DE3856367T2

DE3856367T2 - Verfahren zur Messung von Gewebeplasminogenaktivator, Antithrombin-III und lösliches Fibrin

Info

Publication number: DE3856367T2
Application number: DE3856367T
Authority: DE
Inventors: Mats Gustaf Ranby; Tor-Bjorn Wiman
Original assignee: Biopool International Inc
Current assignee: Biopool International Inc
Priority date: 1987-07-06
Filing date: 1988-07-05
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2008-07-06
Also published as: EP0576038A2; ATE185376T1; JP2710376B2; DE3856367D1; WO1989000005A1; EP0324027A4; AU2314688A; CA1324748C; EP0576038B1; JPH02500805A; EP0324027A1; EP0576038A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung des Gewebeplasminogenaktivators, des Plasminogenaktivatorinhibitors und des löslichen Fibrins. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung des Plasminogenaktivatorinhibitors und löslichen Fibrins unter Verwendung eines genetisch modifizierten Gewebeplasminogenaktivatorproteins als Reagenz. Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf verbesserte Verfahren, Blut abzunehmen, so daß dieser endogene Plasminogenaktivator nicht inaktiviert wird.

Hintergrund

Der Begriff "t-PA" steht für "Gewebeplasminogenaktivator". Der Begriff "PAI" steht für Plasminogenaktivatorinhibitor.
"PAI 1" steht für den Plasminogenaktivatorinhibitor Eins, der manchmal endothelialer Plasminogenaktivatorinhibitor genannt wird. "PAI 2" steht für Plasminogenaktivatorinhibitor Zwei, der manchmal plazentischer Plasminogenaktivatorinhibitor genannt wird. Der Begriff "α&sub2;AP" bedeutet Alpha 2 Antiplasmin, dies ist ein Protein, das in Blut von normalen Individuen gefunden wird und das Enzym Plasmin inhibiert. Der Begriff "Fibrinogenschnitte" schließt die Produkte des Schneidens von Fibrinogen oder Fibrin mit proteolytischen Enzymen oder Plasmin ein.
Die Untersuchung der Inaktivierung des Gewebeplasminogensaktivators in Plasma wurde durch schlechte Methoden behindert. Eine spezifische und sensitive Methode zur Messung des t-PA in Plasmaproben, wobei potentielle fibrinolytische Inhibitoren durch kontrollierte Ansäuerung neutralisiert wurden, wurde beschrieben. (Siehe Wiman, B., et al., Clin. Chim Acta, 127, 279-288, 1982). t-PA, das später durch diese Methode gemessen wurde, wies eine parabole Umsatzrate auf. (Siehe Rånby, M., et al., Thromb. Res. 27, 743-749, 1982). Mit dieser Methode war es außerdem möglich, spezifisch die inhibitorische Aktivität auf t-PA in Plasma zu bestimmen und ein kinetischer Beweis für einen schnellen t-PA Inhibitor in Plasma wurde aufgezeigt.
Unter der Annahme der Bildung eines stöchiometrischen 1 : 1-Komplexes wurde eine Ratenkonstante von ungefähr 10&sup7;M&supmin;¹·s&supmin;¹ berechnet, und die Plasmakonzentration des neuen Inhibitors in gesunden Individuen wurde mit 8 ± 2 Einheiten/ml bestimmt (1 Einheit = Inhibition einer internationalen Einheit (unit) von t-PA). Der t-PA Inhibitorgehalt wurde außerdem im Plasma von verschiedenen Patienten bestimmt. Ein hoher Gehalt an Inhibitoraktivität wurde häufig in Patienten mit tiefen Venenthrombosen, hämostatischen Problemen während einer späten Schwangerschaft, oder schweren Koronarherzkrankheiten gefunden. (Siehe Chmielewska, J., et al., Thromb. Res. 31, 427-436 (1983). Inzwischen ist bekannt, daß die beobachtete PAI-Aktivität das Ergebnis der PAI 1 Aktivität ist.
Es gibt mehrere kommerziell erhältliche Analysesysteme für die Bestimmung von t-PA und PAI, die natives t-PA verwenden, das aus Melanomzellen isoliert wurde. Jedoch sind die PAI-Mengen betreffenden Ergebnisse, die aus diesen Analysen erhalten werden, aufgrund des Schneidens des t-PA in die zweikettige Form des Proteins nicht immer zuverlässig. Das native einkettige t-PA wird durch Plasmin oder durch Trypsin nach dem Arg in der Sequenz -Gln-Phe-Arg-Ile-Lys- in dem t-PA- Protein geschnitten. Dies führt zu einem Problem, wenn versucht wird die PAI 1-Menge in einer biologischen Flüssigkeit durch Inhibierung der t- PA-Aktivität zu messen, da das zweikettige t-PA auch schnell mit PAI 2 reagiert, und außerdem sehr viel schneller als einkettiges t-PA mit anderen Proteasen Inhibitoren, wie z. B. α&sub2;AP reagiert.
Daher besteht eine Notwendigkeit für ein t-PA, das gegen das Schneiden durch proteolytische Enzyme widerstandsfähig ist, so daß die Bildung von zweikettigem t-PA in dem Präparationsverfahren oder während des Analyseverfahrens verhindert wird. Mit solch einem t-PA könnte die Gegenwart von PAI genauer gemessen werden.
Ein anderes Problem, das in früher bekannten Methoden zur Messung des t- PA und PAI auftrat, ist die Tatsache, daß die t-PA und PAI 1 Aktivität nach der Blutentnahme ziemlich unstabil ist, und die Aktivitäten dieser beiden Proteine nach der Blutentnahme schnell abfallen.
Bei der Analyse von t-PA im Blut wurde gefunden, daß Polylysin ein effektiver Aktivator des t-PA ist. Außerdem wurde jedoch gefunden, daß Polylysin kein effektiver Aktivator des t-PA in biologischen Flüssigkeiten ist, die nicht Blut oder Blutplasma sind. Daher besteht eine Notwendigkeit, das Präparat in Plasma zu identifizieren, das zusammen mit Polylysin den effektiven Aktivator des t-PA bildet, was einem erlauben würde, die t-PA Menge in Nichtplasmaflüssigkeiten zu bestimmen.
Ein anderes Problem, auf das man in dem bisher bekannten Stand der Technik traf, ist, daß Plasmaproben angesäuert werden mußten und über relativ lange Zeitdauern bei niedrigem pH inkubiert werden mußten, um die Plasmininhibitor-aktivität in der Plasmaprobe zu zerstören, die die Analyse stört. Aufgrund der Inhibitoren ist die t-PA-Aktivität in Blut oder in Blutplasma nicht stabil und kann demgemäß in normalsauren Plasmaproben nicht genau bestimmt werden. Es besteht eine Notwendigkeit für eine Methode zur Stabilisierung der Aktivität von t-Pa, so daß eine Blutprobe abgenommen werden kann, und durch normale Vorgehensweisen analysiert werden kann. Wenn bisher bekannte Methoden zur Blutabnahme verwendet werden, geht eine große Menge der t-PA Aktivität verloren, bevor das Blut analysiert werden kann.
Ein weiteres Problem, das im bisher bekannten Stand der Technik zur Bestimmung t-PA Aktivität anzutreffen war, ist, daß die t-PA Aktivität in biologischen Flüssigkeiten unterschätzt wird, die außerdem PAI 1 Aktivität enthalten. Dies liegt darin begründet, daß die PAI 1 Aktivität seine biologische Aktivität in dem Analysesystem ausübt. Daher besteht eine Notwendigkeit für eine Methode zur Inhibierung von PAI 1 Aktivität in dem Analysesystem, wenn die t-PA Aktivität in biologischen Flüssigkeiten gemessen wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Entsprechend der vorliegenden Erfindung wurden Varianten des einkettigen t-PA hergestellt, indem durch genetische Modifikation des nativen t-PA Proteins die Aminosäure Arginin durch ein Histidin (Arg nach His), oder durch ein Lysin (Arg nach Lys) oder durch ein Thrionin (Arg nach Thr) ersetzt wurde. All diese Mutanten, einschließlich der unschneidbaren Arg nach Thr Mutante, konnten zur Bestimmung der PAI Aktivität in Plasmaproben verwendet werden. Die Arg nach Thr Mutante stellt einen Vorteil bei PAI 1 Aktivitätsbestimmung dar. Präparationen der Arg nach Thr Mutante sind mit Sicherheit frei von zweikettigem t-PA. Das zweikettige t-PA reagiert im Gegensatz zu dem einkettigen t-PA ohne weiteres mit einer zweiten Form des PAI, bekannt als PAI 2. Daher kann man unter Verwendung des mutierten t-PA den PAI 1, einen Inhibitor der selektiv mit einkettigem t-PA reagiert, genau messen.
Zusätzlich schließt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Blutentnahme ein, so daß der t-PA, der im Blut vorliegt, stabilisiert wird und nicht ohne weiteres durch das PAI, das auch im Blut vorliegt, inaktiviert wird. Das verbesserte Verfahren zur Blutentnahme umfaßt die Ansäuerung des Blutes vom physiologischen pH von ungefähr 7,3 auf einen pH zwischen ungefähr 4,0 und 6,0. Die bevorzugte Methode zur Ansäuerung des Bluts zur Analyse des t-PA ist die Verwendung von Citratpuffer, obwohl selbstverständlich andere Puffer zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Es wurde gefunden, daß es vorteilhaft ist, Pluronic® F-68 zu dem Blut- Citratpuffer-Gemisch zuzugeben, um die Hämolyse des Bluts während der Ansäuerung zu verringern.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, daß Fibrinogen die Plasmakomponente ist, die für die Aktivierung des t- PA durch Polylysin anwesend sein muß. Plasminschnitte von Fibrinogen oder Fibrin aktivieren ebenfalls t-PA in Gegenwart von Polylysin. Somit muß Fibrinogen (oder Fibrinogenschneideprodukte) zusammen mit Polylysin zugegeben werden, wenn t-PA in anderen biologischen Flüssigkeiten als Blut gemessen wird, um die maximale Stimulierung der t-PA Aktivität zu erhalten.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Analyse der Plasminogenaktivator- Inhibitoraktivität bereitzustellen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen t-PA bereitzustellen, der gegen das Schneiden durch proteolytische Enzyme resistent ist und zur Analyse des PAI 1 verwendet werden kann.
Ein weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Entnahme von Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten bereitzustellen, die die t-PA Aktivität stabilisiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Methode zur sofortigen Erniedrigung des pHs von Blut bei gleichzeitiger minimaler Hämolyse bereitzustellen.
Es ist außerdem eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, Polylysin in Kombination mit Fibrinogen oder Fibrinogenschnitten als einen t-PA Cofaktor in biologischen Flüssigkeiten bereitzustellen, die nicht Blut sind.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Messung von Fibrin in einer Probe bereitzustellen, wobei ein einkettiger t-PA, der gegen das Schneiden durch protelytische Enzyme resistent ist, verwendet wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Analyse der t-PA Aktivität zu verbessern, durch das Einschließen von Antikörpern, die PAI 1 und α2 Antiplasmin-Aktivitäten verhindert, da diese Aktivitäten die Analyse der t-PA-Aktivität stören.
Diese und andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach der Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der anhängenden Ansprüche offensichtlich.

Beschreibung der Figur

Fig. 1 zeigt die t-PA Aktivität in Blut, das in verschiedenen Puffern gesammelt wurde.

Detaillierte Beschreibung der offenbarten Ausführungsform

Natives einkettiges t-PA wird durch Plasmin oder durch Trypsin nach dem Arginin in der Sequenz -Gln-Phe-Arg-Ile-Lys- in dem t-PA Protein geschnitten. Dies erzeugt ein Problem bei dem Versuch die PAI Menge in einer biologischen Flüssigkeit durch Inhibition der t-PA Aktivität zu messen. Es ist bekannt, daß die t-PA Aktivität bspw. durch Fibrin oder Fibrinfragmente stimuliert wird. Die Stimulierung des einkettigen t-PA durch die Anwesenheit von Fibrin ist wesentlich größer als die des zweikettigen t-PA.
Der mutierte t-PA reagierte schwach mit polyklonalen Antikörpern, die gegen das Peptid -Gln-Pro-Gln-Phe-Arg-Ile-Lys-Gly-Gly- entwickelt wurden, reagierte jedoch ohne weiteres mit dem nativen Protein. Die spezifische Aktivität, ausgedrückt in IU/ug war folgende: 810 (Arg nach His), 640 (Arg nach Lys), 290 (Arg nach Thr), verglichen zu 810 für den Wildtyp und 660 für t-PA aus Bowes Melanom. Die amidolytische Aktivität gegen D-Ile-Pro-Arg-pNA bei 37ºC, pH 9,0, ausgedrückt in mOD pro Minute bei 1 ug/ml des Enzyms war 15,8 (Arg nach His), 13,6 (Arg nach Lys), 8,3 (Arg nach Thr), 10,0 (Wildtyp), 9,6 für melanomischen einkettigen t-PA verglichen zu 55,2 für zweikettigen melanomischen t-PA.
Alle mutierten t-PA's, einschließlich der unschneidbaren Arg nach Thr Mutante, können zur Bestimmung der PAI Aktivität in Plasmaproben verwendet werden. Die Arg nach Thr Mutante stellt einen theoretischen Vorteil bei der PAI 1 Aktivitätsbestimmung dar. Präparationen der Arg nach Thr Mutante sind sicherlich frei von zweikettigem t-PA, das im Gegensatz zu dem einkettigen t-PA ohne weiteres auch mit PAI 2 reagiert.
Selbstverständlich kann der hierin beschriebene genetisch modifizierte t-PA ohne weiteres von jemandem, der ein übliches Wissen auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Techniken hat, hergestellt werden.
Die Plasminogenaktivierungsrate in Gegenwart und Abwesenheit von Fibrin bei 0,5 um Plasminogen und 37ºC wurde gemessen und der Stimulationsfaktor berechnet. Dieser war ungefähr 950fach für die Arg nach Thr Mutante, was beträchtlich höher war als der des melanomischen einkettigen t-PA und der anderen mutierten t-PA, die alle ungefähr bei 550fach lagen. Der Stimulationsfaktor für melanomischen zweikettigen t-PA war ungefähr 120fach. Verständlicherweise führte die besondere Fibrinsensitivität der Arg nach Thr Mutante zu einer verbesserten Analyse löslichen Fibrins gegenüber dem Wiman-Rånby Protokoll (s. Wiman, B. und Rånby, M., Thromb. Haemostas. 55, 189-183 (1986)). Somit ist gezeigt, daß der plasmininsensitive, als Protein konstruierte mutierte t-PA vorteilhaft gegenüber den bisher bekannten Methoden ist, wenn er zur Analyse der PAI 1 Aktivität und des löslichen Fibrins verwendet wird.
Selbstverständlich kann die gemäß der vorliegenden Erfindung gemessene t-PA Aktivität auch unter Verwendung eines Reagenz bestimmt werden, das Antikörper enthält, die die Antiplasminaktivität und die PAI Aktivität, die in zu analysierenden biologischen Flüssigkeiten anwesend sind, inhibieren.
Die vorliegende Erfindung schließt außerdem ein Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes von löslichem Fibrin in einer Probe ein, das die Schritte enthält: Mischen einer festgesetzten Menge der Probe mit einer festgesetzten Menge eines Reagenz, das einkettigen t-PA, Plasminogen und ein Plasminsubstrat enthält, und das Messen des Schneidens des Plasminsubstrats, wobei diese Rate mit der Menge an löslichem Fibrin in der Probe in Beziehung gesetzt wird.
Es wurde herausgefunden, daß, wenn während des Blutabnehmens der pH des Bluts sofort von dem physiologischen pH 7,3 auf einen pH von zwischen ungefähr 4,0 und 6,0 gesenkt wird, mehrere Vorteile bezüglich der Stabilität der fibrinolytischen Komponenten erreicht werden können, ohne einen der Nachteile oder Schwierigkeiten hereinzubringen, die im Vergleich dazu bei den üblicherweise verwendeten Systemen Vacutainer®, Venaject® zur Blutabnahme zutage treten.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden neun Anteile Blut in einen Behälter hineingezogen, der bereits einen Anteil Citratpuffer mit einem pH von ungefähr 4 und einer Molarität von ungefähr 1 Mol/l Citrat enthält. Der End-pH der Blutprobe sollte bevorzugt zwischen ungefähr 4,5 und 6,5 liegen. Der Citratpuffer sollte bevorzugt im Bereich zwischen 0,5 bis 2 Mol/l eines Natriumcitratpuffers sein und einen pH von ungefähr 4,0 bis 5,5 haben, zu dem 5 bis 15 Volumenanteile Blut während der Abnahme zugegeben werden.
Um Hämolyse der roten Blutzellen und Thrombocytenaktivierung in den Blutproben zu verhindern, kann ggf. Pluronic® F-68 (BASF Corporation, Parsippany, NJ) zu der Lösung zugegeben werden, in die hinein das Blut abgenommen wird. Die optimale Endkonzentration von Pluronic® F-68 ist zwischen ungefähr 0,01% 0,1% (0,1 bis 1 mg/ml). Selbstverständlich können andere Pluronic® Zusätze in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Hämolyse zu verhindern.
Pluronic® F-68 ist eine Spezies mit der folgenden allgemeinen Formel:
HO(C&sub2;H&sub4;O)b(C&sub3;H&sub6;O)a(C&sub2;H&sub4;O)bH,
worin a eine ganze Zahl ist, so daß der hydrophobe Anteil, der durch (C&sub3;H&sub6;O) dargestellt ist, ein Molekulargewicht von ungefähr 950 bis 4000 hat, bevorzugt von ungefähr 1750 bis 3500, und b eine ganze Zahl ist, so daß der hydrophile Anteil, der durch (C&sub2;H&sub4;O) dargestellt ist, ungefähr 50 bis 90 Gew.-% der Verbindung ausmacht.
Pluronic® F-68 hat die folgende spezifische Formel:
HO(C&sub2;H&sub4;O)b(C&sub3;H&sub6;O)a(C&sub2;H&sub4;O)bH,
worin das Molekulargewicht des hydrophoben (C&sub3;H&sub6;O) ungefähr 1750 und das Gesamtmolekulargewicht der Verbindung ungefähr 8400 ist.
Die Vorteile des Verfahrens sind, daß die Raten der Reaktionen zwischen t-PA und PAI 1 und zwischen t-PA und anderen Inhibitoren aus Blut bei einem pH von ungefähr 5 reduziert sind gegenüber denen bei dem physiologischen pH von ungefähr 7,3. Diese reduzierten Reaktionsraten erhöhen stark die Stabilität der t-PA Aktivität in Plasma. Dies ist besonders wichtig, da es sachdienlich ist die t-PA Aktivität zum Zeitpunkt der Probenentnahme zu bestimmen und nicht die niedrigere t-PA Aktivität, die in aufbewahrten Blutproben gefunden wird, die entsprechend dem bisher bekannten Stand der Technik abgenommen wurden. Somit verbessert die vorliegende Erfindung den Wert der Messung von t-PA Aktivität zur Diagnose der Ethiologie (ethiology) einer thrombotischen Krankheit, des Risikos zur Entwicklung einer thrombotischen Krankheit oder der erreichten t-PA Aktivität während einer t-PA Therapie.
Das bevorzugte Verfahren zur Blutabnahme zur Messung der t-PA Aktivität umfaßt das Abnehmen des Blutes in einen Sammelbehälter, der einen Citratpuffer enthält. Der Puffer enthält ungefähr 0,5 Mol/l Natriumcitrat bei einem pH von ungefähr 4,0. Selbstverständlich kann der Citratpuffer ein anderes Metallkation haben als Natrium. Es bedarf nur einer mäßigen pH-Reduktion, um die t-PA Aktivität im Blut zu erhalten. Eine gute t-PA Stabilität wird bei einem End-pH Bereich von ungefähr 5,3 bis 5,8, mit einem bevorzugten pH von ungefähr 5,5, gefunden. Diese Bedingungen sind mild, was darauf hinweist, daß dieser Ansatz sich als wertvoll für seine Analyte, z. B. Fibrinogen, Plasminogen, ATIII, Protein C, usw. erweisen mag.
Es wurde bestimmt, daß die Stabilität der PAI Aktivität in Blutproben, die gemäß der vorliegenden Erfindung abgenommen wurden, deutlich erhöht ist gegenüber solchen, die auf eine herkömmliche Art und Weise abgenommen wurden. Dies ist von Wichtigkeit für diese Art der Analyse, da die Instabilität der PAI 1 Aktivität den Umfang dieser klinisch wichtigen Analyse begrenzt.
Außerdem schützt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung lösliche Fibrinmengen in Blut- und Plasmaproben, wodurch die diagnostische Bedeutung dieser wichtigen Analyse verbessert wird. Es werden hohe Mengen löslichen Fibrins im Blut von Patienten mit malignem Krebs, risikoreichen Schwangerschaften und in Patienten, die an einem schweren Trauma leiden, gefunden. Hohe Mengen löslichen Fibrins ist außerdem ein Symptom von ausgebreiteter intravaskularer Koagulation.
Somit verbessert die vorliegende Erfindung zur Erniedrigung des pHs im Blut während des Abnehmens stark die Stabilität verschiedener wichtiger fibrino-lytischer Parameter, nämlich der t-PA Aktivität, der PAI 1 Aktivität und des löslichen Fibrins in der Blutprobe und in der daraus erhaltenen Plasmaprobe.
Es wurde festgestellt, daß bei der Verwendung von poly-D-Lysin die Stimulierung des t-PA die Plasminogenaktivierung vermittelte, wodurch herausgefunden wurde, daß das humane Plasma einen Faktor enthielt, der den stimulierenden Effekt des poly-D-Lysins verstärkte. In dieser Arbeit wurde dieser Faktor als Fibrinogen identifiziert und es wurde außerdem herausgefunden, daß die Plasminschneideprodukte des Fibrinogens oder Fibrins diesen Effekt ebenfalls hatten. Diese Entdeckung ist wichtig, da sie die Formulierung von praktischen und günstigen Reagentien zur Bestimmung der t-PA Aktivität in Blutplasma und der PAI 1 Aktivität in Blutplasma ermöglicht. Dies ist besonders wichtig in der klinischen täglichen Arbeit.

Beispiel I

Das folgende Beispiel beschreibt eine Messung des t-PA entsprechend der vorliegenden Erfindung:
Citronensäure-Monohydrat, Mr = 210, und Trinatriumcitrat-Dihydrat, Mr = 294, wurden von Merck Darmstadt, W. G., erhalten. Pluronic® F-68 wurde von BASF Corporation, Parsipanny, New Jersey, erhalten. Das Blut wurde durch Venipunktur erhalten und in 0,13 Mol/l Trinatriumcitrat (1 Anteil Citratpuffer zu 9 Anteilen Blut) in einem siliconisierten Venoject® Sammelröhrchen gesammelt.
0,5 Mol/l Lösungen der Citronensäure und des Trinatriumcitrats wurden gemischt, um 0,5 Mol/l Natriumcitratlösungen mit pH 4,0, 4,5, 5,0 und 5,5 zu ergeben. Jede dieser Lösungen wurde aliquotiert und 25% F68 wurde bis zur Endkonzentration von 0, 0,1 oder 1 Gew.-% zugegeben.
1,0 Mol/l und 2,0 Mol/l Citratpuffer mit pH 4,0, 4,5, 5,0 und 5,5, enthaltend 0, 0,1 oder 1% F68 wurden entsprechend hergestellt.
Das mit Citrat versetzte Blut wurde in 300 ul Aliquots aufgeteilt, zu denen 33 ul von jedem der 36 verschiedenen Puffer zugegeben wurden, es wurde gemischt und bei Raumtemperatur (22ºC) für 20 Stunden inkubiert. Die Proben wurden 6 Minuten bei 1500 · g zentrifugiert, alle 6fach in 0,15 Mol/l Natriumchlorid verdünnt und einer pH- und Absorptionsbestimmung bei 537 nm unterzogen. Der Absorptionswert (die optische Dichte bei 1 cm Weglänge) wurde mit dem Verdünnungsfaktor von 6 multipliziert.
Zu einer Reihe von Blutprobenaliquots wurde ein 1 : 9 Volumen verschiedener Citratpuffer zugegeben. Daraus wurde einige 20 Stunden später Plasma erhalten und der pH und die Absorption bei 537 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: pH und Absorption bei 537 nm in Plasma, erhalten aus Blutproben, zu den 1 : 9 Volumen von Citratpuffern mit verschiedenen Konzentrationen, pH und F-68 Gehalt zugegeben wurden. Tabelle 1
*nicht bestimmt
Wie aus Tabelle 1 ersehen werden kann, verringerte die Zugabe von F68 zu dem frisch abgenommenen Blut die Hämolyse der roten Blutzellen wie durch die Absorption bei 537 nm angezeigt wird. Dies ist besonders eindeutig bei der Zugabe von 1 Mol/l Citrat bei einem pH von 4,0 und bei der Zugabe von 2 Mol/l Citrat bei einem pH von 4,5. In beiden Fällen besteht ein dosisabhängiger Anstieg der Stabilität der roten Blutzellmembranen, was gezeigt wird, dadurch daß die Absorption bei 537 nm in dem Maß abfällt, in dem die Pluronic® F-68 Konzentration ansteigt. Es sollte festgehalten werden, daß dieses Experiment mit Blut eines allem Anschein nach gesunden Individuums durchgeführt wurde und daher Probleme bezüglich Hämolyse gering waren. Diese Probleme könnten voraussichtlich sehr viel größer sein, wenn eine große Anzahl von Patientenplasmen ausprobiert werden.

Beispiel 2

Venoject®, Teruno Europe, Lewen, Belgien, sind evakuierte siliconisierte 4,5 ml Röhrchen, enthaltend 0,45 ml 0,13 Mol/l Natriumcitrat und werden im folgenden "normale Venoject" genannt. Einige "normale Venoject" wurden als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung modifiziert. Der Citratpuffer aus den "normalen Venoject" Röhrchen wird durch Herausziehen mit einer hypodermischen Nadel entfernt und 0,45 ml eines 1,0 Mol/l Citratpuffers pH 4,0 wird durch den Gummipfropfen mit einer hypodermischen Nadel eingeführt. Auf diese Weise wird die Citratpufferzusammensetzung geändert, ohne das Vakuum in dem Röhrchen zu zerstören. Die modifizierten Röhrchen werden im folgenden "modifizierte Venoject" genannnt.
Durch Venipunktur wird einem allen Anschein nach gesunden Individuum Blut in zwei "normale Venoject" und in zwei "modifizierte Venoject" Röhrchen hinein abgenommen. Jeweils zu einem "normalen Venoject" und einem "modifizierten Venoject" Röhrchen wurden 4 ul des einkettigen t-PA mit 500 IU/ml, verdünnt in 1,0 Mol/l KHCO&sub3; zugegeben. Dies führte zu einem Anstieg der t-PA Aktivität von ungefähr 8,9 IU/ml im Plasma bei einem Hämotokrit von 0,45. Die vier Röhrchen, "normales Venoject", "normales Venoject + t-PA", "modifiziertes Venoject" und "modifiziertes Venoject + t-PA" werden bei Raumtemperatur (22ºC) inkubiert und davon 1 ml Aliquots nach 0,25, 1, 2 und 3 Stunden entnommen. Die Aliquots werden 6 Minuten bei 1500 · g zentrifugiert und 100 ul des Plasmas durch Zugabe von 100 ul Mol/l Acetatpuffer pH 3,9 angesäuert und nach dem Protokoll von Wiman, et al., Clin. Chem. Act. 127: 279-288 (1983) analysiert, unter Verwendung von Spektrolyse/Fibrinreagentien von Biopool AB, Umeå, Schweden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 2 gezeigt.
In Tabelle 2 wurde die t-PA Aktivität in Blutplasma nach der Abnahme von Blutproben in "normalem Venoject" und "modifiziertem Venoject" mit und ohne Zugabe von ungefähr 9 IU/ml t-PA zum Zeitpunkt Null gemessen. Das Blut wurde vor dem Abtrennen der Blutzellen bei Raumtemperatur für 0,25, 1, 2 und 3 Stunden inkubiert. Die t-PA Aktivität ist in IU/ml ausgedrückt. Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 gesehen werden kann, war die t-PA Aktivität in den modifizierten Venoject-Röhrchen stabil, während sie in den unmodifizierten Röhrchen schnell abfiel.

Beispiel 3

4,5 ml Blut wird in 0,5 ml eines (Natrium) Citratpuffers in siliconisierte Glasröhrchen aus der Cubitalvene sitzender Individuen unter Anlegen einer minimalen Blutstauung gesammelt. Zu jedem von 22 verschiedenen Puffern (Citratpuffer in einem Bereich von 0,13 bis 0,8 Mol/l, pH-Bereich von ungefähr 3 bis 5,5) wird Blut von 5 Individuen abgenommen. Das Blut wird in geschlossenen Polystyrolröhrchen zu 3 · 1,5 ml aliquotiert und bei 22ºC für 0,05, 1 und 4 Tage inkubiert. Durch 10minütige Zentrifugation bei 3000 · g wird Plasma erhalten, eingefroren und bei -20ºC gelagert. Die t-PA Aktivität wird mittels eines fibrinstimulierten chromogenen Substratassays (Biopool AB, Umeå, Schweden) bestimmt. Anschließend wird die mittlere t-PA Aktivitätshalbzeit (t1/2) bestimmt. Der pH wird mit einer Standard- Glaselektrode gemessen. Der relative Grad der Hämolyse, der Hämolysisfaktor (HF), wird als Anstieg der Absorption bei einer Wellenlänge von 540 nm im Vergleich zu einer Blutabnahme in 0,13 Mol/l Trinatriumcitrat bestimmt. Tabelle 3 t-PA Aktivität in Plasma (IU/ml) aus Blut, gelagert bei Raumtemperatur Tabelle 4 Absorption bei 540 nm in Plasma aus Blut, gelagert bei Raumtemperatur
Es wurde herausgefunden, daß die bevorzugte Pufferzusammensetzung ungefähr 0,5 Mol/l Citrat bei einem pH von ungefähr 4,0 ist. Fig. 1 und Tabelle 3 zeigen die t-PA Aktivität in Blut 0,05, 1 und 4 Tage nach der Abnahme in Citratpuffer, 0,5 Mol/l bei pH 4,0 und in dem herkömmlichen 0,13 Mol/l Trinatriumcitratpuffer. Wie in Fig. 1 gezeigt, war der t-PA in dem 0,5 Mol/l Puffer wesentlich stabiler als der t-PA in dem herkömmlichen Puffer. Der End-pH der Blutprobe war ungefähr 5,5, verglichen zu 8,3 mit dem herkömmlichen 0,13 Mol/l Trinatriumcitratpuffer. Die mittlere t-PA Aktivitäts-Halbwertszeit in Blut bei Raumtemperatur war 17 Tage, wenn die Blutabnahme in den 0,5 Mol/l Citratpuffer bei einem pH von 4,0 erfolgte. Tabelle 4 zeigt die Hämolyse in den beiden Puffersystemen. Wie gezeigt ist die Hämolyse in der bevorzugten Pufferzusammensetzung akzeptabel.
Selbstverständlich bezieht sich das zuvor beschriebene nur auf eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und es können eine große Anzahl von Modifikationen oder Veränderungen gemacht werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen, wie er in den nachfolgenden Patentansprüchen angegeben ist.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen von t-PA, ATIII und löslichem Fibrin in einer Probe von frischem Vollblut außerhalb des Körpers durch:

(a) Einbringen einer Probe frischen Vollbluts in einen Behälter außerhalb des Körpers, wobei der Behälter einen sauren Puffer enthält, so daß der endgültige pH des frischen Vollbluts zwischen 4,0 und 6,0 beträgt, wobei das frische Vollblut vor dem Ansäuern nicht modifiziert wurde, und

(b) Bestimmen der gewünschten Enzymaktivitäten im angesäuerten Vollblut, wobei ein einkettiger t-PA-Mutant verwendet wird, der weniger leicht in ein zweikettiges t-PA gespalten wird als natürlich auftretendes t-PA.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Citratpuffer als saurer Puffer verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Citratpuffer Natriumcitrat ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Verhältnis von Puffer zu frischem Vollblut von etwa 1 : 9 verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das frische Blut außerdem mit Pluronic® F-68 der Formel

HO(C&sub2;H&sub4;O)b(C&sub3;H&sub6;O)a(C&sub2;H&sub4;O)bH,

in der a eine ganze Zahl ist, so daß der hydrophobe Anteil, dargestellt durch (C&sub3;H&sub6;O), ein Molekulargewicht von 950 bis 4000 aufweist und b eine ganze Zahl ist, so daß der hydrophile Anteil, dargestellt durch (C&sub2;H&sub4;O), 50 bis 90 Gew.-% der Verbindung ausmacht, gemischt wird in einer wirksamen Menge, um Hämolyse der roten Blutzellen zu verhindern.