DE3852558T2

DE3852558T2 - Integriertes mehrschichtiges analytisches Element.

Info

Publication number: DE3852558T2
Application number: DE3852558T
Authority: DE
Inventors: Takaki Arai; Nakatsugu Yaginuma
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-04-16
Filing date: 1988-04-15
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2008-04-16
Also published as: JPS63259467A; JPH0664056B2; DE3852558D1; EP0287112A2; EP0287112A3; US5008078A; EP0287112B1

Description

Die Erfindung betrifft integrale mehrschichtige Analyseelemente für die Analyse von Substanzen, die in einer flüssigen Probe als Analyt Ammoniak bilden können. Die Erfindung betrifft insbesondere integrale Analyseelemente des mehrschichtigen Typs, welche für die quantitative Analyse von Ammoniakerzeugenden Substanzen, wie Creatinin und Harnstoff usw., welche in biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Urin, Lymphe usw., vorhanden sind, ohne daß sie durch endogenes Ammoniak beeinflußt werden, geeignet sind.
Die quantitative Analyse von Ammoniak-erzeugenden Substanzen, wie Creatinin und Harnstoff usw., welche in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind, ist von äußerster Bedeutung bei der Diagnose von Krankheiten, wie Nierenkrankheit, bei Untersuchungen, die zur Kontrolle des Verlaufs solcher Krankheiten durchgeführt werden, und bei Untersuchungen der Nierenfunktion.
Analyseverfahren nach einem Verfahren, bei dem Ammoniak aus einer Ammoniak-erzeugenden Substanz gebildet wird, und einem Verfahren, bei dem das so gebildete Ammoniak bestimmt wird, sind typisch für die Verfahren, die zur Analyse von Ammoniakerzeugenden Substanzen verwendet werden. Solche Analyseverfahren, umfassend die Umwandlung in Ammoniak, wurden in der Vergangenheit in großem Umfang verwendet. Sie umfassen Naßverfahren oder Lösungsverfahren. Weiterhin wurden in den vergangenen Jahren trockene Analyseverfahren vorgeschlagen und in der Praxis verwendet. Diese beruhen auf der Umwandlung von Ammoniak, wobei für trockene analytische Vorrichtungen typischerweise integrale mehrschichtige analytische Elemente verwendet werden.
Die oben erwähnten Verfahren für die Erzeugung von Ammoniak aus Ammoniak-erzeugenden Substanzen umfassen im allgemeinen Verfahren, bei denen das Ammoniak durch die Einwirkung eines Enzyms gebildet wird. Beispielsweise können Verfahren, bei denen Creatinin in einer Flüssigkeitsprobe spezifisch zu Ammoniak und N-Methylhydantoin mittels Creatinin-Deiminase (EC3.5.4.21) hydrolysiert wird, für die quantitative Analyse von Creatinin in einer biologischen Flüssigkeit verwendet werden. Weiterhin können Verfahren, bei denen Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid unter Verwendung von Urease als Katalysator hydrolysiert wird, für die quantitative Analyse von Harnstoff-Stickstoff in biologischen Flüssigkeiten (im folgenden als BUN bezeichnet) verwendet werden. Bei diesen Verfahren ist die Ammoniak-erzeugende Substanz, die der Analyt ist, das Substrat eines Enzyms, und so sind diese als Ammoniak-erzeugende Substrate bekannt. Verfahren für die Analyse dieser Ammoniak-erzeugenden Substanzen wurden in Analytical Chemistry, 46, 246 (1974), Clinica Chimica Acta, 18, 409 (1967), Clinical Chemical Analysis III, Nitrogen Containing Components (japanisch), S. 13-14 und S. 67-87 (Tokyo Kagaku Dojin, Tokyo, 1979) und Journal of Medical Technology [japanisch, Bd. 5 (Nr. 6)], S. 387-391 (1961), usw. beschrieben.
Jedoch enthalten diese biologischen Flüssigkeiten, die diese Analyten sind, oft Ammoniak (endogenes Ammoniak) in einem Zustand, in dem es als Ammoniumionen freigesetzt wurde, und es war nicht möglich, die Fehler, die durch die Anwesenheit dieses endogenen Ammoniaks entstanden sind, außer acht zu lassen. Es ist daher erforderlich, die Wirkung des endogenen Ammoniaks zu eliminieren, um die Menge an Ammoniak-erzeugenden Substraten genau zu bestimmen, und einige Verfahren für die Eliminierung des endogenen Ammoniaks wurden bereits vorgeschlagen.
Tatsächliche Beispiele für Verfahren zur Analyse von Ammoniak-erzeugenden Substanzen, die ein Verfahren für die Voreliminierung von endogenem Ammoniak bei einem Naßverfahren umfassen, schließen die quantitativen Verfahren, die in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 5,198/83 entsprechend der GB-A-2 102 568, 21,398/84, 31,696/84, 31,697/84, 31,698/84, 31,700/84 und 56,095/86 entsprechend der EP-A- 0 173 276 usw. beschrieben werden, ein (der Ausdruck "OPI", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine "publizierte nichtgeprüfte japanische Patentanmeldung").
Integrale mehrschichtige Analyseelemente für die Analyse von Ammoniak-erzeugenden Substanzen, bei denen die Wirkung des endogenen Ammoniaks durch eine Auffangfunktion für endogenes Ammoniak innerhalb des Analyseelements selbst, wie in den integralen mehrschichtigen Elementen, die in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 278,761/86 entsprechend der EP-A- 0 204 334 beschrieben werden, eliminiert (oder verringert) ist, wurden ebenfalls als Trocken-Analyseverfahren beschrieben. Diese mehrschichtigen Analyseelemente besitzen eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak, in der eine Ammoniak- Auffangreaktion stattfindet, wobei die Schicht benachbart und über der Schicht angebracht ist, in der Ammoniak durch die Ammoniak-Erzeugungsreaktion gebildet wird.
Weiterhin sind Reagenszusammensetzungen, die ein Enzym enthalten, welches Ammoniak als Substrat in eine andere Substanz überführt, in der Auffangschicht für endogenes Ammoniak enthalten. Tatsächliche Beispiele solcher Zusammensetzungen umfassen solche, welche NADH (die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid) und/oder NADPH (die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat), Glutaminsäure- Dehydrogenase (EC1.4.1.3) und α-Ketoglutarsäure (oder ein Salz davon) enthalten.
Es ist offensichtlich, daß in integralen mehrschichtigen Analyseelementen für die Analyse von Ammoniak-erzeugenden Substanzen, welche eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak aufweisen, die Meßempfindlichkeit niedriger ist, da die Auffangschicht für endogenes Ammoniak benachbart zu der Reaktionsschicht angeordnet ist, in der die Ammoniak-erzeugende Reaktion stattfindet, als bei einem Element, bei dem keine Auffangschicht für endogenes Ammoniak verwendet wird, da das Ammoniak, welches bei der Ammoniak-Erzeugungsreaktion gebildet wird, nach oben diffundiert und an einer Nebenreaktion in der Auffangschicht für endogenes Ammoniak teilnimmt.
In der EP-A-0 204 334 wird ein mehrschichtiges analytisches Element beschrieben, das einen Träger, eine Barriereschicht für eine Flüssigkeit, eine Ammoniak-erzeugende Substrat-Reaktionsschicht, eine Auffangschicht für vorhandenes Ammoniak und eine poröse Ausspreitungsschicht umfaßt. In dieser Literaturstelle finden sich keine Hinweise bezüglich einer Schicht, welche die Ammoniak-Diffusion verhindert. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das mehrschichtige analytische Element zusätzlich eine Schicht, die Alkalien oder alkalische Puffer enthält, die unfähig ist, Ammoniak aufzufangen und die unfähig ist, Ammoniak zu erzeugen und die in der Lage ist, die Diffusion von gasförmigem Ammoniak zu verhindern. Die Einarbeitung von Alkalien oder alkalischen Puffern zur Sicherstellung einer wirksamen Diffusionsverhinderungs-Aktivität kann daher nicht aus einer ähnlichen Struktur einer Lichtabschirmungsschicht dieser Druckschrift entnommen werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein integrales mehrschichtiges Analyseelement für die quantitative Analyse von Ammoniak-erzeugenden Substanzen zur Verfügung zu stellen, wobei Meßfehler, die durch Ammoniak, welches in der wäßrigen fluiden Probe vorhanden ist (endogenes Ammoniak), hervorgerufen wird, beseitigt werden, und mit dem die Analyse mit hohem Empfindlichkeitsgrad durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß soll ein integrales mehrschichtiges Analyseelement bereitgestellt werden, mit dem Ammoniak-erzeugende Substanzen, wie Creatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff (im folgendes als "BUN" bezeichnet, von dem angelsächsischen Ausdruck "blood urea nitrogen), quantitativ mit einem hohen Genauigkeitsgrad und schnell unter Verwendung eines einfachen Verfahrens analysiert werden können.
Es wurde jetzt gefunden, daß diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst werden kann, indem ein mehrschichtiges Analyseelement zur Verfügung gestellt wird, welches eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak, eine Ammoniak-erzeugende Schicht, welche ein Reagens, das mit einer Ammoniak-erzeugenden Substanz unter Bildung von gasförmigem Ammoniak reagieren kann, umfaßt, und mindestens eine Schicht, welche Alkalien oder alkalische Puffer enthält, die unfähig ist, Ammoniak aufzufangen, die unfähig ist, Ammoniak zu bilden, die fähig ist, die Diffusion von gasförmigem Ammoniak zu verhindern, und welche zwischen der Auffangschicht für endogenes Ammoniak und der Ammoniak-erzeugenden Schicht angeordnet ist und die einen pH-Wert zwischen 7,0 und 11,0 besitzt, umfaßt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen umfassen die folgenden Strukturen:
[1] Mehrschichtige Analyseelemente für die quantitative Analyse von Ammoniak-erzeugenden Substanzen, in denen aufeinanderfolgend laminiert sind:
(1) ein optisch transparenter und wasserimpermeabler Träger;
(2) eine Ammoniak-Indikatorschicht, welche einen Indikator enthält, in dem eine nachweisbare Änderung durch gasförmiges Ammoniak gebildet wird;
(3) eine Barriereschicht für die Permeation einer Flüssigkeit, durch die gasförmiges Ammoniak hindurchgehen kann;
(4) eine Reagensschicht für die Ammoniak-Erzeugungsreaktion, die eine Reagenszusammensetzung enthält, welche mit Ammoniak-erzeugenden Substanzen reagiert und gasförmiges Ammoniak bildet;
(5) eine Schicht, welche im wesentlichen keine Funktion für die Ammoniak-Auffang- oder Ammoniak-Erzeugungsreaktion besitzt, die jedoch die Funktion aufweist, daß sie im wesentlichen die Diffusion von gasförmigem Ammoniak verhindert;
(6) eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak, die eine Reagenszusammensetzung enthält, welche auf Ammoniak, welches in der wäßrigen fluiden Probe vorhanden ist, einwirkt und dieses Ammoniak in eine Form überführt, in der es im wesentlichen unfähig ist, die Reaktions-Reagensschicht zu erreichen; und
(7) eine poröse Ausspreitungsschicht.
[2] Mehrschichtige Analyseelemente für die quantitative Analyse von Ammoniak-erzeugenden Substanzen, in denen aufeinanderfolgend laminiert sind:
(1) ein optisch transparenter und wasserimpermeabler Träger;
(2) eine Ammoniak-Indikatorschicht, welche einen Indikator enthält, in dem eine nachweisbare Änderung durch gasförmiges Ammoniak gebildet wird;
(3) eine Barriereschicht für die Permeation einer Flüssigkeit, durch die gasförmiqes Ammoniak hindurchgehen kann;
(4) eine Reagensschicht für die Ammoniak-Erzeugungsreaktion, die eine Reagenszusammensetzung enthält, welche mit Ammoniak-erzeugenden Substanzen reagiert und gasförmiges Ammoniak bildet;
(5) eine Schicht, welche im wesentlichen keine Funktion für die Ammoniak-Auffang- oder Ammoniak-Erzeugungsreaktion besitzt, die jedoch die Funktion aufweist, daß sie im wesentlichen die Diffusion von gasförmigem Ammoniak verhindert; und
(6) eine poröse Ausspreitungsschicht, in die eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak eingearbeitet ist, die aus einer porösen Schicht besteht, welche eine Reagenszusammensetzung enthält, die auf das Ammoniak, welches in der wäßrigen fluiden Probe vorhanden ist, einwirkt und das zuvor erwähnte Ammoniak in eine Form umwandelt, in der es im wesentlichen unfähig ist, die oben erwähnte Reaktions-Reagensschicht zu erreichen.
Andere gut bekannte Schichten, wie Zwischenschichten, klebrige Zwischenschichten, Verbindungsschichten und Lichtabschirmungsschichten, können ebenfalls in den Elementen vorhanden sein, vorausgesetzt, daß sie keine nachteilige Wirkung auf die Funktion des erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Analyseelements ausüben, wie in der EP-A-0 204 334 beschrieben.
Der Ausdruck "Ammoniak-erzeugende Substanz", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Verbindung oder eine Gruppe von Verbindungen, die mit einem spezifischen Reagens reagiert und entweder Ammoniak selbst oder Ammoniak auf dem Weg einer Reihe von Reaktionssystemen bildet. Die Schicht, welche die Funktion besitzt, daß sie im wesentlichen die Diffusion von Ammoniak verhindert, ohne daß sie eine Funktion für die Ammoniak-Auffang- oder Ammoniak-Erzeugungsreaktion besitzt, wird im folgenden als "Schicht, welche die Ammoniak-Diffusion verhindert" bzw. "Ammoniakdiffusions-Verhinderungsschicht" bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Analyseelemente ermöglichen, daß irgendwelches endogenes Ammoniak in einer oberen Schicht aufgefangen und entfernt wird, während die Ammoniak-erzeugende Substanz, wie Creatinin oder BUN usw., danach in der Reaktionsschicht reagiert und das Ammoniak, welches gebildet wird, irgendeine nachweisbare Änderung, wie eine Verfärbung, in einer Indikatorschicht erzeugt, wodurch es nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden kann. Die Diffusion des Ammoniaks, welches in der Reaktionsschicht gebildet wird, nach außen wird durch die Anwesenheit der Schicht, welche die Ammoniak-Diffusion verhindert, vermieden, welche zwischen der Auffangschicht für das endogene Ammoniak und der Ammoniak-erzeugenden Reaktions- Reagensschicht angebracht ist, und somit ist die quantitative Natur der Analyse der Ammoniak-erzeugenen Substanz verbessert.
Wenn die erfindungsgeinäßen integralen mehrschichtigen Analyseelemente verwendet werden, ist es nicht erforderlich, komplizierte Verfahren durchzuführen, wie die Bestimmung des endogenen Ammoniaks oder die Beseitigung des endogenen Ammoniaks in einer Vorbehandlung oder Dialyse der Flüssigkeitsprobe, so daß die Bestimmung von Creatinin und Harnstoff usw. leicht und schnell durchgeführt werden kann. Weiterhin sind die Manipulation und Handhabung einfach, da die erfindungsgemäßen Analyseelemente ein integrales Element sind.
Die erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Analyseelemente besitzen eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Ammoniakerzeugenden Substanzen, und eine genaue Analyse kann erreicht werden, selbst mit fluiden Proben, die Spurenmengen an Ammoniak-erzeugenden Substanzen enthalten.
Die erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Analyseelemente sind so, daß die Ammoniak-erzeugende Substanz indirekt bestimmt wird, indem sie (der Analyt) mit einem Reagens umgesetzt wird, welches damit reagiert und Ammoniak bildet, und wobei dann das gebildete Ammoniak bestimmt wird. Durch Änderung des Typs des zuvor erwähnten Reaktionsreagenses für die Erzeugung von Ammoniak ist es möglich, erfindungsgemäße integrale mehrschichtige analytische Elemente für die quantitative Analyse einer Vielzahl von Ammoniak-erzeugenden Substanzen herzustellen.
Spezifische Beispiele für optisch transparente und Flüssigkeits-impermeable Träger (die im folgenden als Träger bezeichnet werden), auf denen die erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Analyseelemente aufgebaut werden können, umfassen transparente Träger, die aus transparenten Polymeren, wie aus Polyethylenterephthalat, Bisphenol-A-polycarbonat, Polystyrol oder Celluloseestern (beispielsweise Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetatpropionat usw.), hergestellt werden, mit einer Dicke von 50 um bis 1 mm und bevorzugt 80 bis 300 um.
Eine Zwischenschicht bzw. darunterliegende Schicht kann auf die Oberfläche des Trägers je nach Bedarf aufgetragen werden, um die Reaktionsschicht oder andere Schichten (beispielsweise eine Wasserabsorptionsschicht) fester an den Träger zu binden. Weiterhin kann die Adhäsionsfestigkeit verbessert werden, indem die Oberfläche des Trägers einer physikalischen oder chemischen Behandlung unterworfen wird, anstatt eine Zwischenschicht vorzusehen.
Die Ammoniak-Indikatorschicht (die im folgenden als "Indikatorschicht" bezeichnet wird) enthält einen Indikator, in dem eine nachweisbare Änderung durch gasförmiges Ammoniak gebildet wird. Sie wird auf den Träger aufgetragen, entweder direkt oder auf eine andere Schicht, wie eine Zwischenschicht usw., abhängig von dem besonderen Fall. Die Indikatorschicht enthält mindestens einen Typ eines farbbildenden Ammoniak-Indikators. Ein farbbildender Ammoniak-Indikator ist eine Verbindung, in der eine nachweisbare Änderung (beispielsweise eine Verfärbung oder eine Farbänderung durch eine Änderung in der Absorptions-Wellenlänge) durch gasförmiges Ammoniak induziert wird.
Leuko-Farbstoffe, wie Leukocyanin-Farbstoffe, Nitro-substituierte Leuko-Farbstoffe und Leukophthalein-Farbstoffe (wie sie in dem US-Reissue-Patent Nr. 30 267 und der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 19,062/83 beschrieben werden); pH-Indikatoren, wie Bromphenolblau, Bromkresolgrün, Bromthymolblau, Chinolinblau und Rosolsäure usw. [wie in "Chemical Dictionary" (japanisch) Bd. 10, S. 63-65 (veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan Co.) beschrieben]; Farbstoff-Vorstufen auf der Grundlage von Triarylmethan; Leukobenzyliden-Farbstoffe (beschrieben in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 379/80 und 145,273/81); Diazoniumsalze und Azo-Farbstoffkuppler; und Farbstoffe, die mit Basen bleichbar sind, usw., können als farbbildender Ammoniak-Indikator in dem erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Analyseelement verwendet werden.
Die Indikatorschicht wird normalerweise hergestellt, indem eine Beschichtungsflüssigkeit gebildet wird, indem mindestens einer dieser farbbildenden Ammoniak-Indikatoren mit einem Polymer-Bindemittel, welches in organischen Lösungsmitteln oder Wasser löslich ist, vermischt wird, und wobei dann diese Flüssigkeit auf den transparenten Träger aufgetragen und getrocknet wird. Spezifische Beispiele für geeignete Polymer- Bindemittel umfassen beispielsweise Celluloseester, wie Cellulosemonoacetat, Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetatbutyrat, Celluloseacetatpropionat usw., Alkylcellulosen, wie Methylcellulose, Ethylcellulose, Propylcellulose usw., und synthetische Vinylpolymere, wie Polymethylmethacrylat, Polyacrylat, Polystyrol, Polyacrylnitril, Polyvinylacetat, Polyvinylbutyral, chloriertes Polyvinylacetat, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, oder Copolymere dieser Materialien.
Die Menge an farbbildendem Ammoniak-Indikator, die eingearbeitet wird, liegt bevorzugt innerhalb des Bereiches von 1 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Bindemittels. Weiterhin kann der pH-Wert der Indikatorschicht durch Zugabe zu der Indikatorschicht einer organischen Säure oder einer anorganischen Säure, wie Ethansulfonsäure, Asparaginsäure, Azelainsäure, Glutarsäure, Bernsteinsäure, Glutaconsäure, Weinsäure, Pimelinsäure, Malonsäure, Äpfelsäure, 3,3-Dimethylglutarsäure, Zitronensäure, p-Toluolsulfonsäure, Perchlorsäure, Chlorwasserstoffsäure usw., einer organischen Base oder einer anorganischen Base, wie Aminomethan, Aminoethan, Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid usw., oder von pH-Puffern so eingestellt werden, daß er innerhalb des Bereiches des farbbildenden pH-Werts des farbbildenden Ammoniak-Indikators liegt, um irgendeine Verfärbung oder Änderung der Farbe des farbbildenden Ammoniak- Indikators während der Herstellung oder Lagerung zu vermeiden.
Die Beschichtungsflüssigkeit, mit der die Indikatorschicht gebildet wird, kann hergestellt werden, indem der farbbildende Ammoniak-Indikator, das Polymer-Bindemittel und die Reagentien, wie die oben erwähnten Säuren für die pH-Einstellung, die je nach Bedarf zugegeben werden, zu einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, 2-Methoxyethanol, Methylethylketon, Dichlormethan, Dichlorethan, Methanol, Ethanol usw., oder Wasser zugegeben werden, um eine Feststoff-Fraktionskonzentration von 1 bis 30 Gew.-% und bevorzugt von 3 bis 20 Gew.-% zu ergeben. Die Flüssigkeit für die Beschichtung kann zu einer Indikatorschicht gebildet werden, indem sie auf einen Träger aufgetragen und getrocknet wird, normalerweise auf eine solche Weise, daß die Schichtdicke nach dem Trocknen innerhalb des Bereiches von 1 bis 30 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 2 bis 20 um liegt.
Eine Barriereschicht für die Permeation einer Flüssigkeit (im folgenden als Barriereschicht bezeichnet), durch die gasförmiges Ammoniak hindurchgehen kann, wird auf der Indikatorschicht aufgebracht. Diese Barriereschicht ist eine Schicht, die aus einer Substanz besteht, durch die gasförmiges Ammoniak hindurchgehen kann, durch die aber Flüssigkeiten, wie die Beschichtungsflüssigkeiten und Probenflüssigkeiten usw., oder störende Komponenten (beispielsweise alkalische Komponenten), die in diesen Flüssigkeiten enthalten sind, im wesentlichen nicht hindurchgehen oder diese durchdringen können, entweder während der Herstellung des mehrschichtigen Analyseelements (in der Praxis während des Beschichtens der Barriereschicht mit der Reaktionsschicht, wie im folgenden beschrieben) oder während des analytischen Verfahrens.
Die Barriereschichten können grob in zwei Arten vom strukturellen Gesichtspunkt aus klassifiziert werden. Die erste Art gehört dem Luft-Barriereschicht-Typ an (im folgenden als "Luft-Barriereschicht" bezeichnet). Sie besteht aus einem porösen Material, welches verbundene Poren enthält, wobei eine Schicht aus Luft im wesentlichen als Barriereschicht wirkt, und der zweite Typ gehört dem Polymer-Barriereschicht-Typ an (im folgenden als "Polymer-Barriereschicht" bezeichnet). Diese besteht aus einer dünnen homogenen nichtporösen Schicht aus einem hydrophoben Polymeren (oder einem Polymeren, welches einen geringen Grad an Hydrophilizität aufweist).
Beispiele für poröse Materialien, welche verbundene Poren enthalten und die eine Luft-Barriereschicht bilden können, umfassen Membranfilter, poröse Materialien, wie fibröse Materialien, die miteinander verschlungen, durchstochen bzw. verklebt oder miteinander verbunden wurden (beispielsweise Papier, Filterpapier, Filz, nichtgewebtes Tuch bzw. nichtgewebte Textilmaterialien usw.), und poröse Materialien, welche aus einem gewebten Material-Grundstoff, einem gestrickten Material-Grundstoff bzw. einem gewirkten Material-Grundstoff oder einem feinen netzartigen Material bestehen.
Spezifische Beispiele für Membranfilter, welche als Luft-Barriereschichten verwendet werden können, umfassen solche, die aus Celluloseacetat (Cellulosediacetat oder Cellulosetriacetat usw.), Cellulosenitrat, regenerierter Cellulose, Polyamiden (Nylon), Bisphenol-A-Polycarbonaten, Polyethylen, Polypropylen und Fluor-enthaltenden Polymeren, wie Polytetrafluorethylen usw., hergestellt worden sind. Werden diese Materialien in einem erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Element verwendet, liegt die Dicke der oben erwähnten Membranfilter innerhalb des Bereiches von 30 bis 300 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 70 bis 200 um.
Die Porosität (Porenfraktion) der Membranfilter beträgt 25 bis 90% und bevorzugt 60 bis 90%. Die durchschnittliche Porengröße der Membranfilter liegt innerhalb des Bereiches von 0,01 bis 20 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 10 um. Membranfilter, die die oben erwähnten Eigenschaften besitzen, können beispielsweise unter Verwendung der Verfahren, die entweder in der US-Patentschrift Nr. 1 421 341 oder in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 21,677/78 beschrieben werden, hergestellt werden. Eine Vielzahl geeigneter Membranfilter ist bereits im Handel von einer Reihe von Herstellern erhältlich, und ein Membranfilter kann je nach Bedarf unter diesen Produkten für die Verwendung ausgewählt werden.
Poröse Materialien, welche aus fibrösen Materialien bestehen, die miteinander verschlungen, verklebt oder miteinander verbunden wurden, die bei der vorliegenden Erfindung als Luft- Barriereschichten verwendet werden können, sind poröse Materialien, welche verbundene Poren besitzen, mit einer Struktur, bei der die porösen Materialien, wie jene, die in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 77,660/83 beschrieben werden, oder die Aggregate davon physikalisch verschlungen oder physikalisch und/oder chemisch verklebt bzw. durchstochen oder miteinander verbunden sind.
Spezifische Beispiele für fibröse Materialien, aus denen die oben erwähnten porösen Materialien bestehen können, umfassen natürliche fibröse Materialien, wie Cellulosefasern, Baumwollfasern, Hanffasern, Seidefasern, Wollfasern usw., Fasern, welche aus regenerierten oder halbsynthetischen Materialien bestehen, wie Rayonfasern, Vinylonfasern, Celluloseacetatfasern usw., und fibröse Materialien, welche aus synthetischen Materialien bestehen, wie Glaswolle, Polyethylenfasern, Polyethylenterephthalatfasern, Polyacrylnitril-Fasermaterialien und Polyvinylchloridfasern usw., oder fibröse Materialien, welche aus Gemischen solcher Fasern bestehen. Beispiele für poröse Materialien, die unter Verwendung der oben erwähnten faserförmigen Materialien hergestellt worden sind, umfassen Reispapier, Japanische Papiere, wie "Minogami" und "Shojigami", Papiere, wie Filterpapier, Pergamentpapier, Imitations-Pergamentpapier usw., welche hergestellt werden, indem die fibrösen Materialien einem Papierherstellungsverfahren unterworfen werden, und Filze und nichtgewebte bzw. nichtgewirkte Stoffe bzw. Textilmaterialien, die aus fibrösen Materialien hergestellt worden sind.
Die Porenfraktion der porösen Materialien, die durch Verschlingen, Durchstechen bzw. Verkleben oder Verbinden der fibrösen Materialien hergestellt worden sind, liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 20 bis 90% und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 50 bis 85%. Die durchschnittliche Porengröße der oben erwähnten porösen Materialien liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 0,01 bis 20 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 10 um. Die Dicke der oben erwähnten Materialien liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 50 bis 500 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 70 bis 300 um.
Beispiele für gewebte bzw. gewirkte Materialien, die als Luft-Barriereschichten verwendet werden können, umfassen gewebte bzw. gewirkte Materialien, die aus Naturfasern hergestellt worden sind (beispielsweise Baumwoll-Hemdenstoff oder -Kleiderstoff usw.), gewebte bzw. gewirkte Materialien, die aus halbsynthetischen Fasern hergestellt worden sind (beispielsweise Hemden- bzw. Kleiderstoffe, die aus regenerierten Cellulosefasern hergestellt worden sind, wie Viskose-Rayon, Cuprammonium-Rayon, Fortisan usw.), gewebte bzw. gewirkte Materialien, die aus synthetischen Fasern hergestellt worden sind [beispielsweise Hemden- bzw. Kleiderstoffe, hergestellt aus Fasern, wie Polyamiden (Nylon)], und gemischte gewebte bzw. gewirkte Materialien, welche aus Naturfasern und halbsynthetischen Fasern oder synthetischen Fasern bestehen (beispielsweise Hemden- bzw. Kleiderstoffe, die aus gemischten gesponnenen Garnen aus Baumwolle und Polyethylenterephthalat- Fasern usw. hergestellt worden sind). Beispiele für gestrickte bzw. gewirkte Materialien, die als Barriereschichten verwendet werden können, umfassen gestrickte bzw. gewirkte Materialien, die aus den gleichen Fasern bestehen, oder Garne, die aus den gleichen Fasern bestehen, und solche, die zur Herstellung der zuvor erwähnten gewebten bzw. gewirkten Materialien verwendet werden können. Beispiele für feine netzartige Materialien, die als Luft-Barriereschichten verwendet werden können, umfassen feine Netze und feine Netzstoffe, hergestellt aus synthetischen Fasern und Garnen (beispielsweise Polyamide (Nylon), Polyethylenterephthalat, Polyacrylnitril, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid), usw. Die Dicke der oben erwähnten gewebten bzw. gewirkten, gestrickten oder feinen netzartigen Materialien liegt üblicherweise innerhalb des Bereiches von 30 bis 300 um. Die Porenfraktion der gewebten bzw. gewirkten, gestrickten oder netzartigen Materialien beträgt normalerweise von 20 bis 60% und bevorzugt von 40 bis 60%.
Es besteht die Gefahr, daß Flüssigkeiten, insbesondere Flüssigkeiten, welche störende Substanzen, wie alkalische Materialien, in Lösung enthalten, durch die Barriereschicht als Folge der Kapillarwirkung innerhalb der Poren im Falle der Luft-Barriereschichten, die aus porösen Materialien hergestellt worden sind und die verbundene Poren, wie oben beschrieben, besitzen, hindurchgehen. Daher ist die Luft-Barriereschicht bevorzugt hydrophob oder wasserabstoßend in dem Ausmaß, daß der Kapillarfluß, bedingt durch die oben erwähnte Kapillarwirkung, nicht auftritt. In Fällen, wo das poröse Material, welches verbundene Poren besitzt, nur schwach hyrophob oder wasserabstoßend ist, ist die Anwendung einer Behandlung, um das Material hydrophob oder wasserabstoßend zu machen, bevorzugt. Die oben erwähnten Behandlungen, um das poröse Material hydrophob oder wasserabstoßend zu machen, können durch Eintauchen, Beschichten oder Besprühen mit einem bekannten Reagens, mit dem die Materialien hydrophob oder wasserabstoßend gemacht werden, durchgeführt werden. Beispiele hierfür sind Siliconharze, Siliconöle, fluorierte Harze und fluorierte Öle, entweder in ihrem ursprünglichen Zustand oder nach der Verdünnung in einem Lösungsmittel (beispielsweise Hexan, Cyclohexan, Petrolether usw.), in solchem Umfang, wie er erforderlich ist, um einen Feststoffgehalt innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 5 Gew.-% zu ergeben. Die Reagentien werden dann zumindest auf die Oberfläche oder auf die Nachbarschaft der Oberfläche des porösen Materials, welches verbundene Poren aufweist, aufgetragen.
Die Luft-Barriereschicht kann gebildet werden, indem ein poröses Material, welches verbundene Poren besitzt, an dem Polymer-Bindemittel, welches in organischen Lösungsmitteln löslich ist, oder an dem wasserlöslichen Polymer-Bindemittel, welches die Matrix für die zuvor beschriebene Indikatorschicht bildet, angebracht wird. Die Anbringung des porösen Materials kann durch Anheften bzw. Verkleben des porösen Materials, während die lndikatorschicht noch naß ist, und dann Trocknen der Kombination erfolgen. In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "während die Indikatorschicht noch naß ist", daß das Lösungsmittel, in dem das Bindemittel gelöst worden ist, noch vorhanden ist, oder daß der getrocknete Film mit einem Lösungsmittel zum Auflösen (einem organischen Lösungsmittel oder Wasser) wieder befeuchtet worden ist, und daß das Bindemittel, welches die Matrix der Indikatorschicht bildet, in nassem Zustand, dispergiertem Zustand oder in Form einer Lösung vorliegt. In Fällen, wo das Bindemittel der Indikatorschicht klebrig ist, wie im Falle von beispielsweise Polyvinylacetat, kann das poröse Material, welches verbundene Poren aufweist, mit dem Indikator direkt unter Anwendung von Druck ohne spezielle Befeuchtung der Indikatorschicht verbunden werden.
Die Polymer-Barriereschichten, die aus dünnen, homogenen, nichtporösen Schichten aus einem hydrophoben Polymeren (oder einem Polymeren, welches eine begrenzte Hydrophilizität besitzt) bestehen, sind bevorzugt aus hydrophoben Polymeren oder Polymeren, die eine begrenzte Hydrophilizität besitzen, hergestellt. Spezifische Beispiele für hydrophobe Polymere und Polymere mit begrenzter Hydrophilizität umfassen Celluloseacetatpropionat, Celluloseacetatbutyrat, Bisphenol-A-Polycarbonat, Polyethylen, Polypropylen, Ethylen-Vinylacetat-Copolymere, Polyurethan, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymere, Polyamide (Nylon), Polymethylmethacrylate und Polyvinylbutyral usw. Diese Polymere können einzeln oder in Form eines Gemisches aus zwei oder mehreren davon verwendet werden.
Die Dicke der Polymer-Barriereschicht liegt üblicherweise innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 6 um, und eine Dicke innerhalb des Bereiches von 0,2 um bis 3 um ist besonders wünschenswert. Eine Polymer-Barriereschicht kann hergestellt werden, indem eine Lösung des Polymeren in einem organischen Lösungsmittel aufgetragen wird und getrocknet wird, gemäß den Verfahren, die in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 19,062/83 und in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 21,452/85 beschrieben werden.
Die Verwendung einer Luft-Barriereschicht, welche aus einem Membranfilter oder einem Membranfilter, welcher, um ihn wasserabstoßend zu machen, behandelt worden ist, besteht, wobei der Membranfilter aus einem Vinylpolymeren, wie Polyethylen oder Polypropylen, oder einem Fluor-enthaltenden Vinylpolymeren, wie Polytetrafluorethylen usw., besteht, ist bevorzugt, da ein analytisches Verfahren von kurzer Dauer, ein hoher Genauigkeitsgrad und eine sehr einheitliche Verfärbung oder Farbänderung in der Indikatorschicht erhalten wird.
Die Ammoniak-erzeugende Reaktionsschicht (die im folgenden als Reaktionsschicht bezeichnet wird) enthält Reagentien, die mit einer Ammoniak-erzeugenden Substanz reagieren und gasförmiges Ammoniak bilden. Sie wird direkt auf der Barriereschicht oder auf einer klebrigen Zwischenschicht, wie im folgenden beschrieben, aufgebracht. Die Reaktionsschicht enthält üblicherweise ein Reagens, das mit der Ammoniak-erzeugenden Substanz unter Bildung von Ammoniak reagieren kann (im allgemeinen ein Enzym oder ein Reagens, welches ein Enzym enthält), einen alkalischen Puffer, um sicherzustellen, daß das Ammoniak, das bei der Reaktion gebildet wird, wirksam als gasförmiges Ammoniak freigesetzt wird, und ein hydrophiles Polymer-Bindemittel, welches zu einem Film verformt werden kann.
Das Reagens, das mit der Ammoniak-erzeugenden Substanz reagiert und Ammoniak bildet, ist bevorzugt ein Enzym oder ein Reagens, welches ein Enzym enthält, und ein Enzym, das für die Analyse geeignet ist, kann leicht für die Verwendung entsprechend dem Typ des Ammoniak-erzeugenden Analyten ausgewählt werden. Wenn ein Enzym als oben erwähntes Reagens verwendet wird, wird die Kombination aus Ammoniak-erzeugender Substanz und Reagens durch die Spezifität des Enzyms bestimmt. Spezifische Beispiele für Ammoniak-erzeugende Substanzen/Reagenskombinationen umfassen Harnstoff/Urease, Creatinin/Creatinin-Deiminase, Aminosäuren/Aminosäure-Dehydrogenase, Aminosäuren/Aminosäure-Oxidase, Aminosäuren/Ammoniak- Lyase, Amine/Amin-Oxidase, Diamine/Amin-Oxidase, Glucose und Phosphoamidat/Phosphamidathexose-Phosphotransferase, ADP/Carbamat-Kinase, Säureamid/Amid-Hydrolase, Nucleobase/Nucleobase-Deaminase, Nucleosid/Nucleosid-Deaminase, Nucleotid/Nucleotid-Deaminase, Guanin/Gluanase usw.
Die alkalischen Puffer, die in der Reaktionsschicht verwendet werden können, besitzen einen pH innerhalb des Bereiches von 7,0 bis 10,5 und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 7,5 bis 10,0. Tatsächliche Beispiele für Puffer umfassen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), Phosphatpuffer, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin (Bicine), N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropansulfonsäure (Taps), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-hydroxypropan-3-sulfonsäure (Heppso), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-3-propansulfonsäure (Epps), N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, 3-[N-Bis(hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonsäure (Dipso), N-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (Hepes), Piperazin-N,N'-bis(2-hydroxypropansulfonsäure)dihydrat (Popso), 3-[N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure (Tapso), N-Tris(hydroxymethyl)methylaminoethansulfonsäure (Tes), N-[2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]glycin (Tricine) usw., oder Alkalimetallsalze (beispielsweise Lithiumsalze, Natriumsalze, Kaliumsalze usw.) oder Erdalkalimetallsalze davon. Einzelheiten dieser Puffer werden auf den Seiten 467-477 von Biochemistry, Bd. 5 (1966); auf den Seiten 300-310 von Analytical Biochemistry, Bd. 104 (1980) und auf den Seiten 1312-1320 der Japanese Chemical Society Publication mit dem Titel Chemistry Handbook, Fundamentals Edition [(japanisch), Tokyo, 1966, veröffentlicht von Maruzen Corp.] beschrieben.
Ein geeignetes hydrophiles Polymeres kann unter den wasserlöslichen Polymer-Bindemitteln ausgewählt werden, die in der zuvor beschriebenen Indikatorschicht verwendet werden können. Andere hydrophile Polymere, die in der Reaktionsschicht verwendet werden können, umfassen Gelatine, Gelatinederivate, Agarose, Pluran, Pluranderivate, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid usw. Von diesen Polymeren ist die Verwendung von Gelatine oder Gelatinederivaten im allgemeinen bevorzugt.
Benetzungsmittel, Bindemittel-Vernetzungsmittel (Härtungsmittel), Stabilisatoren, Chelatbildungsmittel für Schwermetallionen (Komplexierungsmittel) usw. können je nach Bedarf in der Reaktionsschicht verwendet werden, wie auch das Reagens, welches mit der Ammoniak-erzeugenden Substanz reagiert und Ammoniak bildet, der alkalische Puffer und das hydrophile Polymer-Bindemittel, welches zu einem Film verarbeitet werden kann. Geeignete Chelatbildungsmittel für Schwermetallionen sind solche, die zur Maskierung von Schwermetallionen des Typs, der die Enzymaktivität stört, verwendet werden. Spezifische Beispiele solcher Chelatbildungsmittel für Schwermetallionen umfassen Komplexane, wie EDTA-2Na, EDTA-4Na, Nitrilotriessigsäure (NTA), Diethylentriaminpentaessigsäure usw.
Die Reaktionsschicht kann durch Vermischen des Reagenses, welches mit der Ammoniak-erzeugenden Substanz reagiert und Ammoniak bildet, des alkalischen Puffers und der oben erwähnten Reagentien, die je nach Bedarf zugegeben werden, mit dem hydrophilen Bindemittel, welches zu einem Film verformt werden kann, wie Gelatine usw., unter Bildung einer Beschichtungsflüssigkeit und dann Auftragen dieser Flüssigkeit auf die Barriereschicht oder eine klebrige Zwischenschicht und Trocknen hergestellt werden.
Die Menge des Reagenses, welches mit der Ammoniak-erzeugenden Substanz reagiert und Ammoniak bildet, die in der Reaktionsschicht enthalten ist, liegt innerhalb des Bereiches von 100 bis 10000 E und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 200 bis 540 E pro Quadratmeter im Falle der Verwendung eines Enzyms. Die Verwendung einer Menge von alkalischem Puffer innerhalb des Bereiches von 1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Bindemittels, ist geeignet. Wenn ein Chelatbildungsmittel für Schwermetallionen verwendet wird, liegt eine geeignete Menge innerhalb des Bereiches von 0,5 bis 20%, bezogen auf das Gewicht des Bindemittels. Die Trockendicke der Reaktionsschicht liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 1 bis 20 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 3 bis 10 um.
Die klebrige Zwischenschicht, welche zwischen der Barriereschicht und der Reaktionsschicht vorgesehen werden kann, enthält eine Polymerzusammensetzung, die in Luft bei einer Feuchtigkeit von 10 bis 85% und bei normaler Umgebungstemperatur (von 0 bis 40ºC) klebrig ist. Die klebrige Zwischenschicht kann unter Verwendung der Materialien und Verfahren, die in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 21,452/85 beschrieben werden, hergestellt werden. Die Polymerzusammensetzung, aus der die klebrige Zwischenschicht hergestellt wird, kann aus einem individuellen bekannten Polymeren mit einem Glasübergangspunkt (Tg) unterhalb 0ºC, einem Gemisch aus zwei oder mehreren solcher Polymeren oder einem Gemisch, in dem bekannte Klebrigmacher und grenzflächenaktive Mittel zu solchen Polymeren oder Gemischen davon je nach Bedarf zugegeben wurden, hergestellt werden. Die Dicke der klebrigen Zwischenschicht liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 6 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 1 bis 4 um.
Spezifische Beispiele für Polymere, die als klebrige Zwischenschicht verwendet werden können, umfassen Vinylacetat/Butylacrylat-Copolymere, Poly(ethylacrylat), Styrol/Butylacrylat/Acrylsäure/N-(Hydroxymethyl)acrylamid-Vierkomponenten-Copolymere, Butylacrylat/(Ethylacetoacetato)methacrylat/2-Acrylamid-2-methylpropansulfonsäure-Dreikomponenten-Copolymere usw.
Die Schaffung einer klebrigen Zwischenschicht ist in Fällen bevorzugt, bei denen die Polymer-Barriereschicht aus einem dünnen, homogenen, nichtporösen, hydrophoben Polymeren (oder einem Polymeren, welches begrenzte Hydrophilizität besitzt) besteht.
Die Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion, die die Funktion besitzt, daß sie im wesentlichen die Diffusion in die Ammoniak-Auffangschicht des Ammoniaks, welches in der Ammoniak-erzeugenden Reaktionsschicht gebildet wird, verhindert und die im wesentlichen kein Ammoniak auffängt oder eine Ammoniak-erzeugende Reaktion eingeht, wird auf der Ammoniak-erzeugenden Reaktionsschicht vorgesehen.
Die Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion kann eine Schicht sein, welche andere Funktionen ausübt, vorausgesetzt, daß sie im wesentlichen nicht Ammoniak auffängt oder eine Ammoniak-erzeugende Reaktion eingeht. Beispiele für Schichten, die andere Funktionen besitzen, umfassen eine gehärtete hydrophile Polymerschicht, eine Lichtabschirmungsschicht, eine Verbindungsschicht usw.
Die Polymer-Bindemittel, die in der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion verwendet werden können, können ohne besondere Beschränkung ausgewählt werden, vorausgesetzt, daß sie zu im wesentlichen nichtporösen wasserpermeablen Filmen verformt werden können und auf die Reaktionsschicht direkt oder mittels einer geeigneten Zwischenschicht laminiert werden können. Irgendeines der Polymer-Bindemittel, welche in den zuvor erwähnten Indikator- oder Reaktionsschichten verwendet wurden, kann für diesen Zweck verwendet werden, mit der Maßgabe, daß es im wesentlichen gegenüber Wasser permeabel ist. Von diesen Polymeren ist die Verwendung eines hydrophilen Polymeren, insbesondere eines wasserlöslichen hydrophilen Polymeren oder eines Polymeren, welches mit Wasser quillt, des gleichen Typs, wie er in der Reaktionsschicht verwendet wurde, bevorzugt. Bevorzugte hydrophile Polymere sind Gelatine und Gelatinederivate.
Das Polymer-Bindemittel kann alleine für die Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion verwendet werden, aber sein PH-Wert wird zwischen 7,0 und 11,0 mittels eines geeigneten Puffers eingestellt, um die Wirksamkeit zu erhöhen, mit der die Diffusion von Ammoniak verhindert wird. Ein pH-Wert innerhalb des Bereiches von 8,0 bis 10,0 ist besonders wünschenswert.
Puffer können ohne besondere Beschränkung für die Pufferfunktion zur Aufrechterhaltung des pH-Werts der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion innerhalb des zuvor erwähnten Bereiches ausgewählt werden, mit der Maßgabe, daß sie eine Pufferwirkung innerhalb des zuvor erwähnten pH-Bereiches besitzen. Spezifische Beispiele für Puffer, die in der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion verwendet werden können, umfassen Alkalien und alkalische Puffer des gleichen Typs, wie er in der zuvor beschriebenen Reaktionsschicht oder wie er in der im folgenden beschriebenen Autfangschicht für endogenes Ammoniak beschrieben wird.
Im Hinblick auf die Verhinderung der Diffusion von Ammoniak ist eine dickere Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion bevorzugt. Im Hinblick auf die Wasserpermeation ist aber ein dünnerer Film bevorzugt, und eine Filmdicke innerhalb eines Bereiches, der diese beiden Funktionen erfüllt, wird ausgewählt.
Wenn die Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion eine im wesentlichen nichtporöse Schicht ist, welche ein hydrophiles Polymer-Bindemittel enthält, liegt ihre Dicke normalerweise innerhalb des Bereiches von 5 bis 50 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 7 bis 30 um, und das Bedeckungsgewicht des Polymer-Bindemittels liegt innerhalb des Bereiches von 4,0 bis 40 g und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 5,5 bis 25 g pro Quadratmeter des mehrschichtigen Elements.
Eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak, welche ein Reagens enthält, welches auf das Ammoniak (endogenes Ammoniak), das in der wäßrigen fluiden Probe vorhanden ist, einwirkt und es in eine solche Form überführt, daß es die Reaktionsschicht darunter nicht erreicht (im folgenden einfach als "Auffangschicht für endogenes Ammoniak" bezeichnet), wird direkt oder auf eine Lichtabschirmungsschicht, die als Zwischenschicht vorhanden ist, die im folgenden beschrieben wird, oder auf irgendwelche anderen Arten von Zwischenschichten auf der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion aufgetragen. Die Auffangschicht für endogenes Ammoniak besitzt die Funktion, daß sie endogenes Ammoniak, welches ebenfalls in der Probe vorhanden ist, bevor die Ammoniak-erzeugende Substanz, wie Creatinin oder BUN usw., welche der Analyt ist, die Reaktionsschicht erreicht und die Reaktion, bei der Ammoniak gebildet wird, beginnt, auffängt.
Der Ausdruck "Auffangen von endogenem Ammoniak" bedeutet, daß ein Reagenssystem, welches in der endogenen Ammoniakschicht vorhanden ist, sich mit dem endogenen Ammoniak verbindet, um einen Zustand einzunehmen, der im wesentlichen während der Zeit des analytischen Verfahrens unfähig ist, zu dissoziieren, oder daß das Reagenssystem, welches in der Auffangschicht für endogenes Ammoniak vorhanden ist, eine chemische Reaktion mit dem endogenen Ammoniak eingeht, wobei das endogene Ammoniak in irgendeine andere chemische Substanz überführt wird (in der Praxis in ein Ammoniumsalz, ein Ammoniumion oder eine chemische Substanz, die sich von dem gasförmigen Ammoniak unterscheidet), so daß das endogene Ammoniak in der Auffangschicht für endogenes Ammoniak fixiert ist und es im wesentlichen nicht in der Lage ist, die Reaktionsschicht zu erreichen. Der letztere Typ von Auffangschicht für endogenes Ammoniak, der ein Reagenssystem enthält, welches die Funktion aufweist, daß es mit dem endogenen Ammoniak reagiert und es fixiert, ist bevorzugt. In der vorliegenden Beschreibung werden die Reagenssysteme, welche eine chemische Reaktion mit dem endogenen Ammoniak eingehen und es in eine unterschiedliche chemische Substanz überführen, als Auffangreagentien für endogenes Ammoniak bezeichnet.
Reagenszusammensetzungen, welche Enzyme mit der Fähigkeit besitzen, das Ammoniak katalytisch als Substrat in eine andere Substanz zu überführen, sind als Auffangreagens für endogenes Ammoniak bevorzugt. Spezifische Beispiele für Auffangreagentien für endogenes Ammoniak umfassen Reagenszusammensetzungen, welche NADH (die reduzierte Form von Nicotinamid-adenindinucleotid) und/oder NADPH (die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat), Glutaminsäure-Dehydrogenase (EC1.4.1.4. und EC1.4.1.3. können beide verwendet werden, die im folgenden als "GLDH" bezeichnet werden) und α-Ketoglutarsäure oder die Salze davon (im folgenden als "H-KG" bezeichnet), enthalten. Reagenszusammensetzungen, welche Aspartase (EC4.3.1.1) und Fumarsäure oder Fumarate enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Die Verwendung von Reagenszusammensetzungen, welche NADH, GLDH und α-KG enthalten, ist für die Auffangreagentien für endogenes Ammoniak in dem erfindungsgemäßen integralen mehrschichtigen Analyseelement bevorzugt. Wenn Reagenszusammensetzungen, die GLDH enthalten, oder Reagenszusammensetzungen, die Aspartase enthalten, verwendet werden, ist die Verwendung eines geeigneten Puffers bevorzugt, so daß der pH-Wert der Auffangschicht für endogenes Ammoniak normalerweise unterhalb 8,5 und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 7,0 bis 8,5 liegt.
Puffer zur Aufrechterhaltung des zuvor erwähnten pH-Werts, die für das Auffangreagens für endogenes Ammoniak verwendet werden können, umfassen solche, die auf den Seiten 1312-1320 der Japanese Chemical Society Publication mit dem Titel Chemistrv Handbook, Fundamentals Edition (japanisch) (Maruzen Co., Tokyo, 1966) beschrieben werden; solche, die von Norman E. Good et al., "Hydrogen Ion Buffers for Biological Research", Biochemistry 5 (2), S. 467-477 (1966), beschrieben werden; und solche, die von R.M.C. Dawson et al. Data for Biochemical Research, S. 467-508 [2. Ausgabe, Oxford Clerendon Press (1969)] und in Analytical Biochemistry 104, 300-301 (1980), beschrieben werden. Die organischen Säuren oder ihre Alkalimetall- (oder Erdalkalimetall-)salze, die in den integralen mehrschichtigen Analyseelementen verwendet werden, die in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 28,277/82 beschrieben werden, die basischen Polymeren, die sauren Polymeren und die Alkalimetall- (oder Erdalkalimetall-)salze von sauren Polymeren, die in den integralen mehrschichtigen Analyseelementen verwendet werden, die in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 143,959/84 und 10,171/85 usw. beschrieben werden, und Gemische dieser Materialien können als oben erwähnte Puffer verwendet werden.
Beispiele für bevorzugte Puffer unter diesen pH-Puffern umfassen Kombinationen aus Dinatriumhydrogenphosphat, 3-Morpholinopropansulfonsäure [MOPS, CAS Reg. Nr. (1132-61-2)] und Natriumhydroxid, Kombinationen aus Kaliumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat, Kombinationen aus Dinatriumhydrogenphosphat und Zitronensäure, Kombinationen aus Borsäure, Natriumchlorid- und Boraxkombinationen von Kaliumdihydrogenphosphat und Natriumtetraborat und Kombinationen aus Natriumtetraborat und einem alkalischen Mittel, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid usw. Die Auffangschicht für endogenes Ammoniak, die aus Reagentien, wie dem zuvor erwähnten Auf fangreagens für endogenes Ammoniak und einem pH-Puffer usw., und einem hydrophilen Polymer-Bindemittel besteht, kann zu einem Film verformt werden. Die hydrophilen Polymer-Bindemittel, die in der zuvor erwähnten Reaktionsschicht verwendet werden, können als hydrophobe Polymer-Bindemittel verwendet werden. Im allgemeinen ist die Verwendung von Gelatine und Gelatinederivaten unter diesen Polymer-Bindemitteln bevorzugt.
Die Dicke der Auffangschicht für endogenes Ammoniak beträgt normalerweise von 3 bis 30 um und bevorzugt von 5 bis 20 um.
Die Auffangschichten für endogenes Ammoniak enthalten bevorzugt NADPH oder NADH, α-Ketoglutarsäure (α-KG) und Glutaminsäure-Dehydrogenase (GLDH). Der bevorzugte Bereich (pro Quadratmeter Auffangschicht für endogenes Ammoniak) und der bevorzugte Bereich an dem Gehalt dieser Komponenten werden im folgenden aufgeführt. Bevorzugter Bereich (/m²) Bereich für den Gehalt* * Beschichtungsmenge (Gehalt) pro Quadratmeter
Wenn die Auffangschicht für endogenes Ammoniak Aspartase und Fumarsäure (diese kann in Form eines Fumarats verwendet werden) enthält, enthält die Schicht bevorzugt mindestens 1000 Einheiten/m² Aspartase und mindestens 200 mg/m² Fumarsäure (und/oder Fumarat).
Die Auffangschicht für endogenes Ammoniak kann aus einer feinen porösen Schicht bestehen, in der ein Reagens für das Auffangen von Ammoniak, ein pH-Puffer und ein hydrophiles Polymeres, die je nach Bedarf zusammen verwendet werden, in einer porösen Ausspreitungsschicht oder in einer feinen porösen Schicht, die zwischen einer porösen Ausspreitungsschicht und der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion vorgesehen ist, enthalten sind, anstatt daß sie in einer im wesentlichen nichtporösen Schicht vorhanden sind, welche ein Polymer-Bindemittel enthält, und die auf der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion, wie oben beschrieben, vorgesehen ist. Wenn die Reagentien zum Auffangen von Ammoniak in einer porösen Ausspreitungsschicht enthalten sind, wirkt die Ausspreitungsschicht ebenfalls als Auffangschicht für endogenes Ammoniak. Die Menge an Auffangreagens für Ammoniak (Bedeckungsgewicht), die Art und die Menge (Bedeckungsgewicht) des pH-Puffers und der pH-Wert-Bereich der feinen porösen Auffangschicht für endogenes Ammoniak sind gleich wie die in der im wesentlichen nichtporösen Schicht, welche ein Polymer- Bindemittel enthält. Die Verbindung zwischen einer Schicht zur Entfernung des endogenen Ammoniaks mit feiner Porosität und einer porösen Ausspreitungsschicht wird bevorzugt unter Verwendung eines porösen Verbindungsverfahrens, das in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 4,959/86 beschrieben wird, erreicht.
Die Lichtabschirmungsschichten, welche zwischen der Barriereschicht und der Auffangschicht für endogenes Ammoniak vorgesehen sein können, sind wasserpermeable oder wasserdurchdringbare Schichten, in denen feine Teilchen oder feine Pulver (die im folgenden einfach als feine Teilchen bezeichnet werden), die eine Lichtabschirmung ergeben oder die Lichtabschirmungs- und Lichtreflexionseigenschaften besitzen, dispergiert sind und in einer geringen Menge eines hydrophilen (oder schwach hydrophilen) Polymer-Bindemittels, welches zu einem Film verformt werden kann, gehalten werden. Die Lichtabschirmungsschicht wirkt als Lichtreflexions- und Hintergrundschicht und schirmt die Färbung der wäßrigen fluiden Probe, welche auf die poröse Ausspreitungsschicht (die im folgenden beschrieben wird) aufgetüpfelt worden ist, insbesondere die rote Färbung, bedingt durch Hämoglobin, wenn die Probe aus Gesamtblut besteht, ab, wenn die nachweisbare Änderung (Änderung in der Farbe, farbbildende Puffer usw.), die in der Indikatorschicht gebildet wird, durch Reflexion von der Trägerseite aus gemessen wird.
Beispiele für feine Teilchen, die für die Lichtabschirmung und die Lichtreflexion verwendet werden können, umfassen feine Titandioxid-Teilchen, feine Bariumsulfat-Teilchen und feine Teilchen oder Flocken von Aluminium usw.
Beispiele für hydrophile (oder schwach hydrophile) Polymer-Bindemittel, die zu Filmen verformt werden können, umfassen Gelatine, Gelatinederivate und Polyacrylamid usw. Gemische aus Gelatine oder Gelatinederivaten mit bekannten Härtungsmitteln (Vernetzungsmitteln) können ebenfalls verwendet werden.
Das Verhältnis der feinen Lichtabschirmungs-Teilchen und des Polymer-Bindemittels (wenn es trocken ist) in der Lichtabschirmungsschicht liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 2,5 bis 7,5 Vol.-Teilen (Trockenvolumen) des Polymer-Bindemittels pro 10 Vol.-Teile feine Lichtabschirmungs-Teilchen und bevorzuqt innerhalb des Bereiches von 3,0 bis 6,5 Vol.- Teilen des Polymer-Bindemittels (Trockenvolumen) pro 10 Vol.- Teile feine Lichtabschirmungs-Teilchen. Wenn die feinen Lichtabschirmungs-Teilchen aus Titandioxid bestehen, dann liegt das Gewichtsverhältnis innerhalb des Bereiches von 0,6 bis 1,8 Gew.-Teilen (Trockengewicht) und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 0,8 bis 1,5 Gew.-Teilen (Trockengewicht) des Polymer-Bindemittels pro 10 Gew.-Teile feine Titandioxid- Teilchen. Die Dicke der trockenen Lichtabschirmungsschicht liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 3 bis 30 um und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 5 bis 20 um.
Eine poröse Ausspreitungsschicht kann als getrennte Schicht auf der Auffangschicht für endogenes Ammoniak vorgesehen werden.
Eine Ausspreitungsschicht aus gewebtem bzw. gewirktem Material, wie in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 164,356/80 und 66,359/82 beschrieben (beispielsweise eine flache Welle, wie Hemden- bzw. Kleiderstoff oder Popeline), eine Ausspreitungsschicht aus gestricktem bzw. gewirktem Material, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 222,769/85 beschrieben (beispielsweise Trikot-Strick- bzw. -Wirkgewebe, Doppeltrikot-Strick- bzw. -Wirkgewebe, Milanese- Strick- bzw. -Wirkgewebe usw.), eine Ausspreitungsschicht, die aus Papier bestent, welches unter Verwendung von organischen Polymer-Faserpulpen hergestellt worden ist, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 148,250/82 beschrieben, ein Membranfilter (eine trübe Polymerschicht), wie in dem japanischen Patentdokument Nr. 21,677/78 und in der US-Patentschrift Nr. 3 992 158 usw. beschrieben, eine nichtgewebte isotrope poröse Ausspreitungsschicht, wie die kontinuierlichen porösen Schichten mit feinen Poren, bei denen Polymer- Mikrokügelchen, Glas-Mikrokügelchen oder siliciumhaltige Erde bzw. Kieselerde usw. in einem hydrophilen Polymer-Bindemittel vorhanden sind, und eine nichtgewebte isotrope poröse Ausspreitungsschicht, welche aus einer kontinuierlichen porösen Schicht mit feinen Poren besteht, in der Polymer-Mikrokügelchen zusammen unter Punkt-an-Punkt-Kontakt mit einem Polymer- Klebstoff verklebt sind, der in Wasser nicht quillt (eine Schicht mit einer dreidimensionalen gitterartigen Teilchenstruktur), wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 90,859/80 beschrieben, usw. können als poröse Ausspreitungsschicht verwendet werden.
Diese Schichten können so ausgebildet werden, daß sie als Auffangschichten für endogenes Ammoniak wirken, indem ein Auffangreagens für Ammoniak und ein pH-Puffer usw. in die poröse Ausspreitungsschicht eingearbeitet werden. Aber in diesen Ausführungsformen ist eine Ausspreitungsschicht auf Faserbasis, wie eine Ausspreitungsschicht aus einem gewebten Material oder eine Ausspreitungsschicht aus einem gestrickten bzw. gewirkten Material, bevorzugt, damit die Reagenszusammensetzung innerhalb der Ausspreitungsschicht verbleibt.
Beispiele für Verfahren zur Einarbeitung der Reagens zusammensetzungen, welche Enzyme für das Auffangen von Ammoniak in den Ausspreitungsschichten enthalten, umfassen zuerst die Schaffung einer porösen Ausspreitungsschicht auf einer aufgetragenen Schicht und dann die Beschichtung mit einer Lösung aus Wasser oder einem organischen Lösungsmittel, welche die Reagenszusammensetzung, die ein Enzym umfaßt, enthält, auf die Ausspreitungsschicht, wie es in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 171,864/84, 222,769/85 und 222,770/85 usw. beschrieben wird.
Der gewebte Material-Grundstoff oder der gestrickte bzw. gewirkte Material-Grundstoff, der für die poröse Ausspreitungsschicht verwendet wird, kann auf mindestens einer Seite davon einer physikalischen Aktivierungsbehandlung, wie einer Glühentladungsbehandlung oder einer Koronaentladungsbehandlung, unterworfen werden, wie es in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 66,359/82 beschrieben wird. Er kann weiterhin einer Behandlung unterworfen werden, die ihn hydrophil macht, wie einem Waschen und einer Entfettungsbehandlung und Eintauchen in ein hydrophiles Polymeres, wie es in den japanischen Patentanmeldungen Nrn. 164,356/80 und 66,359/82 usw. beschrieben wird, oder er kann einer Behandlung unterworfen werden, bei der das Grundmaterial hydrophil gemacht wird, indem geeignete Kombinationen dieser Behandlungen durchgeführt werden, und die Adhäsionsfestigkeit mit der Unterlageschicht (an der Seite näher dem Träger) kann auf diese Weise erhöht werden.
Eine im wesentlichen nichtporöse Auf fangschicht für endogenes Ammoniak, die ein hydrophiles Polymer-Bindemittel enthält, kann ebenfalls als Bindungsschicht für die Befestigung der porösen Ausspreitungsschicht direkt (d.h. ohne die Vorsehung einer getrennten Verbindungsschicht) wirken, aber eine bekannte Verbindungsschicht, welche ein hydrophiles Polymeres, wie typischerweise Gelatine, enthält, kann vorgesehen werden, damit die Ausspreitungsschicht fest gebunden und einheitlich gehalten wird. Die Dicke der Verbindungsschicht liegt in trockenem Zustand innerhalb des Bereiches von 0,5 bis 5 um.
Grenzflächenaktive Mittel können in den Indikatorschichten, den Reaktionsschichten, den Schichten zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion, den Auffangschichten für endogenes Ammoniak, den Lichtabschirmungsschichten, den Verbindungsschichten, den Ausspreitungsschichten und den Ausspreitungsschichten, welche Reagenszusammensetzungen für das Auffangen von Ammoniak enthalten, vorhanden sein. Nichtionische grenzflächtenaktive Mittel sind Beispiele solcher grenzflächenaktiver Mittel. Spezifische Beispiele für solche nichtionischen grenzflächenaktiven Mittel umfassen p-Octylphenoxypolyethoxyethanol, p-Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Polyoxyethylenoleylether, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, p-Nonylphenoxypolyglycidol, Octylglucosid usw. Die Ausspreitungswirkung (Meßwirkung) auf die wäßrigen fluiden Proben wird verbessert, indem ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel in die Ausspreitungsschicht eingearbeitet wird. Das Wasser in der wäßrigen fluiden Probe kann mit größerer Einheitlichkeit in den Reagensschichten oder in den Wasserabsorptionsschichten während des analytischen Verfahrens adsorbiert werden, wenn ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel in den Schichten vorhanden ist, und weiterhin wird der Flüssigkeitskontakt mit der Ausspreitungsschicht beschleunigt und wird im wesentlichen einheitlich.
Die erfindungsgemäßen mehrschichtigen Analyseelemente können unter Verwendung an sich bekannter Verfahren, die in den Beschreibungen der verschiedenen Patentdokumente, die vorher erwähnt wurden, beschrieben werden, hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen mehrschichtigen Analyseelemente werden bevorzugt in rechteckige Stücke mit einer Seitenlänge von 15 mm und 30 mm oder in runde Stücke mit etwa der gleichen Größe geschnitten und in Diarähmchen bzw. Rähmchen (im folgenden wird der Ausdruck Diarähmchen verwendet), wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 28,331/82, der japanischen Gebrauchsmuster-Geschmacksmusteranmeldung (OPI) Nr. 142, 545/81, der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 63,452/81, der japanischen Gebrauchsmusteranmeldung (OPI) Nr. 32,350/83 und der wiederveröffentlichten japanischen Patentanmeldung (basierend auf der internationalen Anmeldung) Nr. 501,144/83 usw. beschrieben, befestigt, im Hinblick auf die Herstellung, die Verpackung, den Transport, die Lagerung und die Durchführung der Messung. Abhängig von dem Zweck, für den sie verwendet werden, können sie in Form eines langen Bandes in einer Cassette oder in einem Magazin vorhanden sein, oder kleine Stücke können auf eine Karte bzw. einen Karton mit kleiner Öffnung aufgeklebt oder befestigt sein.
Die erfindungsgemäßen mehrschichtigen Analyseelemente können für die Analyse von Analyten (Ammoniak-erzeugenden Substanzen) in fluiden Proben verwendet werden, wobei man die Verfahren verwendet, die in den Beschreibungen der zuvor erwähnten verschiedenen Patente beschrieben werden. Eine wäßrige fluide Probe mit einem Volumen innerhalb des Bereiches von 5 ul ("l" bedeutet "Liter") bis 30 ul und bevorzugt innerhalb des Bereiches von 8 bis 15 ul, die aus Gesamtblut, Plasma, Lymphe, Urin usw. besteht, wird auf die Ausspreitungsschicht als Flecken aufgetragen und bei im wesentlichen konstanter Temperatur innerhalb des Bereiches von 20 bis 40ºC und bevorzugt bei einer im wesentlichen konstanten Temperatur in der Nachbarschaft von 37ºC während einer Zeit von 1 Minute bis 10 Minuten inkubiert. Der Gehalt des Analyten der fluiden Probe kann auf der Grundlage eines an sich bekannten kolorimetrischen Verfahrens bestimmt werden. Bei diesem Verfahren wird eine zuvor hergestellte Eichkurve verwendet. Das Licht, das von der optisch transparenten Trägerseite aus unter Verwendung von sichtbarem und ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge, die gleich ist oder ähnlich wie die Peak-Absorptionswellenlänge der Farbe, die innerhalb des Elemeiits gebildet wurde oder sich geändert hat, reflektiert wurde, wird gemessen. Alternativ kann die Fluoreszenzintensität innerhalb des Elements gemessen werden, und der Analytgehalt der fluiden Probe kann unter Verwendung einer Eichkurve, die zuvor hergestellt worden ist, erhalten werden. Die quantitative Analyse des Analyten kann mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden, indem die Menge an fluider Probe, die als Flecken aufgetragen wurde, und die Zeit und die Temperatur während der Inkubation bei konstanten Werten gehalten werden. Die Menge der Ammoniak-erzeugenden Substanzen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen mehrschichtigen Analyseelemente analysiert werden kann, beträgt bevorzugt von 0,2 bis 30 mg/dl im Falle von Creatinin und von 5 bis 200 mg/dl im Falle von Harnstoff in menschlichem Blut. Die Messungen können sehr leicht unter Verwendung chemischer Analysevorrichtungen, die in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 125,543/85, 220,862/85, 294,367/86 und 161,867/83 usw. beschrieben werden, durchgeführt werden, und sehr genaue quantitative Analysen können auf diese Weise durchgeführt werden.

Beispiel 1

Eine Indikatorschicht wurde auf einen transparenten Polyethylenterephthalat-(PET-)Film (Dicke: 180 um) unter Bildung der im folgenden angegebenen Bedeckungsgewichte aufgetragen, und nach dem Trocknen wurde ein Polypropylen-Membranfilter (durchschnittliche Porengröße: 0,2 um; Porenfraktion: 75%; Dicke: 170 um) als Luft-Barriereschicht aufgebracht, indem ein einheitlicher Druck angewendet wurde.

Bedeckungsgewichte (pro Quadratmeter) der Indikatorschicht

Bromphenolblau 340 mg
Polyvinylacetat-Ethylacrylat- Copolymerlatex 8,5 g
N-Polyoxyethylen-N-octansulfonamid (enthaltend durchschnittlich 16 Einheiten) 100 mg
Eine Reaktionsschicht, eine Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion, eine Zwischenschicht und eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak wurden dann in dieser Reihenfolge aufeinanderfolgend aus den wäßrigen Lösungen auf die Luft-Barriereschicht aufgetragen und getrocknet, wobei die jeweiligen, unten angegebenen Bedeckungsgewichte erhalten wurden.

Bedeckungsgewichte (pro Quadratmeter) der Reaktionsschicht

mit Alkali behandelte Gelatine 11,7 g
Natriumtetraborat 1,7 g
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 300 mg
Creatinin-Iminohydrolase (EC3.5.4.21) (Natriumhydroxid wurde zur Einstellung des pH-Wertes der Beschichtungslösung auf 9,5 zugegeben. Im folgenden wurde der pH-Wert auf gleiche Weise eingestellt.) 750 E

Bedeckungsagwichte (pro Quadratmeter) für die Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion

Dicke der trockenen Schicht 7,5 um
mit Alkali behandelte Gelatine 8,3 g
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 200 mg
Natriumtetraborat (pH-Wert der Beschichtungsflüssigkeit: 9,0) 750 mg

Bedeckungsgewichte (pro Quadratmeter) der Auffangschicht für endogenes Ammoniak

mit Alkali behandelte Gelatine 7,5 g
Natriumtetraborat 1,35 g
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 170 mg
α-Ketoglutarsäure 2,5 g
NADPH 1,6 g
GLDH (EC.1.4.1.4) (pH-Wert der Beschichtungsflüssigkeit: 8,0) 70.000 E
Die Auffangschicht für endogenes Ammoniak wurde einheitlich unter Verwendung einer 0,1%igen wäßrigen p-Nonylphenoxypolyglycidol-Lösung gequollen, und dann wurde ein gestricktes bzw. gewirktes Trikot-Tuch (etwa 240 um dick, unter Verwendung von Polyethylenterephthalat-Spinngarn, Gauge Nr. 40, nach einer 25%-Gewichtsreduktions-Behandlung in NaOH), das einer Glühentladung unterworfen worden war, befestigt und zwischen Druckwalzen geleitet, wobei ein einheitliches Laminat erhalten wurde.
Ein integrales mehrschichtiges Analyseelement für die quantitative Analyse von Creatinin wurde vervollständigt durch Eintauch-Beschichtung in die folgende Lösung, wobei die im folgenden angegebenen Beschichtungsgewichte erhalten wurden. Es wurde dann getrocknet, um die Ausspreitungseigenschaften dieses laminierten Elements zu verbessern.
Methylcellulose (2%ige wäßrige Lösung mit einer Viskosität von 50 mPa s bei 20ºC) 800 mg
Hydroxypropylcellulose (welche 28-30% Methoxygruppen, 7-12% Hydroxypropoxygruppen enthielt, 2%ige wäßrige Lösung mit einer Viskosität von 50 mPa s bei 20ºC) 800 mg
Feine Titandioxid-Körnchen (Rutil-Typ, Korngröße 0,25-0,40 um) 10,7 g
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend durchschnittlich 40 Ethoxyeinheiten) 2,0 g
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 220 mg

Beispiel 2

Ein integrales mehrschichtiges Analyseelement für die quantitative Analyse von Creatinin wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, ausgenommen, daß die Beschichtungsgewichte der Komponenten in der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion, wie im folgenden angegeben, geändert wurden.

Beschichtungsgewichte (pro Quadratmeter) der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion

Dicke der trockenen Schicht 15 um
mit Alkali behandelte Gelatine 16,6 g
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 400 mg
Natriumtetraborat (pH-Wert der Beschichtungsflüssigkeit: 9,0) 1500 mg

Beispiel 3

Ein integrales mehrschichtiges Analyseelement für die quantitative Analyse von Creatinin wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, ausgenommen, daß die Beschichtungsgewichte der Komponenten in der Auffangschicht für endogenes Ammoniak, wie im folgendem angegeben, geändert wurden.

Beschichtungsgewichte (pro Quadratmeter) der Auffangschicht für endogenes Ammoniak

mit Alkali behandelte Gelatine 7,5 g
Natriumtetraborat 1,35 g
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 170 mg
Natrium-α-ketoglutarat 2,5 g
NADH 160 mg
Adenosindiphosphat (ADP) 560 mg
GLDH (EC.1.4.1.4.) (pH-Wert der Beschichtungsflüssigkeit: 8,0) 10500 E

Vergleichsbeispiel 1

Ein integrales mehrschichtiges Analyseelement für die quantitative Analyse von Creatinin wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschreiben, hergestellt, ausgenommen, daß die Auffangschicht für endogenes Ammoniak direkt auf der Ammoniak- Diffusion vorgesehen wurde.

Vergleichsbeispiel 2

Ein integrales mehrschichtiges Analyseelement für die quantitative Analyse von Creatinin wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 3 beschreiben, hergestellt, ausgenomen, daß die Auffangschicht für endogenes Ammoniak direkt auf der Reaktionsschicht ohne eie Schicht zur Verhinderung der Ammoniak- Diffusion vorgesehen wurde.
Die fünf integralen mehrschichtigen Analyseelemente für die quantitative Analyse von Creatinin, wie oben beschrieben, wurden unter Verwendung des im folgenden beschriebenen Verfahrens bewertet. Testlösungen für die Bewertung wurden hergestellt, indem Creatinin-Kristalle in einer 7%igen wäßrigen Lösung aus Human-Serumalbumin gelöst wurden, so daß Endkonzentrationen von 1, 2, 4, 8 und 16 mg/dl erhalten wurden.
10 ul der Lösung für den Bewertungstest wurden auf die Ausspreitungsschicht von jedem Analyseelement aufgetragen, und die optische Dichte der Farbe wurde mittels reflektiertem Licht unter Verwendung von sichtbarem Licht einer mittleren Wellenlänge von 600 nm nach 6 Minuten gemessen. Die numerischen Werte, die in den Tabellen 1 und 2 angegeben sind, sind die Werte, die als Differenz zwischen der optischen Dichte der Farbe, wenn jede Bewertungs-Testlösung auf das Element aufgetropft wurde, und der optischen Dichte der Farbe, die erhalten wurde, wenn die gleiche Albumin-Lösung, die kein Creatinin enthielt, auf das Element getropft wurde, erhalten wurden.
Die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn NADPH als Co-Enzym in der Auffangschicht für endogenes Ammoniak verwendet wird, sind in Tabelle 1 angegeben. Es ist klar, daß die integralen mehrschichtigen Analyseelemente für die Analyse von Creatinin, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden, höhere optische Dichten für die Farbe ergeben als Vergleichsbeispiel 1, welches keine Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion aufweist. Die zusammengelegten mehrschichtigen Analyseelemente der Beispiele 1 und 2 und von Vergleichsbeispiel 1 sind so, daß endogenes Ammoniak keine Wirkung auf die optische Farbdichte besitzt, wenn es in Konzentrationen bis zu etwa 600 ug/dl vorhanden ist. Tabelle 1 Mehrschichtiges Analyseelement Creatininkonzentration (mg/dl) Beispiel Vergleichsbeispiel Dicke der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion keine
(Die numerischen Werte in der Tabelle sind optische Dichten der Farbe.)
Die Ergebnisse, die unter Verwendung von NADH als Co-Enzym in der Auffangschicht für endogenes Ammoniak erhalten wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt, und es ist offensichtlich, daß das integrale mehrschichtige Analyseelement für die Analyse von Creatinin von Beispiel 3 eine höhere optische Dichte für die Farbe als Vergleichsbeispiel 2 ergibt, welches keine Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion aufweist.
Die integralen mehrschichtigen Analyseelemente für die Creatinin-Analyse von Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 2 sind so, daß die optische Dichte der Farbe durch die Anwesenheit von endogenem Ammoniak in Konzentrationen bis zu 200 ug/dl nicht beeinflußt wird. Tabelle 2 Mehrschichtiges Analyseelement Creatininkonzentration (mg/dl) Beispiel Vergleichsbeispiel Dicke der Schicht zur Verhinderung der Ammoniak-Diffusion keine

Beispiel 4

Ein integrales mehrschichtiges Analyseelement für die quantitative Analyse von Creatinin mit einer Indikatorschicht, einer Luft-Barriereschicht, einer Reaktionsschicht, einer Zwischenschicht, einer Auffangschicht für endogenes Ammoniak und einer Ausspreitungsschicht, welche gewirktes bzw. gestricktes Textilmaterial auf einem farblosen transparenten PET-Filmträger, in dieser Reihenfolge, enthielt, wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.

Bedeckungsgewichte (pro Quadratmeter) der Reaktionsschicht

mit Alkali behandelte Gelatine 10,0 g
Natriumtetraborat 2,5 g
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 230 mg
Creatinin-Iminohydrolase (Einstellung des pH-Wertes der Beschichtungsflüssigkeit unter Verwendung von NaOH auf 9,5) 1125 E

Bedeckungsgewichte (pro Quadratmeter) der Ausspreitungsschicht

Methylcellulose (2%ige wäßrige Lösung mit einer Viskosität von 50 mPa s bei 20ºC) 1100 mg
Hydroxypropylcellulose (welche 28-30% Methoxygruppen, 7-12% Hydroxypropoxygruppen enthielt, 2%ige wäßrige Lösung mit einer Viskosität von 50 mPa s bei 20ºC) 1100 mg
Feine Titandioxid-Körnchen (Rutil-Typ, Korngröße: 0,25-0,4 um) 14,9 g
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend durchschnittlich 40 Ethoxyeinheiten) 2670 mg
p-Nonylphenoxypolyglycidol (durchschnittliche Länge: 10 Glycidoleinheiten) 590 mg
Eine quantitative Analyse von Creatinin erfolgte unter Verwendung des integralen mehrschichtigen Analyseelements auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, und es wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.

Claims

1. Mehrschichtiges Analyseelement, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Auffangschicht für endogenes Ammoniak, eine Ammoniak-erzeugende Schicht, welche ein Reagens, das mit einer Ammoniak-erzeugenden Substanz unter Bildung von gasförmigem Ammoniak reagieren kann, umfaßt, und mindestens eine Schicht, welche Alkalien oder alkalische Puffer enthält, welche unfähig ist, Ammoniak aufzufangen, welche unfähig ist, Ammoniak zu bilden, welche fähig ist, die Diffusion von gasförmigem Ammoniak zu verhindern und welche zwischen der Auffangschicht für endogenes Ammoniak und der Ammoniak-erzeugenden Schicht angeordnet ist und die einen pH- Wert zwischen 7,0 und 11,0 besitzt, umfaßt.

2. Mehrschichtiges Analyseelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht, welche die Diffusion von Ammoniak verhindern kann, mindestens 5 um dick ist.

3. Mehrschichtiges Analyseelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen optisch transparenten und wasserimpermeablen Träger umfaßt, der darauf in der folgenden Reihenfolge nach außen von dem Träger aus:

(1) eine Ammoniak-Indikatorschicht, die einen Indikator umfaßt, der eine nachweisbare Änderung, die durch gasförmiges Ammoniak erzeugt wird, zeigt;

(2) eine Barriereschicht für die Permeation einer Flüssigkeit, die gegenüber gasförmigem Ammoniak permeabel ist;

(3) die genannte Ammoniak-erzeugende Schicht;

(4) die genannte Schicht, welche Alkalien oder alkalische Puffer enthält und die die Diffusion von gasförmigem Ammoniak verhindern kann;

(5) die genannte Auf fangschicht für endogenes Ammoniak; und

(6) eine poröse Ausspreitungsschicht

umfaßt.

4. Mehrschichtiges Analyseelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen optisch transparenten und wasserimpermeablen Träger umfaßt, der darauf in der folgenden Reihenfolge nach außen von dem Träger aus:

(3) die genannte Ammoniak-erzeugende Schicht;

(4) die genannte Schicht, welche Alkalien oder alkalische Puffer enthält und die die Diffusion von Ammoniak verhindern kann;

(5) die genannte Auffangschicht für endogenes Ammoniak, wobei die Auffangschicht für endogenes Ammoniak ebenfalls eine poröse Ausspreitungsschicht ist,

umfaßt.

5. Merhschichtiges Analyseelement nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Barriereschicht für die Permeation einer Flüssigkeit eine poröse Luft-Barriereschicht oder eine Polymer-Barriereschicht ist.

6. Mehrschichtiges Analyseelement nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht, welche die Diffusion von Ammoniak verhindern kann, von 4,0 g/m² bis 40 g/m² eines im wesentlichen nichtporösen polymeren Bindemittels umfaßt, wobei die Schicht eine Dicke von 5 bis 50 um besitzt.

7. Merhschichtiges Analyseelement nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht, die die Diffusion von Ammoniak verhindern kann, von 5,5 g/m² bis 25 g/m² eines hydrophilen polymeren Bindemittels, welches ausgewählt wird aus Gelatine und einem Gelatinederivat, enthält, wobei die Schicht einen pH von 8,0 bis 10,0 und eine Dicke von 7 bis 30 um besitzt.