einen festen Träger übertragen und mit markierter HPV 35-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon; markierter HPV 43-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon; markierter HPV 44-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon; oder markierter HPV 56-DNA oder -RNA oder Fragmenten davon hybridisiert werden.
  • Die Hybridisierung in situ wird auf Objektträgern aus Glas durchgeführt, und das Endergebnis des Verfahrens wird durch ein Mikroskop beobachtet. Bei diesem Verfahren werden die DNA oder die RNA nicht aus den Zellen isoliert, sondern zusammen mit allen anderen zellulären Bestandteilen belassen.
  • HPV 35-RNA oder Fragmente davon; HPV 43-RNA oder Fragmente davon; HPV 44-RNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-RNA oder Fragmente davon werden vorzugsweise als Nucleinsäurehybridisierungssonden für HPV-DNA im allgemeinen und HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA bzw. HPV 56-DNA im besonderen verwendet, wenn Rohextrakte, insbesondere Rohextrakte aus Genitalläsionen, anstelle von gereinigter DNA, z.B. aus derartigen Genitalläsionen, verwendet werden.
  • Wenn HPV 35-RNA, HPV 43-RNA, HPV 44-RNA oder HPV 56-RNA als Hybridisierungssonde zum Nachweis von HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA bzw. HPV 56-DNA in einer unbekannten Probe von DNA verwendet wird, dann ist es bevorzugt, die nach der ersten Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen gebildeten DNA-RNA-Hybride mit pankreatischer RNase A (ungefähr 20 mg/ml in 50 millimolar NaCl (pH-Wert: 7,0)) bei Raumtemperatur zu behandeln und anschließend unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu waschen.
  • Die HPV 35-DNA oder Fragmente davon; die HPV 43-DNA oder Fragmente davon; die HPV 44-DNA oder Fragmente davon oder die HPV 56-DNA oder Fragmente davon oder die HPV 35-RNA oder Fragmente davon; die HPV 43-RNA oder Fragmente davon; die HPV 44-RNA oder Fragmente davon; oder die HPV 56-RNA oder Fragmente davon eignen sich als Nucleinsäurehybridisierungssonden für HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen und HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen, wenn sie mit einem radioaktiven Marker, wie ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I oder ³&sup5;S, markiert sind.
  • HPV 35-DNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-DNA oder Fragmente davon können z.B. durch "Nick-Translation" durch bekannte Verfahren, die z.B. in P.J.W. Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113 (1977), S. 237, beschrieben sind und durch T4- DNA-Polymerase-Ersatzsynthese, die z.B. in K.C. Deen et al. Anal. Biochem., Bd. 135 (1983), S. 456, beschrieben ist, radioaktiv markiert werden.
  • HPV 35-RNA oder Fragmente davon; HPV 43-RNA oder Fragmente davon; HPV 44-RNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-RNA oder Fragmente davon können mit einem radioaktiven Marker durch in vitro-Transkription markiert werden, wie z.B. in P. Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 2035, beschrieben ist. Da RNA-Polymerase markierte Vorstufen verwenden kann, ist es möglich, markierte RNA durch dieses Verfahren zu synthetisieren, um HPV 35-RNA-Sonden; HPV 43- RNA-Sonden; HPV 44-RNA-Sonden bzw. HPV 56-RNA-Sonden zum Nachweis von HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen oder von HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen herzustellen. Die markierten Vorstufen, die verwendet werden können, um markierte RNA herzustellen, umfassen Vorstufen mit einem Gehalt an radioaktiven Markern, wie ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I oder ³&sup5;S.
  • HPV 35-DNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-DNA oder Fragmente davon oder HPV 35-RNA oder Fragmente davon; HPV 43- RNA oder Fragmente davon; HPV 44-RNA oder Fragmente davon oder HPV 56-RNA oder Fragmente davon eignen sich auch als Nucleinsäurehybridisierungssonden für HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen und HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA im besonderen, wenn sie mit nicht radioaktiven Markern, wie Biotin, einem Enzym oder einer fluoreszierenden Gruppe, markiert sind. Biotin wirkt als haptenähnliche Gruppe und kann an die DNA oder RNA gebunden und nachgewiesen werden, indem ein Avidin-konjugiertes Enzym oder ein Streptavidinkonjugiertes Enzym an das Biotin gebunden und anschließend durch Waschen nicht spezifisch gebundenes Enzym entfernt wird. Bei Zugabe von geeigneten Substraten für das Enzym kann die Umwandlung des Substrats zu einem gefärbten Produkt beobachtet werden (vgl. J.J. Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 4045). Beispiele für derartige Enzyme umfassen alkalische Phosphatase und Meerrettich- Peroxidase. Außerdem können fluoreszierende Moleküle, wie Fluorescein und Rhodamin, chemisch-mit Avidin oder Streptavidin konjugiert und als nicht-radioaktive Marker eingesetzt werden.
  • Alternativ dazu können die vorstehend beschriebenen Enzyme oder fluoreszierenden Moleküle direkt chemisch mit HPV 35-DNA oder Fragmenten davon; HPV 43-DNA oder Fragmenten davon; HPV 44-DNA oder Fragmenten davon; oder HPV 56-DNA oder Fragmenten davon oder HPV 35-RNA oder Fragmenten davon; HPV 43-RNA oder Fragmenten davon; HPV 44-RNA oder Fragmenten davon; oder HPV 56-RNA oder Fragmenten davon konjugiert werden, wie z.B. in M. Renz, EMBO J., Bd. 6 (1983), S. 817, beschrieben ist, und sie können in dieser Weise als Hybridisierungssonden verwendet werden.
  • Die auf diese Weise markierte HPV 35-DNA oder HPV 35-RNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder HPV 43-RNA oder Fragmente davon; HPV 44-DNA oder HPV 44-RNA oder Fragmente davon; oder HPV 56-DNA oder HPV 56-RNA oder Fragmente davon können, wie vorstehend beschrieben, bei Hybridisierungsuntersuchungen mit einer unbekannten Probe von DNA oder RNA und insbesondere mit einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Probe HPV-DNA oder -RNA im allgemeinen oder HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA bzw. HPV 56-DNA im besonderen enthält.
  • Die unbekannte Probe an DNA kann nicht nur aus einer Genitalläsion, sondern auch aus anderen Läsionen, wie einer Läsion der Kehle, einer oralen Läsion oder einer Hautläsion, stammen.
  • Die unbekannte Probe von DNA oder RNA kann z.B. durch Biopsie einer Epithelläsion, Ausschaben des Zervix oder Abtupfen des Zervix, um abgeschilferte Zellen zu erhalten, erhalten werden. Außerdem kann die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus Bakterienzellen erhalten werden, in die DNA aus einer Läsion gemäß bekannter Verfahren kloniert worden ist, die z.B. in T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) und L. Gissmann, Cancer Surv., Bd. 3 (1984), S. 161-181, beschrieben sind.
  • Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann die Untersuchung auf eine Kreuzhybridisierung durch Untersuchung des Vorhandenseins des radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markers, der mit den doppelsträngigen Nucleinsäurehybriden verbunden ist, erfolgen. Die Verfahren zum Nachweis, ob ein spezieller Marker vorhanden ist, hängen von dem eingesetzten Marker ab und sind dem Fachmann bekannt.
  • Gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der der Nachweis von HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA auf einem Vergleich der epidemiologischen Verteilung der Kreuzhybridisierung einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, mit der von HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA bzw. HPV 56-DNA basiert, zeigt die unbekannte Probe von DNA oder RNA möglicherweise weniger als 50 % Kreuzhybridisierung mit HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44- DNA bzw. HPV 56-DNA unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen, d.h. unter Anwendung von Hydroxylapatit-Chromatographie zum Nachweis, ob zwei HPVs verschiedenes isoliertes Material des gleichen Typs oder isoliertes Material verschiedener Typen repräsentieren, sie kann jedoch nach den hier gewählten Definitionen immer noch als HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA angesehen werden. Daher ist es erforderlich, auch die Kreuzhybridisierung jeder Läsion zu vergleichen, die die epidemiologische Verteilung umfaßt, um HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA in der Probe nachzuweisen. Dies hat seinen Grund darin, daß es möglich ist, daß verschiedene HPV-Typen die gleiche oder eine ähnliche epidemiologische Verteilung zeigen. Indem jedoch gezeigt wird, daß die gleichen Läsionen, die die epidemiologische Verteilung umfassen, eine Kreuzhybridisierung sowohl mit HPV 35-DNA, HPV 43-DNA; HPV 44-DNA; bzw. HPV 56-DNA und der unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus der Genitalläsion stammt, eingehen, ist es möglich, definitiv zu schließen, daß es sich bei der Probe von unbekannter DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, um HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA handelt.
  • Wie nachstehend ausführlicher erläutert wird, ist festgestellt worden, daß HPV 35-DNA oder -RNA in ungefähr 1 % bis 4 % zervikaler Läsionen von leichten Dysplasien bis zu invasivem Krebs vorhanden ist. HPV 35-DNA oder -RNA ist also ziemlich gleichmäßig in zervikalen Läsionen verschiedenen Grads verteilt.
  • Es ist festgestellt worden, daß HPV 43-DNA oder -RNA in ungefähr 1 % bis 4 % gutartiger zervikaler Läsionen (wie leichter Dysplasien) vorhanden ist, sie ist jedoch nicht bei invasivem Krebs aufgefunden worden. HPV 43-DNA oder -RNA scheint also nur bei zervikalen Läsionen von geringem Grad vorhanden zu sein.
  • Es ist festgestellt worden, daß HPV 44-DNA oder -RNA in ungefähr 1 % bis 4 % gutartiger zervikaler Läsionen vorhanden ist, sie ist jedoch bei keinen invasiven Krebsen aufgefunden worden. HPV 44-DNA oder -RNA scheint also nur in zervikalen Läsionen von geringem Grad vorhanden zu sein.
  • Es ist festgestellt worden, daß HPV 56-DNA oder -RNA in ungefähr 1 % bis 4 % gutartiger zervikaler Läsionen vorhanden ist, und sie wird in 4 % invasiver Krebse aufgefunden. HPV 56-DNA oder -RNA scheint also in zervikalen Läsionen von geringem Grad und Krebsen vorhanden zu sein. Andererseits zeigen andere HPV-Typen, wie die HPV-Typen 6, 11, 16, 18 und 31, eine verschiedene Verteilung in zervikalen Läsionen verschiedenen Grads.
  • Gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der der Nachweis von HPV 25-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA auf einem Vergleich der epidemiologischen Verteilung der Kreuzhybridisierung einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, mit der von HPV 35-DNA, HPV 43-DNA, HPV 44-DNA bzw. HPV 56-DNA basiert, würde die unbekannte Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, eine Kreuzhybridisierung mit zervikalen Läsionen eingehen. Wenn eine derartige epidemiologische Verteilung der Kreuzhybridisierung mit der unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, festgestellt wird, dann kann es sich bei dieser unbekannten Probe von DNA oder RNA um eine HPV 35-DNA oder -RNA; eine HPV 43-DNA oder -RNA; eine HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. eine HPV 56-DNA oder -RNA handeln. Indem gezeigt wird, daß die gleichen Läsionen, die die epidemiologische Verteilung umfassen, auch mit der unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, eine Kreuzhybridisierung eingehen, kann schlüssig gezeigt werden, daß es sich bei der unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, um HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA handelt.
  • Die besondere Größe der HPV 35-DNA- oder HPV 35-RNA- Fragmente, HPV 43-DNA- oder HPV 43-RNA-Fragmente, HPV 44-DNA - oder HPV 44-RNA-Fragmente; oder HPV 56-DNA- oder HPV 56-RNA- Fragmente, die erfindungsgemäß als Hybridisierungssonden eingesetzt werden können, ist nicht kritisch. Die Größe der HPV 35-DNA- oder HPV 35-RNA-Fragmente; HPV 43-DNA oder HPV 43-RNA-Fragmente; HPV 44-DNA- oder HPV 44-RNA-Fragmente; oder HPV 56-DNA- oder HPV 56-RNA-Fragmente kann z.B. von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren, abhängig davon, ob einzelsträngige oder doppelsträngige Sonden eingesetzt werden, und vorzugsweise von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren betragen. Wenn die Hybridisierung in situ durchgeführt wird, dann wird es bevorzugt, wenn die Größe der HPV 35-DNA- oder HPV 35-RNA-Fragmente; HPV 43-DNA- oder HPV 43-RNA-Fragmente; HPV 44-DNA- oder HPV 44-RNA-Fragmente; oder HPV 56-DNA- oder HPV 56-RNA-Fragmente kleiner als etwa 500 Basen oder Basenpaare ist, da Fragmente dieser Größe in situ wirksamer als HPV-DNA oder HPV-RNA-Fragmente, die größer als etwa 1000 Basen oder Basenpaare sind, hybridisieren. Bei der Verwendung doppelsträngiger DNA oder RNA muß die DNA oder RNA vor der Durchführung der Hybridisierung denaturiert werden.
  • Die HPV 35-DNA-Fragmente; die HPV 43-DNA-Fragmente; die HPV 44-DNA-Fragmente oder die HPV 56-DNA-Fragmente können durch Restriktionsendonucleaseverdau der HPV 35-Klone 2A oder 2B; der HPV 43-Klone 2A oder 2B; des HPV 44-Klons 2 bzw. der HPV 56-Klone 2A oder 2B oder durch synthetische Herstellung, etwa unter Verwendung beliebiger handelsüblicher DNA- Synthesevorrichtungen oder durch Anwendung bekannter chemischer Verfahren unter Verwendung der HPV 35-DNA-Sequenz; der HPV 43-DNA-Sequenz, der HPV 44-DNA-Sequenz; der HPV 56-DNA-Sequenz, die nach bekannten Verfahren bestimmt werden können (S. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977) S. 5363), erhalten werden.
  • Beim Nachweis von HPV 35-DNA oder -RNA, HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA wird vorzugsweise das gesamte HPV 35-Genom, das gesamte HPV 43- Genom, das gesamte HPV 44-Genom bzw. das gesamte HPV 56-Genom als Hybridisierungssonde verwendet.
  • Die nachstehenden Beispiele werden vorgelegt, um die Erfindung weiter zu erläutern. Sie sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränken. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich alle Teile, Prozente, Verhältnisse und dergl. auf das Gewicht.
    • Beispiel 1 (A) Klonierung von HPV 35-DNA
  • Bei dem eingesetzten Ausgangsmaterial handelte es sich um eine Biopsieprobe eines zervikalen Adenokarzinoms, die aus Washington, D.G., erhalten wurde und aus einigen mg Gewebe bestand. Die gesamte DNA wurde gereinigt, wie in: T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982), beschrieben ist. Genauer gesagt wurde das Gewebe zerkleinert und anschließend über Nacht in 1,0 ml 50 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 8,0 mit einem Gehalt an 0,6 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat und 50 ug/ml Proteinase K bei 37ºC verdaut. Das erhaltene Material wurde zweimal mit 1,0 ml Phenol:Chloroform (1:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. Die DNA wurde dann aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 2 Volumenteilen 90 %-iges (Vol./Vol.) Ethanol gefällt. Die ausgefällte DNA wurde in einem Puffer mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris, 1,0 millimolar EDTA, pH-Wert: 8,0 (nachstehend "TE-Puffer") mit einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml wieder aufgelöst.
  • Die DNA wurde vollständig mit PstI verdaut und einer Elektrophorese auf 1 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen Die DNA wurde auf Nitrocellulosefilter übertragen, wie es in: E.M. Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S. 503, beschrieben ist. Die Filter wurden anschließend unter nicht- stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-35ºC) und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-10ºC) mit DNA aus den HPV-Typen 6, 11, 16, 18 und 31 als Sonden untersucht. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 43ºC in 1,0 m NaCl, 50 millimolar Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4), 1,0 millimolar EDTA, 2 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat, 0,1 % (Gew./Vol.) Gelatine, 50 ug/ml tRNA und 30 % (Vol./Vol.) Formamid durchgeführt. Es wurde viermal 30 Minuten bei 55ºC in 1,2X SSC (1X SSC bedeutet 0,15 m NaCl plus 0,015 m Natriumcitrat), 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 1,0 millimolar EDTA und 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat gewaschen. Die Hybridisierung wurde mit den HPV-Typen 6, 11, 16, 18 und 31 unter nicht-stringenten Bedingungen, nicht jedoch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen erzielt.
  • Die erhaltene gereinigte DNA und lambda L47 wurden mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut, die Fragmente von 3,75 kb und 4,1 kb bildete, wobei die Summe, d.h. 7,85 kb, eine typische Größe für ein Papillomavirus-Genom darstellt. Jedes dieser Fragmente wurde in die einzige BamHI-Stelle von lambda L47 kloniert. Genauer gesagt wurden 2,0 ug der erhaltenen gereinigten DNA und 2,0 ug lambda L47-DNA mit 10 Einheiten BamHI 1 Stunde in einem Gesamtvolumen von 50 ul TE- Puffer bei 37ºC geschnitten. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde anschließend mit 400 ul TE-Puffer verdünnt und, wie vorstehend beschrieben, einer Phenolextraktion mit einem gleichen Volumen an Phenol:Ghloroform unterworfen. Die wäßrige Phase wurde anschließend mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. DNA aus der wäßrigen Phase wurde mit 80 %-igem (Vol./Vol.) Ethanol gefällt und getrocknet. Die getrocknete DNA wurde anschließend in 10 ul 1X Ligasepuffer mit einem Gehalt an 66 millimolar Tris-HCl, 6,6 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT und 1,0 millimolar ATP suspendiert und 2 Stunden bei 42ºC inkubiert, um den lambda-Armen eine Anellierung zu ermöglichen. Sodann wurden 0,5 ul T4-DNA-Ligase, d.h. etwa eine Einheit, und 0,5 41 10 millimolar ATP, pH-Wert 7,0 zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und man ließ die Ligation über Nacht bei 12ºC ablaufen.
  • Sodann wurden die Ligationsprodukte unter Bildung infektiöser Phagen verpackt und verwendet, um E. coli NM538 zu infizieren. Genauer gesagt wurde eine einzelne Kolonie von E. coli NM538, die auf einer Agaroseplatte mit einem Gehalt an 10 g Trypton und 5,0 g NaCl pro Liter (nachstehend "TN- Medium") wuchs, ausgewählt und über Nacht bei 37ºC in 20 ml TN-Medium auf einem Schüttler (250 U/min) bis zur frühen stationären Phase gezüchtet. Die Zellkultur wurde dann vierfach mit TN-Medium verdünnt und 3 Stunden gezüchtet. Sodann wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min in einem Sorvall HB-4-Rotor geerntet, und das erhaltene Zellpellet wurde in 0,25 Teilen des ursprünglichen Volumens in 10 millimolar MgSO&sub4; resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
  • Die verpackten infektiösen Phagen wurden unter Verwendung eines handelsüblichen BRL-Lambda-In Vitro-Verpackungssystems hergestellt (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
  • 100 ul einer geeigneten Verdünnung verpackter Phagen in Phagenlagerungspuffer mit einem Gehalt an 0,5 m Tris-HCl (pH- Wert: 8,0), 0,1 m NaCl, 0,01 m MgSO&sub4; und 0,01 % (Gew./Vol.) Gelatine (Difco ), um 1,5 x 10&sup4; Plaques pro Platte mit 9 cm Durchmesser zu erhalten, wurden zu 100 ul der wie vorstehend hergestellten E. coli NM538 in einem 10-15 ml fassenden Teströhrchen gegeben, leicht gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Zell-Phagen- Lösung auf Trypticase-Sojabohnen-Agarplatten mit einem Gehalt an 10 g Trypticase-Sojabohnenbrühe, 5,0 g NaCl und 15 g Agar pro Liter, die mindestens 1 Tag vorher hergestellt und bei 37ºC vorgewärmt worden waren, plattiert. Danach wurden 3 bis 5 ml einer Agarosedeckschicht mit einem Gehalt an 0,5 % Agarose (hochrein, Elektrophorese-Qualität), gelöst in 10 millimolar MgSO&sub4;, die in einem Mikrowellenofen bis zum Sieden der Lösung erwärmt und anschließend vor der Verwendung auf 45ºC abgekühlt worden war, über die plattierten Zellen-Phagen gegeben. Nachdem sich die Agarose verfestigt hatte, wurden die Platten in einen Inkubator mit Gebläse und guter Zirkulation bei 37ºC für 30 Minuten mit aufgesprungenen DeckeIn der Platten überführt, und anschließend wurden die Deckel geschlossen und die Platten umgedreht. Nach 8 bis 12 Stunden wurden Plaques sichtbar.
  • Die Infektion führte zur konf luenten Lyse der Bakterien auf den Platten. Rekombinante Phagen, die HPV-DNA trugen, wurden durch "Anheben der Plaques", wie von W.D. Benton et al., Science, Bd. 196 (1977), S. 180, beschrieben, lokalisiert. Genauer gesagt wurden konfluent lysierte Platten 1 Stunde bei 4ºC angeordnet, um die Agarose hart werden zu lassen. Anschließend wurde ein Stück Nitrocellulosefilter geeigneter Größe auf jeder Platte angeordnet, indem es in der Mitte gebogen wurde, der Mittelpunkt der Platte berührt wurde und die Kontaktpunkte hin zum Rand geformt wurden. Anschließend wurden vier asymmetrische Löcher mit einer kleinen Nadel ("gauge needle") durch den Nitrocellulosefilter und den Agar gestanzt, und die Positionen der Löcher wurden auf dem Boden der Platte mit einer dauerhaften Markierung markiert. Dies ermöglichte es, für den Nitrocellulosefilter und beliebige andere Flächen, die positive Signale enthielten, einen Bezug zu den entsprechenden Positionen auf der Platte herzustellen. Nach 10 Minuten wurden die Nitrocellulosefilter entfernt, und die DNA wurde denaturiert, indem die Nitrocellulosefilter mit der Plaqueseite nach oben 1 Minute in einer Schale angeordnet wurden, die 200 ml 0,5 m NaOH, 2,0 m NaCl enthielt. Die Nitrocellulosefilter wurden anschließend durch 5-minütiges Eintauchen in 500 ml 0,5 m Tris-HCl, 2,0 m NaCl, pH-Wert: 7,5 neutralisiert. Sodann wurden die Filter 1 Minute in 6X SSC mit einem Gehalt an 0,9 m NaCl, 0,09 m Natriumcitrat gespült, auf Whatman 3 MM-Papier getrocknet und anschließend 30 Minuten bei 80ºC unter Vakuum einer Wärmebehandlung unterzogen.
  • Danach wurde eine nicht-stringente Hybridisierung unter Verwendung von HPV 16-DNA, die durch "Nick-Translation" mit ³²P markiert worden war, als Sonde mit der aus den angehobenen Plaques isolierten DNA durchgeführt (vgl. P.J.W. Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113 (1977) S. 237 und T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Anschließend wurde gewaschen. Dann wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 in NaCl, 28 % (Vol./Vol.) Formamid, 50 millimolar N-Tris- (hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethan-sulfonsäure (nachstehend "TES"), 10X Denhardt-Lösung, 0,1 millimolar EDTA und 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter nicht-stringenten Bedingungen bei 52ºC unter Verwendung von 1,1X SSC (mit einem Gehalt an 0,165 m NaCl und 0,0165 m Natriumcitrat) in 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Entsprechend den Stellen der radioaktiven Exposition wurde eine Region der Platte, die Phagen enthielt, die DNA enthielten, die an HPV 16-DNA hybridisierte, ausgeschnitten und verwendet, um erneut, wie vorstehend beschrieben, E. coli NM538 zu infizieren. Die Lokalisierung von Phagen-Plaques, die HPV-DNA enthielten, wurde durch Wiederholung des vorstehenden Verfahrens durchgeführt. Sieben Plaques wurden unter 2 x 10&sup5; abgesuchten Plaques identifiziert, und drei Typen von Klonen wurden aufgefunden. Zwei Klone zeigten ein 3,75 kb umfassendes Insert, zwei Klone zeigten ein 4,1 kb umfassendes Insert, und zwei Klone zeigten ein 4,3 kb umfassendes Insert. Alle Klone ähnlicher Größe wiesen Identische Restriktionskarten auf. Die 3,75 kb und 4,1 kb umfassenden Klone zeigten keine Kreuzhybridisierung. Von den 4,3 kb umfassenden Klonen wurde jedoch festgestellt, daß sie homolog zu den 3,75 kb umfassenden Klonen und auch zu menschlicher genomischer DNA waren. Dies deutet darauf hin, daß diese Klone verbindende Fragmente zwischen menschlicher DNA und integrierten Kopien von HPV 35-DNA enthielten, und sie wurden nicht weiter analysiert. Ein das 3,75 kb umfassende Fragment enthaltender Klon wurde als HPV 35-Klon 1A bezeichnet, und ein das 4,1 kb umfassende Fragment enthaltender Klon wurde als HPV 35-Klon 1B bezeichnet.
  • Die HPV-DNA der HPV 35-Klone 1A und 1B wurde anschließend mit BamHI verdaut und in die einzige BamHI-Stelle von pBR322 subkloniert. Die erhaltenen rekombinanten DNAs wurden als HPV 35-Klone 2A und 2B bezeichnet. Die HPV 35-Klone 2A und 2B wurden bei der American Type Culture Collection unter ATCC Nr. 40330 bzw. ATCC Nr. 40331 hinterlegt.
    • (B) Charakterisierung von HPV 35-DNA 1. Untersuchungen zur Hybridisierung
  • Untersuchungen zur Hybridisierung wurden für DNA der HPV 35- Klone 2A und 28 durchgeführt, um zu zeigen, daß es sich bei den HPV 35-Klonen 2A und 28 um einen neuen HPV-Typ handelt.
  • Genauer gesagt wurde mit ³²P durch Nick-Translation markierte DNA, die aus den HPV 35-Klonen 2A und 28 hergestellt wurde, in einem Southern-Blot unter stringenten Bedingungen an 5,0 ng DNA aus den HPV-Typen 1 bis 34 hybridisiert. DNA der HPV- Typen 1 bis 34 wurde von Dr. Gerard Orth vom Institut Pasteur, Paris, Frankreich, der die Einteilung der HPV-Typen festgelegt hat, und von Dr. Ethel-Michelle de Villiers vom Papilloma-Referenz-Zentrum in Heidelberg, Deutschland, in bereits immobilisierter Form auf Nitrocellulosefiltern erhalten. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 m NaCl, 28 % (Vol./Vol.) Formamid, 50 millimolar N-Tris-TES, 10X Denhardt-Lösung, 0,5 millimolar EDTA und 20 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter stringenten Bedingungen bei 65ºC unter Verwendung von 0,03X SSC (mit einem Gehalt an 0,0045 m NaCl und 0,00045 m Natriumcitrat) in 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Während eine wesentliche Homologie zwischen der rekombinanten DNA der HPV 35-Klone 2A und 28 und den HPV-Typen 2, 3, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 16, 18, 30 und 31 unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen festgestellt wurde, wurde keine Homologie zu irgendeinem der HPV-Typen 1 bis 34 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen beobachtet, was zeigt, daß die HPV 35-Klone 2A und 28 einen neuen HPV-Typ darstellen.
    • 2. Restriktionsendonucleasekarte
  • Die Restriktionsendonucleasekarte für HPV 35 ist in Fig. 1 gezeigt. Die folgenden Restriktionsenzyme schneiden HPV 35- DNA nicht: SalI, XbaI, NcoI und HpaI.
    • 3. Genomorganisation
  • Um zu zeigen, daß das Genom von HPV 35 die gleiche oder eine ähnliche Organisation der offenen Leserahmen wie HPV 6 aufweist, wurden die folgenden Untersuchungen zur Hybridisierung durchgeführt. Gereinigte DNA aus den HPV 35- Klonen 2A und 28 wurde einem Southern-Blot unter Verwendung von Fragmenten von HPV 6-DNA, die durch Nick-Translation mit ³²P markiert waren, als Sonden unter nicht-stringenten Bedingungen und unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Genauer gesagt wurden Fragmente des mit BamHI linearisierten HPV 6b-Klons mit EcoRI und PstI erzeugt, anschließend auf einem Gel gereinigt, mit ³²P durch Nick-Translation markiert und als Sonden bei Southern-Blots verwendet, die folgende Proben enthielten: (a) mit dem Restriktionsenzym PstI verdautes Material der gereinigten BamHI-Fragmente der HPV 35-Klon 2A-DNA oder (b) mit den Restriktionsenzymen PvuII und PstI verdautes Material der gereinigten BamHI-Fragmente der HPV 35-Klon 2B-DNA. Die Ergebnisse, die in Fig. 2 gezeigt sind, zeigen, daß die DNAs der HPV 35-Klone 2A und 28 die gleiche Genomorganisation wie HPV 6 aufweisen.
    • 4. Epidemiologische Verteilung
  • Um zu zeigen, daß aus den HPV 35-Klonen 2A und 2B hergestellte Hybridisierungssonden wirksam unter stringenten Bedingungen nur an HPV 35-DNA hybridisieren, und daß diese Hybridisierungssonden verwendet werden können, um Genitalläsionen nachzuweisen, die HPV 35 enthalten, und diese Genitalläsionen von Genitalläsionen zu unterscheiden, die die DNA anderer HPV-Typen, z.B. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, wurde die DNA einer Reihe zervikaler Biopsieproben und zervikaler Abtupfungen, die abgeschilferte Zellen enthielten, aus Washington, D.C., Hauptstadtbereich (unter Einschluß von Maryland und Virginia) und aus Michigan und den umgebenden Staaten durch Nucleinsäurehybridisierung unter stringenten und nicht-stringenten Bedingungen auf das Vorhandensein spezieller HPV-DNAs unter Verwendung von Sonden, die spezifisch für verschiedene HPV-Typen waren, unter Einschluß von Sonden, die spezifisch für HPV 35 waren, untersucht. Die Biopsieproben wurden halbiert, wobei die eine Hälfte der Proben für die herkömmliche Lichtmikroskopie vorbereitet wurde, während die andere Hälfte für die molekulare Analyse eingefroren und bei -20ºC gelagert wurde. Die Gewebe, für die Southern-Blot-Hybridisierungen durchgeführt wurden, wurden auf einem Cryostaten geschnitten, um Material für die DNA-Extraktion zu erhalten. Ungefähr jeder 15. Schnitt wurde mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und mikroskopisch untersucht, um zu bestätigen, daß diese Gewebeprobe mit dem Anteil der Probe, der durch Lichtmikroskopie untersucht wurde, vergleichbar war. Abgeschilferte zervikale Zellen wurden durch cytologische Standardmethoden, z.8. Ausstriche, bei doppelten Proben untersucht, wobei die andere Probe für die DNA-Analyse verwendet wurde.
  • Hochmolekulare DNA wurde aus den Proben hergestellt, wie vorstehend beschrieben. 1 bis 10 ug der gereinigten zellulären DNA wurden entweder mit PstI oder mit BamHI verdaut, und die verdauten Proben wurden einer Elektrophorese auf 1,0 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Anschließend wurde eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, mit durch Nick-Translation mit ³²P markierten HPV-DNAs aus den vorstehend erläuterten Typen durchgeführt. (Als HPV 35-DNA wurde ein Gemisch von HPV-DNA aus den HPV 35- Klonen 2A und 28 eingesetzt.) Es ist darauf hinzuweisen, daß, da die HPV-DNAs in pBR322 oder verwandten Vektoren vermehrt wurden, alle Sonden elektrophoretisch gereinigt wurden, um den größten Teil der mit dem Vektor verbundenen Sequenzen zu entfernen und die Möglichkeit einer Reaktion mit pBR322 oder verwandten, vektorähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben zu minimieren. Außerdem wurde die Hybridisierung auch in Gegenwart von markiertem pBR322 und verwandten Vektoren durchgeführt, um irgendwelche möglichen falschen positiven Ergebnisse aufgrund der plasmidähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben aufzudecken. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse von Tabelle 1 sind in Fig. 3 graphisch verdeutlicht. Tabelle 1 Verteilung von HPV-Typen in zervikalen Biopsierproben aus Washington, DC, Hauptstadtbereich, und Michigan normales Plattenepithela metaplastisches Plattenepithelb Kondylom Plattenepithel-Carcinom endozervikales Adenocarcinom Gesamtzahl der HPV-positiven Biopsieproben Gesamtzahl der HPV-negativen Biopsieproben Gesamtzahl der Biopsieproben a Diese Biopsieproben stammten aus der Portio des Zervix. b Diese Biopsieproben stammten aus der Transformationszone.
  • Tabelle 1 und Fig. 3 zeigen, daß zervikale Biopsieproben, die HPV 35 enthalten, von Biopsieproben, die andere HPV-Typen, z.B. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, nicht nur durch das Kriterium des Grads der Kreuzhybridisierung in Lösung bei anschließender Hydroxylapatit-Chromatographie, sondern auch durch die Fähigkeit einer HPV 35-DNA-Sonde, spezifisch bestimmte Populationen von Genitalläsionen, d.h. diejenigen, die HPV 35-DNA enthalten, im Vergleich zu denjenigen, die andere HPV-Typen enthalten, nachzuweisen und zu identifizieren, unterschieden werden können. Außerdem zeigen die Ergebnisse in Tabelle 1 und Fig. 3, daß die epidemiologische Verteilung von HPV 35-DNA unter zervikalen Biopsieproben sich von derjenigen unterscheidet, die für einige andere HPV-Typen aufgefunden wird.
    • Beispiel 2 (A) Klonierung von HPV 43-DNA
  • Bei dem eingesetzten Ausgangsmaterial handelte es sich um eine Biopsieprobe einer Vulvahyperkeratose, die aus Michigan erhalten wurde und aus einigen mg Gewebe bestand. Die gesamte DNA wurde gereinigt, wie in: T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982), beschrieben ist. Genauer gesagt wurde das Gewebe zerkleinert und anschließend über Nacht in 1,0 ml 50 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 8,0 mit einem Gehalt an 0,6 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat und 50 g/ml Proteinase K bei 37ºC verdaut. Das erhaltene Material wurde zweimal mit 1,0 ml Phenol:Chloroform (1:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. Die DNA wurde dann aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 2 Volumenteilen 90 %-iges (Vol./Vol.) Ethanol gefällt. Die ausgefällte DNA wurde in einem Puffer mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris, 1,0 millimolar EDTA, pH-Wert: 8,0 (nachstehend "TE-Puffer") mit einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml wieder aufgelöst.
  • Die DNA wurde vollständig mit PstI verdaut und einer Elektrophorese auf 1,0 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen. Die DNA wurde auf Nitrocellulosefilter übertragen, wie es in: E.M. Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S. 503, beschrieben ist. Die Filter wurden anschließend unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-35ºC) und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-10ºC) mit DNA aus den HPV- Typen 6, 11, 16, 18 und 31 als Sonden untersucht. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 43ºC in 1,0 m NaCl, 50 millimolar Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4), 1,0 millimolar EDTA, 2 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat, 0,1 % (Gew./Vol.) Gelatine, 50 ug/ml tRNA und 30 % (Vol./Vol.) Formamid durchgeführt. Es wurde viermal 30 Minuten bei 55ºC in 1,2X SSC (1X SSC bedeutet 0,15 in NaCl plus 0,015 m Natriumcitrat), 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 1,0 millimolar EDTA und 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat gewaschen. Die Hybridisierung wurde mit den HPV-Typen 6, 11, 16, 18 und 31 unter nicht-stringenten Bedingungen, nicht jedoch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen erzielt.
  • Die erhaltene gereinigte DNA und lambda L47 wurden mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut, die ein Fragment von 6,3 kb ergab, oder mit HindIII, die ein Fragment von 2,85 kb ergab, wobei die Summe, d.h. 9,15 kb, größer als das Papillomavirus-Genom ist. Eine Kartierung zeigte, daß die 6,3 kb und 2,85 kb umfassenden Fragmente in einem Bereich von 1,55 kb überlappten. Die Menge an nicht-überlappenden HPV- Sequenzen, die durch die 6,3 kb und 2,85 kb umfassenden Fragmente repräsentiert wird, ist 7,6 kb oder ungefähr 96 % der typischen Größe des HPV-Genoms (7,9 kb). Jedes dieser Fragmente wurde in die einzige BamHI- oder HindIII-Stelle von lambda L47 kloniert. Genauer gesagt wurden 2,0 ug der erhaltenen gereinigten DNA und 2,0 ug lambda L47-DNA mit 10 Einheiten BamHI 1 Stunde mit einem Gesamtvolumen von 50 ul TE-Puffer bei 37ºC geschnitten. Bei einer anderen Reaktion wurden 2,0 ug lambda L47-DNA und 2 ug der gereinigten DNA mit HindIII im einem Gesamtvolumen von 50 ul TE-Puffer 1 Stunde bei 37ºC geschnitten. Die erhaltenen Reaktionsgemische wurden anschließend mit 400 ul TE-Puffer verdünnt und, wie vorstehend beschrieben, Phenolextraktionen mit gleichen Volumina an Phenol:Chloroform unterworfen. Die wäßrigen Phasen wurden anschließend mit Ghloroform:Isoamylalkohol (24:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. DNA aus den wäßrigen Phasen wurde mit 80 %-igem (Vol./Vol.) Ethanol gefällt und getrocknet. Die getrockneten DNAs wurden anschließend jeweils in 10 ul 1X Ligasepuffer mit einem Gehalt an 66 millimolar Tris-HCl, 6,6 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT und 1,0 millimolar ATP suspendiert und 2 Stunden bei 42ºC inkubiert, um den lambda-Armen eine Anellierung zu ermöglichen. Sodann wurden 0,5 ul T4-DNA-Ligase, d.h. etwa eine Einheit, und 0,5 ul 10 millimolar ATP, pH-Wert 7,0 zu jedem Reaktionsgemisch gegeben, und man ließ die Ligation über Nacht bei 12ºC ablaufen.
  • Sodann wurden die Ligationsprodukte unter Bildung infektiöser Phagen verpackt und verwendet, um E. coli NM538 zu infizieren. Genauer gesagt wurde eine einzelne Kolonie von E. coli NM538, die auf einer Agaroseplatte mit einem Gehalt an 10 g Trypton und 5,0 g NaCl pro Liter (nachstehend "TN- Medium") wuchs, ausgewählt und über Nacht bei 37ºC in 20 ml TN-Medium auf einem Schüttler (250 U/min) bis zur frühen stationären Phase gezüchtet. Die Zellkultur wurde dann vierfach mit TN-Medium verdünnt und 3 Stunden gezüchtet. Sodann wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min in einem Sorvall HB-4-Rotor geerntet, und das erhaltene Zellpellet wurde in 0,25 Teilen des ursprünglichen Volumens in 10 millimolar MgSO&sub4; resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
  • Die verpackten infektiösen Phagen wurden unter Verwendung eines handelsüblichen BRL-Lambda-In Vitro-Verpackungssystems hergestellt (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
  • 100 ul einer geeigneten Verdünnung verpackter Phagen in Phagenlagerungspuffer mit einem Gehalt an 0,5 in Tris-HCl (pH- Wert: 8,0), 0,1 in NaCl, 0,01 in MgSO&sub4; und 0,01 % (Gew./Vol.) Gelatine (Difco ), um 1,5 x 10&sup4; Plaques pro Platte mit 9 cm Durchmesser zu erhalten, wurden zu 100 ul der wie vorstehend hergestellten E. coli NM538 in einem 10-15 ml fassenden Teströhrchen gegeben, leicht gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Zell-Phagen- Lösung auf Trypticase-Sojabohnen-Agarplatten mit einem Gehalt an 10 g Trypticase-Sojabohnenbrühe, 5,0 g NaCl und 15 g Agar pro Liter, die mindestens 1 Tag vorher hergestellt und bei 37ºC vorgewärmt worden waren, plattiert. Danach wurden 3 bis 5 ml einer Agarosedeckschicht mit einem Gehalt an 0,5 % Agarose (hochrein, Elektrophorese-Qualität) , gelöst in 10 millimolar MgSO&sub4;, die in einem Mikrowellenofen bis zum Sieden der Lösung erwärmt und anschließend vor der Verwendung auf 45ºC abgekühlt worden war, über die plattierten Zellen-Phagen gegeben. Nachdem sich die Agarose verfestigt hatte, wurden die Platten in einen Inkubator mit Gebläse und guter Zirkulation bei 37ºC für 30 Minuten mit aufgesprungenen DeckeIn der Platten überführt, und anschließend wurden die Deckel geschlossen und die Platten umgedreht. Nach 8 bis 12 Stunden wurden Plaques sichtbar.
  • Die Infektion führte zur konfluenten Lyse der Bakterien auf den Platten. Rekombinante Phagen, die HPV-DNA trugen, wurden durch "Anheben der Plaques", wie von W.D. Benton et al., Science, Bd. 196 (1977) , S. 180, beschrieben, lokalisiert. Genauer gesagt wurden konfluent lysierte Platten 1 Stunde bei 4ºC angeordnet, um die Agarose hart werden zu lassen. Anschließend wurde ein Stück Nitrocellulosefilter geeigneter Größe auf jeder Platte angeordnet, indem es in der Mitte gebogen wurde, der Mittelpunkt der Platte berührt wurde und die Kontaktpunkte hin zum Rand geformt wurden. Anschließend wurden vier asymmetrische Löcher mit einer kleinen Nadel ("gauge needle") durch den Nitrocellulosefilter und den Agar gestanzt, und die Positionen der Löcher wurden auf dem Boden der Platte mit einer dauerhaften Markierung markiert. Dies ermöglichte es, für den Nitrocellulosefilter und beliebige andere Flächen, die positive Signale enthielten, einen Bezug zu den entsprechenden Positionen auf der Platte herzustellen. Nach 10 Minuten wurden die Nitrocellulosefilter entfernt, und die DNA wurde denaturiert, indem die Nitrocellulosefilter mit der Plaqueseite nach oben 1 Minute in einer Schale angeordnet wurden, die 200 ml 0,5 in NaOH, 2,0 in NaCl enthielt. Die Nitrocellulosefilter wurden anschließend durch 5-minütiges Eintauchen in 500 ml 0,5 in Tris-HCl, 2,0 in NaCl, pH-Wert: 7,5 neutralisiert. Sodann wurden die Filter 1 Minute in 6X SSC mit einem Gehalt an 0,9 in NaCl, 0,09 m Natriumcitrat gespült, auf Whatman 3 MM-Papier getrocknet und anschließend 30 Minuten bei 80ºC unter Vakuum einer Wärmebehandlung unterzogen.
  • Danach wurde eine nicht-stringente Hybridisierung unter Verwendung von HPV 16-DNA, die durch "Nick-Translation" mit ³²P markiert worden war, als Sonde mit der aus den angehobenen Plaques isolierten DNA durchgeführt (vgl. P.J.W. Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113 (1977) S. 237 und T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Anschließend wurde gewaschen. Dann wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 in NaCl, 28 % (Vol./Vol') Formamid, 50 millimolar N-Tris- (hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethan-sulfonsäure (nachstehend "TES"), 10X Denhardt-Lösung, 0,1 millimolar EDTA und 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter nicht-stringenten Bedingungen bei 52ºC unter Verwendung von 1,1X SSC (mit einein Gehalt an 0,165 m NaCl und 0,0165 m Natriumcitrat) in 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Entsprechend den Stellen der radioaktiven Exposition wurde eine Region der Platte, die Phagen enthielt, die DNA enthielten, die an HPV 16-DNA hybridisierte, ausgeschnitten und verwendet, um erneut, wie vorstehend beschrieben, E. coli NM538 zu infizieren. Die Lokalisierung von Phagen-Plaques, die HPV-DNA enthielten, wurde durch Wiederholung des vorstehenden Verfahrens durchgeführt. Ein Plaque wurden unter 1,65 x 10&sup5; abgesuchten Plaques aus der Klonierung unter Verwendung der mit BamHI verdauten DNA identifiziert. Das klonierte Fragment wies eine Größe von 6,3 kb auf und wurde als HPV 43-Klon 1A bezeichnet. Ein Plaque wurden unter 9 x 10&sup4; abgesuchten Plaques aus der Klonierung unter Verwendung der mit HindIII verdauten DNA identifiziert. Das klonierte Fragment wies eine Größe von 2,85 kb auf und wurde als HPV 43-Klon 1B bezeichnet.
  • Die HPV-DNA der HPV 43-Klone 1A und 1B wurde anschließend mit BamHI bzw. HindIII verdaut und in die einzige BamHI- oder HindIII-Stelle von pT713 subkloniert. Die erhaltenen rekoinbinanten DNAs wurden als HPV 43-Klone 2A und 28 bezeichnet. Die HPV 43-Klone 2A und 28 wurden bei der American Type Culture Gollection unter ATCC Nr. 40338 bzw. ATCG Nr. 40339 hinterlegt.
    • (B) Charakterisierung von HPV 43-DNA 1. Untersuchungen zur Hybridisierung
  • Untersuchungen zur Hybridisierung wurden für DNA der HPV 43- Klone 2A und 28 durchgeführt, um zu zeigen, daß es sich bei den HPV 43-Klonen 2A und 2B um einen neuen HPV-Typ handelt.
  • Genauer gesagt wurde mit 32P durch Nick-Translation markierte DNA, die aus den HPV 43-Klonen 2A und 2B hergestellt wurde, in einem Southern-Blot unter stringenten Bedingungen an 5,0 ng DNA aus den HPV-Typen 1 bis 42 hybridisiert. DNA der HPV- Typen 1 bis 42 wurde von Dr. Gerard Orth vom Institut Pasteur, Paris, Frankreich, der die Einteilung der HPV-Typen festgelegt hat, von Dr. Ethel-Michelle de Villiers vom Papilloma-Referenz-Zentrum in Heidelberg, Deutschland, und von Life Technologies, Inc., in bereits immobilisierter Form auf Nitrocellulosefiltern erhalten. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 in NaCl, 28 % (Vol./Vol.) Formamid, 50 millimolar N-Tris- TES, 10X Denhardt-Lösung, 0,5 millimolar EDTA und 20 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter stringenten Bedingungen bei 65ºC unter Verwendung von 0,03X SSC (mit einem Gehalt an 0,0045 m NaCl und 0,00045 m Natriumcitrat) in 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Während eine wesentliche Homologie zwischen der rekombinanten DNA der HPV 43-Klone 2A und 2B und den meisten anderen HPV- Typen unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen festgestellt wurde, wurde keine Homologie zu irgendeinem der HPV-Typen 1 bis 42 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen beobachtet, was zeigt, daß die HPV 43-Klone 2A und 28 einen neuen HPV-Typ darstellen.
    • 2. Restriktionsendonucleasekarte
  • Die Restriktionsendonucleasekarte für die HPV 43-Klone 2A und 2B ist in Fig. 4 gezeigt. Die folgenden Restriktionsenzyme schneiden HPV 43-DNA nicht: EcoRI und SalI.
    • 3. Genomorganisation
  • Um zu zeigen, daß das Genom von HPV 43 die gleiche bder eine ähnliche Organisation der offenen Leserahmen wie HPV 6 aufweist, wurden die folgenden Untersuchungen zur Hybridisierung durchgeführt. Gereinigte DNA aus den HPV 43- Klonen 2A und 28 wurde einem Southern-Blot unter Verwendung von Fragmenten von HPV 6-DNA, die durch Nick-Translation mit ³²P markiert waren, als Sonden unter nicht-stringenten Bedingungen und unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Genauer gesagt wurden Fragmente des mit BamHI linearisierten HPV 6b-Klons mit EcoRI und PstI erzeugt, anschließend auf einem Gel gereinigt, mit ³²P durch Nick-Translation markiert und als Sonden bei Southern-Blots verwendet, die folgende Proben enthielten: (a) mit dem Restriktionsenzym PstI verdautes Material der gereinigten BamHI-Fragmente der HPV 43-Klon 2A-DNA oder (b) mit den Restriktionsenzymen PstI verdautes Material der gereinigten Hindlil-Fragmente der HPV 43-Klon 2B-DNA. Die Ergebnisse, die in Fig. 5 gezeigt sind, zeigen, daß die DNAs der HPV 43-Klone 2A und 2B die gleiche Genomorganisation wie HPV 6 aufweisen.
    • 4. Epidemiologische Verteilung
  • Um zu zeigen, daß aus den HPV 43-Klonen 2A und 2B hergestellte Hybridisierungssonden wirksam unter stringenten Bedingungen nur an HPV 43-DNA hybridisieren, und daß diese Hybridisierungssonden verwendet werden können, um Genitalläsionen nachzuweisen, die HPV 43 enthalten, und diese Genitalläsionen von Genitalläsionen zu unterscheiden, die die DNA anderer HPV-Typen, z.B. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, wurde die DNA einer Reihe zervikaler Biopsieproben und zervikaler Abtupfungen, die abgeschilferte Zellen enthielten, aus Washington, D.C., Hauptstadtbereich (unter Einschluß von Maryland und Virginia) und aüs Michigan und den umgebenden Staaten durch Nucleinsäurehybridisierung unter stringenten und nicht-stringenten Bedingungen auf das Vorhandensein spezieller HPV-DNAs unter Verwendung von Sonden, die spezifisch für verschiedene HPV-Typen waren, unter Einschluß von Sonden, die spezifisch für HPV 43 waren, untersucht. Die Biopsieproben wurden halbiert, wobei die eine Hälfte der Proben für die herkömmliche Lichtmikroskopie vorbereitet wurde, während die andere Hälfte für die molekulare Analyse eingefroren und bei -20ºC gelagert wurde. Die Gewebe, für die Southern-Blot-Hybridisierungen durchgeführt wurden, wurden auf einem Gryostaten geschnitten, um Material für die DNA-Extraktion zu erhalten. Ungefähr jeder 15. Schnitt wurde mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und mikroskopisch untersucht, um zu bestätigen, daß diese Gewebeprobe mit dem Anteil der Probe, der durch Lichtmikroskopie untersucht wurde, vergleichbar war. Abgeschilferte zervikale Zellen wurden durch cytologische Standardmethoden, z.B. Ausstriche, bei doppelten Proben untersucht, wobei die andere Probe für die DNA-Analyse verwendet wurde.
  • Hochmolekulare DNA wurde aus den Proben hergestellt, wie vorstehend beschrieben. 1 bis 10 ug der gereinigten zellulären DNA wurden entweder mit PstI oder mit BamHI verdaut, und die verdauten Proben wurden einer Elektrophorese auf 1,0 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Anschließend wurde eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, mit durch Nick-Translation mit ³²P markierten HPV-DNAs aus den vorstehend erläuterten Typen durchgeführt. (Als HPV 43-DNA wurde ein Gemisch von HPV-DNA aus den HPV 43- Klonen 2A und 28 eingesetzt.) Es ist darauf hinzuweisen, daß, da die HPV-DNAs in pT713, pBR322 oder verwandten Vektoren vermehrt wurden, alle Sonden elektrophoretisch gereinigt wurden, um den größten Teil der mit dein Vektor verbundenen Sequenzen zu entfernen und die Möglichkeit einer Reaktion mit pT713, pBR322 oder verwandten, vektorähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben zu miniinieren. Außerdem wurde die Hybridisierung auch in Gegenwart von markiertem pT713, pBR322 und verwandten Vektoren durchgeführt, um irgendwelche möglichen falschen positiven Ergebnisse aufgrund der plasmidähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben aufzudecken. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse von Tabelle 2 sind in Fig. 6 graphisch verdeutlicht. Tabelle 2 Verteilung von HPV-Typen in zervikalen Biopsieproben aus Washington, DC, Hauptstadtbereich, und Michigan normales Plattenepithela metaplastisches Plattenepithelb Kondylom Plattenepithel-Carcinom endozervikales Adenocarcinom Gesamtzahl der HPV-positiven Biopsieproben Gesamtzahl der HPV-negativen Biopsieproben Gesamtzahl der Biopsieproben a Diese Biopsieproben stammten aus der Portio des Zervix. b Diese Biopsieproben stammten aus der Transformationszone.
  • Tabelle 2 und Fig. 6 zeigen, daß zervikale Biopsieproben, die HPV 43 enthalten, von Biopsieproben, die andere HPV-Typen, z.B. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, nicht nur durch das Kriterium des Grads der Kreuzhybridisierung in Lösung bei anschließender Hydroxylapatit-Chromatographie, sondern auch durch die Fähigkeit einer HPV 43-DNA-Sonde, spezifisch bestimmte Populationen von Genitalläsionen, d.h. diejenigen, die HPV 43-DNA enthalten, im Vergleich zu denjenigen, die andere HPV-Typen enthalten, nachzuweisen und zu identifizieren, unterschieden werden können. Außerdem zeigen die Ergebnisse in Tabelle 2 und Fig. 6, daß die epidemiologische Verteilung von HPV 43-DNA unter zervikalen Biopsieproben sich von derjenigen unterscheidet, die für einige andere HPV-Typen aufgefunden wird.
    • Beispiel 3 (A) Klonierung von HPV 44-DNA
  • Bei dem eingesetzten Ausgangsmaterial handelte es sich um eine Biopsieprobe eines Vulvakondyloins, die aus Michigan erhalten wurde und aus einigen mg Gewebe bestand. Die gesamte DNA wurde gereinigt, wie in: T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982), beschrieben ist. Genauer gesagt wurde das Gewebe zerkleinert und anschließend über Nacht in 1,0 ml 50 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 8,0 mit einem Gehalt an 0,6 % (Gew./Vol.) Natriuindodecylsulfat und 50 ug/ml Proteinase K bei 37ºC verdaut. Das erhaltene Material wurde zweimal mit 1,0 inl Phenol:Chloroform (1:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. Die DNA wurde dann aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 2 Volumenteilen 90 %-iges (Vol./Vol.) Ethanol gefällt. Die ausgefällte DNA wurde in einem Puffer mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris, 1,0 millimolar EDTA, pH-Wert: 8,0 (nachstehend "TE-Puffer") mit einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml wieder aufgelöst.
  • Die DNA wurde vollständig mit PstI verdaut und einer Elektrophorese auf 1 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen Die DNA wurde auf Nitrocellulosefilter übertragen, wie es in: E.M. Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S. 503, beschrieben ist. Die Filter wurden anschließend unter nicht- stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-35ºC) und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-10ºC) mit DNA aus den HPV-Typen 6, 11, 16, 18 und 31 als Sonden untersucht. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 43ºC in 1,0 m NaCl, 50 millimolar Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4) , 1,0 millimolar EDTA, 2 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat, 0,1 % (Gew./Vol.) Gelatine, 50 ug/ml tRNA und 30 % (Vol./Vol.) Formamid durchgeführt. Es wurde viermal 30 Minuten bei 55ºC in 1,2X SSC (1X SSC bedeutet 0,15 m NaCl plus 0,015 m Natriumcitrat), 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 1,0 millimolar EDTA und 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat gewaschen. Die Hybridisierung wurde mit den HPV-Typen 6, 11, 16, 18 und 31 unter nicht-stringenten Bedingungen, nicht jedoch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen erzielt.
  • Die erhaltene gereinigte DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut, die ein Fragment von 7,8 kb bildete (die typische Größe für ein Papillomavirus- Genoin). Dieses Fragment wurde in die einzige BamHI-Stelle von lambda L47 kloniert. Genauer gesagt wurden 2,0 ug der erhaltenen gereinigten DNA und 2,0 ug lambda L47-DNA mit 10 Einheiten BamHI 1 Stunde in einem Gesamtvolumen von 50 ul TE- Puffer bei 37ºC geschnitten. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde anschließend mit 400 ul TE-Puffer verdünnt und, wie vorstehend beschrieben, einer Phenolextraktion mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform unterworfen. Die wäßrige Phase wurde anschließend mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. DNA aus der wäßrigen Phase wurde mit 80 %-igem (Vol./Vol.) Ethanol gefällt und getrocknet. Die getrocknete DNA wurde anschließend in 10 ul 1X Ligasepuffer mit einem Gehalt an 66 millimolar Tris-HCl, 6,6 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT und 1,0 millimolar ATP suspendiert und 2 Stunden bei 42ºC inkubiert, um den lambda-Arinen eine Anellierung zu ermöglichen. Sodann wurden 0,5 ul T4-DNA-Ligase, d.h. etwa eine Einheit, und 0,5 ul 10 millimolar ATP, pH-Wert 7,0 zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und man ließ die Ligation über Nacht bei 12ºC ablaufen.
  • Sodann wurden die Ligationsprodukte unter Bildung infektiöser Phagen verpackt und verwendet, um E. coli NM538 zu infizieren. Genauer gesagt wurde eine einzelne Kolonie von E. coli NM538, die auf einer Agaroseplatte mit einem Gehalt an 10 g Trypton und 5,0 g NaCl pro Liter (nachstehend "TN- Medium") wuchs, ausgewählt und über Nacht bei 37ºC in 20 ml TN-Medium auf einem Schüttler (250 U/min) bis zur frühen stationären Phase gezüchtet. Die Zellkultur wurde dann vierfach mit TN-Medium verdünnt und 3 Stunden gezüchtet. Sodann wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min in einem Sorvall HB-4-Rotor geerntet, und das erhaltene Zellpellet wurde in 0,25 Teilen des ursprünglichen Voluinens in 10 millimolar MgSO&sub4; resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
  • Die verpackten infektiösen Phagen wurden unter Verwendung eines handelsüblichen BRL-Lambda-In Vitro-Verpackungssystems hergestellt (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
  • 100 ul einer geeigneten Verdünnung verpackter Phagen in Phagenlagerungspuffer mit einem Gehalt an 0,5 in Tris-HCl (pH- Wert: 8,0), 0,1 m NaCl, 0,01 m MgSO&sub4; und 0,01 % (Gew./Vol.) Gelatine (Difco ), um 1,5 x 10&sup4; Plaques pro Platte mit 9 cm Durchmesser zu erhalten, wurden zu 100 ul der wie vorstehend hergestellten E. coli NM538 in einem 10-15 ml fassenden Teströhrchen gegeben, leicht gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Zell-Phagen- Lösung auf Trypticase-Sojabohnen-Agarplatten mit einem Gehalt an 10 g Trypticase-Sojabohnenbrühe, 5,0 g NaCl und 15 g Agar pro Liter, die mindestens 1 Tag vorher hergestellt und bei 37ºC vorgewärmt worden waren, plattiert. Danach wurden 3 bis 5 ml einer Agarosedeckschicht mit einem Gehalt an 0,5 % Agarose (hochrein, Elektrophorese-Qualität), gelöst in 10 inillimolar MgSO&sub4;, die in einem Mikrowellenofen bis zum Sieden der Lösung erwärmt und anschließend vor der Verwendung auf 45ºC abgekühlt worden war, über die plattierten Zellen-Phagen gegeben. Nachdem sich die Agarose verfestigt hatte, wurden die Platten in einen Inkubator mit Gebläse und guter Zirkulation bei 37ºC für 30 Minuten mit aufgesprungenen Deckeln der Platten überführt, und anschließend wurden die Deckel geschlossen und die Platten umgedreht. Nach 8 bis 12 Stunden wurden Plaques sichtbar.
  • Die Infektion führte zur konfluenten Lyse der Bakterien auf den Platten. Rekombinante Phagen, die HPV-DNA trugen, wurden durch "Anheben der Plaques", wie von W.D. Benton et al., Science, Bd. 196 (1977), 5. 180, beschrieben, lokalisiert. Genauer gesagt wurden konfluent lysierte Platten 1 Stunde bei 4ºC angeordnet, um die Agarose hart werden zu lassen. Anschließend wurde ein Stück Nitrocellulosefilter geeigneter Größe auf jeder Platte angeordnet, indem es in der Mitte gebogen wurde, der Mittelpunkt der Platte berührt wurde und die Kontaktpunkte hin zum Rand geformt wurden. Anschließend wurden vier asymmetrische Löcher mit einer kleinen Nadel ("gauge needle") durch den Nitrocellulosefilter und den Agar gestanzt, und die Positionen der Löcher wurden auf dem Boden der Platte mit einer dauerhaften Markierung markiert. Dies ermöglichte es, für den Nitrocellulosefilter und beliebige andere Flächen, die positive Signale enthielten, einen Bezug zu den entsprechenden Positionen auf der Platte herzustellen. Nach 10 Minuten wurden die Nitrocellulosefilter entfernt, und die DNA wurde denaturiert, indem die Nitrocellulosefilter mit der Plaqueseite nach oben 1 Minute in einer Schale angeordnet wurden, die 200 ml 0,5 m NaOH, 2,0 m NaCl enthielt. Die Nitrocellulosefilter wurden anschließend durch 5-minütiges Eintauchen in 500 ml 0,5 m Tris-HCl, 2,0 m NaCl, pH-Wert: 7,5 neutralisiert. Sodann wurden die Filter 1 Minute in 6X SSC mit einem Gehalt an 0,9 in NaCl, 0,09 m Natriumcitrat gespült, auf Whatman 3 MM-Papier getrocknet und anschließend 30 Minuten bei 80ºC unter Vakuum einer Wärmebehandlung unterzogen.
  • Danach wurde eine nicht-stringente Hybridisierung unter Verwendung von HPV 16-DNA, die durch "Nick-Translation" mit ³²P markiert worden war, als Sonde mit der aus den angehobenen Plaques isolierten DNA durchgeführt (vgl. P.J.W. Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113 (1977) 5. 237 und T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Anschließend wurde gewaschen. Dann wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 m NaCl, 28 % (Vol./Vol.) Formamid, 50 millimolar N-Tris- (hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethan-sulfonsäure (nachstehend "TES"), 10X Denhardt-Lösung, 0,1 millimolar EDTA und 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter nicht-stringenten Bedingungen bei 52ºC unter Verwendung von 1,1X SSC (mit einem Gehalt an 0,165 in NaCl und 0,0165 m Natriumcitrat) in 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Entsprechend den Stellen der radioaktiven Exposition wurde eine Region der Platte, die Phagen enthielt, die DNA enthielten, die an HPV 16-DNA hybridisierte, ausgeschnitten und verwendet, um erneut, wie vorstehend beschrieben, E. coli NM538 zu infizieren. Die Lokalisierung von Phagen-Plaques, die HPV-DNA enthielten, wurde durch Wiederholung des vorstehenden Verfahrens durchgeführt. Sechs Plaques wurden unter 2 x 10&sup5; abgesuchten Plaques identifiziert. Alle Klone wiesen Identische Restriktionskarten auf. Einer der Klone wurde für die weiteren Untersuchüngen ausgewählt und als HPV 44-Klon 1 bezeichnet.
  • Die HPV-DNA des HPV 44-Klons 1 wurde anschließend mit BamHI verdaut und in die einzige BamHI-Stelle von pT713 subkloniert. Die erhaltene rekombinante DNA wurden als HPV 44-Klon 2 bezeichnet. Der HPV 44-Klon 2 wurde bei der American Type Gulture Collection unter ATGC Nr. 40353 hinter legt.
    • (B) Charakterisierung von HPv 44-DNA 1. Untersuchungen zur Hybridisierung
  • Untersuchungen zur Hybridisierung wurden für DNA des HPV 44- Klons 2 durchgeführt, um zu zeigen, daß es sich bei dem HPV 44-Klon 2 um einen neuen HPV-Typ handelt.
  • Genauer gesagt wurde mit ³²P durch Nick-Translation markierte DNA, die aus dem HPV 44-Klon 2 hergestellt wurde, in einem Southern-Blot unter stringenten Bedingungen an 5,0 ng DNA aus den HPV-Typen 1 bis 43 hybridisiert. DNA der HPV-Typen 1 bis 43 wurde von Dr. Gerard Orth vom Institut Pasteur, Paris, Frankreich, der die Einteilung der HPV-Typen festgelegt hat, von Dr. Ethel-Michelle de Viliiers vom Papilloma-Referenz- Zentrum in Heidelberg, Deutschland, und von Life Technologies, Inc., in bereits immobilisierter Form auf Nitrocellulosefiltern erhalten. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 m NaCl, 28 % (Vol./Vol.) Formamid, 50 millimolar N-Tris- TES, 10X Denhardt-Lösung, 0,5 millimolar EDTA und 20 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter stringenten Bedingungen bei 65ºC unter Verwendung von 0,03X SSC (mit einem Gehalt an 0,0045 m NaCl und 0,00045 m Natriumcitrat) in 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Während eine wesentliche Homologie zwischen der rekombinanten DNA des HPV 44-Klons 2 und den meisten der HPV-Typen 1 bis 43 unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen festgestellt wurde, wurde keine Hoinologie zu irgendeinem der HPV-Typen 1 bis 43 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen beobachtet, was zeigt, daß der HPV 44-Klon 2 einen neuen HPV-Typ darstellt.
    • 2. Restriktionsendonucleasekarte
  • Die Restriktionsendonucleasekarte für HPV 44 ist in Fig. 7 gezeigt. Die folgenden Restriktionsenzyme schneiden HPV 44- DNA nicht: BglI, BglII, ClaI, EcoRV, HindIII, NruI, SalI, SphI, SstI und XhoI.
    • 3. Genomorganisation
  • Um zu zeigen, daß das Genom von HPV 44 die gleiche oder eine ähnliche Organisation der offenen Leserahmen wie HPV 6 aufweist, wurden die folgenden Untersuchungen zur Hybridisierung durchgeführt. Gereinigte DNA aus den HPV 44- Klonen 2A und 28 wurde einem Southern-Blot unter Verwendung von Fragmenten von HPV 6-DNA, die durch Nick-Translation mit ³²P markiert waren, als Sonden unter nicht-stringenten Bedingungen und unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Genauer gesagt wurden Fragmente des mit BamHI linearisierten HPV 6b-Klons mit EcoRI und PstI erzeugt, anschließend auf einem Gel gereinigt, mit 32P durch Nick-Translation markiert und als Sonden bei Southern-Blots verwendet, die mit dem Restriktionsenzym Ncol verdautes Material des gereinigten BamHI-Fragments der HPV 44-Klon 2- DNA enthielten. Die Ergebnisse, die in Fig. 8 gezeigt sind, zeigen, daß die DNA des HPV 44-Klons 2 die gleiche Genomorganisation wie HPV 6 aufweist.
    • 4. Epidemiologische Verteilung
  • Um zu zeigen, daß aus dem HPV 44-Klon 2 hergestellte Hybridisierungssonden wirksam unter stringenten Bedingungen nur an HPV 44-DNA hybridisieren, und daß diese Hybridisierungssonden verwendet werden können, um Genitalläsionen nachzuweisen, die HPV 44 enthalten, und diese Genitalläsionen von Genitalläsionen zu unterscheiden, die die DNA anderer HPV-Typen, z.B. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, wurde die DNA einer Reihe zervikaler Biopsieproben und zervikaler Abtupfungen, die abgeschilferte Zellen enthielten, aus Washington, D.C., Hauptstadtbereich (unter Einschluß von Maryland und Virginia) und aus Michigan und den umgebenden Staaten durch Nucleinsäurehybridisierung unter stringenten und nicht-stringenten Bedingungen auf das Vorhandensein spezieller HPV-DNAs unter Verwendung von Sonden, die spezifisch für verschiedene HPV-Typen waren, unter Einschluß von Sonden, die spezifisch für HPV 44 waren, untersucht. Die Biopsieproben wurden halbiert, wobei die eine Hälfte der Proben für die herkömmliche Lichtmikroskopie vorbereitet wurde, während die andere Hälfte für die molekulare Analyse eingefroren und bei -20ºC gelagert wurde. Die Gewebe, für die Southern-Blot-Hybridisierungen durchgeführt wurden, wurden auf einem Cryostaten geschnitten, um Material für die DNA-Extraktion zu erhalten. Ungefähr jeder 15. Schnitt wurde mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und mikroskopisch untersucht, um zu bestätigen, daß diese Gewebeprobe mit dem Anteil der Probe, der durch Lichtmikroskopie untersucht wurde, vergleichbar war. Abgeschilferte zervikale Zellen wurden durch cytologische Standardmethoden, z.B. Ausstriche, bei doppelten Proben untersucht, wobei die andere Probe für die DNA-Analyse verwendet wurde.
  • Hochmolekulare DNA wurde aus den Proben hergestellt, wie vorstehend beschrieben. 1 bis 10 ug der gereinigten zellulären DNA wurden entweder mit PstI oder mit BamHI verdaut, und die verdauten Proben wurden einer Elektrophorese auf 1,0 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Anschließend wurde eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, mit durch Nick-Translation mit ³²P markierten HPV-DNAs aus den vorstehend erläuterten Typen durchgeführt. Es ist darauf hinzuweisen, daß, da die HPV-DNAs in pT713 oder verwandten Vektoren vermehrt wurden, alle Sonden elektrophoretisch gereinigt wurden, um den größten Teil der mit dem Vektor verbundenen Sequenzen zu entfernen und die Möglichkeit einer Reaktion mit pT713 oder verwandten, vektorähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben zu minimieren. Außerdem wurde die Hybridisierung auch in Gegenwart von markiertein pT713 oder pBR322 und verwandten Vektoren durchgeführt, um irgendwelche möglichen falschen positiven Ergebnisse aufgrund der plasmidähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben aufzudecken. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse von Tabelle sind in Fig. 9 graphisch verdeutlicht. Tabelle 3 Verteilung von HPV-Typen in zervikalen Biopsieproben aus Washington, DC, Hauptstadtbereich, und Michigan normales Plattenepithela metaplastisches Plattenepithelb Kondylom Plattenepithel-Carcinom endozervikales Adenocarcinom Gesamtzahl der HPV-positiven Biopsieproben Gesamtzahl der HPV-negativen Biopsieproben Gesamtzahl der Biopsieproben a Diese Biopsieproben stammten aus der Portio des Zervix. b Diese Biopsieproben stammten aus der Transformationszone.
  • Tabelle 3 und Fig. 9 zeigen, daß zervikale Biopsieproben, dIe HPV 44 enthalten, von Biopsieproben, die andere HPV-Typen, z.B. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, nicht nur durch das Kriterium des Grads der Kreuzhybridisierung in Lösung bei anschließender Hydroxylapatit-Chromatographie, sondern auch durch die Fähigkeit einer HPV 44-DNA-Sonde, spezifisch bestimmte Populationen von Genitalläsionen, d.h. diejenigen, die HPV 44-DNA enthalten, im Vergleich zu denjenigen, die andere HPV-Typen enthalten, nachzuweisen und zu identifizieren, unterschieden werden können. Außerdem zeigen die Ergebnisse in Tabelle 3 und Fig. 9, daß die epidemiologische Verteilung von HPV 44-DNA unter zervikalen Biopsieproben sich von derjenigen unterscheidet, die für einige andere HPV-Typen aufgefunden wird.
    • Beispiel 4 (A) Klonierung von HPV 56-DNA
  • Bei dem eingesetzten Ausgangsmaterial handelte es sich um eine Biopsieprobe eines Vulvakondyloms, die aus Washington, D.G., Hauptstadtbereich, erhalten wurde und aus einigen mg Gewebe bestand. Die gesamte DNA wurde gereinigt, wie in: T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982), beschrieben ist. Genauer gesagt wurde das Gewebe zerkleinert und anschließend über Nacht in 1,0 ml 50 inillimolar Tris-HCl, pH-Wert: 8,0 mit einem Gehalt an 0,6 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat und 50 ug/ml Proteinase K bei 37ºC verdaut. Das erhaltene Material wurde zweimal mit 1,0 ml Phenol:Chloroform (1:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. Die DNA wurde dann aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 2 Volumenteilen 90 %-iges (Vol./Vol.) Ethanol gefällt. Die ausgefällte DNA wurde in einem Puffer mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris, 1,0 millimolar EDTA, pH-Wert: 8,0 (nachstehend "TE-Puffer") mit einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml wieder aufgelöst.
  • Die DNA wurde vollständig mit PstI verdaut und einer Elektrophorese auf 1,0 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen. Die DNA wurde auf Nitrocellulosefilter übertragen, wie es in: E.M. Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S. 503, beschrieben ist. Die Filter wurden anschließend unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-35ºC) und unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (Tm-10ºC) mit DNA aus den HPV- Typen 6, 11, 16, 18 und 31 als Sonden untersucht. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 43ºC in 1,0 m NaCl, 50 millimolar Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4), 1,0 millimolar EDTA, 2 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat, 0,1 % (Gew./Vol.) Gelatine, 50 ug/ml tRNA und 30 % (Vol./Vol.) Formamid durchgeführt. Es wurde viermal 30 Minuten bei 55ºC in 1,2X SSC (1X SSC bedeutet 0,15 m NaCl plus 0,015 m Natriumcitrat), 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 1,0 millimolar EDTA und 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat gewaschen. Die Hybridisierung wurde mit den HPV-Typen 6, 11, 16, 18 und 31 unter nicht-stringenten Bedingungen, nicht jedoch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen erzielt.
  • Ein Teil der erhaltenen gereinigten DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease EcoRI verdaut, die ein Fragment von 5,1 kb ergab (das ungefähr 65 % der typischen Größe eines Papillomavirus-Genoms darstellt). Dieses Fragmente wurde in die einzige EcoRI-Stelle von lambda L47 kloniert. Ein anderer Teil der erhaltenen gereinigten DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut, die ein Fragment von 5,9 kb ergab (das ungefähr 75 % der typischen Größe eines Papilloinavirus-Genoms darstellt). Dieses Fragmente wurde in die einzige BamHI-Stelle von lambda L47 kloniert. Genauer gesagt wurden 2,0 ug der erhaltenen gereinigten DNAs und 2,0 g lambda L47-DNA mit 10 Einheiten EcoRI oder 10 Einheiten BamHI 1 Stunde mit einem Gesamtvolumen von 50 ul TE-Puffer bei 37ºC geschnitten. Die erhaltenen Reaktionsgemische wurden anschließend mit 400 ul TE-Puffer verdünnt und, wie vorstehend beschrieben, Phenolextraktionen mit gleichen Volumina an Phenol:Chloroform unterworfen. Die wäßrigen Phasen wurden anschließend mit Ghloroforin:Isoamylalkohol (24:1 (Vol./Vol.)) extrahiert. DNA aus den wäßrigen Phasen wurde mit 80 %-igem (Vol./Vol.) Ethanol gefällt und getrocknet. Die getrockneten DNAs wurden anschließend jeweils in 10 ul 1X Ligasepuffer mit einem Gehalt an 66 millimolar Tris-HCl, 6,6 millimolar MgCl&sub2;, 10 millimolar DTT und 1,0 millimolar ATP suspendiert und 2 Stunden bei 42ºC inkubiert, um den lambda-Armen eine Anellierung zu ermöglichen. Sodann wurden 0,5 ul T4-DNA-Ligase, d.h. etwa eine Einheit, und 0,5 ul 10 millimolar ATP, pH-Wert 7,0 zu den Reaktionslösungen gegeben, und man ließ die Ligation über Nacht bei 12ºC ablaufen.
  • Sodann wurden die Ligationsprodukte unter Bildung infektiöser Phagen verpackt und verwendet, um E. coli NM538 zu infizieren. Genauer gesagt wurde eine einzelne Kolonie von E. coli NM538, die auf einer Agaroseplatte mit einem Gehalt an 10 g Trypton und 5,0 g NaCl pro Liter (nachstehend "TN- Medium") wuchs, ausgewählt und über Nacht bei 37ºC in 20 ml TN-Medium auf einem Schüttler (250 U/min) bis zur frühen stationären Phase gezüchtet. Die Zellkultur wurde dann vierfach mit TN-Mediuin verdünnt und 3 Stunden gezüchtet. Sodann wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min in einem Sorvall HB-4-Rotor geerntet, und das erhaltene Zellpellet wurde in 0,25 Teilen des ursprünglicher Volumens in 10 millimolar MgSO&sub4; resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
  • Die verpackten infektiösen Phagen wurden unter Verwendung eines handelsüblichen BRL-Lambda-In Vitro-Verpackungssystems hergestellt (vgl. T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
  • 100 ul einer geeigneten Verdünnung verpackter Phagen in Phagenlagerungspuffer mit einem Gehalt an 0,5 m Tris-HCl (pH- Wert: 8,0), 0,1 m NaCl, 0,01 m MgSO&sub4; und 0,01 % (Gew./Vol.) Gelatine (Difco ), um 1,5 x 10&sup4; Plaques pro Platte mit 9 cm Durchmesser zu erhalten, wurden zu 100 ul der wie vorstehend hergestellten E. coli NM538 in einem 10-15 ml fassenden Teströhrchen gegeben, leicht gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Zell-Phagen- Lösung auf Trypticase-Sojabohnen-Agarplatten mit einem Gehalt an 10 g Trypticase-Sojabohnenbrühe, 5,0 g NaCl und 15 g Agar pro Liter, die mindestens 1 Tag vorher hergestellt und bei 37ºC vorgewärint worden waren, plattiert. Danach wurden 3 bis 5 ml einer Agarosedeckschicht mit einem Gehalt an 0,5 % Agarose (hochrein, Elektrophorese-Qualität), gelöst in 10 millimolar MgSO&sub4;, die in einem Mikrowellenofen bis zum Sieden der Lösung erwärmt und anschließend vor der Verwendung auf 45ºC abgekühlt worden war, über die plattierten Zellen-Phagen gegeben. Nachdem sich die Agarose verfestigt hatte, wurden die Platten in einen Inkubator mit Gebläse und guter Zirkulation bei 37ºC für 30 Minuten mit aufgesprungenen Deckeln der Platten überführt, und anschließend wurden die Deckel geschlossen und die Platten umgedreht. Nach 8 bis 12 Stunden wurden Plaques sichtbar.
  • Die Infektion führte zur konf Iuenten Lyse der Bakterien auf den Platten. Rekombinante Phagen, die HPV-DNA trugen, wurden durch "Anheben der Plaques", wie von W.D. Benton et al., Science, Bd. 196 (1977), S. 180, beschrieben, lokalisiert. Genauer gesagt wurden konfluent lysierte Platten 1 Stunde bei 4ºC angeordnet, um die Agarose hart werden zu lassen. Anschließend wurde ein Stück Nitrocellulosefilter geeigneter Größe auf jeder Platte angeordnet, indem es in der Mitte gebogen wurde, der Mittelpunkt der Platte berührt wurde und die Kontaktpunkte hin zum Rand geformt wurden. Anschließend wurden vier asymmetrische Löcher mit einer kleinen Nadel ("gauge needle") durch den Nitrocellulosefilter und den Agar gestanzt, und die Positionen der Löcher wurden auf dem Boden der Platte mit einer dauerhaften Markierung markiert. Dies ermöglichte es, für den Nitrocellulosefilter und beliebige andere Flächen, die positive Signale enthielten, einen Bezug zu den entsprechenden Positionen auf der Platte herzustellen. Nach 10 Minuten wurden die Nitrocellulosefilter entfernt, und die DNA wurde denaturiert, indem die Nitrocellulosefilter mit der Plaqueseite nach oben 1 Minute in einer Schale angeordnet wurden, die 200 ml 0,5 m NaOH, 2,0 m NaCl enthielt. Die Nitrocellulosefilter wurden anschließend durch 5-minütiges Eintauchen in 500 ml 0,5 m Tris-HCl, 2,0 m NaCl, pH-Wert: 7,5 neutralisiert. Sodann wurden die Filter 1 Minute in 6X SSC mit einem Gehalt an 0,9 m NaCl, 0,09 m Natriumcitrat gespült, auf Whatman 3 MM-Papier getrocknet und anschließend 30 Minuten bei 80ºC unter Vakuum einer Wärmebehandlung unterzogen.
  • Danach wurde eine nicht-stringente Hybridisierung unter Verwendung von HPV 16-DNA, die durch "Nick-Translation" mit 32P markiert worden war, als Sonde mit der aus den angehobenen Plaques isolierten DNA durchgeführt (vgl. P.J.W. Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113 (1977) S. 237 und T. Maniatis et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Anschließend wurde gewaschen. Dann wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 m NaCl, 28 % (Vol./Vol.) Formamid, 50 millimolar N-Tris- (hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethan-sulfonsäure (nachstehend "TES"), 10X Denhardt-Lösung, 0,1 millimolar EDTA und 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter nicht-stringenten Bedingungen bei 52ºC unter Verwendung von 1,1X SSC (mit einem Gehalt an 0,165 m NaCl und 0,0165 m Natriumcitrat) in 10 milllmolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Entsprechend den Stellen der radioaktiven Exposition wurde eine Region der Platte, die Phagen enthielt, die DNA enthielten, die an HPV 16-DNA hybridisierte, ausgeschnitten und verwendet, um erneut, wie vorstehend beschrieben, E. coli NM538 zu infizieren. Die Lokalisierung von Phagen-Plaques, die HPV-DNA enthielten, wurde durch Wiederholung des vorstehenden Verfahrens durchgeführt. Zwei Plaques wurden unter 1,3 x 10&sup5; abgesuchten Plaques aus der Klonierung unter Verwendung der mit EcoRI verdauten DNA identifiziert. Beide Klone wiesen Identische Restriktionskarten auf. Einer der Klone wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt und als HPV 56-Klon 1A bezeichnet. Ein Plaque wurden unter 5 x 10&sup4; abgesuchten Plaques aus der Klonierung unter Verwendung der mit BamHI verdauten DNA identifiziert und als HPV 56-Klon 1B bezeichnet.
  • Die HPV-DNA der HPV 56-Klone 1A und 1B wurde anschließend mit EcoRI bzw. BamHI verdaut und in die einzige EcoRI- oder BamHI-Stelle von pT713 subkloniert. Die erhaltenen rekombinanten DNAs wurden als HPV 56-Klone 2A und 2B bezeichnet. Die HPV 56-Klone 2A und 28 wurden bei der American Type Culture Collection unter ATCC Nr. 40341 bzw. ATCC Nr. 40379 hinterlegt.
    • (B) Charakterisierung von HPV 56-DNA 1. Untersuchungen zur Hybridisierung
  • Untersuchungen zur Hybridisierung wurden für DNA der HPV 56- Klone 2A und 28 durchgeführt, um zu zeigen, daß es sich bei den HPV 56-Klonen 2A und 2B um einen neuen HPV-Typ handelt.
  • Genauer gesagt wurde mit ³²P durch Nick-Translation markierte DNA, die aus den HPV 56-Klonen 2A und 28 hergestellt wurde, in einem Southern-Blot unter stringenten Bedingungen an 5,0 ng DNA aus den HPV-Typen 1 bis 45 hybridisiert. DNA der HPV- Typen 1 bis 45 wurde von Dr. Gerard Orth vom Institut Pasteur, Paris, Frankreich, der die Einteilung der HPV-Typen festgelegt hat, von Dr. Ethel-Michelle de Villiers vom Papilloma-Referenz-Zentrum in Heidelberg, Deutschland, und von Life Technologies, Inc., in bereits immobilisierter Form auf Nitrocellulosefiltern erhalten. Genauer gesagt wurde die Hybridisierung bei 41ºC in einer Lösung mit einem Gehalt an 1,0 m NaCl, 28 % (Vol./Vol.) Formamid, 50 millimolar N-Tris- TES, 10X Denhardt-Lösung, 0,5 millimolar EDTA und 20 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4) durchgeführt. Anschließend wurde unter stringenten Bedingungen bei 65ºC unter Verwendung von 0,03X SSC (mit einem Gehalt an 0,0045 m NaCl und 0,00045 m Natriumcitrat) in 10 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert: 7,4), 0,1 millimolar EDTA gewaschen.
  • Während eine wesentliche Homologie zwischen der rekombinanten DNA der HPV 56-Klone 2A und 28 und den meisten der HPV-Typen 1 bis 45 unter nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen festgestellt wurde, wurde keine Homologie zu irgendeinem der HPV-Typen 1 bis 45 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen beobachtet, was zeigt, daß die HPV 56-Klone 2A und 28 einen neuen HPV-Typ darstellen.
    • 2. Restriktionsendonucleasekarte
  • Die Restriktionsendonucleasekarte für die HPV 56-Klone 2A und 2B ist in Fig. 4 gezeigt. Die folgenden Restriktionsenzyme schneiden HPV 56-DNA nicht: BglII, NcoI, HindIII, SalI, SstI und XbaI.
    • 3. Genomorganisation
  • Um zu zeigen, daß das Genom von HPV 56 die gleiche oder eine ähnliche Organisation der offenen Leserahinen wie HPV 6 aufweist, wurden die folgenden Untersuchungen zur Hybridisierung durchgeführt. Gereinigte DNA aus den HPV 56- Klonen 2A und 28 wurde einem Southern-Blot unter Verwendung von Fragmenten von HPV 6-DNA, die durch Nick-Translation mit ³²P markiert waren, als Sonden unter nicht-stringenten Bedingungen und unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Genauer gesagt wurden Fragmente des mit BamHI Iinearisierten HPV 6b-Klons mit EcoRI und PstI erzeugt, anschließend auf einem Gel gereinigt, mit 32P durch Nick-Translation markiert und als Sonden bei Southern-Blots verwendet, die mit den Restriktionsenzymen BamHI plus EcoRV verdautes Material des gereinigten EcoRI-Fragments der HPV 56-Klon 2A-DNA und mit den Restriktionsenzymen EcoRI plus EcoRV verdautes Material des gereinigten BamHI-Fragments der HPV 56-Klon 28-DNA enthielten. Die Ergebnisse, die in Fig.11 gezeigt sind, zeigen, daß die DNAs der HPV 56-Klone 2A und 28 die gleiche Genomorganisation wie HPV 6 aufweisen.
    • 4. Epidemiologische Verteilung
  • Um zu zeigen, daß aus den HPV 56-Klonen 2A und 28 hergestellte Hybridisierungssonden wirksam unter stringenten Bedingungen nur an HPV 56-DNA hybridisieren, und daß diese Hybridisierungssonden verwendet werden können, um Genitalläsionen nachzuweisen, die HPV 56 enthalten, und diese Genitalläsionen von Genitalläsionen zu unterscheiden, die die DNA anderer HPV-Typen, z.B. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, wurde die DNA einer Reihe zervikaler Biopsieproben und zervikaler Abtupfungen, die abgeschilferte Zellen enthielten, aus Washington, D.C., Hauptstadtbereich (unter Einschluß von Maryland und Virginia) und aus Michigan und den umgebenden Staaten durch Nucleinsäurehybridisierung unter stringenten und nicht-stringenten Bedingungen auf das Vorhandensein spezieller HPV-DNAs unter Verwendung von Sonden, die spezifisch für verschiedene HPV-Typen waren, unter Einschluß von Sonden, die spezifisch für HPV 56 waren, untersucht. Die Biopsieproben wurden halbiert, wobei die eine Hälfte der Proben für die herkömmliche Lichtmikroskopie vorbereitet wurde, während die andere Hälfte für die molekulare Analyse eingefroren und bei -20ºC gelagert wurde. Die Gewebe, für die Southern-Blot-Hybridisierungen durchgeführt wurden, wurden auf einem Gryostaten geschnitten, um Material für die DNA-Extraktion zu erhalten. Ungefähr jeder 15. Schnitt wurde mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und mikroskopisch untersucht, um zu bestätigen, daß diese Gewebeprobe mit dein Anteil der Probe, der durch Lichtmikroskopie untersucht wurde, vergleichbar war. Abgeschilferte zervikale Zellen wurden durch cytologische Standardmethoden, z.B. Ausstriche, bei doppelten Proben untersucht, wobei die andere Probe für die DNA-Analyse verwendet wurde.
  • Hochmolekulare DNA wurde aus den Proben hergestellt, wie vorstehend beschrieben. 1 bis 10 ug der gereinigten zellulären DNA wurden entweder mit PstI oder mit BamHI verdaut, und die verdauten Proben wurden einer Elektrophorese auf 1,0 % (Gew./Vol.) Agarosegelen unterworfen und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Anschließend wurde eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, mit durch Nick-Translation mit ³²P markierten HPV-DNAs aus den vorstehend erläuterten Typen durchgeführt. (Als HPV 56-DNA wurde ein Gemisch von HPV-DNA aus den HPV 56- Klonen 2A und 28 eingesetzt.) Es ist darauf hinzuweisen, daß, da die HPV-DNAs in pT713 oder verwandten Vektoren vermehrt wurden, alle Sonden elektrophoretisch gereinigt wurden, um den größten Teil der mit dein Vektor verbundenen Sequenzen zu entfernen und die Möglichkeit einer Reaktion mit pT713 oder verwandten, vektorähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben zu miniinieren. Außerdem wurde die Hybridisierung auch in Gegenwart von markiertem pT713, oder pBR322 und verwandten Vektoren durchgeführt, um irgendwelche möglichen falschen positiven Ergebnisse aufgrund der plasmidähnlichen Sequenzen in den Gewebeproben aufzudecken. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 gezeigt. Die Ergebnisse von Tabelle 4 sind in Fig. 12 graphisch verdeutlicht. Tabelle 4 Verteilung von HPV-Typen in zervikalen Biopsieproben aus Washington, DC, Hauptstadtbereich, und Michigan normales Plattenepithela metaplastisches Plattenepithelb Kondylom Plattenepithel-Carcinom endozervikales Adenocarcinom Gesamtzahl der HPV-positiven Biopsieproben Gesamtzahl der HPV-negativen Biopsieproben Gesamtzahl der Biopsieproben a Diese Biopsieproben stammten aus der Portio des Zervix. b Diese Biopsieproben stammten aus der Transformationszone.
  • Tabelle 4 und Fig. 12 zeigen, daß zervikale Biopsieproben, die HPV 56 enthalten, von Biopsieproben, die andere HPV- Typen, z.8. 6, 11, 16, 18, 31 oder 33 enthalten, nicht nur durch das Kriterium des Grads der Kreuzhybridisierung in Lösung bei anschließender Hydroxylapatit-Chromatographie, sondern auch durch die Fähigkeit einer HPV 56-DNA-Sonde, spezifisch bestimmte Populationen von Genitalläsionen, d.h. diejenigen, die HPV 56-DNA enthalten, im Vergleich zu denjenigen, die andere HPV-Typen enthalten, nachzuweisen und zu identifizieren, unterschieden werden können. Außerdem zeigen die Ergebnisse in Tabelle 4 und Fig. 12, daß die epidemiologische Verteilung von HPV 56-DNA unter zervika1en Biopsieproben sich von derjenigen unterscheidet, die für einige andere HPV-Typen aufgefunden wird.

Claims (82)

1. Rekombinante DNA von HPV 35, HPV 43, HPV 44 oder HPV 56, umfassend einen Klonierungsvektor und HPV 35-DNA oder Fragmente davon; HPV 43-DNA oder Fragmente davon; HPV 44- DNA oder Fragmente davon; bzw. HPV 56-DNA oder Fragmente davon.
2. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, wobei der Klonierungsvektor aus der aus pBR322, pUC11, lambda charon, lambda L47, aus M13 abgeleiteten Bakteriophagen, pZIP-Neo SV [X1], pBKTK-1, pT712 und pT713 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
3. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basenpaaren aufweisen.
4. Rekombinante DNA nach Anspruch 3, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basenpaaren aufweisen.
5. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, wobei die rekombinante DNA die identifizierenden Merkmale der HPV 35-Klone 2A und 2B (ATCC Nr. 40330 bzw. ATCC Nr. 40331); der HPV 43- Klone 2A und 2B (ATCC Nr. 40338 bzw. ATCC Nr. 40339); des HPV 44-Klons 2 (ATCC Nr. 40353) oder der HPV 56-Klone 2A und 2B (ATCC Nr. 40341 bzw. ATCC Nr. 40379) aufweist.
6. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, wobei die HPV-DNA der rekombinanten DNA mit einem Marker markiert ist.
7. Rekombinante DNA nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt.
8. Rekombinante DNA nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt, der aus der aus ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
9. Rekombinante DNA nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Marker um einen nicht-radioaktiven Marker handelt, der aus der aus Biotin, einem Enzym und einem fluoreszierenden Molekül bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
10. Rekombinante DNA nach Anspruch 9, wobei das Enzym aus der aus alkalischer Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
11. Rekombinante DNA nach Anspruch 9, wobei das fluoreszierende Molekül aus der aus Fluoreszein und Rhodamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
12. Reine HPV 35-DNA oder Fragmente davon; reine HPV 43-DNA oder Fragmente davon; reine HPV 44-DNA oder Fragmente davon; bzw. reine HPV 56-DNA oder Fragmente davon.
13. Reine HPV-DNA nach Anspruch 12, wobei die HPV-DNA oder Fragmente davon biologisch hergestellt wurden.
14. Reine HPV-DNA nach Anspruch 12, wobei die HPV-DNA oder Fragmente davon chemisch hergestellt wurden.
15. Reine HPV-DNA nach Anspruch 12, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
16. Reine HPV-DNA nach Anspruch 15, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
17. Reine HPV 35-RNA oder Fragmente davon; reine HPV 43-RNA oder Fragmente davon; reine HPV 44-RNA oder Fragmente davon; oder reine HPV 56-RNA oder Fragmente davon.
18. Reine HPV-RNA nach Anspruch 17, wobei die HPV-RNA oder Fragmente davon biologisch hergestellt wurden.
19. Reine HPV-RNA nach Anspruch 17, wobei die HPV-RNA oder Fragmente davon chemisch hergestellt wurden.
20. Reine HPV-RNA nach Anspruch 17, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
21. Reine HPV-RNA nach Anspruch 20, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
22. HPV-Hybridisierungssonde, umfassend ein Mitglied der aus (i) mit einem Marker markierter HPV 35-DNA oder Fragmenten davon; (ii) mit einem Marker markierter HPV 35-RNA oder Fragmenten davon; (iii) mit einem Marker markierter HPV 43-DNA oder Fragmenten davon; (iv) mit einem Marker markierter HPV 43-RNA oder Fragmenten davon; (v) mit einem Marker markierter HPV 44-DNA oder Fragmenten davon; (vi) mit einem Marker markierter HPV 44-RNA oder Fragmenten davon; (vii) mit einem Marker markierter HPV 56-DNA oder Fragmenten davon und (viii) mit einem Marker markierter HPV 56-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe.
23. HPV-Hybridisierungssonde nach Anspruch 22, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
24. HPV-Hybridisierungssonde nach Anspruch 23, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
25. HPV-Hybridisierungssonde nach Anspruch 22, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt.
26. HPV-Hybridisierungssonde nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt, der aus der aus ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
27. HPV-Hybridisierungssonde nach Anspruch 22, wobei es sich bei dem Marker um einen nicht-radioaktiven Marker handelt, der aus der aus Biotin, einem Enzym und einem fluoreszierenden Molekül bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
28. HPV-Hybridisierungssonde nach Anspruch 27, wobei das Enzym aus der aus alkalischer Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
29. HPV-Hybridisierungssonde nach Anspruch 27, wobei das fluoreszierende Molekül aus der aus Fluoreszein und Rhodamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
30. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung, umfassend
(a) ein Mitglied aus der aus (I) mit einem Marker markierter HPV 35-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 35-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe und
(b) mit einem Marker markierte DNA oder RNA oder Fragmente davon mindestens eines anderen HPV-Typs; oder
(a') ein Mitglied aus der aus (i) mit einem Marker markierter HPV 43-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 43-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe und
(b') mit einem Marker markierte DNA oder RNA oder Fragmente davon mindestens eines anderen HPV-Typs; oder
(a") ein Mitglied aus der aus (i) mit einem Marker markierter HPV 44-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 44-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe und
(b") mit einem Marker markierte DNA oder RNA oder Fragmente davon mindestens eines anderen HPV-Typs; oder
(a"') ein Mitglied aus der aus (i) mit einem Marker markierter HPV 35-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 35-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe und
(b"') mit einem Marker markierte DNA oder RNA oder Fragmente davon mindestens eines anderen HPV-Typs.
31. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
32. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
33. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt.
34. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt, der aus der aus ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
35. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem Marker um einen nicht- radioaktiven Marker handelt, der aus der aus Biotin, einem Enzym und einem fluoreszierenden Molekül bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
36. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei das Enzym aus der aus alkalischer Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
37. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei das fluoreszierende Molekül aus der aus Fluoreszein und Rhodamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
38. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem anderen HPV-Typ um mindestens ein Mitglied der aus HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18 und HPV 31 bestehenden Gruppe handelt.
39. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 38, wobei es sich bei dein anderen HPV-Typ um mindestens ein Mitglied der aus HPV 16, HPV 18 und HPV 31 bestehenden Gruppe handelt.
40. HPV-Hybridisierungssonden-Zusammensetzung nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem anderen HPV-Typ um HPV 16, HPV 18 und HPV 31 handelt.
41. Verfahren zum Nachweis von HPV-DNA oder -RNA, umfassend:
(1) Ausführung einer Hybridisierung unter nicht- stringenten Bedingungen mit
(a) einem aus der folgenden Gruppe ausgewählten Mitglied:
(i) mit einem Marker markierte HPV 35-DNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 43-DNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 44-DNA oder Fragmente davon; oder mit einem Marker markierte HPV 56-DNA oder Fragmente davon und
(ii) mit einem Marker markierte HPV 35-RNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 43-RNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 44-RNA oder Fragmente davon; oder mit einem Marker markierte HPV 56-RNA oder Fragmente davon,
(b) und einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, und
(2) Untersuchung auf das Auftreten von Kreuzhybridisierung, um HPV-DNA oder -RNA in der Probe nachzuweisen.
42. Verfahren nach Anspruch ul, wobei die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus einer Genitalläsion, einer Läsion der Kehle, einer oralen Läsion oder einer Hautläsion stammt.
43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus einer Genitalläsion stammt.
44. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die unbekannte Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, durch Biopsie einer Epithelläsion, Ausschaben des Zervix oder Abtupfen des Zervix, um abgeschilferte Zellen zu erhalten, erhalten wird oder es sich um DNA handelt, die aus einer Genitalläsion stammt und in einen Klonierungsvektor kloniert worden ist.
45. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
47. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Hybridisierung auch mit
(c) mindestens einem der folgenden Bestandteile durchgeführt wird: einem Mitglied aus der aus (i) mit einem Marker inarkierter HPV 6-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 6-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe; einem Mitglied aus der aus (i) mit einem Marker inarkierter HPV 11-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 11-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe; einem Mitglied aus der aus mit einem Marker inarkierter HPV 16-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 16-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe; und einem Mitglied aus der aus (i) mit einem Marker markierter HPV 18-DNA oder Fragmenten davon und (ii) mit einem Marker markierter HPV 18-RNA oder Fragmenten davon bestehenden Gruppe.
48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei es sich bei dem weiteren Typ um mindestens ein Mitglied der aus HPV 16 und HPV 18 bestehenden Gruppe handelt.
49. Verfahren nach Anspruch 48, wobei es sich bei dem weiteren Typ um HPV 16 und HPV 18.
50. Verfahren nach Anspruch 41, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt.
51. Verfahren nach Anspruch 50, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt, der aus der aus ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
52. Verfahren nach Anspruch 41, wobei es sich bei dem Marker um einen nicht-radioaktiven Marker handelt, der aus der aus Biotin, einem Enzym und einem fluoreszierenden Molekül bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
53. Verfahren nach Anspruch 52, wobei das Enzym aus der aus alkalischer Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
54. Verfahren nach Anspruch 52, wobei das fluoreszierende Molekül aus der aus Fluoreszein und Rhodamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
55. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Kreuzhybridisierung zu DNA-DNA-Hybriden führt.
56. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Kreuzhybridisierung zu DNA-RNA-Hybriden führt.
57. Verfahren zum Nachweis von HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43- DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA, umfassend:
(1) Durchführung einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit
(a) einem aus der folgenden Gruppe ausgewählten Mitglied:
(i) mit einem Marker markierte HPV 35-DNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 43-DNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 44-DNA oder Fragmente davon; bzw. mit einem Marker markierte HPV 56-DNA oder Fragmente davon und
(ii) mit einem Marker markierte HPV 35-RNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 43-RNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 44-RNA oder Fragmente davon; bzw. mit einem Marker markierte HPV 56-RNA oder Fragmente davon,
(b) und einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, und
(2) Untersuchung des Auftretens einer Kreuzhybridisierung, um HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43- DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA in der Probe nachzuweisen.
58. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus einer Genitalläsion, einer Läsion der Kehle, einer oralen Läsion oder einer Hautläsion stammt.
59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei die unbekannte Probe von DNA oder RNA aus einer Genitalläsion stammt.
60. Verfahren nach Anspruch 59, wobei die unbekannte Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, durch Biopsie einer Epithelläsion, Ausschaben des Zervix oder Abtupfen des Zervix, um abgeschilferte Zellen zu erhalten, erhalten wird oder es sich um DNA handelt, die aus einer Genitalläsion stammt und in einen Klonierungsvektor kloniert worden ist.
61. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
62. Verfahren nach Anspruch 61, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
63. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die HPV 35-DNA, die HPV 43-DNA, die HPV 44-DNA oder die HPV 56-DNA das HPV 35- Genom; das HPV 43-Genom; das HPV 44-Genom; bzw. das HPV 56-Genom umfaßt.
64. Verfahren nach Anspruch 57, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt.
65. Verfahren nach Anspruch 64, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt, der aus der aus ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
66. Verfahren nach Anspruch 57, wobei es sich bei dem Marker um einen nicht-radioaktiven Marker handelt, der aus der aus Biotin, einem Enzym und einem fluoreszierenden Molekül bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
67. Verfahren nach Anspruch 66, wobei das Enzym aus der aus alkalischer Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
68. Verfahren nach Anspruch 66, wobei das fluoreszierende Molekül aus der aus Fluoreszein und Rhodamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
69. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Kreuzhybridisierung zu DNA-DNA-Hybriden führt.
70. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Kreuzhybridisierung zu DNA-RNA-Hybriden führt.
71. Verfahren zum Nachweis von HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43- DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; oder HPV 56-DNA oder -RNA, umfassend:
(1) Durchführung einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit
(a) einer ersten Fraktion von DNA oder RNA, die jeweils aus einer Genitalläsion aus einer Reihe von Genitalläsionen stammt, wobei die Reihe ein epidemiologisches Fortschreiten zu zervikalem Krebs zeigt, und
(b) einem aus der folgenden Gruppe ausgewählten Mitglied:
(i) mit einem Marker markierte HPV 35-DNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 43-DNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 44-DNA oder Fragmente davon; bzw. mit einem Marker markierte HPV 56-DNA oder Fragmente davon und
(ii) mit einem Marker markierte HPV 35-RNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 43-RNA oder Fragmente davon; mit einem Marker markierte HPV 44-RNA oder Fragmente davon; bzw. mit einem Marker markierte HPV 56-RNA oder Fragmente davon;
(2) Durchführung einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen mit
(a) einer zweiten Fraktion von DNA oder RNA, die aus jeder Genitalläsion der Reihe von Genitalläsionen stammt, und
(b) einer unbekannten Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, die mit einem Marker markiert ist;
(3) Vergleich der epidemiologischen Verteilung der in Stufe (1) erhaltenen Kreuzhybridisierung mit der in Stufe (2) erhaltenen Kreuzhybridisierung und der Kreuzhybridisierung der DNA aus jeder Läsion, die die epidemiologische Verteilung umfaßt, um HPV 35-DNA oder -RNA; HPV 43-DNA oder -RNA; HPV 44-DNA oder -RNA; bzw. HPV 56-DNA oder -RNA in der Probe nachzuweisen.
72. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 15 bis etwa 8000 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
73. Verfahren nach Anspruch 72, wobei die Fragmente eine Größe von etwa 300 bis etwa 800 Basen oder Basenpaaren aufweisen.
74. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die HPV 35-DNA, die HPV 43-DNA, die HPV 44-DNA oder die HPV 56-DNA das HPV 35- Genom; das HPV 43-Genom; das HPV 44-Genom; bzw. das HPV 56-Genom umfaßt.
75. Verfahren nach Anspruch 71, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt.
76. Verfahren nach Anspruch 75, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker handelt, der aus der aus ³²P, ¹&sup4;C, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
77. Verfahren nach Anspruch 71, wobei es sich bei dem Marker um einen nicht-radioaktiven Marker handelt, der aus der aus Biotin, einem Enzym und einem fluoreszierenden Molekül bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
78. Verfahren nach Anspruch 77, wobei das Enzym aus der aus alkalischer Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
79. Verfahren nach Anspruch 77, wobei das fluoreszierende Molekül aus der aus Fluoreszein und Rhodamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
80. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die unbekannte Probe von DNA oder RNA, die aus einer Genitalläsion stammt, durch Biopsie einer Epithelläsion, Ausschaben des Zervix oder Abtupfen des Zervix, um abgeschilferte Zellen zu erhalten, erhalten wird oder es sich um DNA handelt, die aus einer Genitalläsion stammt und in einen Klonierungsvektor kloniert worden ist.
81. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die Kreuzhybridisierung zu DNA-DNA-Hybriden führt.
82. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die Kreuzhybridisierung zu DNA-RNA-Hybriden führt.
DE19883886450 1987-05-26 1988-05-26 Aus Nukleinsäuren von menschlichen Papillomaviren bestehende Hybridisierungsproben und Methoden für deren Anwendung. Expired - Lifetime DE3886450T2 (de)

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