DE3853282T2 - Diagnostischer Test für Pseudomonas Aeruginosa Infektionen. - Google Patents

Description

Technisches Gebiet
• Die Erfindung betrifft allgemein die Verwendung neuer immunologischer Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose von durch Pseudomonas aeruginosa verursachten Infektionen. Insbesondere wird ein empfindlicher und spezifischer Immunofluoreszenztest beschrieben, der monoklonale Antikörper für ein Protein einer äußeren Membran von P. aeruginosa verwendet.
Kurze Beschreibung des Standes der Technik
• Gram-negative bakterielle Infektionen sind die Ursache von Erkrankungen und Sterblichkeit bei menschlichen Patienten. Infektionen, die aufgrund eines dieser gram-negativen Organismen, P. aeruginosa, auftreten, werden in der Medizin als besonders schwierig zu behandelnd angesehen. Die Prognose, daß sich ein Patient von einer durch P. aeruginosa verursachten Infektion wieder erholt, wird erhöht, wenn die Diagnose im Verlaufe der Infektion so früh wie möglich gemacht und eine geeignete Behandlung eingeleitet wird, bevor die Zahl der Bakterien im Wirt zu groß und es viel schwieriger wird, sie unter Kontrolle zu bringen.
• Die Diagnose von durch P. aeruginosa verursachten Infektionen basiert häufig auf klinischen Befunden, mikrobiologischen Kulturen und biochemischen Tests. Obgleich eine rasche und genaue Diagnose von P. aeruginosa-Infektionen sehr erwünscht ist, ist dies unter Verwendung vorhandener Reagentien und vorhandener Verfahren zur Zeit nicht möglich. Eine Gramsche Färbung direkter Abstriche von Patienten sind von geringem oder keinem Wert. Die zur Zeit einzige Methode, der wirklich vertraut werden kann, ist die Isolierung des Bakteriums in Reinkultur und seine nachfolgende Identifizierung durch biochemische oder serologische Verfahren. Konventionelle Laboratoriums-Kulturverfahren umfassen die Inkubierung klinischer Proben während 24 bis 48 Stunden, um den Organismus auf makroskopisch bestimmbare Mengen zu vermehren. Um P. aeruginosa von verwandten Pseudomonas und anderen Enterobakterien zu unterscheiden sind Subkultivierungsverfahren und Stoffwechselassay erforderlich, die weitere 24 bis 48 Stunden erfordern können.
• In dem Bestreben, das diagnostische Verfahren für die oft lebensbedrohenden Infektionen, die von P. aeruginosa verursacht werden, schneller und einfacher zu machen, wurden verschiedene immunologische Versuche unternommen. Die Immunofluoreszenzbestimmung von P. aeruginosa unter Verwendung von in Kaninchen produzierten polyklonalen Antiseren wird von Ajello et al., Invest. Urology 5 (1967) 203; Sands et al., J. Clin. Path. 28 (1975) 997; und Kohler et al., J. Clin. Microbiol., 9 (1979) 253 beschrieben. Aufgrund einer Vielzahl von Problemen, die mit solchen Präparationen verbunden sind, sind diese Reagentien in klinischen Laboratorien nicht akzeptiert worden.
• Zur monoklonalen Antikörper-Technologie wurden von Kohler und Milstein, Nature 256 (1975) 495, bahnbrechende Arbeiten durchgeführt. Monoklonale Antikörper können nun in praktisch unbegrenzten Mengen konsistent und mit einem hohen Reinheitsgrad hergestellt werden. Diese Möglichkeiten erleichtern die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Durchführung diagnostischer Tests, die in Krankenhäusern und anderen klinischen Einrichtungen erforderlich sind.
• Monoklonale Antikörper gegen verschiedene Komponenten der komplexen äußeren Membran von P. aeruginosa wurden produziert. Es wurden verschiedene monoklonale Antikörper beschrieben, die an das Lipopolysaccharid von P. aeruginosa binden, einschließlich der O-Seitenketten, des Kernes und der Lipid A-Anteile des Moleküls. Monoklonale Antikörper, die an die O-Seitenketten binden, sind im allgemeinen serotypisch oder immunotypisch spezifisch, sind jedoch selbst ungeeignet, um alle Serotypen oder Immunotypen von P. aeruginosa zu bestimmen. Monoklonale Antikörper, die an den Kern und Lipid A-Anteile binden, sind nicht spezifisch, weil sie dazu fähig sind, auch an andere Spezien von Pseudomonas oder andere gram-negative Bakterien zu binden.
• Die äußere Membran von P. aeruginosa enthält zusätzlich zu ihrer Lipopolysaccharid-Komponente verschiedene Polypeptide. Eines dieser Proteine, Protein F, ist in großer Zahl in der Membran vorhanden und bildet wassergefüllte Kanäle durch den hydrophoben Kern der Membran. Mutharia und Hancock haben die Herstellung und Charakterisierung verschiedener Mausmonoklonaler Antikörper gegen Porin-Protein F in der äußeren Membran von P. aeruginosa beschrieben (Infect. Immun. 42 (1983) 1027; Can. J. Microbiol. 31 (1985) 381; und Adv. Exp. Med. Biol. 185 (1985) 215), die alle unter Bezugnahme darauf Bestandteil dieser Beschreibung sind.
• Immunofluoreszenz-Färbeverfahren können in 2 Kategorien unterteilt werden, und zwar in direkte und indirekte. Beim direkten Färbeverfahren wird ein Fluorophor mit einem Antikörper konjugiert (nachfolgend als primärer Antikörper" bezeichnet), der dazu fähig ist, direkt an das Zellantigen, an dem Interesse besteht, zu binden. Beim indirekten Färbeverfahren wird der primäre Antikörper nicht mit einem Fluoreszenzmarker versehen; seine Bindung wird stattdessen durch die Bindung eines Fluoreszenz-markierten zweiten Antikörpers sichtbar gemacht, wobei dieser zweite Antikörper dazu fähig ist, an den primären Antikörper zu binden. In einigen Fällen ist der zweite Antikörper unmarkiert und ein dritter Antikörper, der dazu fähig ist, mit dem zweiten Antikörper zu binden, ist fluoreszenzmarkiert.
• In einigen Fällen ist eine indirekte Immunofluoreszenz von Vorteil, weil sie empfindlicher als eine direkte Immunofluoreszenzmethode sein kann, weil an jedes gebundene Molekül des ersten Antikörpers mehrere Moleküle des markierten zweiten Antikörper binden können. Es ist jedoch allgemein bekannt, daß die indirekte Immunofluoreszenz stärker als die direkte Immunofluoreszenz zu einer nichtspezifischen Anfärbung neigt, d.h. zu einer Anfärbung, die nicht auf der spezifischen Antigen-Antikörper-Wechselwirkung, die von Interesse ist, beruht (Johnson et al., in Handbook of Experimental Immunology, D.M. Weir, Ed., Oxford: Blackwell Publications (1979), und Mishell et al., Ed., Selected Methods in Cellular Immunology, San Fransisco: W.H. Freeman (1980)). Zusätzlich machen mehrere Stufen, die bei der Durchführung der indirekten Tests erforderlich sind, diese Verfahren langsamer, arbeitsintensiver, und empfänglicher gegenüber technischen Fehlern.
• Trotz der Verfügbarkeit monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Strukturkomponenten von P. aeruginosa, einschließlich Protein F, besteht in Kliniken und klinischen Laboratorien weiterhin ein starkes und dringliches Bedürfnis für einen raschen, empfindlichen und genauen diagnostischen Test auf P. aeruginosa. Dieses Bedürfnis wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Zusammenfassung der Erfindung
• Es werden neue Reagentien und Verfahren zur Bestimmung und Diagnose von P. aeruginosa in biologischen Proben bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Umsetzung einer Probe, von der man vermutet, daß sie den Organismus enthält, mit einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, der (das) dazu fähig ist, an Protein F der äußeren Membran zu binden, das im wesentlichen allen Serotypen oder Immunotypen von P. aeruginosa gemeinsam ist, Abtrennen der Probe vom ungebundenen Antikörper, und Bestimmung der Anwesenheit der zwischen dem monoklonalen Antikörper und dem P. aeruginosa-Antigen gebildeten Immunkomplexe, und damit der Gegenwart von P. aeruginosa. Es werden außerdem neue Hybrid-Zellinien bereitgestellt, die monoklonale Antikörper produzieren, die dazu fähig sind, spezifisch an Protein F von P. aeruginosa zu binden. Wenn die monoklonalen Antikörper markiert und mit einem solubili-sierenden Reagens kombiniert sind, wird ein spezifischer und rascher direkter Test für P. aeruginosa möglich.
Beschreibung spezifischer Ausführungsformen
• Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Zusammensetzungen monoklonaler Antikörper bereitgestellt, wobei diese Antikörper dazu fähig sind, an das Protein F der äußeren Membran von P. aeruginosa selektiv zu binden, und die deshalb als diagnostischer Test verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können hergestellt werden, indem man die Expression von Nucleinsäuresequenzen, die für auf Protein F von P. aeruginosa spezifische Antikörper kodieren, immortalisiert. Dies kann erreicht werden, indem man solche Sequenzen, die für den Antikörper typisch cDNA-kodierend sind, in einen Wirt einbringt, der zur Kultivierung und Kultur fähig ist. Die immortalisierte Zellinie kann eine Säugetierzellinie sein, die durch Oncogenese, Transfektion, Mutation oder dergleichen transformiert wurde. Solche Zellen umfassen Myelom-Linien, Lymphom-Linien, oder andere Zellinien, die dazu fähig sind, die Expression und Sekretion des Antikörpers in vitro zu unterstützen. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommendes Immunglobulin eines von Menschen verschiedenen Säugers sein, das durch Transformation eines Lymphocyten mittels eines Virus oder durch Fusion des Lymphocyten mit einer neoplastischen Zelle produziert wurde, z.B. ein Myelom, um eine Hybridzellinie zu erzeugen. Typischerweise wird die Lymphoidzelle eines gegen Protein F immunisierten Tieres oder ein Fragment davon, das ein Epitop enthält, erhalten.
• Die Immunisierungsverfahren sind allgemein bekannt und können beträchtlich variieren und trotzdem wirksam bleiben. Siehe Golding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (1983). Immunogene Mengen antigener Präparationen werden, im allgemeinen bei Konzentrationen im Bereich von 1 ug bis 20 mg/kg Wirt, injiziiert. Die zur Immunisierung des Tieres verwendete antigene Präparation umfaßt vorzugsweise solche Protein F-Moleküle, die durch die Peptidoglycan-Moleküle der Zellwand nach Behandlung mit einem Detergens erhalten bleiben, wie dies weiter unter erörtert wird. Die Verabreichung der antigenen Präparationen kann ein oder mehrere Male vorgenommen werden, und normalerweise in Intervallen von 1 bis 4 Wochen. Immunisierte Tiere werden zur Produktion des Antikörpers für das gewünschte Antigen überprüft, dann wird die Milz entnommen und die Milz-B Lymphocyten werden isoliert und transformiert oder mit einer Myelom-Zellinie fusioniert. Die Transformation oder Fusion kann auf konventionellen Wegen durchgeführt werden, wobei die Fusionstechnik in einer Vielzahl von Patenten beschrieben ist, z.B. in 4172124; 4350683, 4363799; 4381292; und 4423147. Siehe auch Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980) und die darin angegebenen Literaturhinweise, und Golding, supra.
• Die Hybrid-Zellinien können kloniert und gemäß konventioneller Verfahren gescreent werden, und in den Zellüberständen können Antikörper bestimmt werden, die dazu fähig sind, an Protein F von P. aeruginosa zu binden. Die geeigneten Hybrid-Zellinien können dann in einer Kultur im größeren Maßstab in vitro gezüchtet werden oder zur Produktion von Ascitesflüssigkeit in die Bauchhöhle eines geeigneten Wirts injiziert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Antikörper, der spezifisch für Protein F ist, können die Überstände im Vergleich mit den betreffenden monoklonalen Antikörpern in einem Vergleichsversuch gescreent werden. Auf diese Weise können aus einer Vielzahl von Quellen, die auf der Verfügbarkeit der vorliegenden für das bestimmte Antigen spezifischen Antikörper basieren, leicht Hybrid-Zellinien produziert werden. Alternativ können diese Hybrid-Zellinien mit anderen neoplastischen B-Zellen fusioniert werden, oder solche anderen B-Zellen können als Empfänger für genomische DNA, die für den Antikörper kodiert, dienen. Oder der monoklonale Antikörper kann unter Verwendung von Hybrid-DNA-Techniken, ein durch Insertion von genomischer DNA oder cDNA, die für eine oder beide schweren und leichten Ketten kodiert, in einen Expressionsvektor zur Expression der Ketten hergestelltes Immunglobulin sein. Siehe z.B. die Europäischen Patentveröffentlichungen 171496 und 173494.
• Obgleich neoplastische B-Zellen von Nagern, insbesondere von Mäusen, bevorzugt sind, können andere Säugertierarten verwendet werden, wie z.B. Lagomorpha, Rinder, Schafe, Pferde, Schweine, Vögel oder dergleichen. Die Immunisierung dieser Tiere ist leicht durchzuführen und ihre Lymphocyten, insbesondere Splenocyten, können für Fusionen erhalten werden.
• Die durch die transformierten oder Hybrid-Zellinien sekretierten monoklonalen Antikörper können irgendeine der Klassen oder Subklassen von Immunglobulinen sein, wie z.B. IgM, IgD, IgA, oder Subklassen von IgG, die für jede Tierart bekannt sind. Da IgG der in diagnostischen Untersuchungen am meisten verwendete Isotyp ist, ist es für diesen Zweck bevorzugt. Die monoklonalen Antikörper können als ganze, oder als Fragmente, wie z.B. als Fv, Fab, F(ab')&sub2;, verwendet werden, aber normalerweise als ganze Antikörper.
• Die erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörper sind insbesondere für diagnostische Zwecke geeignet. Typischerweise umfaßt die diagnostische Untersuchung die Bestimmung der Bildung eines Komplexes durch Bindung des monoklonalen Antikörpers an ein bestimmtes Epitop am Protein F-Antigen von P. aeruginosa. Monoklonale Antikörper, die dazu fähig sind, die Bindung von durch die erfindungsgemäße Hybrid-Zellinie produzierten Antikörpern zu blockieren, wie z.B. der nachfolgend beschriebene ATCC Nr. H89277, sind bevorzugt.
• Zur Verwendung in diagnostischen Assays können die erfindungsgemäßen Antikörper direkt markiert werden. Eine Vielzahl von Markern kann verwendet werden, wie z.B. Radionuklide, Fluoreszenzmarker, Enzyme, Enzymsubstrat, Enzym-Cofaktoren, Enzym-Inhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) usw. Unmarkiert können die Antikörper in Agglutinationsassays Verwendung finden. Zusätzlich können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (sekundäre Antikörper) verwendet werden, die mit dem monoklonalen Antikörper reaktiv sind, wie z.B. Antikörpern, die für das Immunglobulin spezifisch sind. Es sind zahlreiche Arten von Immunoassays verfügbar und für den Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt.
• Im allgemeinen ist es notwendig, den primären Antikörper aus der Ascitesflüssigkeit oder dem Kulturüberstand vor der Markierung zumindest teilweise zu reinigen. Reinigungsverfahren sind allgemein bekannt (Mishell et al., supra) und können Ammoniumsulfatfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie, oder einige Kombinationen davon umfassen.
• Aufgrund der leichten Verfügbarkeit von Fluoreszenzmikroskopen im klinischen Laboratorium ist die bevorzugte Markersubstanz der vorliegenden Erfindung ein Fluorophor, typischerweise Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Phycocyanin. Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit Fluorophoren sind bekannt (Weir, supra). Typischerweise werden Antikörper mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in einem ungefähren Verhältnis von 45 ug FITC pro mg Antikörper-Protein während ca. 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Der markierte Antikörper wird vom freien Marker durch Gelfiltration abgetrennt, z.B. an Sephadex G-25. Die Markierung mit Phycoerythrin oder Phycocyanin wird typischerweise durchgeführt wie von Oi et al., J. Cell. Biol., 93 (1982) 981 und im US-Patent 4520110 beschrieben.
• Die auf Gegenwart von P. aeruginosa zu untersuchende biologische Probe kann, abhängig von der Quelle der Probe, auf eine Vielzahl von Wegen zubereitet werden. Die Probe kann eine Probe von menschlichem Blut, Speichel, Urin, Wundexsudat, oder menschlichem Gewebe sein, oder eine Laboratoriumskultur davon. Vor oder zur Zeit der Kombination des primären Antikörpers mit der Probe wird die Probe mit einem solubilisierenden Reagens behandelt, daß die Antigen-Determinanten von Protein F, die auf andere Weise für die Antikörper-Zusammensetzungen nicht leicht zugänglich sind, freisetzen. Diese solubilisierenden Agentien umfassen Detergentien, wie z.B. Triton X-100 (Triton ist ein eingetragenes Warenzeichen von Rohm und Haas Co., für Octylphenoxypolyethoxyethanol) und Natriumdeoxycholat. Eine Kombination von solubilisierenden Agentien, wie z.B. Triton X-100, mit einem Chelatisierungsmittel, wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), wird bevorzugt. Die Konzentration von Triton X-100 beträgt üblicherweise ca. 0,05 % bis 2,5 % (v/v), vorzugsweise ca. 0,5 % (v/v), und die Konzentration an EDTA kann im Bereich von 1 mM bis zu ca. 100 mm liegen, beträgt vorzugsweise aber ca. 9 mM. Die Solubilisierungsstufe wird in einem geeignet gepufferten Medium, normalerweise in PBS, bei alkalischem oder neutralem ph-Wert, normalerweise von pH = 7,0 bis pH = 9,3, und vorzugsweise bei ph = 9,3, durchgeführt. Es scheint, daß diese Verfahren die Protein F-Moleküle, die nicht mit dem Peptidoglycan der Bakterienzellwand assoziert sind, sowie die Lipopolysaccharidmoleküle der Zellen freisetzt, weil die Zelle mit Anti-LBS-Antikörpern nach der gewünschten Behandlung nicht reaktiv ist. Dies kann Epitope oder Domänen von Protein F, die bei unbehandelten Zellen auf andere Weise nicht zugänglich sind, freisetzen. Die erfindungsgemäßen Antikörper reagieren mit solchen Molekülen von Protein F, die mit dem Peptidoglycan nach Behandlung mit Triton X-100 und EDTA assoziert bleiben. Wenn die Solubilisierungsstufe gleichzeitig mit der Zugabe des primären Antikörpers verläuft, muß sichergestellt werden, daß der Antikörper unter den verwendeten Solubilisierungsbedingungen stabil und mit seinem Bindungspartner reaktiv bleibt. Man muß deshalb darauf achten, nicht die gesamten Porin-Protein F-Moleküle, die an die Peptidoglycan-Struktur gebunden sind, zu solubilisieren.
• Die biologische Probe, von der vermutet wird, daß sie P. aeruginosa enthält, wird mit dem primären Antikörper unter Bedingungen kombiniert, die für eine Immunkomplexbildung erförderlich sind. Wenn der Test ein Einstufen- Immunofluoreszenzassay ist, ist der primäre Antikörper markiert. Typischerweise wird die Probe zuerst durch Hitze und/oder Ethanolbehandlung an einen Glasobjektträger fixiert oder angeheftet, obwohl für einen Fachmann auf diesem Gebiet auch andere Fixiermittel oder Adhäsionsmittel bekannt sind. Die Probe wird dann mit dem Solubilisierungsmittel während einer ausreichenden Zeitspanne, normalerweise von 1 bis 30 Minuten, und insbesondere von ca. 10 Minuten, in Kontakt gebracht, und das Solubilisierungsmittel dann vom Objektträger abgewaschen. Alternativ können, wie vorstehend beschrieben, das Solubilisierungsmittel und der primäre Antikörper kombiniert und in einer Stufe zugegeben werden. Der primäre Antikörper sollte mit der Probe während ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden, obwohl die Bedingungen etwas variieren können. Der Objektträger wird abgespült, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Wenn der primäre Antikörper mit FITC markiert wurde, kann die umgesetzte Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit Standard-Fluoresceinfiltern (Excitation = 490 nm; Emission = 520 nm) und eine 40X Ölimmersionslinse ausgestattet ist, betrachtet werden. Die quantitative Bestimmung der Fluoreszenz basiert auf einer visuellen Beobachtung der Helligkeit oder des relativen Kontrastes des spezifisch angefärbten Antigens. Geeignete positive und negative Kontrollen machen eine Interpretation genauer. Eine Kontrastfarbung, wie z.B. Evans-Blau, können verwendet werden, um den fluoreszierenden Organismus leichter sichtbar zu machen.
• Die Erfindung kann verwendet werden, um die Gegenwart von P. aeruginosa in klinischen Proben oder Laboratoriumskulturen spezifisch festzustellen. Der monoklonale Antikörper zeigt keine Kreuzreaktion mit anderen klinisch bedeutsamen gram-negativen oder gram-positiven Organismen oder anderen Pseudomonas-Arten, die erfindungsgemäß, wie in Tabelle 1 angegeben, getestet wurden. Es wird angenommen, daß im wesentlichen alle Isolate der verschiedenen Serotypen oder Immunotypen von P. aeruginosa durch die Antikörper erkannt werden können, während angenommen wird, daß keine Pseudomonas-Arten, die von P. aeruginosa verschieden sind, erfaßt werden. Für eine Übersicht eines typisierenden Schemas für P. aeruginosa, siehe Zierdt, C.H., in Glucose Nonfermenting Gram-negative Bacteria in Clinical Microbiology, Gilardi, G.L., Ed., CRC Press, Seiten 213-238 (1978), und das neuere vorgeschlagene International Antigenic Typing Scheme (IATS) System in Liu, P.V., Int. J. Syst. Bacteriol. 33 (1983) 256-264. Wünschenswerterweise werden so mindestens 90 bis 95 %, normalerweise 95 bis 99 %, und vorzugsweise mehr als 99 % klinische Isolate von P. aeruginosa erfindungsgemäß bestimmt. Darüberhinaus zeigt keine der Nicht-Pseudomonas-Spezien eine Kreuzreaktion mit den hier beschriebenen Antikörpern, mit Ausnahme eines Organismus mit der Bezeichnung "CDC-Group I", einer heterogenen Gruppe von aus Menschen selten isolierten Organismen.
• Zur Verwendung der Antikörper zur Bestimmung von P. aeruginosa können auch Kits bereitgestellt werden, wobei diese Kits Kompartimente umfassen, die einen monoklonalen Antikörper, der dazu fähig ist, spezifisch an Protein F der äußeren Membran von P. aeruginosa zu binden, ein Solubilisierungsmittel, und Marker und notwendige Reagentien zur Ausbildung eines bestimmbaren Signals, enthalten. Die erfindungemäße monoklonale Antikörper- Zusammensetzung kann deshalb normalerweise in lyophilisierter Form bereitgestellt werden, entweder allein oder zusammen mit zusätzlichen Antikörpern, die spezifisch für andere Antigene von P. aeruginosa sind. Die Antikörper, die mit einem Marker konjugiert werden können, sind in den Kits zusammen mit Puffern, wie z.B. Tris, Phosphat, Carbonat, usw., Stabilisatoren, Biociden, inerten Proteinen, z.B. Rinderserumalbumin oder dergleichen, vorhanden. Im allgemeinen sind diese Materialien in einer Menge von weniger als ca. 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge des aktiven Antikörpers, und normalerweise in einer Gesamtmenge von mindestens ca. 0,001 Gew.-%, ebenfalls bezogen auf die Antikörperkonzentration, vorhanden. Häufig ist es wünschenswert, ein inertes Verdünnungsmittel oder einen Träger zur Verdünnung der wirksamen Bestandteile einzuschließen, wobei der Träger in einer Menge von ca. 1 bis 99 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung vorhanden sein kann. Wenn ein zweiter Antikörper, der zur Bindung des monoklonalen Antikörpers fähig ist, verwendet wird, so ist dieser normalerweise in einem getrennten Gefäß vorhanden. Der zweite Antikörper kann mit einem Marker konjugiert sein und auf eine analoge Weise wie die vorstehend beschriebenen Antikörperformul ierungen formuliert sein.
• Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden experimentellen Beschreibung, in denen die Erfindung mittels Beispielen beschrieben wird, ersichtlich. Die Beispiele werden aber nur zur Veranschaulichung angegeben und stellen keine Beschränkung dar.
Beispiel 1
• Beispiel 1 veranschaulicht die Methode, die zur Herstellung eines Maus-monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an P. aeruginosa-Protein F bindet, verwendet wird.
Reinigung des Protein F
• 6 l L-Kulturlösung (1 % (Gew/Vol] Difco-Kulturbrühe, 1 % [Gew/Vol] Difco Hefeextrakt, 0,5 % [Gew/Vol) Natriumchlorid) wurden mit P. aeruginosa Fisher Immunotyp 5 (ATCC 27316) aus einer Trypticase-Soja-Agar-Schrägkultur (über Nacht) beimpft. Die Nährkultur wurde über Nacht bei 37ºC unter Beluftung kultiviert und die Bakterien geerntet und wie von Yoshimura et al. (J. Biol. Chem. 258 (1983) 2308) beschrieben gewaschen. Die Bakterien wurden durch Beschallung (Braun-Sonic 1510) zerstört und die äußeren Membranen durch Zentrifugieren bei 100 000 x g isoliert. Protein F wurde aus den äußeren Membran durch wiederholte Extraktionen in Lithiumdodecylsulfat isoliert, durch Erhitzen vom Peptidoglycan freigesetzt, und dann von den Proteinen der äußeren Membran durch Gelfiltration an einer Sephacrylr 200-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) wie von F. Yoshimura et al., supra, beschrieben, abgetrennt. Die Elution der Proteine wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm überwacht, und aliquote Teile der Hauptpeak-Fraktionen wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) gemäß dem Verfahren von Lugtenberg et al. (FEBS Lett., 58 (1978) 254) in der Modifikation von Hancock et al. (J. Bacteriol. 140 (1979) 902) überprüft. Aliquote Teile wurden in SDS-Puffer, 0,125 M Tris-HCl, pH = 6,8, 2 % (Gew/Vol) SDS, 10 % (v/v) Glycerin und 0,005 % (Gew/Vol) Bromphenolblau solubilisiert und dann 10 Minuten bei 85-95ºC erhitzt. Die Elektrophorese wurde 16 Stunden lang bei einer konstanten Spannung von 55 bis 60 V durchgeführt. Molekulargewichtsstandards (Phosphorylase B, Molekulargewicht [MW] 92500; Rinderserumalbumin, MW 66200; Ovalbumin, MW 45000; Sojabohnentrypsininhibitor, MW 21500; Lysozym, MW 14400) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) waren im gleichen Polyacrylamidgel enthalten. Das Molekulargewicht des aus diesem Hauptpeak isolierten Protein betrug 35000 Dalton, was dem Molekulargewicht von Protein F (Hancock et al. und Yoshimura et al., supra) entspricht. Die Reinheit des Proteins war größer als 95 %, beurteilt durch Anfärbung des Gels mit Coomassie-Blau.
Herstellung eines Maus-monoklonalen Antikörpers, der Protein F bindet
• 3 Monate alte BALB/c-Mäuse wurden während eines Zeitraums von 6 Monaten mit einer Vielzahl von Antigenpräparationen extensiv immunisiert. Den Mäusen wurden anfänglich dreimal P. aeruginosa Fisher Immunotyp 7 (ATCC 27318) Bakterien, die durch Autoklavisierung während 30 Minuten durch Hitze abgetötet wurden, injiziert, gefolgt von 3 Injektionen mit P. aeruginosa Fisher Immunotyp 7 Lipopolysaccharid (LPS) (20-50 ug pro Maus), gereinigt durch das Verfahren von Westphal et al., Methods in Carbohydrate Chemistry 5 (1985) 83, Academic Press, New York. Die Mäuse wurden dann zweimal mit lebensfähigem P. aeruginosa Fisher Immunotyp 6 (ATCC 27317)-Bakterien immunisiert, zuerst mit 1 x 10&sup7; Organismen und dann mit 3,4 x 10&sup7; Organismen. Die Mäuse erhielten dann in Abständen von je einer Woche 4 Injektionen von gemäß dem Verfahren von Hancock et al. (J. Bacteriol. 136 (1978) 381) aus P. aeruginosa Fisher Immunotyp-6 Organismen gereinigten äußeren Membranen in Kombination mit gereinigtem P. aeruginosa Protein F. Die Dosis der verabreichten äußeren Membranen betrug 80 bis 100 ug Protein pro Injektion, und die Anfangsdosis an Protein F betrug 5 ug und wurde während des Verlaufs der 4 Injektionen erhöht, so daß die Enddosierung 20 ug betrug.
• 3 Tage nach der letzten Injektion wurde die Milz einer Maus aseptisch entfernt und eine Einzelzellsuspension durch leichte Rotation des Organs zwischen den Enden zweier steriler Glasobjektträger hergestellt. Die mononuklearen Milzzellen wurden in einem Verhältnis von 3:1 mit Log-Phasen- Mäusemyelomzellen (NSI-1, erhalten von Dr. C. Milstein, Molecular Research Council, Cambridge, England) kombiniert und fusioniert, um gemäß dem von Tam et al. (Infect. Immun 36 (1982) 1042) beschriebenen Verfahren Hybridomas auszubilden. Die Hybrid-Zellsuspension wurde auf eine Konzentration von 1,5 x 10&sup6; Zellen pro ml in RPMI-Hybrid-HAT (RPMI 1640 [Gibco, Grand Island, NY], enthaltend 15 % Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 100 ug/ml Streptomycin und 100 IE/ml Penicilin, 1,0 x 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4,0 x 10&supmin;&sup7; M Aminopterin, und 1,6 x 10&supmin;&sup5; M Thymidin), das 2,0 x 10&sup6; frisch hergestellte BALB/c-Thymocyten pro ml als Feeder-Zellen enthielt, verdünnt. Die Mischung wurde auf Costar-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (200 ul pro Vertiefung) aufgebracht. Die Kulturen wurden durch Entfernung und Ersatz von 50 % des Volumens jeder Vertiefung mit frischem RPMI-Hybrid-HAT-Medium alle 2 bis 3 Tage gespeist. Die Kulturüberstände wurden auf die Gegenwart von Anti-P. aeruginosa-Protein F-Antikörper durch Enzym-Linked Immunosorbant-Assay (ELISA) untersucht, als das Zellwachstum in den Vertiefungen am 7. Tag nach der Fusion ca. 40 % Konfluenz erreichte. In den Kulturüberständen vorhandene Anti-Protein F-Antikörper wurden durch ELISA an Antigen-beschichteten Platten bstimmt. Gereinigtes Protein F, 1,5 ug pro ml in 0,05 M Bicarbonatpuffer, pH = 9,6, wurde zu Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen (Linbro) (50 ul pro Vertiefung) zugegeben und 1 Stunde bei 37ºC in einer Feuchtkammer inkubiert. Ungebundenes Antigen wurde entfernt, indem zuerst der Puffer aus den Vertiefungen entfernt wurde und die Vertiefungen dann dreimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), ph = 7,2 (100 ul pro Vertiefung) gewaschen wurden. Um nichtspezifischen Reaktionen vorzubeugen, wurden potentiell reaktive Stellen durch Zugabe von 5 % (Gew/Vol) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (5 % BSA-PBS) (75 ul pro Vertiefung) zu den Titerplatten und Inkubieren während 45 Minuten bei 37ºC blockiert. Nach Entfernen des unabsorbierten BSA wurden die Kulturüberstände (50 ul) aus jeder Vertiefung der Fusionsplatten in die entsprechenden Vertiefungen der Antigenplatten Replika-plattiert und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Der ungebundene Antikörper wurde aus den Vertiefungen entfernt und die Platten dreimal mit 100 ul 1 % (Gew/Vol) BSA-PBS gewaschen. Danach wurden 50 ul pro Vertiefung Meerrettich-Peroxidasekonjugiertes Protein A (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA), in 1 % BSA-PBS entsprechend verdünnt, zu den Platten zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wie vorstehend beschrieben gewaschen und dann das Substrat (100 ul pro Vertiefung) zugegeben. Das Substrat wurde hergestellt durch Lösen einer Tablette aus Chromagen, o-Phenylendiamin-2 HCl (Organon Diagnostic, Orange, NJ) in 22 ml 0,1 M Citratpuffer, pH = 5, und nachfolgendem Mischen der Lösung mit dem gleichen Volumen an 0,03 % (v/v) H&sub2;O&sub2; kurz vor der Verwendung. Die Reaktionen wurden nach 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln mit 3N H&sub2;SO&sub4; (50 ul pro Vertiefung) beendet. Die die Hybridoma-Zellen sekretierenden monoklonalen Antikörper, die an Protein F binden, wurden durch Messung der kolorimetrischen Reaktionen in jeder Vertiefung bei einer Absorption bei 490 nm mit einem automatischen ELISA-Anzeigegerät lokalisiert.
• Die Zellen in einer Vertiefung, bezeichnet als PaPor5 IGl, produzierten einen Antikörper, der an Protein F bindet. PaPor 5 IGl Zellen aus der Master-Vertiefung wurden mit geringer Dichte subkultiviert und dann durch wie von Tam et al., supra, beschriebene Verfahren der begrenzenden Verdünnung kloniert. Der monoklonale Antikörper und die klonale Zellinie aus dieser Vertiefung wurden im folgenden Text beide mit der Bezeichnung PaPor 5 IGl identifiziert. Die Zellen einer anderen Vertiefung, als IGL 2 bezeichnet, produzierten ebenfalls einen Antikörper, der mit Protein F reagierte.
• Ascitesflüssigkeit, die einen hohen Titer an monoklonalem Antikörper enthielt, wurde aus BALB/c Nu/Nu-Mäusen oder (BALB/c [weiblich] x C57Bl/6 [männlich])Fl-Mäusen gemäß den von Tam et al., supra, beschriebenen Verfahren erhalten. 2 bis 3 Monate alten männlichen Mäusen wurden intraperitoneal 0,5 ml Pristan (2,6,10, 14-Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) 10-21 Tage vor der intraperitonealen Injektion mit Log-Phasen PaPor 5 IGl-Zellen injiziert. Jede Maus wurde mit 5,0 x 10&sup6; Zellen in 0,5 ml RPMI injiziert. Nach ca. 2 Wochen wurde die angesammelte Ascitesflüssigkeit aus den Mäusen jeden zweiten bis dritten Tag entfernt. Die Konzentration an Antikörper in der Ascitesflüssigkeit wurde durch Agarosegelelektrophorese (Paragon, Beckman Instruments, Inc. Brea, CA) bestimmt und alle Ascites, die 5 mg/ml oder mehr Antikörper enthielten, wurden in gleiche Mengen unterteilt und bei -70ºC eingefroren.
Bestimmung der Spezifität von PaPor 5 IGl durch Immun-Blot
• Die Umsetzung von PaPor 5 IGl mit P. aeruginosa Protein F wurde durch Immun-Blot (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350) bestätigt. Gereinigtes P. aeruginosa Protein F wurde auf ein 14 % SDS Polyacrylamidgel, wie vorstehend beschrieben, aufgebracht. Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Lysozym, MW 14300; beta-Lactoglobulin, MW 18400; alpha-Chymotrypsinogen, MW 25700; Ovalbumin, MW 43000; Rinderserumalbumin, MW 68000; Phosphorylase B, MW 97400; und Myosin, MW 200000) (BRL, Gaithersburg, MD) waren im gleichen Polyacrylamidgel enthalten. Nach der Elektrophorese wurde Protein F auf eine Nitrozellulosemembran (NCM) (0,45 um, Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH) durch Elektrophorese in 25 mM Natriumphosphat (pH = 7,2), während 1-2 Stunden bei 27 V (Bittner et al., Anal. Biochem., 1 (1980) 459) überführt. Nach Überführung wurde die NCM in 0,5 % (v/v) Tween-20 in PBS (PBS-Tween) (Batteiger et al., J. Immunol. Meth., 55 (1982) 297) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Für diese Stufe und alle nachfolgenden Stufen wurde der Trog, der die NCM enthielt, auf eine Schüttelplatte gestellt, um eine Verteilung der Lösung über die gesamte NCM sicherzustellen. Nach einer Stunde wurde die PBS-Tween-Lösung abgegossen und die NCM in Streifen geschnitten. Ein Streifen wurde mit Kulturüberstand, der PaPor 5 IGl monoklonalen Antikörper enthielt, inkubiert, ein zweiter wurde mit dem Kulturüberstand, der einen irrelevanten Anti-P. aeruginosa Exopolysaccharid-Mausmonoklonalen Antikörper enthielt, inkubiert, und ein dritter mit Kulturmedium. Nach einer Inkubationsdauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die NCM-Streifen 5-mal, und zwar jedes Mal 5 Minuten lang, mit PBS-Tween gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Alkalische Phosphatase-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus IgG (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA) wurde gemäß den Angaben des Herstellers verdünnt und mit den NCM-Streifen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die NCM 5-mal wie vorstehend beschrieben gewaschen wurden, wurde Substrat, das Bromchlorindolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium (Sigma, St. Louis, Mo), hergestellt wie von Leary et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 (1983) 4045) beschrieben, zugegeben und 10-20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Wegwaschen des Substrats mit destilliertem Wasser beendet. Die Ergebnisse des Experiments zeigten, daß PaPor 5 IGl spezifisch an gereinigtes Protein F gebunden war. Keine Färbung der Protein F-Bande wurde an den NCM-Streifen, die entweder mit Anti-Exopolysaccharid-monoklonalem Antikörper oder dem Kulturmedium inkubiert waren, beobachtet. In einem ähnlichen Experiment unter Verwendung des Kulturüberstands aus den mit IGl2 bezeichneten Zellen wurde gefunden, daß der durch diese Zellinie produzierte Antikörper ebenfalls spezifisch mit Protein F reagiert.
Beispiel II
• Beispiel II beschreibt die direkte Konjugation von Maus-monoklonalem Antikörper, PaPor 5 IGl, mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und seine Verwendung zur Identifizierung von P. aeruginosa.
• PaPor 5 IGl Antikörper wurde durch Protein A-Sepharose -Chromatographie (Ey, P.L. et al., Immunochemistry 15 (1978) 429) gereinigt und dann bei 4ºC über Nacht in Konjugationspuffer 0,29 M Carbonat/Bicarbonat, pH = 9,3, 1 M NaCl, dialysiert. Nach der Dialyse wurden 80 ul des Antikörpers (5 mg/ml), mit 2 ul Fluorescein-5-Isothiocyanat (FITC) (Lot 5E, Isomer I, F-143, Molecular Probes Inc., Junction City, OR), solubilisiert in Dimethylsulfoxid bei einer Konzentration von 24 mg/ml kurz vor der Verwendung kombiniert. Nach einer Inkubationsdauer von 30 Minuten bei 37ºC wurde die Mischung über eine PD-10 Sepharose -Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) in 0,01 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH = 9,3, der 0,1 M NaCl, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,01 % Natriumazid enthielt, pre-equilibriert. Der FITC-konjugierte Antikörper wurde in dem Leervolumenanteil gesammelt.
• Die Bakterien für die Untersuchung wurden hergestellt aus Übernacht-Kulturen an einem geeigneten festen Medium. Die Organismen wurden in PBS resuspendiert und die optische Dichte auf einen Mcfarland 2 Standard eingestellt. Die suspendierten Organismen wurden dann auf Carlson-Träger mit 30 Vertiefungen (Carlson, Peoton, IL) (2 ul pro Vertiefung) aufgebracht und bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Die Träger wurden bis zur Verwendung im Assay bei -70ºC mit einem Trocknungsmittel gelagert.
• Am Tage des Assays wurden die hergestellten Bakterienträger zuerst in 95 % Ethanol 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Nach Abdampfen des Ethanols von den Trägern durch Erwärmen bei 37ºC auf einem Objektträgererwärmer wurden sie mit 5,0 % (v/v) Triton X-100 und 9 mM EDTA in PBS (3 ul pro Vertiefung) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur behandelt. Die Objektträger wurden dann mit destilliertem Wasser 1 Minute lang gewaschen und bei 37ºC getrocknet. FITC-konjugiertes PaPor 5 IGl (66 ug/ml) wurde zugegeben (5 ul pro Vertiefung) und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Träger wurden gewaschen und, wie oben angegeben, mit einem Deckplättchen, das mit PBS-Glycerin (1:1, v/v), pH = 9,8, das 2,5 % (Gew/Vol) Triethylendiamin zur Stabilisierung des Fluoresceins enthielt, versehen war, bedeckt, und in einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben. Abschnitt A zeigt die Ergebnisse für 30 verschiedene Isolate von P. aeruginosa, einschließlich der 17 IATS-Typ-Stämme und 6 Repräsentanten von 7 Fisher-Immunotypen. Abschnitt B umfaßt 17 von P. aeruginosa verschiedene Pseudomonas-Spezien. Abschnitt C zeigt die Ergebnisse von 29 anderen Organismen aus einer Vielzahl von von Pseudomonas verschiedenen gram-positiven und gram-negativen Bakterien. Wie es aus der Tabelle I ersichtlich ist, zeigte PaPor 5 IGl starke Immunofluoreszenz mit allen Stämmen von P. aeruginosa. Unter anderen getesteten Pseudomonas-Spezien zeigte keine mit den Antikörper einen bestimmbaren Grad an Immunofluoreszenz. Unter den getesteten Nicht-Pseudomonas-Spezien zeigte nur ein Organismus, der als zur CDC Gruppe I gehörend klassifiziert wurde, eine bestimmbare Reaktivität.
• Da die Intensität der durch die FITC-konjugierten Antikörper gebundenen Organismen ein wichtiges Kriterium für die Brauchbarkeit eines Objekträger-Immunofluoreszenztests ist, wurde der Test unter Bedingungen durchgeführt, die denen für klinische Blutkulturen ähnlich sind. Ein P. aeruginosa-Stamm wurde entweder in Bactec Broth (Johnston Laboratories, Townson, Maryland) oder einer Zweiphasen-Nährlösung (PML Microbiologicals, Tualatin, Oregon), die 5 ml normales Blut enthielt, inokuliert. Nach Inkubation bei 37ºC während 8 Stunden wurde eine sichtbare Trübung beobachtet und ein Teil der Kultur wurde für den direkten Immunofluoreszenztest entnommen. Ein kleiner Tropfen der Blut-Nährlösung wurde in eine Vertiefung eines Trägers gegeben und mit einem Tropfen deionisiertem Wasser vereinigt, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Die Mischung wurde gleichmäßig über die gesamte Vertiefung ausgebreitet und trocknen gelassen. Die Probe wurde dann mit Ethanol fixiert und der Assay wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Fluoreszenz des P. aeruginosa-Stammes betrug 4+, während keine Immunofluoreszenz beobachtet wurde, wenn Escherichia coli, ein übliches Blut-Pathogen, auf die gleiche Weise untersucht wurde.
• Obwohl die Erfindung vorstehend zur besseren Darstellung und zum besseren Verständnis detailliert beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der anliegenden Ansprüche möglich sind. Tabelle I: Ergebnisse des direkten Immunofluoreszenz-Assays für P. aeruginosa unter Verwendung von FITC-konjugiertem PaPor 5 IGl an Bakterienisolaten Organismus Ergebnisse Bereich A Pseudomonas aeruginosa Fisher Pseudomonas maltophilia Pseudomonas testosteroni Pseudomonas mendocina Pseudomonas picketti Pseudomonas putrefaciens Pseudomonas stutzeri Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas vesiculare Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas cepacia Pseudomonas acidovorans Pseudomonas diminuta Pseudomonas paucimobilis Pseudomonas pertycinogena Pseudomonas aureofaciens Acinetobacter calcoaceticus var. anitratum Actinomyces israelli Bacteroides fragilis Bacteroides oralis Bifidobacterium dentium Campylobacter sputorum ssp bubulus Corynebacteruim ulcerans E. Coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Eubacterium limosum Fusobacterium nucleatum Haemophilus influenzae (untypeable) CDC - Group I Haemophilus influenzae type B Lactobacillus catenaforme Leptotrichia buccalis Micrococcus luteus Moraxella lacunata Neisseria meningitidis Neisseria sicca Legionella pneumophila serogroup Peptococcus asaccharlyticus Peptostreptoccocus anaerobius Rothia dentocariosa Cardiobacterium hominis Staphylococcus aureus ("Woods") epidermis Treponema denticola 0
• Die Ergebnisse wurden an einer Skala von 0 bis 4+ nach der Intensität der Immunofluoreszenzfärbung bewertet, wobei 0 negativ bedeutet, 1+ die geringste Intensität und 4+ die größte Intensität bedeutet.

Claims (13)

1. Verfahren zur Detektion des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa in biologischen Proben, wobei man bei diesen Verfahren eine Probe, von der man vermutet, daß sie das Bakterium enthält, mit einem solubilisierenden Reagens und mit einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, mit der Befähigung zur spezifischen Bindung an Protein F der äußeren Membran des Bakteriums, umsetzt, man diese Probe von ungebundenem monoklonalen Antikörper trennt und die Präsenz oder das Fehlen eines Iinmunkomplexes detektiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der monoklonale Antikörper markiert ist.

3 Verfahren nach Anspruch 2, worin die Markierung ausgewählt ist unter Fluorophoren, Enzymen, lumineszierenden Verbindungen, Radioisotopen und Partikeln.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Fluorophor ausgewählt ist unter Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Phycocyanin.

5. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Markierung Fluorescein-Isothiocyanat ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das solubilisierende Reagens ein Detergens, ein chelatbildendes Nittel oder ein Gemisch davon ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei man außerdem die Probe auf einer festen Oberfläche immobilisiert, bevor man die Probe mit dem solubilisierenden Reagens in Kontakt bringt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin das solubilisierende Reagens ein Gemisch aus Octylphenoxypolyethoxyethanol und Ethylendiamintetraessigsäure ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der verwendete monoklonale Antikörper von der Hybridzellinie PaPor5 IGl (ATCC# HB 9277) produziert wird.

10. Monoklonaler Antikörper, produziert von der Hybridzellinie PaPor5 IGl (ATCC# HB 9277) zur Verwendung bei einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.

11. Kit zur Verwendung bei der Detektion der Präsenz von Pseudomonas aeruginosa, wobei der Kit Kompartimente umfaßt, enthaltend eine Zusammensetzung eines monoklonalen Antikörpers, wobei der Antikörper mit Protein F von P. aeruginosa reagiert, ein solubilisierendes Reagens und Markierungen, die ein detektierbares Signal hervorrufen, kovalent gebunden an den Antikörper oder gebunden an zweite Antikörper, welche mit dem monoklonalen Antikörper reagieren.

12. Kit nach Anspruch 11, worin der monoklonale Antikörper von der Hybridzellinie PaPor5 IGl (ATCC# HB 9277) produziert wird.

13. Kit nach Anspruch 11, worin das solubilisierende Reagens Octylphenoxypolyethoxyethanol und Ethylendiamintetraessigsäure umfaßt.