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DE3879406T2 - Bestimmung aktiver bestandteile der proteolyse. - Google Patents

Bestimmung aktiver bestandteile der proteolyse.

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DE3879406T2
DE3879406T2 DE8888906168T DE3879406T DE3879406T2 DE 3879406 T2 DE3879406 T2 DE 3879406T2 DE 8888906168 T DE8888906168 T DE 8888906168T DE 3879406 T DE3879406 T DE 3879406T DE 3879406 T2 DE3879406 T2 DE 3879406T2
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dried
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Petter Friberger
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Chromogenix AB
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine bevorzugt in der klinischen Diagnose zu verwendende gefriergetrocknete Reagentienkombination, die eine einfache und schnelle Bestimmung von bei der Protolyse wirksamen Bestandteilen ermöglicht, z.B. von Proteasen und insbesondere Proenzymen, Inhibitoren, Cofaktoren und Proteaseaktivatoren. Die Erfindung betrifft außerdem ein neues Verfahren zur Herstellung einer solchen Reagentienkombination und deren Verwendung auf den Gebieten der Coagulation und der Fibrinolyse.
  • Proteinspaltende Enzyme, sogenannte Proteasen, haben eine Vielzahl von wichtigen Funktionen im Körper. Als Beispiele für Proteasen sind zu erwähnen: Trypsin und Chymotrypsin, die vom Pancreas ausgeschieden werden und am Verdauungsprozeß beteiligt sind; Elastase, Kallikrein und verschiedene Arten des Catepsins und die Enzyme des komplementären Systems, d.h. diejenigen, die unter anderem an Reaktionen beteiligt sind, die durch entzündliche oder allergische Bedingungen hervorgerufen werden; Thrombin und die Faktoren VIIa, Xa, XIa und XIIa, die aus Proteasen bestehen, welche an der zur Bildung von Blutcoagulum führenden Reaktionskette maßgeblich beteiligt sind; und Plasmin und exogene Urokinase, die die Auflösung des Blutcoagulums bewirkende Proteasen sind.
  • Demgemäß sind die Diagnosemethoden zur in-vitro-Messung der Proteaseaktivität für eine Vielzahl von klinischen Anwendungen von grober Wichtigkeit. Nicht nur die Menge der aktiven Protease, sondern vor allem die Menge an Proenzym, das in aktive Protease umgewandelt werden kann, und außerdem die Mengen von an proteolytischen Prozessen beteiligten Inhibitoren und Aktivatoren werden gemessen. Selbstverständlich sind solche Messungen von großer Wichtigkeit bei der Untersuchung von pathologischen Zuständen. Bei bestimmten Behandlungen, z.B. in der Chirurgie und/oder bei der medikamentösen Behandlung, wird vielfach zuerst eine quantitative Bestimmung einiger dieser Substanzen ausgeführt.
  • Herkömmliche Methoden zur Bestimmung von bei der Proteolyse wirksamen Komponenten , z.B. Proteasen und verwandte Faktoren, z.B. Proenzyme, Inhibitoren und Aktivatoren, basieren auf sogenannten Bioassays, immunologischen in-vitro-Reaktionen oder auf der Verwendung von biologischen Proteinen, die nicht an sich natürliche Substrate für die verwandte Protease sein müssen.
  • Die Nachteile der obigen Verfahren bestehen darin, daß sie sowohl im Hinblick auf ihre Durchführung als auch durch die Einstellung zeitraubend und arbeitsaufwendig sind; außerdem haben sie eine begrenzte Empfindlichkeit und/oder zeigen eine fehlende Spezifität, und sind darüber hinaus schwer zu standardisieren.
  • In den letzten Jahren wurden auf Aminosäuren oder kurzen Peptiden basierende synthetische, niedrigmolekulare Subtrate entwickelt und mit einem gewöhnlich photometrisch ohne weiteres meßbaren Marker, der leicht von Proteasen abgespalten wird, ausgestattet. Diese Substrate haben in großem Male die Verfahren zur Quantifizierung von Proteasen erleichtert, da viele der oben erwähnten Nachteile mittels solcher Substrate beseitigt wurden (Hemker H.C. - Handbook of synthetic substrates, 1983, Martinus Mijhoff Publishers, Boston).
  • Diese Substrate, insbesondere solche mit einem photometrisch meßbaren Marker versehenen, sogenannte chromogene Substrate, ermöglichten so die Entwicklung von Verfahren mit verbesserter Spezifität und Reproduzierbarkeit. Überdies wird durch diese Verfahren die Aktivität anstatt der Menge gemessen, wie es z.B. bei immunologischen Methoden der Fall ist; dadurch erhält man ein lineares Verhältnis des gesuchten Parameters zum Meßergebnis, im Unterschied zu den log-log- und linlog-(ln-log)-Verhältnissen, die meist bei sogenannten Bioassays vorkommen.
  • Trotz der o.g. Vorteile sind die auf der Aufspaltung von solchen, üblicherweise chromogenen, Substraten basierenden Meßverfahren noch aufgrund einiger Nachteile, die deren Nützlichkeit (Anwendungsmöglichkeit) begrenzen, beeinträchtigt.
  • In der Regel umfassen diese sogenannten Substratverfahren Zweistufenreaktionen, welche einerseits eine rein biochemische Reaktion und andererseits eine Reaktion zwischen einer Protease und einem geeigneten Substrat beinhalten. In Abhängigkeit davon, welcher aktive Bestandteil bestimmt werden soll, kann die Reaktion wie folgt dargestellt werden. A. Bestimmung des Inhibitors B. Bestimmung des Cofaktors C. Bestimmung des Aktivators (P im Überschuß) D. Bestimmung des Proenzyms (A im Überschuß)
  • Somit bedeutet der zweite Reaktionsschritt Spaltung des einen Marker aufweisenden Substrats durch den Einfluß eines entsprechenden Enzyms, wobei sich die Menge des für die Spaltung zur Verfügung stehenden Enzyms aus der Menge des aktiven Enzyms, das nachher zurückbleibt oder durch die erste Reaktion gebildet wird, ergibt.
  • In all diesen Fällen ist die freigesetzte Menge des Markers M proportional zu den Analyten I, C, A bzw. P. Die obigen Abkürzungen sind im folgenden erklärt, Konzentrationen sind durch einen Index markiert.
  • E = Enzym
  • I = Inhibitor
  • S-M = mit Marker ausgestattetes Substrat
  • M = Marker
  • S = nach Abspalten des Markers zurückbleibender Substratrest
  • R = mit dem Enzym durch den Einfluß eines Cofaktors reagierender Reaktant
  • C = Cofaktor
  • A = Aktivator
  • P = Proenzym oder Enzymzusammensetzung, die anderweitig aktiviert werden kann
  • p = Rest der Aktivierung einer Proenzym/Enzym-Zusammensetzung
  • In der Regel sind diese Zweistufenmethoden zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Da eine Vielzahl von Pipettierstufen eingeschlossen ist, ist es wichtig, überdies bei der Ausführung der Analyse die Reaktionszeiten der jeweiligen Schritte mit großer Sorgfalt zu befolgen. Weiterhin beschränkt das Zweistufenverfahren die Anzahl der Tests, die in ein und derselben Serie manuell ausgeführt werden können.
  • Daneben wird die Einsetzbarkeit dieser Verfahren durch die verhältnismäßig kurze Lagerfähigkeit (ein Monat oder weniger), die rekonstituierte biochemische Reagentien gewöhnlich aufweisen, beeinträchtigt. Im Handel erhältliche Reagentien für diese Analysen sind gewöhnlich so gepackt, daß sie für 20 bis 200 Analysen ausreichen. Folglich sollte der Anwender aus ökonomischen Gründen eine entsprechende Anzahl von Analysen innerhalb der Zeitspanne, in der die rekonstituierten Reagentien stabil sind, durchführen. Bis heute haben die Techniken und Kosten einzelne Packungen für separate Tests verhindert, da die verwendeten Reagentien üblicherweise auf die eine oder andere Weise individuell verpackt werden müssen, z.B. in separaten Paketen oder räumlich getrennt in einem Verpackungscontainer ("compartmentalized").
  • Gegenwärtig gibt es nur eine im Handel erhältliche Packungsform, bei der sich die Reagentien für einen Einmaltest physikalisch getrennt in ein- und demselben Plastikcontainer befinden (ACAR, Dupont, USA). Der Container mit technisch kompliziertem Design ist lediglich in einem speziell für diesen Zweck hergestellten Instrument verwendbar, welches die Trennwände zwischen den Reagentiencompartimenten automatisch aufbricht und Proben und weitere Reagentien nach vorher festgelegter Zeit hinzugibt.
  • Es ist auch möglich, die Handhabung konventionell verpackter Reagentien bis zu einem gewissen Grad zu vereinfachen, indem man die Reaktionsbedingungen und die Reaktanten so verändert, daß das Zweistufenverfahren in ein Einstufenverfahren umgewandelt wird. Die beiden Reaktionen können dann so parallel ablaufen, daß der Analyt immer noch direkt proportional zur Photometerablesung ist. Dieses Verfahren wird entweder so ausgeführt, daß verschiedene Reagentien unverzüglich nacheinander zugefügt werden - was die Anzahl der Pipettierungsstufen nicht reduziert - oder daß bestimmte Reagentien im voraus vermischt werden (z.B. Substrat und biochemisches Reagens). Das Pipettieren wird dann vereinfacht, aber man erhält ein noch instabileres Reagens (Lagerfähigkeit gewöhnlich nur ein Tag). Besonders die letztgenannte Methode wurde in automatischen Verfahren angewendet (siehe unten).
  • Ein Vorteil der Substratverfahren ist ihre Anwendbarkeit bei automatischen Analysatoren für die Anwendung in Kliniken, wobei sie den Wechsel zum Einstufenverfahren des Meßprozesses erleichtern (Bergström K. und Lahnborg, G. Tronb. Res 1975, Bd. 6, 223-233; Kapke G.F. et al, Clin. chem. 1982, Bd. 28, 1521-1524). Auf diese Weise werden viele Nachteile der Substratverfahren ausgeräumt. Eine Investition in automatische Analysatoren erfordert jedoch lange Testreihen und die Konzentration auf zentrale Einheiten für die Wirtschaftlichkeit; das bedeutet allerdings, daß die Zeitspanne von der Probennahme bis zum Erhalt der Analyseergebnisse inakzeptabel lang werden kann.
  • Ein vergleichbar kompliziertes Verfahren zum Erhalt von Einstufenverfahren wird in der EP-A2-0 168 738 beschrieben; Pipettierstufen und exakte Zeitvorschriften werden vermieden. Das hier beschriebene Verfahren ist jedoch im wesentlichen beschränkt durch das technisch komplizierte Verfahren des Aufbringens der biochemisch notwendigen Reagentien und Substrate auf eine feste Trägermatrix, und zwar entweder in getrennten Verfahren unter Verwendung verschiedener, die Reaktion verhindernder Lösemittel oder durch Kompartimentierung. Außerdem ist ein speziell zu diesem Zweck konstruierter Apparat erforderlich, um die resultierende Farbe abzulesen.
  • Die US-Patentschrift 4 409 327 offenbart eine verbesserte Bestimmung von niedrigen Heparinkonzentrationen, wobei die Verbesserung durch Zugabe von Harnstoff und bestimmten Harnstoffderivaten zu einem konventionellen Reagensgemisch erreicht wird. Obwohl in diesem Patent beansprucht wird, daß ein Reagens Thrombin oder den Xa-Faktor und ein chromogenes Substrat mit einem pH von 6-9 enthält, das im Trockenstadium durchaus stabil ist und nach Zugabe von Wasser ca. eine Woche gelagert werden kann, wird dies nicht bewiesen. Im Gegenteil sollte ein solches Reagens eine niedrige Stabilität besitzen, da der genannte pH-Bereich der Lösung dem optimalen pH-Bereich der genannten Enzyme entspricht. Die dargestellten Beispiele des Patents der Reagentienmischung für die Bestimmung der Heparinaktivität im Plasma schließen nicht das verwendete chromogene Substrat ein. Anfänglich wird das genannte Gemisch mit der Testprobe inkubiert, wonach das Subtrat hinzugefügt wird und die gewünschte Reaktion sofort beginnt.
  • Die DE-A-34 13 311 beschreibt die Bestimmung der Thromboplastinzeit. Thromboplastin ist kein Enzym; es ist jedoch oft mit Proteasen verunreinigt. Auf diese Weise wird gemäß diesem Patent ein chromogenes Substrat mit hoher Spezifizität für Thrombin, aber niedriger Spezifizität für andere Proteasen verwendet, um ein Thromboplastinzeit-Reagens mit verbesserter Stabilität zu erhalten. Beispiel 1 offenbart ein lyophilisiertes Reagens, das ein chromogenes Substrat umfaßt und Thromboplastin einschließt. Enzymatische Aktivität ist jedoch im Reagens nicht vorhanden, sondern wird mit der Testprobe geliefert.
  • Die EP-A-O 123 883 beschreibt ein Reagens für die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit, das ein Sulfatid, ein Phospholipid und ein lösliches Calciumsalz in Kombination mit einem für Thrombin spezifischen chromogenen Substrat enthält, wobei das Reagens lyophilisiert sein kann. Dieses Reagens enthält keine Komponente, die enzymatische Reaktivität gegenüber dem chromogenen Substrat aufweist. Somit wird das Subtrat nicht durch andere Reagenskomponenten vor deren Anwendung abgebaut.
  • Es ist der Gegenstand der Erfindung, eine Reagentienkombination zu schaffen, durch die die Bestimmungen von proteolytisch aktiven Komponenten leicht in einem einzigen Schritt ausgeführt werden können, wobei das Substratverfahren angewendet wird, wobei jedoch die oben erwähnten Nachteile eliminiert werden.
  • Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch eine gefriergetrocknete Reagentienkombination gemäß Anspruch 1 erreicht.
  • Demgemäß bezieht sich die Erfindung auf eine gefriergetrocknete Reagentienkombination, die in einem Behälter eingeschlossen und zur direkten oder indirekten Bestimmung einer bei der Proteolyse wirksamen Komponente vorgesehen ist, und zwar durch Spaltung eines in der Reagentienkombination enthaltenen, durch eine Protease unter Bildung eines meßbaren Meßwerts spaltbaren Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagentienkombination in im wesentlichen nicht-reagierter Form sämtliche für die Bestimmung erforderlichen Reagentien enthält, wobei die Reagentien ein chromogenes Substrat und eine Komponente mit enzymatischer Aktivität gegenüber dem Substrat sowie gegebenenfalls ein an sich bekanntes Additiv oder mehrere umfassen, und daß sie durch eine an sich bekannte Gefriertrocknung einer sämtliche in der gefriergetrockneten Reagentienkombination in im wesentlichen nicht-reagierter Form enthaltenden Lösung hergestellt ist, wobei die gefriergetrocknete Reagentienkombination bei ihrer Rekonstitution, z.B. in einer Pufferlösung, im wesentlichen ihre ursprüngliche Aktivität aufweist.
  • Die Reagentienkombination ist vorzugsweise in einer für das Ausführen einer separaten Einschritt-Substratverfahren-Bestimmung von proteolytisch aktiven Komponenten, z.B. Proenzymen, Proteaseaktivatoren, Cofaktoren oder Proteaseinhibitoren oder deren Aktivatoren, ausreichenden Menge in dem Behälter enthalten.
  • Demgemäß beinhaltet die vorliegende Reagentienkombination ein Substrat, das durch eine Protease gespalten werden kann, um einen detektierbaren Meßwert zu erhalten. Abhängig davon, welche proteolytisch aktive Komponente zu bestimmen ist, enthält die Reagentienkombination auch andere Reagentien, die üblicherweise aus den folgenden Komponenten ausgewählt sind: Proenzym, Proteaseaktivator, Proteaseinhibitor, ein Aktivator für den Inhibitor und ein Cofaktor für die Proteolyse. Die Reagentienkombination enthält, wie unten detaillierter erklärt wird, vorzugsweise auch Additive, z.B. Stabilisierungsadditive.
  • Einsetzbare Subtrate sind alle diejenigen, die durch Proteasen gespalten werden können, um einen detektierbaren Meßwert zu erhalten. Besonders geeignete Subtrate sind einen photometrisch meßbaren Meßwert gebende, sogenannte chromogene Subtrate. Die o.g. synthetischen Substrate werden dann bevorzugt eingesetzt. Solche Substrate sind im Handel erhältlich, z.B. von KabiVitrum AB Diagnostika, Mölndal, Schweden, z.B. unter den handelsüblichen Bezeichnungen S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys- pNA 2HCl), S-2337 (N-alpha-Benzoyl-Ile-Glu(gamma-piperidid)- Gly-Arg-pNA HCl), S-2366 (< Glu-Pro-Arg-pNA HCl), S-2390 (H-D-Val-Phe-Lys-pNA 2HCl) und S-2732 (N-alpha-Succinoyl-Ile- Glu(gamma-piperidid)-Gly-Arg-pNA HCl). Zusätzlich zu diesen Substraten, die in den folgenden Beispielen beschrieben sind, werden weitere gemäß der Erfindung einsetzbare Substratbeispiele in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefaßt. Die genannten Substrate sind nur Beispiele, sollen die vorliegende Erfindung jedoch nicht beschränken. Tabelle 1 Analyte Enzym Bestimmung Struktur 1. Antifaktor Xa 2. Antithrombin 3. Antiplasmin 4. Heparin 5. Fibrinmonomer 8. Plasminogen 9. Protein C Thrombin Plasmin Chromozym-Lxx) Chromozym-P'Lxx) Spektrozym-Xaxx) Chromozym-PLxx) Succinoyl-D-Arg-Gly-Arg-pNA Tosyl-Gly-Pro-Lys-PNA siehe Antifaktor Xa! Succinoyl-Ile-Glu-(gamma-piperide)-Gly-Arg-pNA Benzyloxycarbonyl-D-Arg-Gly-Arg-pNA Methyloxycarbonyl-D-CHG-Gly-Arg-pNA x) Hersteller KabiVitrum AB xx) Hersteller Phentapharm AG, Basel, Schweiz Abkürzungen: 80 C = t-Butyloxycarbonyl CHA = Cyclohexylalanin CHG = Cyclohexylglycin Tosyl = p-Toluolsulfonyl
  • Die Erfindung ist allgemein anwendbar für die Bestimmung der proteolytisch wirksamen Komponenten gemäß den Grundprinzipien für das Substratbestimmungsverfahren, vorausgesetzt, daß solche Gefriertrocknungsbedingungen für eine Lösung der Reagentien hergestellt werden können, daß daß diese Verbindungen ihre Wirkung nicht verlieren, indem sie z.B. miteinander reagieren, sondern im wesentlichen ihre ursprüngliche Aktivität nach der Rekonstitution zurückerlangen.
  • Bis jetzt war es möglich, geeignete Bedingungen für alle Reagentienkombinationen von Interesse herzustellen, insbesondere für die Bereiche der Coagulation und Fibrinolyse, ausgenommen der Kombination von Reagentien, die für die Bestimmung von &alpha;&sub1;-Antitrypsin und F VIII erforderlich sind. Solche Bedingen werden jedoch nach weiteren Versuchen möglicherweise auch für diese Kombinationen geschaffen werden.
  • Diese Erfindung ist zur Bestimmung der o.g. proteolytisch aktiven Komponenten für das Substratbestimmungsverfahren gut geeignet. Demgemäß liegen geeignete Reagentienkombinationen vor, wenn die proteolytisch wirksame Komponente besteht aus a) einem Inhibitor, b) einem Cofaktor, c) einem Aktivator oder d) einem Proenzym, einem chromogenen Substrat, das durch Protease gespalten werden kann in Kombination mit a) einer Protease, b) einer Protease und einem Reaktanten, der mit einer Protease unter dem Einfluß des Cofaktors reagieren kann, um bestimmt zu werden, c) einem Proenzym oder einer anderen wirksamen Enzymverbindung und bzw. d) einem Aktivator für das Proenzym. Zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden durch erläuternde Beispiele dargestellt.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Herstellung der gefriergetrockneten Reagentienkombination, deren Herstellungsverfahren in Anspruch 5 definiert ist.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Reagentienkombination, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine sämtliche für die Bestimmung erforderlichen Reagentien enthaltende und gegebenenfalls ein oder mehrere an sich bekannte Additive enthaltende Lösung in einem Lösemittel, z.B. Wasser, unter so kontrollierten Bedingungen hergestellt wird, daß die Reagentien in der sich ergebenden Lösung und einer anschließenden Gefriertrocknung derselben im wesentlichen nicht-reaktiv bleiben, und daß die Lösung in dem Behälter in an sich bekannter Weise gefriergetrocknet wird, wobei die gefriergetrocknete Reagentienkombination erhalten wird, in der die Reagentien in einer im wesentlichen nicht-reagierten Form enthalten sind und diese ihre im wesentlichen ursprüngliche Aktivität nach der Rekonstitution der Reagentienkombination, z.B. in einer Pufferlösung, bewahren.
  • Gemäß der Erfindung ist es wichtig, daß alle in der Gefriertrocknungskombination enthaltenen Reagentien in derselben Lösung gelöst sind, zumindest im eigentlichen Gefriertrocknungsverfahren. Das Verfahren kann besonders leicht ausgeführt werden, wenn zunächst aus allen beteiligten Reagentien eine Vorratslösung hergestellt wird, wobei diese außerdem mögliche Additive enthält, die danach in die Behälter verteilt und in diesen gefriergetrocknet werden. Es ist jedoch natürlich außerdem möglich, mehrere Vorratslösungen herzustellen, die eines oder einige der betreffenden Reagentien enthalten sowie mögliche Additive, wobei die Lösungen danach zusammengebracht werden und gemeinsam als eine einzelne Lösung in dem jeweiligen Container gefriergetrocknet werden. Wasser ist ein geeignetes Lösemittel, selbst wenn Additive oder andere Lösemittel verwendet werden können, z.B. Essigsäure, Methanol und Dimethylsulfoxid.
  • Gemäß einer geeigneten Ausführungsform der Erfindung wird eine für einen Einzeltest vorgesehene Menge der Lösung (oder Lösungen) in jeden Container gegeben. Eine Küvette oder eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte oder ähnlichem wird dann vorzugsweise als Container verwendet, welchem eine Probe zugegeben werden kann, worauf der Container direkt einer Standardausrüstung der klinischen Analyse, z.B. Photometrie, zugeführt wird.
  • Gemäß der Erfindung ist es wichtig, daß die Bedingungen bei der Herstellung der Lösung aller Reagentien oder bei der Kombination verschiedener Lösungen von Reagentien eingestellt werden, z.B. durch Versetzen des Lösemittels mit geeigneten Additiven von stabilisierenden löslichen Komponenten und/oder vorzugsweise mittels Puffersalzen in einem solchen solchen pH-Bereich, daß ein Gemisch solcher gewöhnlich miteinander reaktiver Komponenten für die Herstellung der gefriergetrockneten Reagentienkombination gelöst sein können, ohne daß unerwünschte, aber an sich erwartete Reaktionen bei der Herstellung auftreten. Wie die Bedingungen aufeinander abgestimmt werden müssen, hängt von den in der Reagentienkombination enthaltenen Reagentien ab und wird weiter unten näher erläutert.
  • Die Festsetzung solcher kontrollierter Bedingungen ermöglicht erfindungsgemäß eine gleichzeitige Gefriertrocknung aller Reagentien in einer einzigen Lösung. Das Reagentiengemisch in der endgültigen Form des Produkts ist in einem Gefriertrocknungszustand ohne besondere Compartimentisierung der in dem Gemisch enthaltenen Komponenten vorhanden, wobei das Gemisch eine gute Stabilität aufweist; ein sofortiges Lösen aller in dem Reaktionsgemisch enthaltenen Komponenten wird für die gefriergetrocknete Reagentienkombination durch den Zusatz einer in einem Puffer gelösten Probe erreicht.
  • Demgemäß wird durch die Erfindung ein Produkt hergestellt, das die Anwendung aller Vorteile der Substratbestimmungsverfahren ermöglicht und womit weitere Vorteile erreicht werden. Mehrere Pipettierschritte sind z.B. nicht nötig, da das Pipettieren nur für die Zubereitung der Probe notwendig ist. Gleichermaßen werden die Ansprüche an die Genauigkeit in bezug auf die Einhaltung korrekter Inkubations- und Reaktionsperioden ausgeschaltet. Zusätzlich werden niedrigere Ansprüche an die technische Ausbildung des Ausführenden gestellt und es ist kein speziell gebautes Instrument für die Verwendung der Reagentienkombination nötig.
  • Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Produkte ist eine beträchtlich längere Lagerfähigkeit gegenüber entsprechenden rekonstituierten Reagentien, und daß sie durch den Hersteller standardisiert werden können; dies ermöglicht beträchtlich vereinfachte Verfahren zur Berechnung der Testergebnisse im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren desselben Typs, die gewöhnlich die Erstellung einer Eichkurve erfordern.
  • Die vorliegende gefriergetrocknete Reagentienkombination ist daher außerordentlich gut für den Routineeinsatz unter Verwendung üblicher Instrumente zur Ausführung einzelner Tests in kleinen und/oder großen Kliniken geeignet, wenn diese keinen automatisierten Analysator betreiben und/oder kein qualifiziertes Personal zur Verfügung steht. Weiterhin ermöglicht das erfindungsgemäße Produkt, in akuten Situationen einen schnellen Befund zu erhalten, da die Bestimmung lokal ("am Bett") ausgeführt werden kann und keine Vorbereitungsarbeit, z.B. das Herstellen von Reagentienlösungen, ein Erstellen der Eichkurve oder das Ausführen von Vergleichen, benötigt wird.
  • Weiterhin bedeutet die Verwendung des erfindungsgemäßen Produkts eine beträchtliche Ersparnis von Resourcen und Material im Vergleich mit handelsüblichen Produkten, z.B. "Kits", die für die Bestimmung von wenigen Proben nicht geeignet sind, oder, soweit sie für die Ausführung einer einzelnen Analyse bestimmt sind, eine spezielle Ausrüstung erfordern.
  • Wie oben ausgeführt enthält die erfindungsgemäße Reagentienkombination ein Substrat, daß die Eigenschaft besitzt, von Proteasen und zusätzlich anderen Reagentien gespalten zu werden, in Abhängigkeit davon, welche proteolytisch aktive Komponente man zu bestimmen wünscht. Folglich muß die Herstellung dieses Produktes unter Bedingungen stattfinden, die im Hinblick darauf überprüft werden, welche Reagentien in die Reagentienkombination eingeschlossen werden sollen, d.h. in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Komponente. Das Verfahren wird im folgenden im Hinblick auf seine gegenwärtig wichtigen Ausführungsformen, nämlich Bestimmung von Inhibitoren, Cofaktoren, Aktivatoren und Proenzymen, näher erläutert.
    • I. Verfahren zur Herstellung eines Produkts zur Bestimmung von Inhibitoren
  • Die Bestimmung der Menge an Proteaseinhibitor in einer Probe basiert auf der Tatsache, daß eine bekannte und definierte Menge eines Enzym-Inhibitors durch die Bildung eines 1: 1-Komplexes zu der Probe gegeben wird und daß der Enzymüberschuß durch Zugabe einer bekannten und definierten Menge eines geeigneten Substrats bestimmt wird.
  • Gemäß der Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß es bei geeigneten Bedingungen für die Herstellung im großen Maßstab möglich ist, eine sowohl das Enzym als auch das Substrat enthaltende Lösung unter kontrollierten Bedingungen derart herzustellen, daß weder das Enzym noch das Substrat in der Lösung oder bei der Gefriertrocknung zerstört wird. Außerdem ist außerordentlich überraschend, daß das Enzym bei der Herstellung der Reagentienkombination nicht mit dem Substrat reagiert, obwohl das Enzym und das Substrat nach der Rekonstitution der gefriergetrockneten Kombination fast vollständige Aktivität erreichen, z.B. durch Zusatz eines geeigneten Puffers.
  • Bei der Bestimmung von Proteaseinhibitoren basiert das Verfahren der Erfindung auf der Tatsache, daß ein pH-Bereich ermittelt wurde, innerhalb dessen die Enzymaktivität in bezug auf das Substrat vernachlässigbar ist; es findet jedoch keine Denaturierung des Enzyms oder irgendeine Hydrolyse des Substrats statt. Ein solcher pH-Bereich ist bevorzugt 3-5 und insbesondere bevorzugt 4,2. Der günstigste pH-Wert innerhalb des Bereiches variiert etwas, je nachdem, welches Enzym und welches Substrat für den Prozeß verwendet werden soll.
  • Weiterhin ist es vorteilhaft, daß für die Abstimmung des optimalen pH ein solcher Puffer verwendet wird, dessen Salze, welche beim Gefriertrocknen austreten oder nach dem Gefriertrocknen in solch geringen Mengen vorhanden sind, daß die Probe vor der Analyse in den üblicherweise verwendeten Puffern die einen pH von 6,5 bis 9,5 aufweisen, zubereitet werden kann, so daß optimale Reaktionsbedingungen, d.h. pH 6,5 bis 9,5, sowohl für die Substrat-Enzym-Reaktion als auch für die Enzym-Inhibitor-Reaktion erhalten werden. Geeignete Puffer für dieses Verfahren zur Herstellung von Reagentien sind Gemische schwacher organischer Säuren wie mit den entsprechenden Salzen versetzte Ameisen- oder Essigsäure. Außerdem können andere Säuren, die einen pKa-Wert in demselben Bereich haben wie Zitronensäure, Ascorbinsäure usw., verwendet werden; jedoch werden in der Regel niedrigere Konzentrationen benötigt, mit dem Ergebnis, daß man einen bedeutend instabileren pH erhält.
  • Um einen Nachteil des Verfahrens während der Gefriertrocknung und während der anschließenden Lagerung der Reagentienmischung zu verhindern und um beim Hinzugeben der Probe ein schnelles Lösen der Reagentienmischung zu fördern sowie zur Minimierung der Reagensadsorption an dem Reagensbehälter werden geeignete Zusätze wie anorganische Salze, inaktivierte Proteine, z.B. Albumin, Zucker, z.B. Mannitol und/oder oberflächenaktive Mittel wie Polyethylenglycol (PEG, Carbowax 8000, erhältlich bei Union Carbide, USA) und Triton X-100 (Rohm & Haas, USA), verwendet.
  • Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, sind die erzielten hervorragenden Ergebnisse bei Verwendung der erfindungsgemäßen Reagentienkombination darauf zurückzuführen, daß es möglich ist, Reaktionsbedingungen für die Analyse, z.B. pH, Ionenstärke und Puffersalze, die für beide Reaktionen geeignet sind, zu finden, d.h. sowohl bei der Bestimmung des Inhibitors für die Substrat-Enzym-Reaktion als auch für die Inhibitor-Enzym-Reaktion.
  • Die Wahl des Substrats ist ebenfalls von großer Bedeutung bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung. Neben der oben ausgeführten Tatsache, daß das Sustrat durch Protease zur Bildung einer detektierbaren Antwort spaltbar sein muß, ist es außerdem wesentlich, daß solch ein Substrat für eine bestimmte Reaktion ausgewählt wird, das wirksam genug mit dem Enzym reagiert, um vernünftige Meßbedingungen, vorzugsweise Reaktionszeiten von weniger als 10 min, zu erreichen, das als Substrat immer noch nicht ausreichend wirksam ist, um die Reaktion des Enzymmoleküls mit dem Inhibitor zu verhindern. Diese Bedingung kann teilweise über die Bindungsaffinität des Substrats zum Enzym, Km, die vorzugsweise 2-8x10&supmin;&sup4; mol/l betragen sollte, ausgedrückt werden.
  • Es werden gewöhnlich handelsübliche synthetische Substrate verwendet, z.B. die in Tabelle 1 aufgeführten, und solche, wie sie in den erläuterten Beispielen beschrieben sind. Geeignete Substratkonzentrationen sind 1-20x10&supmin;&sup4; mol/l. Die Konzentration sollte so hoch sein, daß eine lineare Beziehung zwischen der Enzymkonzentration und der Markerkonzentration besteht. Im allgemeinen ist eine Substratkonzentration von 5x10&supmin;&sup4; mol/l bevorzugt.
  • Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, daß eine optimale Substratkonzentration und die Affinitätseigenschaften des Substrats durch Additive in der Reaktionsmischung beeinflußt werden, und daher strenge allgemeine Auswahlkriterien nicht definiert werden können.
  • Natürlich hängt die Wahl des Enzyms davon ab, welcher Inhibitor zu bestimmen ist. Solche Enzyme sind für eine Vielzahl von für die Klinik interessanten Inhibitoren im Handel erhältlich , z.B. für mehrere wichtige Proteaseinhibitoren, die im Plasma vorkommen, wie Antithrombin, das über eine Reaktion mit Thrombin oder Faktor Xa in Gegenwart von Heparin bestimmt werden kann, Antiplasmin, das über Plasmin bestimmt werden kann, und Kallikreininhibitoren, und es können gemäß der Erfindung gefriergetrocknete Reagentienkombinationen für die Ausführung dieser Bestimmungen hergestellt werden.
    • II. Verfahren zur Herstellung eines Produkts zur Bestimmung von Cofaktoren
  • Cofaktoren umfassen viele verschiedene Arten von Substanzen, die Enzymreaktionen auslösen Zur Veranschaulichung wird hier zunächst ein Faktor dargestellt, der die Inhibierung bestimmter Serinproteasen auslöst, in erster Linie FXa und Thrombin, mit dem Inhibitor Antithrombin, gegenüber Heparin. Das Verfahren zur Bestimmung von Heparin und ähnlichen Substanzen entspricht dem oben beschriebenen Inhibitorverfahren, abgesehen davon, daß der Inhibitor, in diesem Fall Antithrombin, im Überschuß zugesetzt werden muß.
  • Daher muß die Enzymmenge erheblich erhöht werden, damit fehlerfreie Reaktionsbedingungen erhalten werden können. Ansonsten beruht das Verfahren auf denselben Grundlagen wie das oben erläuterte Inhibitorverfahren für Antithrombin und den Xa-Faktor. Folglich werden dieselben Bedingungen angewendet wie in dem Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination für die Inhibitorbestimmung gemäß dem Verfahren I.
  • Ein weiterer Cofaktor, der bestimmt werden kann, ist das Fibrin-Monomer. Dieses ist ein durch ein Coagulationsenzym umgewandeltes Plasmaprotein und ist ein Cofaktor bei der Aktivierung von Proenzymplasminogen über das Enzym t-PA (Plasminogenaktivator), welches dann als Aktivator dient. Dieses Enzym, d.h. der Aktivator, wird zusammen mit Plasminogen, d.h. seinem Substrat, und einem chromogenen Substrat, das für die Produktaktivierung geeignet ist, nämlich dem das Enzymplasmin, gefriergetrocknet. Das Verfahren für die Herstellung dieser Reagentienkombination stimmt mit dem Verfahren zur Herstellung der Reagentienkombination für die oben beschriebene Inhibitorbestimmung überein mit dem Unterschied, daß der pH-Bereich, der für die Gefriertrocknung verwendet werden kann, außerdem den pH-neutralen Bereich umfaßt und demgemäß geeigneterweise 3-8,5 und vorzugsweise 5-7 ist.
    • III. Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung von Aktivatoren
  • Das Verfahren zur Bestimmung des Aktivators baut auf dem Prinzip der Gefriertrocknung eines geeigneten Proenzyms zusammen mit einem Substrat auf, das für das aktivierte Coenzym geeignet ist, in Gegenwart von Zusätzen, die die Stabilität und Löslichkeit in Analogie zu dem oben Geschriebenen fördern. Darüber hinaus können gewisse Bestimmungsmethoden die Gegenwart reaktionsfördernder Reagentien erforderlich machen. Daher ist es erfindungsgemäß möglich, alle für die Bestimmung von z.B. t-PA, nämlich Plasminogen, Plasminsubstrat und Stimulator des Fibrin- oder Polylysintyps benötigten Reagentien gleichzeitig gefrierzutrocknen und trotzdem ihre Aktivität zu erhalten, wenn die oben beschriebenen Bedingungen erfüllt sind, die in Analogie mit dem oben beschriebenen Verfahren II auch einen neutralen pH-Wert einschließen. Demgemäß ist ein geeigneter pH-Bereich 3-8,5 und vorzugsweise 6-7.
    • IV. Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung von Proenzymenen
  • Proenzyme wie Protein C, Plasminogen und Faktor X sind für die Bestimmung im Einstufenverfahren mittels der Substrattechnik gut geeignet, vorausgesetzt, daß der als Reagens verwendete Aktivator in Gegenwart von Substrat für das entsprechende aktivierte Proenzym schnell reagiert. Demgemäß umfaßt das Verfahren dieser Ausführungsform gemäß der Erfindung die Gefriertrocknung eines Substrats zusammen mit einem Aktivator, der die Hauptmenge des in der Probe auftretenden Proenzyms innerhalb einiger Minuten aktiviert. Die resultierende Reagentienkombination ist für die Bestimmung des Proenzyms vorgesehen, wobei die Probe so stark verdünnt wird, daß natürlich in der Probe vorkommende Inhibitoren des aktivierten Proenzyms in so niedriger Konzentration vorliegen, daß sie die Reaktion zwischen dem aktivierten Proenzym und seinem Subtrat nicht stören.
  • Gemäß der Erfindung wird die Gefriertrocknung auf herkömmliche Weise ausgeführt, z.B. bei 0,08-0,15 mbar durch Einfrieren bei einer Temperatur von -45º bis -40ºC, vorzugsweise -42ºC, für 1-5 h, vorzugsweise 1 h, und nachfolgender Trocknung für 12-20 h, bevorzugt 15 h, bei einer Temperatur von 12-24ºC, vorzugsweise 22ºC.
  • Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung einer gefriergetrockneten Reagentienkombination für die quantitative, semiquantitative oder qualitative Bestimmung von Koagulations- und Fibrinolysefaktoren in einer Probe, insbesondere in einer biologischen, z.B. Gesamtblut, Blutplasma, Blutserum, cerebrospinale Flüssigkeit, Lungenflüssigkeit oder Urin, in einem Einstufenverfahren durch Zugabe der Probe zu der gefriergetrockneten Reagentienkombination, die in einem Behältnis, vorzugsweise einer Küvette, eingeschlossen ist, und Ablesen der erhaltenen Reaktion in an sich bekannter Weise.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Hilfe der folgenden Beispiele näher erläutert, die als solche nicht einschränkend sind; es wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, wobei die Fig. 1-9 Standardkurven für eine Anzahl verschiedener, bei der Proteolyse aktiver Komponenten zeigen, die mit Hilfe einer geeigneten erfindungsgemäßen gefriergetrockneten Reagentienkombination auf eine Wellenlänge von 405 nm festgesetzt werden.
    • Beispiel 1
  • In diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Reagentienkombination zur Bestimmung eines Proteaseinhibitors, Antifaktor Xa, und ihre Verwendung beschrieben.
  • a) 1000 ml Acetatpuffer werden hergestellt durch Lösen von 500 ml eines Gemisches von 0,2 M Essigsäure und 0,2 M Natriumacetat in Wasser durch Zugabe von destilliertem Wasser bis auf 1000 ml. Der gewünschte pH-Wert von 4,2 wird durch 368 ml 0,2 M Essigsäure und 132 ml 0,2 M Natriumacetat erhalten.
  • b) Um eine verbesserte Stabilität und erhöhte Löslichkeit der Reagentienkombination zu erzielen, werden Albumin und Mannitol zu der Pufferlösung a) in den oben angegebenen Mengen hinzugefügt.
  • c) Herstellung zur Gefriertrocknung:
  • 650 mg/l (0,8 mmol/l) des Subtrats S-2732 und 1000 nkat (1000 nkat/l) Xa-Faktor werden zu der Pufferlösung a) hinzugefügt, der 5 g/l (0,5%) BSA und 10 g/l (1%) Mannitol beigegeben wurden.
  • d) Herstellung einer gefriergetrockneten Reagentienkombination zur Bestimmung des Antifaktors Xa:
  • Jeweils 200 ul der Lösung c) werden auf die entsprechende Plastik-Mikroküvette übertragen (Kartell Art. Nr. 1938). Die Küvetten werden bei -42ºC für 1 h in einen Gefrierschrank gegeben und 15 h bei 22ºC und einem Druck von 0,08-0,15 mbar getrocknet.
  • e) Verwendung der Küvetten nach d) für die Bestimmung des Antifaktors Xa:
  • 300 ul Plasma (gelöst 1:500) in 0,05 mol/l Tris, pH 8,4, 1=0,2, enthaltend EDTA (7,5 mmol/l), Heparin (3 IU/ml) und PEG (1%) werden zu der Küvette hinzugefügt, d) die die aus S-2732 (0,13 mg), FXa (0,2 nkat) und BSA und Mannitol bestehende gefriergetrocknete Reagentienkombination enthält.
  • Nach der Zugabe beträgt der pH der Kontrollösung 8,2. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur (25ºC) oder bei 37ºC und wird nach 8 min durch Zugabe von 300 ul 5%-iger AcOH unterbrochen.
  • Die Absorption der Lösung bei 405 nm wird danach in einem Photometer abgelesen und das Ergebnis wird verglichen mit den Antifaktor Xa in bekannten Mengen enthaltenden Proben, mit denen die in Fig. 1a gezeigten Standardkurven bereits vom Hersteller der Reagentienkombination angefertigt wurden. Diese Kurven zeigen die Beziehung zwischen Dosis und Antwort und sind die Basis für die von dem Hersteller berechneten und von dem Anwender eingesetzten Faktoren für die Berechnung der in Frage kommenden Analyten.
  • Es wurde gefunden, daß die Reaktion eine niedrige Temperaturabhängigkeit aufweist, was auch in Fig. 1a deutlich wird.
  • In Fig. 1b ist die Korrelation zu einem allgemein verwendeten und im Handel erhältlichen "Kit" zur Bestimmung von Antithrombin (Coates Antithrombin, KabiVitrum AB, Schweden) dargestellt.
    • Beispiel 2
  • In diesem Beispiel wird ein Verfahren für die Herstellung einer Reagentienkombination, die auf die Bestimmung von Antithrombin gerichtet ist, und ihre Anwendung beschrieben.
  • a) Eine gefriergetrocknete Reagentienkombination, für die Bestimmung von Antithrombin, die S-2366 (0,1 mg), Thrombin (0,7 nkat) sowie BSA und Mannitol enthält, wird in einer Küvette analog dem Beispiel 1 hergestellt.
  • b) Verwendung der Reagentienkombination zur Bestimmung von Antithrombin.
  • 300 ul Plasma (verdünnt 1:80) in dem gleichen Puffer wie im Beispiel 1e) aufgeführt, werden zu der Küvette von a) hinzugegeben, deren Inhalt gefriergetrocknet war. Man läßt die Reaktion bei 37ºC ablaufen und unterbricht nach 8 min durch Zugabe von 300 ul 5%-iger Essigsäure. Die Messung wird analog zum Beispiel 1e) ausgeführt, wobei die in Fig. 2 gezeigte Standardkurve erhalten wird.
    • Beispiel 3
  • In diesem Beispiel wird ein Verfahren für die Herstellung einer Reagentienkombination für die Bestimmung von Antiplasmin und ihre Verwendung beschrieben.
  • a) Analog zum Beispiel 1 wird eine Küvette hergestellt, die eine gefriergetrocknete Reagentienkombination für die Bestimmung von Antiplasmin enthält, welche ihrerseits S-2251 (0,3 mg), Plasmin (0,3 nkat) und BSA und Mannitol enthält.
  • b) Verwendung der Reagentienkombination für die Bestimmung von Antiplasmin.
  • 300 ul Plasma (verdünnt 1:30) in 0,05 mol/l Tris, pH = 8,3, das 0,15 mol/l Methylamin enthält, wird zu der Küvette von a) hinzugefügt, deren Inhalt gefriergetrocknet war. Die Reaktion verläuft bei 37ºC und wird nach 8 min durch Zugabe von 300 ul 5%-iger Essigsäure unterbrochen. Die Messung wird analog zum Beispiel 1e) ausgeführt. Es wird die in Fig. 3 gezeigte Standardkurve erhalten.
  • Die obigen Beispiele zeigen Reagentienkombinationen für die Bestimmung von Proteaseinhibitoren. Die beiden sich unmittelbar anschließenden Beispiele beschreiben Reagentienkombinationen für die Bestimmung von Cofaktoren.
    • Beispiel 4
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung von Heparin und ihre Verwendung werden in diesem Beispiel beschrieben.
  • a) Eine Küvette, die für die Bestimmung von Heparin eine Reagentienkombination enthält, welche ihrerseits S-2732 (0,2 mg), FXa (0,5 nkat) sowie BSA und Mannitol enthält, wird analog zum Beispiel 1 hergestellt.
  • b) Anwendung einer Reagentienkombination für die Bestimmung von Heparin.
  • 300 ul Plasma (verdünnt 1:15) in 0,05 mol/l Tris, pH = 8,4, I = 0,2, das EDTA (7,5 mmol/l) und PEG (1%) enthält, wird zu der Küvette von a) hinzugefügt, deren Inhalt gefriergetrocknet worden war. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur ausgeführt und nach 6 min durch Zugabe von 300 ul von 5%-iger Essigsäure unterbrochen. Sie wird analog zu dem Beispiel 1e) gemessen. Man erhält die in Fig. 4 gezeigte Standardkurve.
    • Beispiel 5
  • In diesem Beispiel werden ein Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung von Fibrininonomer und ihre Anwendung beschrieben.
  • a) S-2390 (12 mg) und Mannitol (19 mg) werden in 7,0 ml 0,03 mol/l Natriumacetatpuffer, pH = 4,9, der 0,01% Tween 80 enthält, gelöst und mit 2,5 mg in 0,8 ml sterilem Wasser gelöstem menschlichem Glu-Plasminogen vermischt. 100 mg in 0,5 ml Wasser gelöstes BSA und 3,6 ug in 0,8 ml Natriumacetatpuffer gelöstes t-PA werden zu der resultierenden Lösung hinzugefügt, wonach zusätzlicher Puffer hinzugegeben wird, so daß ein Gesamtvolumen von 20 ml erreicht wird. Portionen von 200 ul der fertigen Lösung werden auf Mikroküvetten verteilt und gemäß dem Beispiel 1d) gefriergetrocknet.
  • b) Verwendung der Reagentienkombination für die Bestimmung von Fibrinmonomer.
  • 300 ul Plasma (verdünnt 1:41) in 0,063 mol/l Tris, pH = 8,5, der 0,01% Tween 80 enthält, wird zu der Küvette von a) hinzugefügt, deren Inhalt gefriergetrocknet worden war und sich aus S-2390 (0,12 mg), Plasminogen (25 ug) und t-PA (0,036 ug) sowie Mannitol, Tween 80 und BSA zusammensetzte. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur und wird nach 20 min durch Zugabe von 300 ul 20%-iger Essigsäure unterbrochen. Es wird analog zu dem Beispiel 1e) gemessen. Man erhält die in Fig. 5 gezeigte Standardkurve.
  • Eine auf die Bestimmung eines Aktivators für eine Enzymreaktion gerichtete Anwendungsform wird in dem nachfolgenden Beispiel erläutert.
    • Beispiel 6
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung von t-PA und ihre Verwendung werden in diesem Beispiel beschrieben.
  • a) S-2251 (9 mg), gelöst in 13,5 ml destilliertem Wasser, wird mit 0,75 ml einer wäßrigen Lösung, die Plasminogen (18,75 CU) und Mannitol (15 mg) enthält, gemischt. Die resultierende Lösung wird gekühlt und mit 0,75 ml einer wäßrigen Lösung, die CNBr-verdautes Fibrin-(ogen) (3,75 mg) und Mannitol (15 mg) enthält, gemischt. 200 ul-Portionen der fertigen Lösung werden auf Mikroküvetten verteilt und gemäß dem Beispiel 1d) gefriergetrocknet.
  • b) Verwendung der Reagentienkombination für die Bestimmung von t-PA.
  • 300 ul vorbehandeltes Plasma (verdünnt 1:125) in 0,05 mol/l Tris, pH = 8,3, das 0,01% Tween 80 enthält, wird zu der Küvette von a) hinzugefügt, deren Inhalt gefriergetrocknet worden war und sich aus S-2251 (120 ug), Plasminogen (0,25 CU) und CNBr-vorverdautem Fibrin(ogen) (50 ug) sowie Mannitol zusammensetzte. Die Reaktion verläuft bei 37ºC und wird nach 2 h 45 min durch Zugabe von 300 ul 20%-iger AcOH unterbrochen.
  • Es wird analog zu dem Beispiel 1e) gemessen; man erhält die in Fig. 6 gezeigte Standardkurve.
  • In dem nachfolgenden Beispiel sind Anwendungsformen erläutert, die auf die Bestimmung von Proenzymen gerichtet sind.
    • Beispiel 7
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung des Faktors X und ihre Verwendung sind in diesem Beispiel beschrieben.
  • a) S-2337 (24 mg) und Mannitol (120 mg) gelöst in 6,5 ml destilliertem Wasser, werden mit 3,5 ml einer wäßrigen Lösung, die Rossel's Vipern Gift (RVV, Miami Serpentarium Labs, USA) (0,9) und NaCl (60 mg) enthält, gemischt. Eine CaCl&sub2;-Lösung (0,1 mol/l) wird zu der resultierenden Lösung hinzugegeben, so daß man ein Gesamtvolumen von 20 ml erhält. 200 ul-Portionen der fertigen Lösung werden auf Mikroküvetten verteilt und gemäß dem Beispiel 1d) gefriergetrocknet.
  • b) Verwendung der Reagentienkombination für die Bestimmung des Faktors X.
  • 600 ul Plasma (verdünnt 1:60) in 0,05 mol/l Tris, pH = 7,8, das Polybrene (20 mg/l, Aldrich, USA) enthält, wird zu der Küvette von a) hinzugefügt, deren Inhalt gefriergetrocknet worden war und sich aus S-2337 (0,24 mg) und RVV (9 ug) sowie Mannitol, CaCl&sub2; und NaCl zusammensetzte. Die Reaktion verläuft bei 37ºC und wird nach 3 min durch Zugabe von 200 ul 20%-iger AcOH unterbrochen. Es wird analog zu dem Beispiel 1e) gemessen; man erhält die in Fig. 7 gezeigte Standardkurve.
    • Beispiel 8
  • In diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung von Plasminogen und deren Verwendung beschrieben.
  • a) S-2251 (30 mg) wird in 16 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 4 ml einer Lösung, die Streptokinase (80.000 IU) und 12 mg Albumin (20 %) enthält, gemischt. 200 ul-Portionen der resultierenden fertigen Lösung werden auf Mikroküvetten verteilt und gemäß Beispiel 1d) gefriergetrocknet.
  • b) Verwendung der Reagentienkombination für die Bestimmung von Plasminogen.
  • 300 ul Plasma (verdünnt 1:20) in 0,05 mol/l Tris, pH = 7,4 und I = 0,05 werden zu der Küvette von a) hinzugegeben, deren Inhalt gefriergetrocknet worden war und sich aus S-2251 (0,3 mg) und Streptokinase (800 IU) sowie Albumin zusammensetzte. Die Reaktion verläuft bei 37ºC und wird nach 3 min durch Zusatz von 300 ul 5%-iger Essigsäure unterbrochen. Es wird analog zu Beispiel 1e) gemessen und man erhält die in Fig. 8 gezeigte Standardkurve.
    • Beispiel 9
  • In diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Herstellung einer Reagentienkombination zur Bestimmung von Protein C und ihre Anwendung beschrieben.
  • a) S-2366 (12 mg) wird in 19,55 ml destilliertem Wasser gelöst; es werden 0,45 ml Protac -C-Lösung (10 U/ml), Pentapharm, Schweiz) hinzugegeben. 200 ul-Portionen der resultierenden Lösung werden auf Mikropipetten verteilt und gemäß Beispiel 1d) gefriergetrocknet.
  • b) Verwendung der Reagentienkombination für die Bestimmung von Protein C.
  • 300 ul Plasma (verdünnt 1:11) in 0,025 mol/l Tris, pH = 8,4, die 0,1 % PEG enthalten, werden zu der Küvette von a) hinzugegeben, deren Inhalt gefriergetrocknet worden war und sich aus S-2366 (0,12 mg) und Protac C (0,045 U) zusammensetzte. Die Reaktion verläuft bei 37ºC und wird nach 7 min durch Zugabe von 300 ul 20%-iger AcOH unterbrochen. Es wird analog zu Beispiel 1e) gemessen; man erhält die in Fig. 9 gezeigte Standardkurve.
  • In diesen Beispielen wurden Abkürzungen verwendet, die die folgende Bedeutung haben:
  • BSA Rinderserumalbumin
  • Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
  • EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
  • PEG Polyethylenglycol
  • AcOH Essigsäure
  • Tween 80 Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Atlas
  • Chemical Industries, USA)
  • Glu Glutaminsäure
  • t-PA Plasminogenaktivator
  • S-2251 H-D-Val-Leu-Lys-pNA 2HCl
  • S-2337 N-alpha-benzoyl-Ile-Glu(gamina-piperidid)- Gly-Arg-pNA HCl
  • S-2366 < Glu-Pro-Arg-pNA HCl
  • S-2390 H-D-Val-Phe-Lys-pNA 2HCl
  • S2732 N-alpha-Succinoyl-Ile-Glu(gamma-piperidid)- Gly-Arg-pNA. HCl
  • -pNA p-Nitroanilid
  • A&sub4;&sub0;&sub5; Absorption bei 405 nm
  • nkat Nanokatal (1 katal = die Menge an Enzymaktivität, die unter spezifischen Bedingungen 1 mol Substrat pro Sekunde spaltet)
  • 1 U sich auf den internationalen Standard
  • (Heparin) beziehende Einheit
  • 1 U sich auf den internationalen Standard
  • (Streptokinase) beziehende Einheit
  • CU (Plasminogen) Caseineinheit
  • U (Protac ) 1 U = die Menge von Protac -Aktivierungsprotein C, die in 1 ml normalem menschlichem Citratplasma enthalten ist.
  • Die Standardkurven, die in den Abbildungen gezeigt sind, wurden vorzugsweise beim Hersteller der Reagentienkombinationen erhalten, und zwar durch Messen des A&sub4;&sub0;&sub5; von Proben mit verschiedenen bekannten Mengen der zu bestimmenden Komponente mittels der jeweiligen Standardkurve in Analogie mit den ausgeführten Messungen, gemäß dem entsprechenden Beispiel.

Claims (11)

1. Gefriergetrocknete Reagentienkombination, die in einem Behälter eingeschlossen und zur Bestimmung einer bei der Proteolyse wirksamen Komponente vorgesehen ist, und zwar direkt oder indirekt durch Spaltung eines in der Reagentienkombination enthaltenen, durch eine Protease unter Bewirkung einer meßbaren Antwort spaltbaren Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagentienkombination in im wesentlichen nicht-reagierter Form sämtliche für die Bestimmung erforderlichen Reagentien enthält, wobei die Reagentien ein chromogenes Substrat und eine Komponente mit enzymatischer Aktivität gegenüber dem Substrat sowie gegebenenfalls ein an sich bekanntes Additiv oder mehrere umfassen, und daß sie durch eine an sich bekannte Gefriertrocknung einer sämtliche in der gefriergetrockneten Reagentienkombination in im wesentlichen nicht-reagierter Form enthaltenden Lösung hergestellt ist, wobei die gefriergetrocknete Kombination bei ihrer Rekonstitution, z.B. in einer Pufferlösung, im wesentlichen ihre ursprüngliche Aktivität aufweist.
2. Reagentienkombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Behälter mit einem nicht unterteilten Innenraum eine Menge der für eine Einzelbestimmung vorgesehenen Reagentienkombination enthalten ist, wobei der Behälter bevorzugt direkt in einer für die Bestimmung der Antwort vorgesehenen Meßvorrichtung einsetzbar ist.
3. Reagentienkombination nach Anspruch 1 oder 2, die zur Bestimmung einer in der Proteolyse wirksamen Komponente vorgesehen ist und die aus a) einem Inhibitor, b) einem Cofaktor, c) einem Aktivator oder d) einem Proenzym besteht, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich zu dem Substrat, das durch Proteasen spaltbar und bevorzugt ein chromogenes Substrat ist, und gegebenenfalls anderen Additiven a) eine Protease, b) eine Protease und ein mit der Protease unter dem Einfluß des zu bestimmenden Cofaktors reaktionsfähiges Reagens, c) ein Proenzym oder eine aktivierbare Enzymverbindung oder d) einen Aktivator für das Proenzym enthält.
4. Reagentienkombination nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Bestimmung von 1) Antifaktor Xa, 2) Heparin-, 3) Fibrinmonomer oder 4) Protein C vorgesehen ist und
1) Faktor Xa, N-alpha-Succinoyl-Ile-Glu(gamma-piperidid)- Gly-Arg-pNA-Substrat, Rinder-Serumalbumin und Mannitol;
2) Faktor Xa, N-alpha-Succinoyl-Ile-Glu(gamma-piperidid)- Gly-Arg-pNA-Substrat, Rinder-Serumalbumin und Mannitol;
3) Plasminogen, H-D-Val-Phe-Lys-pNA-Substrat, t-PA, Mannitol, oberflächenaktives Mittel und Rinder-Serumalbumin oder
4) Protein C-Aktivator und Glu-Pro-Arg-pNA-Substrat enthält.
5. Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Reagentienkombination nach Anspruch 1, die zur Bestimmung von bei der Proteolyse wirksamen Komponenten vorgesehen ist, und zwar direkt oder indirekt durch Spaltung eines in der Reagentienkombination enthaltenen, durch eine Protease unter Bewirkung einer meßbaren Antwort spaltbaren Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß eine sämtliche für die Bestimmung erforderlichen Reagentien enthaltende Lösung, wobei die Reagentien ein chromogenes Substrat und eine Komponente mit enzymatischer Aktivität gegenüber dem Substrat sowie gegebenenfalls ein an sich bekanntes Additiv oder mehrere umfassen, in einem Behälter in einem Lösemittel, z.B. Wasser, unter so kontrollierten Bedingungen hergestellt wird, daß die Reagentien in der sich ergebenden Lösung und bei einem sich anschließenden Gefriertrocknen der Lösung im wesentlichen nicht-reaktiv bleiben, und daß die Lösung in dem Behälter in an sich bekannter Weise gefriergetrocknet wird, wobei die gefriergetrocknete Reagentienkombination erhalten wird, und wobei die Reagentien in einer im wesentlichen nicht-reagierten Form enthalten sind und im wesentlichen nach der Rekonstitution der Reagentienkombination, z.B. in einer Pufferlösung, im wesentlichen die ursprüngliche Aktivität aufweisen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter bei dem Gefriertrocknen die Lösung in einer Menge enthält, die für eine Einzelbestimmung geeignet ist, wobei der Behälter einen nicht unterteilten Innenraum aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Herstellung einer für die Bestimmung von Cofaktoren oder Aktivatoren vorgesehenen Reagentienkombination die Bedingungen, vorzugsweise mittels eines Puffers, auf einen pH-Wert von 3 bis 8,5, und bei der Herstellung einer für die Bestimmung von Inhibitoren oder Proenzymen vorgesehenen Reagentienkombination auf einen pH-Wert von 3 bis 5 eingestellt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefriertrocknung bei 0,08 bis 0,15 mbar unter Gefrieren bei einer Temperatur von -45º bis -40ºC, vorzugsweise -42ºC, für eine Zeitspanne von 1 bis 5 h, vorzugsweise 1 h, und einem anschließenden Trocknen für eine Zeitspanne von 12 bis 20 h, vorzugsweise 15 h bei einer Temperatur von 12 bis 24ºC, vorzugsweise 22ºC, durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung Additive, wie inaktives Protein, z.B. Albumin; Zucker bzw. Kohlenhydrate, z.B. Mannitol; und/oder oberflächenaktive Mittel, z.B. Polyethylenglykol, enthält.
10. Verfahren nach einem jeden der obigen Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bei der Bestimmung einer bei der Proteolyse wirksamen Reagentienkombination herstellt, die aus a) einem Inhibitor, b) einem Cofaktor, c) einem Aktivator oder d) einem Proenzym besteht, und daß die Lösung der Reagentienkombination, die gefriergetrocknet wird, zusätzlich zu dem durch Protease spaltbaren Substrat und gegebenenfalls Additiven a) eine Protease, b) eine Protease und einen mit der Protease unter dem Einfluß des zu bestimmenden Cofaktors zur Reaktion befähigten Reaktanten, c) ein Proenzym oder eine aktivierbare Enzymverbindung oder d) einen Aktivator für das Proenzym enthält.
11. Verwendung einer gefriergetrockneten Reagentienkombination nach Anspruch 1 für die quantitative, semi-quantitative oder qualitative Bestimmung von Coagulationsfaktoren und Fibrinolysefaktoren in einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe, z.B. Vollblut, Blutplasma, Blutserum, cerebrospinaler Flüssigkeit, Lungenflüssigkeit oder Urin, in einem einstufigen Verfahren durch Zugabe der Probe zu der in einem Behälter, vorzugsweise einer Küvette, enthaltenen gefriergetrockneten Reagentienkombination, und durch Registrierung der sich ergebenden Reaktion bzw. Antwort in an sich bekannter Weise.
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