DE3873402T2

DE3873402T2 - Antimikrobische zubereitungen.

Info

Publication number: DE3873402T2
Application number: DE8888304202T
Authority: DE
Inventors: Carol Avis Day; Brian Wilson Holton
Original assignee: Microbial Developments Ltd
Current assignee: Microbial Developments Ltd
Priority date: 1987-05-07
Filing date: 1988-05-09
Publication date: 1992-12-03
Anticipated expiration: 2008-05-10
Also published as: ES2051844T3; GB2206028A; IE62187B1; GB8710795D0; GB2206028B; IE881391L; FI882129A0; FI882129L; GB8810722D0; US4851240A; NO882013L; US5006347A; DK252588D0; DE3873402D1; ATE78991T1; NO882013D0; DK252588A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Zubereitungen für die Vorbeugung und Behandlung von mikrobiellem Befall in menschlichen und tierischen Nahrungsmittel.
Menschliche und tierische Nahrungsmittel sind für ein breites Spektrum von mikrobiellen Befall anfällig. Diese sind selten nützlich und häufig schädlich. Jene der schädlichen Art können eine leichte Kontamination von Nahrungsmittel, oder Krankheiten verursachen, die von leichten Magenschmerzen bis zum Tod des Konsumenten reichen, immer unter der Voraussetzung, daß das Nahrungsmittel nicht vollständig ungenießbar wurde.
Sehr wenige Arten von Befall führen zum Tode, aber ein bekanntes Beispiel ist die Salmonelleninfektion durch Konserven. Andere schädliche Arten von Befall sind im allgemeinen weniger gefährlich, verderben aber dennoch das Produkt. Ein Beispiel dieser Art ist die Clostridium-Infektion, die sowohl menschliche Nahrungsmittel wie auch tierisches Futter befallen kann. Milchprodukte sind ganz besonders auf Infektionen anfällig, insbesondere Käse, und das Ergebnis ist ein unangenehm scharfer Geschmack, verbunden mit einer unkontrollierten Gasentwicklung, die ebenfalls die Ursache für ein unansehliches, verformtes Produkt sein kann.
Futter wie beispielsweise Gras, Mais, Luzerne, Unkraut, Bohnen und Erbsen, wird von den Bauern während der wärmeren Monate des Jahres geerntet und mittels eines als Silieren bekannten Verfahrens konserviert, wobei das Material unter Luftausschluß gelagert wird, um die anaerobe Fermentierung der im Futter enthaltenen Zucker in Milchsäure und andere günstige Silosäuren zu bewirken. Das Futter wird dadurch als geeignetes Futtermittel für Wiederkäuer während der kälteren Monate des Jahres, wenn Frischfutter nicht verfügbar ist, konserviert.
Das konservierte Futter (Silofutter) bildet einen wichtigen Teil der Tierfütterung für eine wirtschaftliche Produktion von Milch und Fleisch durch die Bauern. Infolgedessen ist es wichtig, daß vom ursprünglichen Nährwert so viel wie möglich erhalten bleibt und daß durch Mikroorganismen verursachte Infektionen und Verderb während des Silierens auf ein Minimum reduziert wird. Diese Infektionen sind unwahrscheinlich, falls die Silierung unter idealen Bedingungen erfolgt.
Silofutter, das unter nicht perfekten Bedingungen eingemietet wurde, ist jedoch anfällig für eine Nachgärung durch schädliche Mikroorganismen, insbesondere wenn der Säuregehalt für die Stabilisierung des Silofutters ungenügend ist, erhöht sich die Silotemperatur, der Gehalt an Trockenmasse ist niedrig, der Nitratspiegel im Silofutter hoch, oder wenn das Silofutter durch schlechte Erntebedingungen durch Erde und Schlamm verunreinigt wurde.
Aufgrund von unvorhersehbaren Wetterbedingungen und der Notwendigkeit, die Miete zu einem Zeitpunkt zu errichten, der durch andere Faktoren bestimmt wird, sind ideale Bedingungen für die Silierung nur selten erzielbar.
Eine Nachgärung im Silofutter zeichnet sich häufig durch eine Vermehrung von Clostridium-Arten aus, wie beispielsweise C. tyrobutyricum und C. sporogenes (sogenannte Buttersäurebakterien), die einen Zerfall von Protein und Restzucker in Buttersäure und Ammoniak verursachen, wodurch der Nährwert des Silofutters erheblich reduziert und die Genießbarkeit verringert wird.
Listeria kann Silofutter ebenfalls befallen, besonders jenes, das anfällig für aeroben Verderb ist. Dies betrifft Silofutter, das schlecht verdichtet ist und in das deshalb Luft eindringen kann; Silofutter, in das von der Oberfläche her durch eine schlechte Miete mit unzureichenden Plastikabdeckungen Luft eindringen kann; und Ballensilos mit einem hohem Anteil an Trockenmasse und somit geringer Verdichtung, und deren Plastikhüllen auch leicht beschädigt werden können, wodurch dann Luft eindringen und infolgedessen eine Vermehrung von Listeria spp. erfolgen kann.
Ein deutlicher Zusammenhang zwischen der Fütterung von schlechtem oder verschimmeltem Silofutter und dem Auftreten von Listeriose bei Vieh ist gut dokumentiert. Der Einsatz von Listeria-spezifischen Phagen dient zur Verringerung des Auftretens von Listeriose und listeriellen Aborten bei Rindern und Schafen. Obwohl selten beobachtet, sind Listeria spp. auch für Menschen pathogen.
Um eine solche Nachgärung zu verhindern, werden für moderne Verfahren zur Silofutter-Erzeugung Silozusätze vor der Silierung verwendet. Herkömmliche Zusätze basieren auf Säuren wie beispielsweise Ameisen-, Schwefel- und Salzsäuren, und wirken durch direkte Säuerung des Silofutters zur Hemmung von schädlichen Mikroorganismen.
Die direkte Beimengung von Säuren zum Silofutter während der Ernte kann für die Feldarbeiter ein gefährlicher Vorgang sein und kann zu Korrosionen der landwirtschaftlichen Maschinen führen. In letzter Zeit werden biologische Mittel als Silofutter-Zusätze verwendet. Beispielsweise werden dem Futter Zubereitungen beigemengt, die einen oder mehrere Stämme homofermentative Milchsäurebakterien enthalten, die die Gärung beschleunigen und den Anteil an natürlichen Silosäuren erhöhen und somit zur Konservierung des Silofutters beitragen.
Viele biologische Silofutter-Zusätze enthalten auch Enzyme, die in der Lage sind, Faserbestandteile im Futter zu hydrolysieren, um den für die Gärung verfügbaren Zuckeranteil zu erhöhen. Die Verwendung dieser Enzyme wird im allgemeinen für Futterarten mit einem niedrigen natürlichen Zuckergehalt bevorzugt, die sonst vielleicht zu wenig Milchsäure produzieren würden.
Ein alternatives Verfahren ist die Behandlung des Grünfutters mit einer leichten Lösung aus einer Verbindung von Formaldehyd und Ameinsensäure. Der hauptsächliche Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß Formaldehyd nicht nur ein Mittel zur Quervernetzung von Proteinen, sondern auch karzinogen ist.
Neueste Forschungen führten zur Verwendung von Mittel wie beispielsweise Molassen und Enzyme als Schutz für Grünfutter. Diese Verfahren sind teuer und viele Forscher sind derzeit damit beschäftigt, eine billigere, wirksame Methode zum Schutz von Silofutter zu finden.
In anderen Bereichen muß ein mikrobieller Befall nicht immer unerwünscht sein. Die Herstellung von bestimmten Käsesorten hängt beispielsweise vollkommen vom Vorhandensein von bestimmten Mikroben ab und Yoghourt ist eine dicke Kultur aus unschädlichen Bakterien.
Bakterienkulturen werden auch als solche verwendet und gewinnen mit den jüngsten Durchbrüchen in der Biotechnologie immer größere Bedeutung. Diese Kulturen werden jedoch unbrauchbar, wenn sie durch Viren (Bakteriophagen oder Phagen) kontaminiert werden.
Phagen wurden erstmals in den frühen Sechzigern dieses Jahrhunderts erkannt. Seit diesem Zeitpunkt konzentrierte sich die Aufmerksamkeit auf sie aus zwei Gründen; ihre Wirkung auf die Bakterienzelle und ihre Fähigkeit in einigen Fällen zur Translokation von Bakteriengenen. Diese Fähigkeit ist für die heutigen genetischen Untersuchungen ganz besonders von Bedeutung und ermöglichte die Entwicklung von brauchbaren Verfahren zu Genklonierung. Nichtsdestoweniger werden Phagen durch andere Systeme ersetzt, die den betreffenden Organismus weniger schädigen. Kulturen, die durch unkontrollierte Phagen infiziert sind, sind nutzlos, da keine Mittel zur Bekämpfung der Virusinfektion verfügbar sind. Solche Kulturen können daher nur zerstört werden.
In Food Science and Technology Abstracts (Nr. 6, 1979, S. 1025, Abs. 79034280) wird die Verwendung von spezifischen Phagen für Streptokokken in Käsemolke beschrieben, obgleich keine antibakterielle Wirkung beobachtet wurde, und die Verwendung von Breitspektrumphagen wurde vorgeschlagen.
Es wurde nun entdeckt, daß die Behandlung von Lebensmittel mit kleinen Mengen von Clostridien- und/oder Listerien-spezifischen Phagen den Befall durch schädliche Mikroben verhindern kann.
Somit betrifft ein erster Aspekt dieser Erfindung die Verwendung von zumindest einer Art von Bakteriophagen für die Behandlung oder Vorbeugung von bakterieller Infektion von Lebensmittel oder deren Bestandteilen, wobei die Bakteriophagen für Clostridia spp. und/oder Listeria spp. spezifisch sind.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Verfahren für die Zubereitung eines menschlichen oder tierischen Nahrungsmittels, umfassend die Beimengung einer Zubereitung von zumindest einer Art von Bakteriophagen zum Nahrungsmittel oder zumindest zu einem seiner Bestandteile.
Des weiteren betrifft diese Erfindung Zubereitungen für die Verwendung gemäß den zwei vorerwähnten Aspekten der Erfindung, die zumindest einen Bakteriophagen-Typ und einen hiefür geeigneten Träger enthalten.
Die besonderen Vorteile dieser Erfindung liegen in der nicht-korrosiven Qualität der Zubereitungen, wirksam bei der Silierung von nassem Gras mit niedrigem Zuckergehalt, und darin, daß dabei weniger Abfall und Ausschuß anfällt und mehr Silofutter für die Fütterung verbleibt.
Bakteriophagen sind außerordentlich Wirt-spezifisch. Es erfolgt eine äußerst schnelle Vermehrung innerhalb der Wirtszelle, was zur Zerstörung der Zelle (Lyse) und zur Freisetzung von bis zu 20.000 neuen Phagen führt, von denen jede einzelne eine weitere Infektion verursachen kann. Phagen sind außerhalb der Wirtszelle prinzipiell nicht-lebend und können daher eine sehr beträchtliche Langlebigkeit aufweisen, weshalb sie sich für Zubereitungen gemäß dieser Erfindung besonders gut eignen.
Es sei vermerkt, daß, da Bakteriophagen in den Organismen, die sie infizieren können, hoch spezifisch sind, ein bestimmter Phagen-Typ nur eine Art von Bakterium befällt und oft nur ausgewählte Stämme dieser Art. Daher besteht für den Konsumenten keine Gefahr, durch den Phagen infiziert zu werden.
Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung von Phagen gemäß dieser Erfindung liegt darin, daß, nachdem für die Wirksamkeit nur eine äußerst geringe Menge von Phagen erforderlich ist, sich keine Beeinträchtigung des Geschmacks ergibt. Da des weiteren Phagen nur ganz spezifische Organismen infizieren, kann keine Vermehrung der Phagen ohne Wirtsbakterium erfolgen, so daß das Nahrungsmittel durch das Vorhandensein dieser Phagen vollständig unbeeinflußt bleibt.
Ein Nachteil bei früheren antimikrobiellen Zubereitungen war das Fehlen jeglicher Spezifizität des Befalls. Jede antibiotische Behandlung führte zur wahllosen Zerstörung der natürlichen Bakterienflora, nicht nur im Nahrungsmittel, sondern auch im Darm des Konsumenten. Auch in dieser Hinsicht liefern Phagen die Lösung dieses Problems und können nach Bedarf gegen jedes Bakterium ausgewählt werden.
Somit betrifft ein weiterer Aspekt dieser Erfindung die Verwendung oder das Verfahren gemäß der oben erwähnten Beschreibung, wobei der/die Bakteriophage(n) gemäß der Spezifizität des Wirtsbakteriums ausgewählt wird.
Es sei vermerkt, daß, obgleich für diese Erfindung lysogene Phagen verwendet werden können, die Verwendung von lytischen Phagen im allgemeinen bevorzugt wird, da eine Infektion zur raschen Zerstörung des Wirtes führt.
Es ist bekannt, daß Bakterien in der Lage sind, eine Resistenz gegen Phageninfektion zu entwickeln. Daher betrifft diese Erfindung des weiteren die Verwendung oder das Verfahren gemäß der oben erwähnten Beschreibung, wobei die Zubereitung zumindest zwei Phagenstämme umfaßt, die für einen Wirt spezifisch sind. Falls der Ziel-Mikroorganismus gegen einen Phagen eine Resistenz entwickelt, oder der Phage lysogen wird, erfolgt trotzdem noch die Zerstörung des unerwünschten Organismus.
Die "Rotation" der Phagen ist ganz besonders zu bevorzugen. Zum Beispiel stehen in dem Fall, in dem drei Phagen gegen Clostridia spp. verfügbar sind, drei Zubereitungen von verschiedenen Phagenpaaren für eine Verwendung in aufeinanderfolgenden Behandlungen zur Verfügung, um das Risiko einer Resistenzentwicklung zu minimieren.
"Rotation" bedeutet in diesem Zusammenhang, die Bakteriophagen-Zusammensetzung der Zubereitungen gemäß dieser Erfindung für die verschiedenen Produktionsserien der an der selben Stelle zubereiteten Lebensmittel zu variieren. Diese Änderungen müssen nicht periodisch, nicht einmal regelmäßig erfolgen, sofern gelegentlich unterschiedliche Zusammensetzungen verwendet werden, um eine Resistenzentwicklung zu verhindern.
Zubereitungen gemäß dieser Erfindung können Phagen enthalten, die für mehrere verschiedene Arten von Bakterien spezifisch sind. Eine Silofutter-Behandlung kann zum Beispiel für C. sporogenes, C. tyrobutyricum und Listeria spp. spezifische Phagen enthalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsart liefert diese Erfindung einen Silofutter-Zusatz, der Bakteriophagen enthält, die für jene Clostridium-Arten spezifisch sind, die am häufigsten in Silofutter vorkommen, entweder allein oder auf einem Träger oder einer Base, oder kombiniert mit Milchsäurebakterien und/oder hydrolytischen Enzymen, und/oder kombiniert mit anderen Silofutter-Zusatz-Bestandteilen in einer bakteriophagen Konzentration von 10² bis 10¹² pfu (Plaque-bildende Einheiten) pro Gramm Futter.
Clostridia spp. sind besonders anfällig für eine Behandlung gemäß dieser Erfindung. Anaerobier sind im allgemeinen wesentlich weniger effizient als Aerobier, da die Lebensprozesse auf das Wesentliche beschränkt werden müssen, um eine wirksame Verwertung der anaeroben Umgebung zu ermöglichen. Daher sind die äußerst komplexen Mechanismen von E. coli und dergleichen für Anaerobier unerreichbar, um eine Verteidigung gegen einen Phagenangriff zu entwickeln.
Ein weiterer Vorteil ergibt sich aus mit Clostridium-spezifischen Phagen behandeltem Silofutter. Cellulose eignet sich zum Beispiel nicht als Nahrungsmittelquelle für Menschen, kann aber durch den Einfluß ihrer Darmflora von Wiederkäuern verdaut werden. Drei Hauptarten von Floren sind bekannt und werden im allgemeinen als das chemische Zwischenprodukt, das sie erzeugen, bezeichnet: Butter-, Propion- und Essigsäure. Der Stoffwechselweg von Buttersäure ist erheblich unwirksamer als der der anderen zwei Säuren, und die betroffenen Floren sind im allgemeinen Clostridia spp. Infolgedessen wird mit Clostridium-spezifischen Phagen behandeltes Silofutter nicht nur von Clostridien-Zersetzung bewahrt, sondern überträgt den Phagen zum Empfänger-Wiederkäuer. Dies zerstört die Clostridien-Flora im Pansen und ermöglicht dem Tier, das Futter besser zu verwerten. Eine direkte Behandlung mit Phagen-Zubereitung(en) hätte die gleiche Wirkung und bildet, als solche, einen weiteren Aspekt dieser Erfindung.
Infolgedessen ist eine Verwendung oder ein Verfahren gemäß der vorerwähnten Beschreibung nicht nur als Nahrungsmittelkonservierung sondern auch als Wachstumsförderung für Vieh wirksam, indem es zu einer effizienteren Ausnutzung der Nährstoffe führt.
Durch den Zusatz von spezfischen Clostridien- Phagen (10&sup5; - 10&sup7; pfu/ml) zu Trinkwasser und/oder Futter wird der Buttersäure-Metabolismus im Pansen gesteuert, was zu einer nützlichen Gewichtszunahme (und Milchproduktion bei Kühen) führt. Des weiteren läßt sich wahrscheinlich eine verstärkte Wirkung bei Kühen beobachten, die sowohl mit behandeltem Silofutter wie auch durch direkte Verabreichung behandelt wurden, da in diesem Fall nicht nur eine bessere Gärung des Silofutters selbst erfolgt, wodurch der Nährwert erhöht wurde, sondern auch eine Auswirkung auf die Milchproduktion/Gewichtszunahme ist durch die Übertragung von Phagen vom Silofutter in den Pansen und der darauffolgenden verstärkten Wirkung der Pansen-Manipulation wahrscheinlich.
Geeignete Bakteriophagen für die Verwendung gemäß dieser Erfindung können aus Erden, Silofutter, Siloabwässern und landwirtschaftlichem Schlamm, tierischen und pflanzlichen Abfällen, dem Inhalt des Verdauungstraktes, Luft oder Wasser gewonnen werden, wobei vorzugsweise bekannte Verfahren zur Bakteriophagenverstärkung [siehe Betz, J.V., & Anderson, K.E., (1983), J. Bact., 87, 40] verwendet werden. Auf diese Weise isolierte Bakteriophagen können mittels bekannter Verfahren im Hinblick auf ihre Wirtsspezifizität gekennzeichnet werden.
Geeignete Mengen von Phagen für die Verwendung gemäß dieser Erfindung können beispielsweise durch ein Serienverfahren gewonnen werden, bei dem man eine Wirtsbakterienkultur fast bis zum vollen Volumen wachsen läßt und sie dann mit einem Phagen impft. Nach Ablauf eines geeigneten Zeitraumes bis zur maximalen Phagenvermehrung wird die Kultur, falls erforderlich mittels chemischer oder physikalischer Verfahren weiter aufgelöst, und das Lysat zentrifugiert. Der Phagen-tragende Überstand kann dann, beispielsweise durch Ultrafiltration, weiter gereinigt und konzentriert werden (beispielsweise Gefriertrocknung) . Die so gewonnene Zubereitung kann direkt verwendet werden oder mit weiteren Zutaten kombiniert werden, um die Verpackung, den Endverbrauch, usw. zu erleichtern.
Die industrielle Massenproduktion von Clostridium- spezifischen Phagen kann eine anfängliche Fermentierung der Clostridium-Wirtsspezies umfassen, vorzugsweise unter optimalen Submerskultur-Bedingungen während einer geeigneten Zeitdauer, um ein logarithmisches Wachstum der Kultur zu erzielen. Dann werden spezifische Phagen-Zubereitungen in die Clostridien-Kultur eingeführt und die Inkubation weitergeführt, bis eine maximale Lyse nachgewiesen werden kann. Eine Downstream-Rückgewinnung dieser Phagen-Zubereitung aus der Lösung kann durch anfängliches Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit erfolgen, um verbleibenden Debris und Bakterienzellen zu entfernen, und der Phage dann gereinigt und mittels Ultrazentrifugations- und Ultrafiltrationsverfahren konzentriert werden. Die gewonnene konzentrierte Phagen- Zubereitung kann mittels bekannter Verfahren kältekonserviert und gefriergetrocknet werden, oder vorzugsweise auf ein geeignetes Trägermaterial plattiert oder damit vermischt werden und entsprechenderweise luft- oder vakuumgetrocknet werden. Bakteriophagen können auch in säurebeständigen biologisch abbaubaren Gummis eingekapselt werden, um ein gemischtes Silozusatzprodukt zu ergeben, das wahlweise organische Säuren enthalten kann. Das übliche Aktivitätspotential von Phagen, die gemäß dem vorerwähnten Verfahren zubereitet werden, reicht, je nach der speziellen Phagenmorphologie, von 10&sup9; bis 10¹² pfu/Gramm des Konzentrats.
Für die Verwendung als Silofutterkonservierung enthält eine geeignete Zubereitung gemäß dieser Erfindung von 10² bis 10¹&sup0; pfu/g, vorzugsweise 10&sup5; bis 10&sup7;/g. Die Zubereitung ist günstigerweise eine Flüssigkeit und wird beim Einmieten auf die Pflanzen gesprüht, obgleich jedes andere geeignete Verfahren angewendet werden kann.
Zubereitungen gemäß dieser Erfindung enthalten geeigneterweise zumindest zwei Sorten von Phagen, wahlweise, je nach Bedarf, spezifisch für mehr als eine Bakterienfamilie. Die Zubereitungen können je nach Bedarf flüssig oder fest sein. Flüssige Zubereitungen eignen sich zur Verwendung bei der Herstellung von Käse, zum Sprühen auf Silofutter, oder zur Verabreichung an Vieh, und können einfache Suspensionen von Phagen in Wasser sein, umfassen jedoch vorzugsweise einen geeigneten Träger. Geeignete Träger können beispielsweise auf Zucker basieren, wie Mannitol, können aber jede beliebige in Fachkreisen bekannte Substanz umfassen.
Flüssige Zubereitungen können von jeder der allgemein für entsprechende Zwecke zur Verfügung stehenden Zubereitungen zubereitet werden, denen eine geeignete Menge von Phagen beigemengt wird. Als Alternative kann eine konzentriertere Stammlösung zubereitet werden, die bestehenden Handelsprodukten beigemengt wird.
Das Vorerwähnte trifft, mutatis mutandis, für feste Zubereitungen und Formulierungen zur Verabreichung an Vieh zu. Feste Zubereitungen sind üblicherweise in Puder- oder Granulatfom verfügbar, und so muß jede Stammlösung einen Träger, wie beispielsweise Maistreber, Kleie oder Kalkstein, umfassen.
Zubereitungen zur Konservierung von Silofutter sind günstigerweise Kombinationen mit fachspezifischen biologischen Zubereitungen. Daher enthalten sie zum Beispiel Enzyme und Milchsäurebakterien, um die Qualität des Silofutters noch zu verbessern und ein breiteres Anwendungsspektrum der Zubereitungen zu ermöglichen.
Formulierungen zur Verabreichung an Vieh werden normalerweise so hergestellt, daß sie im Futter eingeschlossen oder dem Trinkwasser beigemengt werden. Als Regel gilt, daß feste Formulierungen als Zusatz zum Futter geeignet sind, wohingegen flüssige Formulierungen sich als Zusatz zu Trinkwasser eignen.
Formulierungen zur Verabreichung an Vieh können auch direkt in jeder geeigneten Form gegeben werden, wie beispielsweise als Bolus, Kapsel, Tablette oder Lösung.
Um die Phagenaktivität im Endprodukt wie auch während der Zubereitung zu bestimmen, kann eine gesamtspezifische Phagenzählung erfolgen, beispielsweise mit dem Doppelagarschichtplattierungsverfahren für die Plaque-Produktion, wobei in jedem Fall die Wirts-Mikrobenspezies verwendet wird. Das von Adams, M.H., in "Bacteriophages" (Interscience Publishers (1959)) beschriebene Verfahren ist für diesen Zweck geeignet.
Um Käse vor eine Infektion zu schützen, kann bei der Käseerzeugung eine geeignete Phagen-Zubereitung beigemengt werden, im allgemeinen bereits in einem frühen Produktionsstadium, wie beispielsweise während des Labstadiums, bei dem die Mischung noch flüssig ist, um eine gleichmäßige Verteilung im Käse zu gewährleisten. Dadurch wird die Bildung von kleinen Befallsstellen verhindert, die den Geschmack, die Textur und das Aussehen des Produktes beeinträchtigen würden.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und dürfen in keiner Weise als Einengung des Umfanges dieses Patentes verstanden werden. BEISPIEL 1 - Zubereitungen Formulierung zur Beimengung pro Gramm Futter Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium sporogenes Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium tyrobutyricum Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium bifermentans Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen
Körniger Träger oder Träger auf löslicher Basis für ein brauchbares Anwendungsverhältnis, um eine zufriedenstellende Verteilung im Silofutter zu erzielen, z.B. 500 Gramm pro Tonne Silofutter bei Anwendung als Trockenpulver, oder entsprechend in Wasser aufgelöst, um mit 1 bis 2 Liter pro Tonne Silofutter zu sprühen.

BEISPIEL 2 - Zubereitungen

Zubereitungen gemäß Beispiel 1, mit Zusatz von vermehrungsfähigen Milchsäurebakterien: Formulierung zur Beimengung pro Gramm Futter Lactobacillus plantarum Pediococcus acidilactici

BEISPIEL 3 - Zubereitungen

Zubereitung gemäß Beispiel 1 oder 2, mit Zusatz von Enzymen: Formulierung zur Beimengung pro Gramm Futter Hemicellulase Zubereitung Polygalacturonase Mikrobielle Cellulase 5 Xylanase-Einheiten 2 PG Einheiten 2 CMC Einheiten BEISPIEL 4 - Alternative Zubereitungen Formulierung zur Beimengung pro Gramm Futter Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium tyrobutyricum Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium sporogenes Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium bifermentans Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Zuckerrohr oder Rüben Melassen BEISPIEL 5 - Alternative Zubereitungen Formulierung zur Beimengung pro Gramm Futter Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium tyrobutyricum Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium sporogenes Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Zubereiteter Bakteriophage lytisch zu Clostridium bifermentans Stämmen, die häufig in Silofutter vorkommen Alle angemessen säuregeschützt Ameinsensäure (85%)

BEISPIEL 6: Feldversuche

Silomieten mit einem Fassungsvermögen von 60 Tonnen wurden willkürlich mit frisch geschnittenem Weidelgras gefüllt, das beim Ernten mit folgenden Silozusatz-Mischungen behandelt wurde:
A. Ohne Zusatzstoff;
B. Mit einem herkömmlichen Zusatzstoff auf Säurebasis (Ameisensäure) mit einem Anwendungsverhältnis von 2 Litern pro Tonne Futter;
C. Mit einem herkömmlichen biologischen Silozusatz (SAFE-SILE flüssig) (eingetragene Marke) mit einem Anwendungsverhältnis von 2 Litern pro Tonne Futter;
D. Mit einem Zusatzstoff, der eine entsprechende Clostridien Bakteriophagen-Zubereitung enthält, um eine Konzentration von 10&sup5; pfu pro Gramm Futter zu ergeben; und
E. Mit einem Zusatzstoff, der einen herkömmlichen biologischen Silozusatz (SAFE-SILE flüssig) in Kombination mit einer Clostridien Bakteriophagen-Zubereitung, um eine Konzentration von 10&sup7; pfu pro Gramm Futter zu ergeben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Zeit
Es wurden in regelmäßigen Abständen Silo-Analysen durchgeführt, um mittels Gas-Flüssigkeits-Chromatographie zu bestimmen: Trockenmasse (DM%); pH; Ammoniakstickstoff (NH&sub3;N als % des Gesamtstickstoffs); Rohprotein (CP%); veränderter Säuredetergensfasergehalt (MAD%); D-Wert (%); metabolisierbare Energie (ME MJ/kg); aufschließbares Rohprotein (DCP g/kg) und flüchtige (Milch-, Essig- und Butter-) Fettsäuren (% Naßbasis).
Der D-Wert ist ein Maß der Aufschließbarkeit des Silofutters, höhere Werte bedeuten dabei eine bessere Aufschließbarkeit. Für Gras wird der D-Wert gemäß folgender Formel errechnet:
D = 91,4 - (0,81 x MAD) .
Mit Bakteriophagen-Zubereitungen behandeltes Silofutter wies einen günstigeren Gehalt an Ammoniakstickstoff und Buttersäure auf, was ein Hinweis auf die Hemmung der Nachgärung ist.

BEISPIEL 7: Feldversuche

Silomieten mit einem Fassungsvermögen von 60 Tonnen wurden willkürlich mit frisch geschnittenem Weidelgras gefüllt, das beim Ernten mit folgender Silozusatz-Mischung behandelt wurde:
A. Ohne Zusatzstoff; und
B: Mit einem Zusatzstoff, der einen herkömmlichen biologischen Silozusatz (SAFE-SILE flüssig, Downland Marketing Ltd.) enthielt, in Kombination mit einer Clostridien Bakteriophagen-Zubereitung, um eine Konzentration von 10&sup5; pfu pro Gramm Silofutter zu ergeben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Zeit
Wie vorhin wurden in regelmäßigen Abständen Silo- Analysen durchgeführt, um mittels Gas-Flüssigkeits-Chromatographie zu bestimmen: Trockenmasse (DM%); pH; Ammoniakstickstoff (NH&sub3;N als % des Gesamtstickstoffs); Rohprotein (CP%); veränderter Säuredetergensfasergehalt (MAD%); D-Wert (D%); metabolisierbare Energie (ME MJ/kg); aufschließbares Rohprotein (DCP g/kg) und flüchtige (Milch-, Essig- und Butter-) Fettsäuren (% Naßbasis)
Auch hier wies das mit Bakteriophagen-Zubereitungen behandelte Silofutter einen günstigeren Gehalt an Ammoniakstickstoff und Buttersäure auf, was ein Hinweis auf die Hemmung der Nachgärung ist.

BEISPIEL 8 - Toxikologie

(1) Toxikologische Versuche mit einzelnen Milchkühen

Zwei Friesische Milchkühe mit Stammbaum in der Laktationsperiode (Registrierungs-Nummern: 6190154 und 5958858) von der Microferm Herde wurden isoliert und vor den Versuchen 10 Tage lang akklimatisiert. Während dieses Zeitraumes wurden Milchproben analysiert und dabei festgestellt, daß diese keine spezifischen Clostridien Bakteriophagen enthielten.
Der Kuh Nr. 6190154 wurde über das Trinkwasser über einen Zeitraum von 14 Tagen in einer Dosierung von 10¹&sup4; pfu/Kuh/Tag eine für Clostridium sporogenes spezifische Bakteriophagen-Zubereitung verabreicht.
Der Kuh Nr. 5958858 wurde über das Trinkwasser über einen Zeitraum von 14 Tagen in einer Dosierung von 10¹&sup4; pfu/Kuh/Tag eine für Clostridium tyrobutyricum spezifische Bakteriophagen-Zubereitung verabreicht.
Bei diesen Dosierungen kann man von einer 100 bis 1000-fachen Zunahme der aufgenommenen Bakteriophagen im Vergleich zu jenen Mengen ausgehen, die durch normale Aufnahme von mit Bakteriophagen behandelten Silofutter aufgenommen werden können.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Milchprotokolle zu Beginn des Versuches Milchprotokolle bei Beendigung des Versuches Durchschnittl. tägl. Ertrag Butter Fett % Protein % Laktose % Gesamtherde
Keine Probe der in Abständen von 3 Tagen von jeder Kuh analysierten Milch wies spezifische Clostridien Bakteriophagen auf. Während und nach den Versuchen war bei den Kühen keine Wirkung der Behandlung zu beobachten.

(2) Toxikologischer Versuch an Ratten

Es wurde eine Toxizitätsuntersuchung mit einmaliger oraler Dosis durchgeführt. Das angewendete Verfahren entsprach den Erfordernissen einer Toleranzprüfung für akute orale Toxizität gemäß Anhang V der EG Richtlinien bezüglich Klassifizierung, Packung und Kennzeichnung von gefährlichen Substanzen. Für die Beurteilung von Zusätzen für Tiernahrung ist dies ein zulässiges Verfahren.
Die Testsubstanz war eine Mischung der gleichen Konzentration von zu Clostridium sporogenes und Clostridium tyrobutyricum spezifischen Bakteriophagen mit einem kombinierten Gehalt von 2 x 10¹&sup0; pfu/Gramm. Diese wurde als einzelne Dosis oral per 2000 mg/kg Lebendgewicht verabreicht. In allen Fällen wurden keine Auswirkungen der Behandlung beobachtet und bei der Nekropsie nach Abschluß der Untersuchung keine Anomalien festgestellt.

BEISPIEL 9: Bakteriophagen Käse Zubereitungen

Der Käse wird mittels des üblichen Verfahrens zur Käseproduktion mit Zusatz von Clostridien Phagen Mischungen von 10&sup5; bis 10&sup7; pfu/ml Milch zubereitet.
Der Phage wird bei der Käseerzeugung im Labstadium zugefügt, um das Stadium der Hitzebehandlung der Milch zu vermeiden. Dadurch wird die Vermehrungsfähigkeit des Phagen gewährleistet. Der Einschluß des Phagen während des Labstadiums gewährleistet auch eine gleichmäßige Verteilung des Phagen während der Bildung des Käsebruchs, so daß er in der Molke (die meistens weggeschüttet wird) nicht völlig verloren geht.
Die Wärmeresistenz von Phagen ist relativ hoch. Die meisten Clostridien Phagen überleben 60ºC/80 Min. Die Hitzebehandlung von Milch für die Käseerzeugung übersteigt selten 40ºC, so kann der Phage in jedem Stadium zugefügt werden. Während und nach dem Reifestadium können Proben für die Phagenzählung und Clostridium Zählung entnommen werden.

Claims

1. Verwendung von Bakteriophagen für die Behandlung oder Vorbeugung von bakteriellen Infektionen von Nahrungsmittel oder deren Bestandteilen, wobei die Bakteriophagen für Clostridia spp. und/oder Listeria spp. spezifisch sind.

2. Verwendung von Bakteriophagen gemäß Anspruch 1, wobei das Nahrungsmittel Käse oder Silofutter ist.

3. Verwendung von Bakteriophagen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Nahrungsmittel regelmäßig an der selben Stelle zubereitet wird und wobei verschiedene Arten von Bakteriophagen abwechselnd verwendet werden.

4. Zusammensetzung für die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, die zumindest einen Bakteriophagen- Typ und einen hiefür geeigneten Träger enthält.

5. Konzentrat umfassend die in Anspruch 4 definierten Bestandteile, das für eine Verdünnung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel geeignet ist, um eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 zu ergeben.

6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 umfassend das Konzentrat nach Anspruch 5 in Kombination mit einer bekannten Zubereitung für die Konservierung von Nahrungsmittel oder deren Bestandteilen.

7. Verfahren für die Zubereitung von Lebensmittel umfassend die Beimengung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, 5 oder 6 während der Zubereitung.

8. Formulierung gemäß Definition in einem der Ansprüche 4 bis 6 für die Verabreichung an Wiederkäuer, umfassend zumindest einen Bakteriophagen-Typ und einen hiefür geeigneten Träger.

9. Lebensmittel enthaltend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6.