DE3885987T2

DE3885987T2 - Modifizierte Antikörperkonjugate mit erhöhter Eliminationsrate.

Info

Publication number: DE3885987T2
Application number: DE3885987T
Authority: DE
Inventors: Michael Jules Mattes
Original assignee: Center for Molecular Medicine and Immunology
Current assignee: Center for Molecular Medicine and Immunology
Priority date: 1987-09-14
Filing date: 1988-09-14
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2008-09-15
Also published as: CA1310264C; AU2223988A; AU611196B2; JP2519305B2; EP0308208A1; JPH01221400A; US4859449A; IL87740A; ATE97817T1; IE882775L; IL87740A0; EP0308208B1; IE62005B1; DE3885987D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Konjugate, die Glycosidreste aufweisen, die an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen binden, und ihre Verwendung in einem Verfahren zur Kontrolle der Bluteliminationsrate von Antikörpern, die auch an therapeutische und/oder diagnostische Mittel konjugiert werden können.
Antikörper werden als zielgerichtete Träger für diagnostische und therapeutische Mittel verwendet, z. B. Radioisotope, Mittel für magnetische Resonanzdarstellung (MRI), Toxine und cytotoxisch Arzneimittel, besonders bei der Diagnose und Behandlung von Krebs und bestimmten infektiösen Erkrankungen. Oftmals ist es sinnvoll, ein Antikörperkonjugat, welches das diagnostische oder therapeutische Mittel trägt, durch intravenöse Injektion einzuführen, aber es gibt Fälle, in denen eine solche Verabreichungsform nachteilig ist oder eine andere Verabreichungsform bestimmte Vorteile bietet.
Es ist bekannt, daß Antikörper alleine eine cytotoxische Wirkung bei Zellen auslösen, die Antigene tragen, an welche die Antikörper spezifisch binden. Dies ist auf zumindest zwei verschiedene aber wahrscheinlich komplementäre Mechanismen zurückzuführen, die beide auf die natürlichen Effektorfunktionen der Antikörper zurückzuführen sind. Ein erster Mechanismus wird antikörperabhängige, zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC) und der andere komplementvermittelte Cytotoxizität genannt. Beide können entweder alleine oder als Teil eines multimodalen Behandlungsprotokolls zur Therapie von Tumoren und infektiösen Läsionen verwendet werden.
Nichtsystemische, regionale Verabreichungsformen von Antikörpern und Antikörperkonjugaten sind besonders in der Diagnose und Behandlung von Tumoren und infektiösen Läsionen zweckmäßig, die auf eine bestimmte Körperhöhle, z. B. den Peritonealraum, begrenzt sind. Eine intrakavitäre Verabreichung kann auch die Notwendigkeit eines tumorspezifischen Antikörpers beseitigen, wenn der zielgerichtete Antikörper nicht nennenswert an andere Gewebe in der Höhle bindet, in die er vor dem Eintritt in den Blutstrom injiziert wird. Dennoch kann eine möglichen Wanderung des Antikörperkonjugats in den Blutstrom zu einer Aufnahme durch normale Gewebe führen und kann auch, im Falle eines radiomarkierten Konjugats, eine deutliche Schädigung des Knochenmarks bewirken. Ein weiteres Problem, das sich aus der Aufnahme in den großen Blutkreislauf ergibt, ist ein Anstieg in der Hintergrundstrahlung, wiederum im Falle eines radiomarkierten Konjugats, aufgrund der Blutpoolaktivität. Die Wirksamkeit und Sicherheit von bestimmten diagnostischen und therapeutischen Methoden, bei welchen nichtsystemisch verabreichte Antikörper und Antikörperfragmentkonjugate verwendet werden, könnten verbessert werden, wenn ein Verfahren zur Verfügung stünde, das die rasche Eliminationsrate des Konjugats erhöht, sobald es in den Blutstrom gelangt.
Umgekehrt könnte die Wirksamkeit anderer diagnostischer und therapeutischer Verfahren, die systemisch verabreichte Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörper und Antikörperfragmentkonjugate verwenden, verbessert werden, wenn die Beeinflussung der Bluteliminationsrate solcher Mittel möglich wäre, damit in einem bestimmten Zeitraum eine geringe oder keine Elimination stattfindet, um eine maximale Aufnahme des Mittels durch das Zielgewebe zu ermöglichen, wonach das restliche zirkulierende Mittel rasch eliminiert wird.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sollen diese Probleme lösen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines modifizierten Antikörperkonjugats zur Verwendung in der Diagnose und Therapie von Tumoren und infektiösen Läsionen, die auf regional verabreichte Antikörper und/oder Antikörperkonjugate ansprechen, wobei die Elimination eines nichtsystemisch verabreichten Antikörpers oder Antikörperkonjugats erhöht ist, sobald es im großen Blutkreislauf vorhanden ist.
Die Erfindung betrifft ein Diagnose- und Therapieverfahren unter Verwendung modifizierter Antikörper oder Antikörperkonjugate, die systemisch injiziert werden, wobei die Leberzellenelimination der Konjugats eine gewisse Zeit zur Verbesserung des diagnostischen oder therapeutischen Wirkung gehemmt ist, wonach eine rasche Elimination zur Verringerung der Nebenwirkungen oder zur Verminderung des Hintergrunds und zur Verstärkung der diagnostischen Auflösung erfolgt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von Reagenzien und Reagenzsätzen zur Verwendung in den vorangehenden Verfahren.
Bei näherem Studium der Beschreibung und der angeschlossenen Ansprüche werden dem Fachmann weitere Zielsetzungen und Vorteile dieser Erfindung offensichtlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung eines modifizierten Antikörperkonjugats, bestehend aus einem Antikörper oder Antikörperfragment, das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist, in der Zubereitung eines Mittels zur Behandlung oder Diagnose von Tumoren und infektiösen Läsionen. Die Verwendung kann ferner die Verringerung der Ausströmungsrate des Konjugats in den Blutstrom umfassen.
Das Antikörperkonjugat kann auch an ein Radioisotop, Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, Toxin oder Arzneimittel konjugiert sein.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein modifiziertes Antikörperkonjugat zur Verwendung in der Medizin geschaffen, welches einen Antikörper oder ein Antikörperfragment aufweist, der oder das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist.
Das Antikörperkonjugat kann auch an ein Radioisotop, Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, Toxin oder Arzneimittel konjugiert sein.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Antikörperkonjugats geschaffen, welches einen Antikörper oder ein Antikörperfragment aufweist, der oder das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei das Verfahren das Befestigen oder Exponieren eines terminalen Glycosidrests, der imstande ist, an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen zu binden, an oder auf dem Antikörper oder Antikörperfragment des Antikörperkonjugats umfaßt.
Ein weiteres Merkmal betrifft die Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, das auch an ein Radioisotop, Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, Toxin oder Arzneimittel konjugiert sein kann, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird; wobei der Antikörper eine Vielzahl von terminalen Gylcosidresten, die an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen binden, exponiert aufweist, in der Zubereitung eines Mittels zur Behandlung eines menschlichen Patienten mit einem Tumor oder einer infektiösen Läsion. Das Mittel wird parenteral aber nichtsystemisch verwendet, wobei dem Patienten eine diagnostisch oder therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers oder Antikörperfragments injiziert wird.
Dann kann eine diagnostische Bilddarstellung des Tumors, z. B. Ovartumors, vorgenommen werden.
Zusätzlich betrifft ein weiteres Merkmal auch die Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, das an ein Radioisotop, Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, Toxin oder Arzneimittel konjugiert ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder mit diesem verbunden ist; wobei der Antikörper modifiziert ist, indem eine Vielzahl von terminalen Gylcosidresten, die an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist, in der Zubereitung eines Mittels zur Behandlung eines menschlichen Patienten mit einem Tumor oder einer pathologischen Läsion. Der Antikörper oder das Antikörperfragment wird dem Patienten intravenös in einer diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Menge injiziert. Dem Patienten wird bei, vor oder nach der Injektion des modifizierten Antikörpers oder Antikörperfragmentkonjugats eine Menge eines kompetitiven Inhibitors der Bindung an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen intravenös injiziert, die ausreicht, die Leberzellenelimination des zirkulierenden modifizierten Konjugats über einen genügend langen Zeitraum zu hemmen oder deutlich zu verzögern, um eine Aufnahme des modifizierten Konjugats durch den Tumor oder die Läsion zu ermöglichen oder dessen diagnostische oder therapeutische Wirkung aufrechtzuerhalten, wonach das modifizierte Konjugat aus dem Blutkreislauf ausgeschieden wird.
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein modifiziertes Antikörperkonjugat geschaffen, das einen Antikörper oder ein Antikörperfragment aufweist, der oder das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist (wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment auch an ein Radioisotop, Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, Toxin oder Arzneimittel konjugiert sein kann), wobei auf dem Antikörper oder dem Antikörperfragment ein Glycosidrest, z. B. eine Vielzahl von terminalen Glycosidresten, exponiert ist, der an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen bindet.
Sterile injizierbare Zubereitungen und Reagenzsätze, die den vorangehenden modifizierten Antikörper enthalten, sind auch zur Verwendung in der Erfindung vorgesehen.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem modifizierten Antikörperkonjugat, das einen Antikörper oder ein Antikörperfragment aufweist, der oder das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist; und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Zusammensetzung kann eine sterile injizierbare Zusammensetzung sein, die zum Beispiel für eine nichtsystemische parenterale Injektion über einen intraperitonealen Weg geeignet ist.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei das Verfahren das Vermischen eines modifizierten Antikörperkonjugats, das einen Antikörper oder ein Antikörperfragment aufweist, der oder das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Die Zusammensetzung kann eine sterile injizierbare Zusammensetzung sein.
Die Immunotherapie ist bei gewissen Arten von Tumoren und infektiösen Läsionen eine attraktive Behandlungsmethode. Antikörper oder Antikörperfragmente, die an Marker binden, die durch Tumore oder infektiöse Läsionen erzeugt werden oder damit verbunden sind, an die therapeutisch wirksame Radioisotope, Arzneimittel oder Toxine konjugiert sind, können zur zielgerichteten Lenkung des therapeutischen Wirkstoffes zu dem Tumor oder der Läsionsstelle verwendet werden. Zusätzlich kann der nichtkonjugierte Antikörper durch die ADCC und/oder komplementvermittelten Mechanismen, wie von Herlyn et al, Cell Immunol., 92 : 105, 1985, beschrieben, ein geeignetes therapeutisches Mittel sein. Ein großes Hindernis in der Anwendung einer solchen Immunotherapie war die Schwierigkeit, Antikörper zu erhalten, die äußerst spezifisch an die Tumor- oder Läsionsantigene binden und mit normalen Geweben nicht kreuzreagieren.
Gewisse Tumore und Läsionen sind oftmals auf bestimmte Körperhöhlen oder -bereiche begrenzt, und zur Verringerung von Nebenwirkungen wurde die regionale Verabreichung von radiotherapeutischen oder chemotherapeutischen Mitteln versucht. Der Begriff "regionale Verabreichung" wird hierin zur Bezeichnung des Einführung in eine bestimmte Körperhöhle, der intrakavitären Weges, oder der Einführung in ein nichtvenöses Kreislaufsystem, das eine begrenzte Region des Körpers wie ein Organ, eine Gliedmaße, eine Drüse oder dergleichen versorgt, verwendet. Die intrakavitäre Verabreichung umfaßt z. B. den intraperitonealen, intrapleuralen, intrathekalen und ähnliche Wege. Die nichtvenöse regionale zirkulatorische Verabreichung umfaßt intraarterielle Wege, z. B. die Injektion in renale, hepatische, karotische, portale und andere Arterien, die ein Organ oder eine Gliedmaße versorgen, und intralymphatische Wege, z. B. die Injektion in Geweberegionen, die durch infizierte oder tumorbefallene Lymphknoten drainiert werden. Die intraarterielle und intralymphatische Verabreichung kann mit gleichzeitiger Abklemmung oder Behinderung des Blut oder Lymphstromes aus der interessierenden Region erfolgen, so daß der Durchgang des injizierten Konjugats in den großen Kreislauf verzögert wird.
Tumore oder infektiöse Läsionen, die auf bestimmte Körperhöhlen oder auf beschränkte Regionen begrenzt sind, die durch verschiedene arterielle Blut- oder Lymphgefäße versorgt werden, wären Kandidaten für die regionale Theraphiemethodologie der Erfindung. Zum Beispiel ist das Ovarialkarzinom im allgemeinen auf den Peritonealraum begrenzt, selbst wenn Metastasen vorliegen, obwohl extraabdominale Metastasen auftreten können. Ovarialkarzinome werden durch gegenwärtige Methoden nicht wirksam behandelt und stellen den hauptsächlichen Grund für den Tod von Patientinnen in den Vereinigten Staaten mit gynäkologischen Malignitäten dar. Die intraperitoneale Chemotherapie und Radiotherapie mit Radiokolloiden waren in der Behandlung des Ovarialkrebses nicht besonders erfolgreich, aber eine geeignete Immunotherapie könnte deutlich besser sein.
Beispiele für andere Tumore, die häufig maligne Effusionen entwickeln und die daher gleichermaßen behandelt werden könnten, umfassen den Dickdarmkrebs, das Lungenkarzinom und Mesotheliom.
Tumore und Läsionen, die auf das Gehirn oder die Wirbelsäule begrenzt sind, können durch intrathekale Verabreichung behandelt werden. Tumore und Läsionen in anderen begrenzten, flüssigkeitsgefüllten Räumen, z. B. Synovial- oder Intraoccularflüssigkeit, können auch gleichermaßen behandelt werden.
Lymphknotentumore und/oder infektiöse Läsionen können durch Injektion in das Gewebe von Regionen behandelt werden, die durch diese Lymphknoten drainiert werden.
Organe oder Körperregionen, wie z. B. die Leber oder ein einzelnes Gliedmaß, die eine getrennte arterielle Versorgung aufweisen und auf die der Tumor oder die infektiöse Läsion begrenzt ist, können durch intraarterielle Injektion behandelt werden.
Die Verwendung des intrakavitären oder anderer regionaler Wege zur Verabreichung der therapeutischen Antikörper und Antikörperkonjugate können die Notwendigkeit von Antikörpern umgehen, die stark tumor- oder läsionsspezifisch sind. Es genügt, daß der Antikörper spezifisch an einen Marker bindet, der von dem Tumor oder der Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, und nicht an andere Zell- oder Gewebearten, denen der Antikörper in der bestimmten Form der verwendeten, regionalen Verabreichungsart ausgesetzt wird.
Wenn nicht anders angegeben, soll der Begriff "Antikörper", wie hierin verwendet, sowohl ganze Immunglobuline als auch Antikörperfragmente umfassen. Manchmal wird es praktisch sein, die Abkürzung "Antikörper/Fragment" zur Bezeichnung eines Antikörpers und/oder eines Antikörperfragments zu verwenden. Somit kann der Antikörper ein vollständiges IgG, IgA, IgD, IgE, IgM oder ein Fragment, wie zum Beispiel F(ab')&sub2;, F(ab)&sub2;, Fab', Fab, eine monovalente leichte/schwere Kette oder dergleichen, einschließlich deren Isotypen und Subtypen sein. Er kann ein polyklonaler Antikörper, vorzugsweise ein affinitätsgereinigter Antikörper, von einem Menschen oder einem geeigneten Tier sein, z. B. von einer Ziege, einem Kaninchen, einer Maus oder dergleichen, oder ein monoklonaler Antikörper, der durch herkömmliche Techniken hergestellt wird, z. B. ein muriner Antikörper, der von einem Hybridom abgeleitet wird, das durch Verschmelzen von Lymph oder Milzzellen von einer Maus erhalten wird, die gegen ein Tumor- oder infektiöses Läsionantigen mit Myelomazellen einer geeigneten immortalen Zellinie immunisiert wurde.
Es ist offensichtlich, daß jede andere Art von Antikörper/Fragment, ob durch gegenwärtig bekannte Methodologie, einschließlich chimärischer Antikörper, hybrider Antikörper, Polyome und ähnlicher immunologischer Techniken, oder durch rekombinante, DNA-vermittelte Synthese und Expression, Kassettenmodifikation oder ähnliche Techniken hergestellt, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, solange er als zielgerichteter Träger für einen diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoff dienen kann.
Beispiele für Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch an Marker binden, die durch Tumore oder infektiöse Läsionen erzeugt werden oder damit verbunden sind, wurden inter alia bei Hansen et al., U.S. Patent 3.927.193 und Goldenberg, U.S. Patente 4.331.647, 4.348.376, 4.361.544, 4.468.457, 4.444.744, 4.460.459, 4.460.561 und 4.624.846 geoffenbart. Diese Patente offenbaren auch zahlreiche Antikörper und Antikörperfragmente, die an Tumormarker und Marker, die mit infektiösen Läsionen verbunden sind, binden. Verfahren zur Radiomarkierung solcher Antikörper und Antikörperfragmente sind auch in den vorangehenden Literaturstellen geoffenbart, wie auch Verfahren zur Konjugierung solcher Antikörper und Fragmente an Verstärkungsmittel zur magnetischen Resonanzdarstellung.
Antikörper, die für die i.p. Therapie oder zur Darstellung von Ovarialkarzinomen geeignet sind, sollten mit der Oberfläche der Ovarialkarzinomzellen, aber nicht mit mesothelialen Zellen reagieren. Geeignete Antikörper sind in der Wissenschaft bekannt und wurden z. B. von Mattes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 568-572, 1984; Kabawat et al., Am. J. Clin. Pathol., 79 : 98-104,1983; Tsuji et al., Cancer Res., 45 : 2358-2362,1985; und Miotti et al., Intl. J. Cancer, 39 : 297-303, 1987; geoffenbart.
Die Tumortherapie mit nichtkonjugierten Antikörpern, die die natürlichen Effektorfunktionen ADCC oder komplementvermittelte Lysis nützt, wurde von einigen Forschern beschrieben, z. B. Herlyn at al., J. Immunol., 134 : 1300, 1985; und Ceriani et al., Cancer Res., 47 : 532-540, 1987.
Die Tumorradioimmunotherapie ist in der Wissenschaft gut bekannt und wurde z. B. von Goldenberg et al., Cancer Res., 41 : 4354, 1981; Jones et al., Intl. J. Cancer, 35 : 715-720, 1985; und Zalcberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 72 : 697-702, 1984, beschrieben.
Zu therapeutisch wirksamen Radioisotopen zählen starke Beta-Emitter und Alpha-Emitter, z. B. 1-131, Y-90, Cu-67, Re-186, Bi-212 und dergleichen. Solche Radioisotope können durch eine Reihe von herkömmlichen Verfahren an Antikörper konjugiert werden. Zu Radioiodierungsverfahren zählen z. B. Chloramin-T-Konjugation und enzymatische Koppelung. Radiometalle können unter Verwendung von verschiedenen herkömmlichen Chelatoren, z. B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Ethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), bis-Thiosemicarbazonen (TSC), Porphyrinen und dergleichen konjugiert werden, wie z. B. in den obenerwähnten Goldenberg Patenten und in einer Reihe von aktuellen Texten beschrieben wird. Es ist offensichtlich, daß die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung nicht auf bestimmte Chelatoren, Radioisotope oder Markierungsverfahren beschränkt ist.
Zu chemotherapeutischen, tumorbekämpfenden Mitteln zählen Arzneimittel und Toxine. Zu tumorbekämpfenden Arzneimitteln zählen z. B. Methotrexat (MTX), 5-Fluorouracil (5-FU), cis-Platinverbindungen und dergleichen wie auch Ricin A-Kette und ähnliche pflanzliche Toxine. Auch in diesem Fall ist die Erfindung nicht durch das bestimmte Arzneimittel oder Toxinkonjugat eingeschränkt.
Die Konjugation solcher Arzneimittel an Antikörper kann durch eine Reihe herkömmlicher Mittel erfolgen. Es kann eine Kopplung zwischen einer Carboxyl- oder Amingruppe auf dem Arzneimittel mit einer als Gegenstück ausgebildeten Amin- oder Carboxylgruppe auf den Lysin- oder Aspartat/Glutamat-Seitenresten auf dem Antikörper bei Verwendung von Kopplungsmitteln wie Carbodiimiden zur Bildung der Amidbindungen durchgeführt werden. Andere Kopplungsarten umfassen die Schiff'sche Basenbildung, die bifunktionelle Linkerkopplung zwischen Aminen oder jede einer Vielzahl anderer gut bekannter Techniken.
Die Arzneimittel können auf Trägermoleküle geladen werden, die ihrerseits an den Antikörper gekoppelt werden, wie z. B. in Rowland, U.S. Patent Nr. 4.046.722 geoffenbart. Therapeutische Mittel zur Behandlung infektiöser Läsionen umfassen z. B. Radioisotope und Antibiotika. Diese Mittel können auch durch die allgemein üblichen Verfahren, die zur Arzneimittel- und Toxinkonjugation verwendet werden, an Antikörper konjugiert werden.
Die Anwendung dieser Antikörperkonjugate gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Wahl von auf Tumor oder Läsion gerichteten Antikörpern, die die richtige Spezifität für den Tumor oder die Läsion aufweisen und im wesentlichen mit den Geweben, die an der Innenseite des Raumes oder Gefäßes liegen, in das das Konjugat injiziert wird, nicht kreuzreaktiv sind.
Zum Beispiel werden Antikörper, die bei Patienten mit Ovarialkarzinom intraperitoneal (i.p.) injiziert werden, zunächst nur einer Art von normaler Zelle, Mesothelialzellen, ausgesetzt, die alle Oberflächen des Peritonealraumes auskleiden. Es sind Antikörper bekannt, die an die Oberfläche der frischen Ovartumorzellen aber nicht an Mesothelialzellen binden, obwohl sie an normale Epithelialzellen binden, wie oben erwähnt wurde.
Die Verwendung solcher Antikörper oder Fragmente davon, entweder alleine oder an Radioisotope, Arzneimittel oder Toxine konjugiert, könnte zur Therapie des Ovarialkarzinoms wirksam sein, aber die Konjugate verursachen unerwünschte Nebenwirkungen, wenn sie aus dem Peritonealraum in den Blutstrom wandern. Dieses Wandern oder Ausströmen erfolgt vorwiegend durch das sehr durchlässige Mesothel und die Lymphgefäße an der Unterseite des Diaphragmas, wie von French et al., Quart. J. Exper. Physiol., 45 : 88-103, 1960, beschrieben, und dies mindert den Vorteil der i.p. Therapie. Sobald die Konjugate den Blutstrom erreichen, ist es wünschenswert, daß sie rasch eliminiert werden, so daß eine Bindung an antigenpositive Zellen oder Gewebe außerhalb des Peritonealraumes verhindert wird.
Bei Radioisotopkonjugaten verringert die rasche Elimination die Knochenmarktoxizität. Arzneimittel- und Toxinkonjugate sollten rasch zur Verringerung der Toxizität bei gesunden Geweben und Organen eliminiert werden. Die rasche Elimination von gewissen pflanzlichen Toxinen oder von besonders cytotoxischen Arzneimitteln kann die Leber überbelasten und wäre nicht vorteilhaft, aber dies kann durch Vorversuche festgestellt und bis zu einem gewissen Ausmaß durch eine geringere Ladung mit den terminalen Glycosidresten abgeschwächt werden, die die Elimination von Antikörpern, in denen sie enthalten sind, beschleunigen.
Erfindungsgemäß wird eine beschleunigte Elimination von Antikörpern und Antikörperkonjugaten durch deren Konjugation an Glycoside, die an das hepatische Lectin binden, oder durch Exposition solcher Glycoside als terminale Reste auf bestehenden, komplexen Kohlenhydraten auf dem Antikörper erzielt. Die Begriffe "hepatisches Lectin", "Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor" oder "Glycosidrezeptor von menschlichen Leberzellen", wie hierin verwendet, bezeichnen alle den spezifischen Glycoproteinrezeptor auf den Leberzellen, der gewisse terminale Glycoside bindet und die Elimination von Molekülen aus dem Blutkreislauf auslöst, die solche terminalen Glycosidreste tragen. Ashwell et al., Adv. Enzymol., 41 : 99-128, 1974, gibt einen Überblick über die Eigenschaften des Rezeptors. Die Funktion des Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptors wurden umfassend auf molekularer Ebene untersucht, wie in einer jüngsten Studie von Neutra et al., J. Histochem. Cytochem., 33 : 1134-1144, 1985, dargestellt ist.
Üblicherweise binden das hepatische Lectin Galactose, Glucose und N-Acetylgalactosaminreste, im allgemeinen D-Galactoside und D-Glucoside, normalerweise in der β-Glycopyranosidform, obwohl von gewissen α-Glycosiden bekannt ist, daß sie an das Lectin binden. Es können auch andere Glycoside ermittelt werden, die mit vergleichbarer Affinität binden, und diese sind auch zur Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung zweckmäßig. Der Glycosidrest sollte ein terminaler Rest sein, um an das Lectin zu binden.
Die Glycoside können an der Oberfläche eines Antikörpers durch geeignete Behandlung exponiert werden. Antikörper sind Glycoproteine mit Kohlenhydratregionen, die komplexe, asparagingebundene Kohlenhydrate enthalten. Diese komplexen Kohlenhydrate bestehen aus mehreren verschiedenen Arten von Zucker und enthalten im allgemeinen terminale Sialsäure, d. h., N-Acetylneuraminsäure, Reste, die üblicherweise an Galactoseresten anhaften. Die Sialsäurereste können durch Enzyme, die als Neuraminidasen bezeichnet werden und von welchen mehrere im Handel erhältlich sind, entfernt werden, wodurch die Galactosereste exponiert werden.
Entsialysierungsverfahren sind dem Fachmann gut bekannt, wie z. B. jene, die von Ashwell, loc. cit. berichtet werden. Wenn die Neuraminidasebehandlung eine ausreichende Zahl von Galactoseresten oder anderen lectinbindenden Resten exponiert, ist es ein zweckmäßiges Verfahren, einen Antikörper zur Beschleunigung seiner Elimination aus dem Gesamtkreislauf zu modifizieren.
Die neuraminidasevermittelte Entsialysierung führt jedoch nicht immer zu einer ausreichenden Exposition von lectinbindenden Glycosidresten auf einem Antikörper. Darüberhinaus weisen Antikörperfragmente wie Fab und F(ab')&sub2; normalerweise die komplexe Kohlenhydratregion nicht auf, da diese als Teil des Fc-Teils nach der enzymatischen Spaltung entfernt wird. Eine weitere Alternative ist die Konjugation von Glycosidresten an den Antikörper oder das Antikörperfragment durch eine von zahlreichen bekannten Methoden. Lee et al., Biochem., 15 : 3956-3962, 1976; und Krantz et al., Biochem., 15 : 3963-3968, 1976, beschreiben mehrere Verfahren zur Befestigung von Glycosiden an Proteinen, wie auch andere Methoden zur Herstellung solcher Konjugate, die in der Wissenschaft gut bekannt sind. Bei einer Methode werden Diazoniumsalze von p-Aminophenylglycosiden verwendet, die mit Tyrosin, Histidin, Tryptophan und Phenylalaninresten reagieren. Die p-Aminophenylglycoside sind im Handel erhältlich und auch leicht synthetisch zugänglich.
Die p-Aminophenylglycoside können zu Isothiocyanaten durch Reaktion mit Thiophosgen umgewandelt werden und diese reagieren mit Lysylresten. Sie können auch direkt bei Verwendung von herkömmlichen Kondensationsmitteln, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) oder 1 Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid (EDAC), mit Proteincarboxylen reagiert werden, z. B. auf Aspartat oder Glutamatresten.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von glycosylierten Antikörpern ist die Amidinierung, besonders die Einführung von Zuckern in Form von Thioglycosyiamidinoderivaten. Die vorangehenden Literaturstellen zeigen auch, daß der Fachmann in diesem Bereich weiß, daß Thioglycosylamidinoderivate von Proteinen effizient durch ihre Reaktion mit 2-Imino-2-methoxyethyl 1-Thioglycosiden (IME-Thioglycosiden) hergestellt werden können. Die IME-Thioglycoside sind selbst einfach aus Cyanomethylthioglycosidvorläufern, z. B. durch Reaktion mit methylalkoholischem Natriummethoxid, herzustellen. PROTEIN
Die Synthese von Cyanomethylthioglycosiden wurde von Lee et al., siehe oben, beschrieben und solche Derivate von einigen Zuckern, einschließlich D-Galactose und D-Glucose, sind im Handel erhältlich. Andere geeignete Glycoside und Herstellungsverfahren sind in der Wissenschaft gut bekannt, wie bereits inter alia in den vorangehenden Literaturstellen erwähnt.
Der Vorteil der Verwendung der Imidierung zur Einführung von Glycosidreste auf Antikörperkonjugaten besteht darin, daß die erhaltenen Imidate die Ladung der Lysylreste behalten und die glycosylierten Antikörper im allgemeinen ihre Immunoreaktivität, selbst bei höherer Ladung, behalten, solange kritische Lysinreste an den Bindungsstellen nicht nennenswert zur Reaktion gebracht werden. Im Gegensatz dazu kann die Diazokoppelung, Amidierung und Thioharnstoffbildung eine signifikante Veränderung in der Ladung auf dem Protein bewirken und/oder hydrophobe Wechselwirkungen herbeiführen (von den Phenylgruppen dieser Derivate). Dies kann wiederum Konformationsveränderungen auslösen, die die Antikörper-Bindungsfunktion und/oder Bioverteilung beeinflussen. Die einfache und wirksame Weise dieser Glycosylierungsmethode machen sie scheinbar zu dem Verfahren der Wahl für die Aktivierung der Antikörper und Antikörperfragmente zur Bindung an das hepatische Lectin zur Beschleunigung ihrer Elimination aus dem Blutstrom.
Zwischen dem Vorteil einer hohen Glycosidladung zur raschen Elimination aus dem Blut und der Beibehaltung der Immunoreaktivität muß ein Gleichgewicht erzielt werden, besonders wenn andere Komponenten auch an den Antikörper konjugiert werden, wie Arzneimittel oder Chelatoren. Die Radioiodierung beeinträchtigt die Lysinreste nicht, während viele andere Konjugate diese Reste als Anhaftungspunkt benutzen, und somit ist die Radioiodierung von Antikörperlysinglycosylimidaten zur Herstellung eines Mittels für die Radioimmunotherapie (RAIT) besonders interessant.
Ein weiteres interessantes Merkmal der Therapie mit radioiodiniertem Antikörper ist, daß Iodradioisotope rasch in der Leber deiodiniert werden und das Radioisotop rasch durch die Harnblase ausgeschieden wird. Radiometalle werden andererseits oftmals durch die Leber oder die Nieren zurückgehalten, und es können hohen Konzentrationen von Radioaktivität in diesen Organen aufgebaut werden, die einen nicht akzeptierbaren Schaden verursachen. Derzeit werden neuartige Chelatoren entwickelt, die dieses mögliche Problem beseitigen könnten, und diese könnten die Herstellung besserer RAIT-Mittel erlauben.
Eine Vielzahl von konjugierten Glycosidresten ist für die wirksame Beschleunigung der Elimination aus dem Blut wünschenswert. Vorzugsweise genügen zumindest etwa 10 Glycosidreste pro Antikörper/Fragment zur Beschleunigung der Elimination, bevorzugter zumindest etwa 25 Reste zur raschen Elimination und vielleicht noch mehr zur rascheren Elimination, z. B. bis zu 50-75 Reste pro Antikörper/Fragment. Die Immunoreaktivität des glycosylierten Antikörperkonjugats kann durch einen herkömmlichen, z. B. Immunoperoxidase, Test und eine geeignete Zellinie, an die der Antikörper spezifisch bindet, bestimmt werden.
Im allgemeinen wird die Glycosylierung in einem Ausmaß durchgeführt, das die Immunoreaktivität nicht signifikant verringert, aber die Eliminationsrate maximiert. In einigen Fällen, besonders wenn Toxin oder cytotoxische Arzneimittelkonjugate verwendet werden, kann es ratsam sein, das Ausmaß der Glycosylierung zu verringern, so daß es zu keiner Überbelastung der Leber und keiner unannehmbare Schädigung der Leberfunktion kommt. Es versteht sich, daß eine gewisse Leberschädigung ein annehmbarer Preis für die tumorizidale Wirksamkeit ist, den Patienten, deren Krebs sonst der Chemotherapie und/oder Radiotherapie widersteht, bezahlen.
Die Verabreichung des modifizierten Antikörpers oder Antikörperkonjugats in einem Therapieprotokoll erfolgt nach den klinischen Indikationen für den bestimmten Fall. Es werden bekannte regionale, z. B. intrakavitäre, antikörperzielgerichtete Therapieprotokolle verwendet, wie z. B. jene, die in den obengenannten Literaturstellen' erwähnt sind. Anstelle der hierin verwendeten Antikörper oder Antikörperkonjugate werden Antikörper oder radiomarkierte oder arzneimittelkonjugierte Antikörper verwendet, die durch Exposition von oder weitere Konjugation mit hepatischen lectinbindenden Glycosiden gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert wurden. Da die Mark- und normale Organtoxizität von zumindest einigen Konjugaten durch die rasche Elimination aus dem Blut verringert wird, ist es normalerweise möglich, die Dosis des modifizierten Konjugats im Vergleich zu dem nicht modifizierten Konjugat zu erhöhen und somit die therapeutische Wirkung jeder Dosis zu steigern.
Die intraperitoneale tumorbekämpfende Therapie erfolgt oft nach einem chirurgischen Eingriff durch einen Katheter, der während des Eingriffs implantiert wurde. Es ist einfach, das therapeutische Mittel durch den Katheter in einem Lösungsvolumen zu injizieren, das zur Gewährleistung eines ausreichenden Kontakts mit dem Inneren der Höhle ausreicht. Es hat sich gezeigt, daß die Erhöhung des Volumens der injizierten Lösung zu einer längeren Retention und einem langsameren Ausströmen des injizierten Mittels im i.p. Raum führt.
Die therapeutische Wirksamkeit einer regionalen Verabreichung eines modifizierten Antikörperkonjugats gemäß der Erfindung kann weiter unter den richtigen Umständen verstärkt werden, indem die Ausströmungsrate des Konjugats aus der Region und/oder der Höhle, in die es eingeführt wurde, in den Blutstrom verringert wird. Dies kann durch jedes von mehreren möglichen Mitteln erfolgen.
Das Ausströmen von großen Molekülen wie Antikörperkonjugaten aus dem Peritonealraum erfolgt normalerweise durch das durchlässige subdiaphragmatische Mesothel in die Lymphgefäße, die wiederum in den Blutstrom führen. Die Erfinder haben herausgefunden, daß das Bauchwasser die Ausströmungsrate von therapeutischen Antikörperkonjugaten in den Blutstrom deutlich senkt. Eine Ansammlung von Bauchwasser tritt bei Patienten mit Ovarialkarzinom häufig auf, und das Ausströmen aus dem Peritonealraum wird bei solchen Patienten stark verzögert. Im allgemeinen tritt eine solche Ansammlung von Bauchwasser natürlich nur bei Patienten mit einer großen Tumorbelastung auf. Selbst dann wirkt dies mit der intrakavitären Verabreichung eines therapeutischen Antikörperkonjugats zur Verringerung seiner Ausströmungsrate zusammen.
Bei Patienten mit einer geringeren Tumorbelastung kann die Herbeiführung einer schwachen Entzündung des Mesothels und der Lymphgefäße, durch die das Ausströmen erfolgt, die Flüssigkeitsansammlung und die damit verbundene längere Retention des Antikörperkonjugats im Peritonealraum auslösen. Zum Beispiel führt die i.p. Injektion eines vollständigen Freund'schen Adjuvans oder nur eines Mineralöls zu einer schwachen Entzündung und bewirkt eine geringe Ansammlung von Bauchwasser.
Die spätere Behandlung mit einem Immunsuppresivum oder einem entzündungshemmenden Arzneimittel, z. B. einem Corticosteroid, das die Wirkungen des Entzündungserregers aufhebt, kann zur Begrenzung der Entzündung auf den Zeitraum verwendet werden, in dem sie die Therapie unterstützt.
Ein weiteres Verfahren zur Verringerung der Ausströmungsrate des Antikörperkonjugats aus dem Peritonealraum durch das Diaphragma besteht in der Senkung der Atmungsfrequenz des Patienten, z. B. durch Anästhesie, obwohl dies nur eine mäßig wirksame Methode darstellt. Das Abklemmen oder andersartige Blockieren der Lymphgefäße, die das Diaphragma drainieren, kann auch die Drainage und das Durchströmen verlangsamen. Jedes dieser Verfahren kann bei anderen Regionen oder Höhlen angewendet werden, wie für den Fachmann der Medizin offensichtlich ist.
Die modifizierten Antikörperkonjugate der Erfindung können auch in einem systemisch verabreichten Therapieschema verwendet werden, wenn die Kontrolle der Eliminationsrate des Konjugats aus dem Blut gewünscht wird, so daß ein hoher Blutspiegel des Konjugats eine gewisse Zeit aufrechterhalten werden kann, in der die Aufnahme durch die Zielgewebe erfolgt, wonach eine rasche Elimination des zirkulierenden Konjugats folgt. Vor, bei und/oder nach der Verabreichung des Konjugats wird ein, z. B. kompetitiver, Inhibitor, der imstande ist, an das hepatische Lectin zu binden, zur Blockierung der Glycosidrezeptorstellen des Lectins verabreicht. Vorzugsweise erfolgt eine kontinuierliche, intravenöse Infusion des Inhibitors bis zu dem Zeitpunkt, zu dem die Auslösung einer raschen Blutpoolelimination gewünscht ist, z. B. um die Marktoxizität und die Schädigung von normalen Geweben zu verringern.
Ein wirksamer kompetitiver Inhibitor sollte beim Menschen nichttoxisch und nichtimmunogen sein, so daß verhältnismäßig große Mengen über einen Zeitraum von einigen Tagen ohne Toxizität verabreicht werden können. Zu solchen geeigneten Inhibitoren zählen z. B. entsialysierte Humanserumproteine, glycosidbeladene Träger und glycosylierte Humanserumproteine. Ein besonders zweckmäßiges Asialoglycoprotein ist entsialysiertes Orosomucoid (α&sub1;-Säure-Glycoprotein), das einfach durch herkömmliche Neuraminidasebehandlung von Orosomucoid erhalten werden kann, wie z. B. von Krantz et al., loc. cit., beschrieben. Eine weitere leicht verfügbare Alternative ist entsialysiertes Fetuin. Die Amidinierung oder andere Glycosylierung von Serumproteinen, z. B. Humanserumalbumin, erzeugt auch Inhibitoren von Serumproteinen, z. B. erzeugt Humanserumalbumin auch Inhibitoren, die für diesen Zweck geeignet sind. Die Amidinierung eines Aminodextrans stellt eine dritte allgemeine Möglichkeit zur Erzeugung eines glycosylierten synthetischen Trägermoleküls dar, das die lecetinhemmenden Glycoside trägt.
Der Lectininhibitor wird über einen Zeitraum und in einer Menge verabreicht, die zur Hemmung oder Verzögerung der Aufnahmegeschwindigkeit des modifizierten Antikörpers oder Antikörperkonjugats durch die Leberzellen und zur Optimierung der Aufnahme durch das Zielgewebe oder organ ausreichen, ohne den Patienten einem hohen Risiko einer Schädigung des Marks oder eines normalen Organs auszusetzen. Dies ist in einzelnen Fällen unterschiedlich, und der Arzt muß diese Beurteilung aufgrund seiner genauen Kenntnisse des Krankengeschichte des Patienten und des Stadiums der Erkrankung treffen. Die richtige Menge des Lectininhibitors kann durch Aufzeichnung der Ausscheidungsrate des Markes von einem glycosylierten oder entsialysierten markierten Antikörper oder Serumprotein als Funktion des Inhibitorspiegels bestätigt werden.
Das Experiment zeigt auch die Zeitdauer nach Beendigung der Inhibitorinfusion, bevor eine rasche Elimination des Markers eintritt. Es ist zu erwarten, daß diese Parameter entsprechend dem Zustand des einzelnen Patienten und dem Ausmaß, in dem die Leber- und/oder Nierenfunktion durch die Erkrankung beeinträchtigt sind, schwanken können. Die Erstellung eines Protokolls zur Verabreichung des Inhibitors, beginnend entweder vor, bei oder eine gewisse Zeit nach Verabreichung des modifizierten Antikörperkonjugats, kann auf die hepatische Antwort des Patienten und die Bedürfnisse der Therapiemodalität abgestimmt werden.
Es ist offensichtlich, daß die vorangehende Methode die zweite Antikörpereliminationsmethode ergänzt, die in Goldenberg, U.S. Patent 4.624.846 offenbart ist, einschließlich der Verwendung von Inhibitoren des Reticuloendothelialsystems (RES) zur Vermeidung einer starken Leberschädigung. Es ist auch offensichtlich, daß die Elimination in der zweiten Antikörpermethode durch einen anderen Mechanismus erfolgt, da sie durch das RES vermittelt wird, während bei dem vorliegenden Verfahren die Leberzellen-Elimination beteiligt ist.
Methoden zur Darstellung von Tumoren und infektiösen Läsionen bei Verwendung der Szintigraphie oder magnetischen Resonanz können durch die Verwendung der erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper und Antikörperkonjugate verbessert werden. Die regionale Verabreichung eines Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung oder MRI in der Form eines Antikörperkonjugats kann oftmals gegenüber der systemischen Verabreichung Vorteile aufweisen. Die Darstellung lymphatischer Strukturen wird im allgemeinen durch die Verabreichung des Bilddarstellungsmittels durch eine subkutane Injektion in eine Region vorgenommen, die von einem regionalen lymphatischen Drainierungssystem versorgt wird und ihrerseits regionale Lymphknoten von Interesse versorgt. Die intrathekale Verabreichung von MRI-Mitteln ist im allgemeinen der bevorzugte Weg zur Darstellung der Wirbelsäule und kann auch für die Darstellung des Gehirns effektiv sein. Die intrakavitäre Verabreichung von szintigraphischen oder MRI Mitteln kann dieselben Vorteile wie in der Therapie aufweisen, wo der Antikörper mit dem Gewebe außerhalb der Höhle kreuzreaktiv ist.
In allen diesen Fällen kann die Bildauflösung und Wirksamkeit verbessert werden, wenn das Darstellungsmittel rasch aus dem Blutstrom eliminiert wird, sobald es aus der Verabreichungsregion in den großen Kreislauf wandert. Der Blutpoolhintergrund wird verringert und die Aufnahme durch Gewebe, die nicht das Ziel darstellen, minimiert. Die rasche Elimination aus dem Blut kann die Zeit zwischen der Injektion und der Bilddarstellung verringern und die anderen Vorteile einiger Radioisotope mit kurzen Halbwertszeiten und MRI-Mitteln mit raschen metabolischen Eliminationsraten verstärken, besonders der freien radikalen Mittel. Zusätzlich wird die Verwendung von F(ab')&sub2; und besonders Fab und Fab'Fragmentkonjugaten durch die rasche Hintergrundelimination verbessert.
Bei den Therapiemitteln sind Antikörper mit den richtigen Spezifitäten für viele Arten von Tumoren und infektiösen Läsionen bekannt, und dieselben Antikörper werden oft sowohl zur Bilddarstellung als auch zur Therapie verwendet.
Radioisotope für den Radioimmunonachweis (RAID) umfassen Gamma- und Positron-Emitter, wobei die Gammaenergien im Bereich von etwa 50-500 KeV liegen. Solche geeigneten Radioisotope umfassen z. B. 1-131, 1-123, In-111, Ga-67 und Tc-99m. Die Markierung von Antikörpern mit Radioiod ist gut bekannt, und Verfahren für eine solche Markierung sind oben erwähnt. Die Radiometalle werden an Antikörper durch Chelatbildung oder durch direkte Markierung durch eine Reihe herkömmlicher Verfahren konjugiert. Chelatoren wie EDTA und DTPA wurden direkt oder durch kurze bifunktionelle Linker an Antikörper gebunden und werden zur In-, Ga, und Tc-Bindung verwendet. Eine Vielzahl anderer Chelatoren wurde entwickelt und werden weiterhin entwickelt, um Radiometalle zur Bilddarstellung fester zu binden, und jede dieser Markierungstechniken und Reagenzien kann in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, da es nicht auf bestimmte Darstellungsmittel begrenzt ist. Vielmehr kann die Wirksamkeit jedes szintigraphischen oder MRI-Antikörperkonjugats für die regional verabreichte Bilddarstellung durch Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhöht werden, da es effizienter aus dem großen Blutkreislauf eliminiert wird und die Darstellung nicht in dem Ausmaß beeinflußt, wie dies sonst der Fall ist.
MRI-bildverstärkende Mittel für die Antikörper-zielgerichtete Bilddarstellung umfassen eine Vielzahl von Antikörperkonjugaten, von welchen eine Reihe in Goldenberg, U.S. Patent 4.624.846 geoffenbart oder in der Wissenschaft gut bekannt ist, wie durch die hierin zitierten Literaturstellen bestätigt wird. Insbesondere Gd(III), Mn(II), Cu(II) und andere Übergangsmetall- und Metallionen der Actinidreihe mit einigen ungepaarten Elektronen in den inneren Hüllen liefern die paramagnetischen Momente, die zur wirksamen Verstärkung der Relaxationsrate der Protonen in ihrer unmittelbaren Nachbarschaft erforderlich sind. Die Chelatbildung solcher Metallionen erfolgt bei Verwendung von Chelatoren, die jenen ähnlich sind, die zur Bindung von Radiometallen verwendet werden, die zu denselben Übergangsmetallen und Actinidmetallreihen gehören. Solche Chelatoren sind in der Wissenschaft gut bekannt, und ihre Konjugation an Antikörper erfolgt durch ähnliche herkömmliche Techniken wie jene, die zur Bindung von Chelatoren für Radiometalle, wie oben beschrieben, verwendet werden. Nichtmetallische, z. B. freie radikale, MRI-Mittel, die an Antikörper konjugiert sind, erlangen durch die verbesserte Methodologie der Erfindung aus den obenerwähnten Gründen ebenso Vorteile.
Die Arten von Glycosiden, Glycosylierungsverfahren und das Ausmaß der Ladung der Glycosidreste ist in den meisten Fällen ähnlich wie bei den therapeutischen Konjugaten. Da die Mengen an Radioisotopen und paramagnetischen Metallionen im allgemeinen im Vergleich zu therapeutischen Dosen gering sind, ist es normalerweise vorteilhaft, die Glycosidladung der Konjugate in Übereinstimmung mit der bewahrten Immunoreaktivität zu maximieren. Eine solche Ladung ist im wesentlichen dem bevorzugten Maß an Glycosylierung gleich, das zur Erhöhung der raschen Elimination der Therapiekonjugate verwendet wird.
Die Verringerung der Ausströmungsrate von der Verabreichungsregion, z. B. durch Herbeiführen einer Flüssigkeitsansammlung, Verringerung der Atmungsfrequenz, Blockierung des Flusses der drainierenden Lymphgefäße und dergleichen, verstärkt die Aufnahme des Darstellungsmittels durch die Zielgewebe weiter und stellt eine bevorzugte Ausführungsform des Bilddarstellungsverfahrens in geeigneten Fällen dar. Wenn die Zielaufnahme ausreichend schnell ist, kann jedoch ein verhältnismäßig rasches Ausströmen des Mittels aus der Region und Elimination aus dem großen Kreislauf vorteilhafter sein, um die Verringerung des Hintergrundes und Verbesserung der Auflösung in der Bilddarstellung zu maximieren.
Die systemische, d. h. , intravenöse Verabreichung von szintigraphischen Bilddarstellungs- und MRI-Mitteln in Form von Antikörperkonjugaten kann auch durch Verwendung der vorliegenden Erfindung verbessert werden. Analog zu dem Therapiefall kann es vorteilhaft sein, die Eliminationsrate eines Antikörperkonjugats im Blutstrom zu manipulieren, so daß nach einer Periode einer hohen Blutkonzentration zur Aufnahme durch die Zielgewebe eine rasche Verringerung in der Hintergrund-Blutpoolaktivität erzielt werden kann. Dies kann durch Verwendung eines modifizierten, glycosylierten Konjugats gemäß der Erfindung und Injektion eines kompetitiven Inhibitors der Bindung durch hepatisches Lectin erreicht werden. Die Optimierung des Verabreichungszeitpunktes und -spiegels des Inhibitors wird, neben anderen Parametern, durch die besondere Art des darzustellenden Bildes, die Art von verwendetem Antikörper oder Fragment, das Zielgewebe und sein Ausmaß an vaskulärer Durchlässigkeit und die Antigenkonzentration bestimmt.
Auch hier sind die Arten von Inhibitoren, Glycosiden und Antikörpern und die Verfahren zu deren Herstellung stark zu den Therapiekonjugaten analog, mit den offensichtlichen Unterschieden in den Darstellungsradioisotopen oder MRI-Verstärkungsmitteln.
Eine sterile, injizierbare Zubereitung zur therapeutischen Verwendung beim Menschen nach dem Verfahren der Erfindung umfaßt normalerweise: (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines modifizierten Antikörpers oder Antikörperfragments, der oder das spezifisch an einen Marker bindet, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem eine Vielzahl von terminalen Gylcosidresten, die an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist; und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren sterilen Injektionsträger. Solche geeigneten Injektionsträger umfassen z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung, welche wahlweise Humanserumalbumin enthält. Wenn die Zubereitung in einem intravenösen Verabreichungsverfahren verwendet werden soll, enthält sie normalerweise einen kompetitiven hepatischen Lectin-Bindungsinhibitor in einer ausreichenden Menge, um die gewünschte Kontrolle der Eliminationsrate zu erlangen. Dies ist bei anderen injizierbaren Zubereitungen und Reagenzsätzen zur Bilddarstellung und Therapie der Fall.
Eine erfindungsgemäße, sterile, injizierbare Zubereitung zur Darstellung eines Tumors oder einer infektiösen Läsion bei einem menschlichen Patienten umfaßt normalerweise: (a) eine diagnostisch wirksame Menge eines modifizierten Antikörpers oder Antikörperfragments, der oder das spezifisch an einen Marker bindet, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment an ein Radioisotop oder ein Verstärkungsmittel zur magnetischen Resonanzdarstellung konjugiert ist, und der Antikörper oder das Antikörperfragment ferner an eine Vielzahl von terminalen Glycosidresten, die an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen binden, konjugiert ist oder auf ihm exponiert ist; und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren sterilen Injektionsträger.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzsatz zur Herstellung einer sterilen, injizierbaren Zubereitung zur therapeutischen Verwendung beim Menschen umfaßt normalerweise in einem oder mehreren geeigneten sterilen Behältern: (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines modifizierten Antikörpers oder Antikörperfragments, der oder das spezifisch an einen Marker bindet, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem eine Vielzahl von terminalen Gylcosidresten, die an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist; und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren sterilen Injektionsträger.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzsatz zur Herstellung einer sterilen, injizierbaren Zubereitung zur Darstellung eines Tumors oder einer infektiösen Läsion bei einem menschlichen Patienten umfaßt normalerweise in einem oder mehreren geeigneten sterilen Behältern: (a) eine diagnostisch wirksame Menge eines modifizierten Antikörpers oder Antikörperfragments, der oder das spezifisch an einen Marker bindet, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment an ein Radioisotop oder ein Verstärkungsmittel zur magnetischen Resonanzdarstellung konjugiert oder zur Konjugation angepaßt ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment ferner modifiziert ist, indem eine Vielzahl von terminalen Gylcosidresten, die an den Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor des Menschen binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist; und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren sterilen Injektionsträger.
Ohne weitere Ausführung wird angenommen, daß ein Fachmann mit Hilfe der vorangehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollen Ausmaß nutzen kann. Die folgenden bevorzugten spezifischen Ausführungsbeispiele sollen daher nur der Veranschaulichung und in keiner Weise als Einschränkung der übrigen Beschreibung dienen. In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen unkorrigiert in Grad Celsius angegeben; wenn nicht anders angeführt, sind alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Therapie mit radioiodiertem Konjugat

(a) Glycosylierung von MoAb
Cyanomethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (Sigma Chemical Co.) wird in Methanol bei 0,1M gelöst und mit 0,1 Volumen 0,1M Natriummethoxid in Methanol vermischt. Teilmengen werden verdampft und in 0,25M Natriumboratpuffer gelöst, pH 8,5, der gereinigtes antiovarielles Oberflächenantikörper-IgG enthält. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Probe in PBS dialysiert. Auf dem Antikörperkonjugat befinden sich etwa 25 β-D-Galactosereste.
(b) Radioiodierung
Die Radioiodierung des glycosylierten Antikörpers mit I-131 erfolgt im wesentlichen durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 des U.S. Patents Nr.
4.348.376 und eine sterile, pyrogenfreie Lösung davon wird im wesentlichen nach dem Beispiel 5(a) dieses Patents zubereitet.
(c) Therapie einer Patientin mit Ovarialkarzinom durch i.p. Verabreichung
Eine Patientin mit Ovarialkarzinom, die nach dem chirurgischen Eingriff einen intraperitonealen Katheter eingesetzt bekam und eine Reihe von nichtresektierbaren kleinen und mittleren festen Tumorknoten im gesamten Peritonealraum aufweist, erhält durch Infusion durch den Katheter etwa 150 mCi der Lösung vom obigen Absatz (b), vorzugsweise auf ein Volumen von etwa 0,5-2 Liter verdünnt. Die Verkleinerung von größeren Massen und das offensichtliche Verschwinden von kleineren Tumorherden wird bei der chirurgischen Nachuntersuchung festgestellt.

Beispiel 2

Intravenöse Therapie

(a) Glycosylierung von monoklonalem Anti-CEA-I-131
Der monoklonale Anti-CEA-Antikörper wird, im wesentlichen wie in Beispiel 1(a), glycosyliert, um etwa 15 β-D-Galactose-thioglycosidreste zu konjugieren.
(b) Radioiodierung
Die Radioiodierung und Herstellung einer sterilen, pyrogenfreien Lösung des markierten Konjugats werden im wesentlichen wie in Beispiel 1(b) ausgeführt.
(c) Therapie
Die Therapie wird an einer Patientin mit Ovarialkarzinom im wesentlichen wie in Beispiel 7(a) des U.S. Patents 4.348.376 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine sterile Lösung von entsialysiertem Human-α-1-Säure-Glycoprotein, das durch im Handel erhältliche, agarosegebundene Neuraminidasebehandlung des im Handel erhältlichen Proteins hergestellt wird, gemeinsam mit dem radiomarkierten Antikörper über einen Zeitraum von mehreren Stunden infundiert wird und die Infusion des Inhibitors alleine 35 Stunden fortgesetzt und dann beendet wird, und eine rasche Elimination des zirkulierenden Antikörperkonjugats beobachtet wird. Die Knochenmarktoxizität des Konjugats ist gegenüber einer ähnlichen Dosis, die ohne rasche Leberzellen-Elimination verabreicht wird, verringert.

Beispiel 3

Systemische Szintigraphie mit Tc-99m-Fab

Antic-CEA-Fab wird mit 25 β-D-Galactoseresten und mit 2-3 bis-Thiosemicarbazonchelatoren konjugiert und dann mit Tc-99m bei Verwendung von Zinndichloridreduktion von Pertechnetat markiert. Dieses Konjugat wird intravenös gemeinsam mit einer sterilen Lösung von entsialysiertem Human α-1-Säure-Glycoprotein injiziert, das durch Neuraminidasebehandlung des im Handel erhältlichen Proteins hergestellt wird. Die Infusion des Inhibitors wird nach 12 Stunden beendet, wonach eine rasche Elimination des zirkulierenden Fab-Konjugats beobachtet wird. Die rasche Elimination des zirkulierenden, nichtzielgerichteten Fab-Konjugats ermöglicht die szintigraphische Darstellung von kolorektalem Krebs früher als sonst und mit höherer Auflösung, entweder mit oder ohne Subtraktion.
Die vorangehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg wiederholt werden, indem die generisch oder spezifisch beschriebenen Reaktionsteilnehmer und/oder Verfahrensbedingungen dieser Erfindung anstelle der in den vorangehenden Beispielen beschriebenen verwendet werden.
Aus der vorangehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die wesentlichen Merkmale dieser Erfindung erkennen und verschiedene Veränderungen und Modifikationen der Erfindung durchführen, um diese an verschiedene Gebrauchsweisen und Bedingungen anzupassen.

Claims

1. Modifiziertes Antikörperkonjugat, welches einen Antikörper oder Antikörperfragment aufweist, das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den menschlichen Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist.

2. Antikörperkonjugat nach Anspruch 1, das an ein Radioisotop, ein Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, ein Toxin oder ein Arzneimittel konjugiert ist.

3. Antikörperkonjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Glycosidrest Galactose, N-Acetylgalactosamin oder Glucose ist.

4. Antikörperkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Tumor ein Ovarialtumor ist.

5. Modifiziertes Antikörperkonjugat, welches einen Antikörper oder Antikörperfragment aufweist, das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den menschlichen Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist, zur Verwendung in der Medizin.

6. Antikörperkonjugat nach Anspruch 5, das an ein Radioisotop, ein Verstarkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, ein Toxin oder ein Arzneimittel konjugiert ist.

7. Verwendung eines modifizierten Antikörperkonjugats, welches einen Antikörper oder Antikörperfragment aufweist, das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den menschlichen Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist, in der Zubereitung eines Mittels zur Behandlung oder Diagnose von Tumoren und infektiösen Läsionen.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Antikörperkonjugat an ein Radioisotop, ein Verstärkungsmittel für die magnetische Resonanzdarstellung, ein Toxin oder ein Arzneimittel konjugiert ist.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein modifiziertes Antikörperkonjugat aufweist, weiches einen Antikörper oder Antikörperfragment aufweist, das imstande ist, spezifisch an einen Marker zu binden, der durch einen Tumor oder eine infektiöse Läsion erzeugt wird oder damit verbunden ist, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment modifiziert ist, indem ein terminaler Gylcosidrest, der imstande ist, an den menschlichen Leberzellen-Asialoglycoproteinrezeptor zu binden, an ihm befestigt oder auf ihm exponiert ist; und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, die eine sterile injizierbare Zusammensetzung ist.