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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein
an ein Tier verabreichtes Arzneimittel im Körper
absorbiert und im Blut verteilt wird oder nicht.
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Arzneimittel werden oral, intravenös, intraperitoneal,
rektal, intramuskulär, subkutan oder durch Inhalieren in
Form von entsprechenden Zubereitungen, oder durch
perkutane Absorption in Form von äußeren Zubereitungen
verabreicht und die geeignete Methode der Verabreichung
wird von Fall zu Fall in Abhängigkeit von der Art des
Arzneimittels und von der Art der zu behandelnden
Krankheit gewählt.
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Bei allen diesen Verabreichungsmethoden ist es wichtig,
sich über das tatsächliche Verhalten des verabreichten
Arzneimittels im Körper klar zu werden, wie der
Absorption, der Verteilung, den Metabolismus und dem
Ausscheiden, um dessen Wirksamkeit zu bestimmen.
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Die Verteilung eines an einen tierischen Körper
verabreichten Arzneimittels wird derzeit durch eine
Analyse des im Blut oder im Gewebe enthaltenen
Arzneimittels durch physikochemische Methoden, wie MPLC,
oder unter Verwendung eines mit einem Radioisotop
markierten Arzneimittels gemessen.
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Jedoch sind bei einigen Arzneimitteln, enthaltend
Substanzen, die nach einer bestimmten Methode aus einer
Pflanze oder einem Lebewesen, das in einer speziellen
Weise vorher behandelt wurde, extrahiert wurden (wie
biochemische, natürliche Arzneimittel und rohe
Arzneimittel-Zubereitungen) häufig eine Vielzahl von
aktiven Komponenten enthalten, und daher zeigen sie eine
Arzneimittelwirkung als ein Ergebnis von synthetischen
Wirkungen dieser Komponenten. Versucht man, das
tatsächliche Verhalten eines solchen Arzneimittels im
lebenden Körper zu untersuchen, z. B. durch orale
Verabreichung nach einer üblichen analytischen Methode, so
muß das Verhalten jeder dieser Komponenten,
einschließlich unbekannter oder Spurensubstanzen,
bestimmt werden. Dies kann man mit den derzeit verfügbaren
Techniken kaum bewerkstelligen und es besteht deshalb ein
Bedarf für eine neue Methode, mittels der man leicht und
genau das Verhalten solcher Arzneimittel bestimmen kann.
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur
Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe man bestimmen kann,
ob ein Arzneimittel, das einem Tier mittels einer Methode,
die keine intravenöse Injektion ist, verabreicht wurde,
absorbiert wird mittels des Verdauungstraktes, der
Blutgefäße, der Haut, der Schleimhäute und dadurch in das
Blut gelangt.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Methode
zur Verfügung zu stellen, mittels der man bestimmen kann,
ob oder ob nicht die aktiven Bestandteile eines
Arzneimittels, welche eine Vielzahl von unbekannten oder
Spurenkomponenten enthalten (wie biologische, natürliche
Arzneimittel und rohe Arzneimittel-Zubereitungen) in das
Blut eingebracht werden und wirksam gegen die zu
behandelnde Krankheit sind, wenn man es mittels einer
Methode, die keine intravenöse Injektion ist, verabreicht.
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Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Bestimmen
des Verhaltens von Arzneimitteln in lebenden Körpern,
umfassend das Verabreichen des zu prüfenden Arzneimittels
an ein Tier mittels einer Methode, die keine intravenöse
Injektion ist, Deproteinisieren des von dem Tier
erhaltenen Plasmas und intravenöse Verabreichung des so
erhaltenen deproteinisierten Plasmas an ein
unterschiedliches Versuchstier und Untersuchen der in dem
Versuchstier durch das Arzneimittel verursachten Wirkung.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gibt es keine
spezielle Begrenzung hinsichtlich der Art des Tieres, dem
das zu prüfende Arzneimittel verabreicht wird. Alle Arten
von Tieren, wie sie üblicherweise für pharmazeutische
Untersuchungen verwendet werden, können für den Zweck der
Erfindung verwendet werden, einschließlich Mäuse, Ratten,
Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen, Hunde, Katzen, Affen,
Ziegen, Schafe, Schweine und Pferde. Die Verwendung von
ziemlich kleinen Tieren ist jedoch vorteilhaft zur
Durchführung der Versuche, und zwar sowohl hinsichtlich
der Kosten als auch hinsichtlich der Menge des zu
verwendenden Arzneimittels und der Einfachheit bei der
Handhabung des Tiers. Infolgedessen sind kleine Tiere, wie
Ratten, Mäuse, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen, Hunde,
Katzen und Affen bei der Anwendung bevorzugt.
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Das Plasma, hergestellt aus einer Blutprobe, die man
erhalten hat aus einem mit einem Arzneimittel behandelten
Tier, wird nach irgendeiner der üblicherweise angewendeten
Methoden deproteinisiert. Diese schließen das Behandeln
mit einem Proteindenaturisierungsmittel ein, wie
organische Lösungsmittel (z. B. Ethanol und Aceton) und
Säuren, Erhitzen, isoelektrische Ausfällung und Aussalzen.
Die abgetrennten Proteine werden dann durch Filtrieren
entfernt (durch Filterpapier, Glasfilter oder Celit) und
durch Ultrafiltration, Chromatografie oder Zentrifugieren.
Das so erhaltene deproteinisierte Plasma kann dem
Versuchstier ohne weitere Behandlung zur Beobachtung der
Wirkung des Arzneimittels intravenös verabreicht werden.
Alternativ kann man es vor der intravenösen Verabreichung
von den Additiven, wie Ethanol, befreien, oder man kann es
unter vermindertem Druck zur Entfernung des Lösungsmittels
konzentrieren und anschließend mit einem geeigneten
Lösungsmittel, wie destilliertes Wasser, auf eine
geeignete Konzentration, welche die Verabreichung an ein
Versuchstier ermöglicht, verdünnen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die letzte
Bestimmung durchgeführt, indem man die Wirkung des
Arzneimittels bei dem Versuchstier, dem das
deproteinisierte Plasma intravenös verabreicht wurde,
feststellt. Diese Untersuchungsmethode variiert im
Hinblick auf die Art der pharmakologischen Wirkung des
untersuchten Arzneimittels und soll deshalb von Fall zu
Fall ausgewählt werden. Beispielsweise kann der Blutdruck
bei einem Versuchstier bei hypotensiven Mitteln gemessen
werden; übliche analgetische Tests, wie die Randall-
Selitto-Methode, werden bei Analgetika angewendet, und
pharmakologische Untersuchungen zur Bestimmung der
Unterdrückungswirkung von Reflexen oder dergleichen wendet
man an bei Arzneimitteln für die Behandlung von mentalen
oder Nervenerkrankungen.
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Die folgenden Beispiele beschreiben weiterhin die
Erfindung, ohne diese zu beschränken.
(1) Test-Arzneimittel
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Extrakt, das von der entzündeten Haut von Kaninchen
isoliert wurde, wurde mit Vacciniavirus (nachfolgend
abgekürzt als "VV", siehe japanische
Patentveröffentlichung Nr. 4206 (1950)) inokuliert und
Aminopyrin und Diazepam wurden als Test-Arzneimittel
verwendet. Jedes davon wurde in Form einer wäßrigen
Lösung von 0,5% CMC-Na für orale Verabreichung angewendet
und als eine Lösung in physiologischer Kochsalzlösung für
die intravenöse Verabreichung.
(2) Herstellung des Plasmaextrakts
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Ein zu untersuchendes Arzneimittel wurde einer Gruppe von
60 bis 120 Mäusen oral verabreicht und eine Blutprobe
wurde in Gegenwart von Heparin aus der abdominalen Aorta
aller Mäuse unter Etherisierung nach bestimmten
Zeitabständen genommen, und das Plasma wurde vom Blut
getrennt. Bei dieser Verfahrensweise wurden Plasmaproben,
die rot waren (die bei visueller Beobachtung eine Hämolyse
anzeigten) nicht für den Versuch verwendet. Alle
Plasmaproben wurden mit der 4-fachen Volumenmenge Ethanol
vermischt, die Mischung wurde 1 Stunde stehen gelassen und
die ausgefallenen Proteine wurden durch Zentrifugieren
(4000 U/min·30 Minuten bei 4ºC) entfernt. Das so
erhaltene deproteinisierte Plasma wurde von dem
Lösungsmittel durch Behandeln bei 40ºC unter vermindertem
Druck befreit, destilliertes Wasser wurde zur Herstellung
eines Plasmaextrakts, das die 5-fache Konzentration des
Ursprungsplasmas hatte, zugegeben, und dieses Extrakt
wurde intravenös an Mäuse in den Schwanz in einer Menge
von 10 ml/kg zur Untersuchung der pharmakologischen
Wirkung verabreicht.
TESTBEISPIEL 1 - Analgetischer Test
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Normale Mäuse und SART (Specific Alternation of Rhythm in
Temperature)-gestreßte Mäuse wurden für diese
Untersuchung verwendet. SART-gestreßte Mäuse wurden nach
der Methode von Kita et al (Folia pharmacol. japon., 71,
195-210 (1975)) vorbereitet. Die Mäuse wurden in einen
thermostatischen Käfig bei einer Umgebungstemperatur von
4ºC und von 24ºC, wobei sich die Temperaturen stündlich
änderten, von 10 Uhr morgens bis 5 Uhr nachmittags und bei
4ºC von 5 Uhr nachmittags bis 10 Uhr morgens am nächsten
Tag gehalten. Diese Stressbelastung wurde für 5 Tage vor
dem Test durchgeführt.
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Die Schmerzgrenze wurde bei jeder Maus vor und nach der
Verabreichung eines Test-Arzneimittels oder Plasmaextrakts
unter Verwendung der nachfolgend beschriebenen,
modifizierten Randall-Selitto-Methode
(Schwanzpressmethode) gemessen.
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Ein Druckpunkt bei der Randall-Selitto-Vorrichtung wurde
ausgetauscht gegen eine Plastikplatte (1,5 mm dick und
2,0 cm breit) und ein mechanischer Druck wurde etwa 1,5 cm
kausal vom Schwanzansatz der Ratte mit 16 g/sek ausgeübt.
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Die Druckintensität, die eine Flucht- oder Schreireaktion
verursachte, wurde als Schmerzgrenze bezeichnet. Der
analgetische Index wurde dann gemäß der nachfolgenden
Gleichung berechnet und Mäuse mit einem analgetischen
Index von 1,5 oder mehr wurden positiv hinsichtlich des
therapeutischen Effekts bewertet.
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Analgetischer Index = Druckgewicht (g) nach der Verabreichung/Durchschnittliches Druckgewicht (g) vor
der Verabreichung (n = 2)
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Die erhaltenen Ergebnisse werden nachfolgend beschrieben.
EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE
(1) Zeitablauf der analgetischen Wirkung
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VV und Aminopyrin wurden jeweils oral oder intravenös
SART-gestressten Mäusen verabreicht und die Schmerzgrenze
wurde im Verlauf der Zeit gemessen. Es wurde gezeigt, daß
das Peak der VV-Wirkung 60 Minuten nach der oralen
Verabreichung und 20 Minuten nach der intravenösen
Verabreichung festgestellt wurde. Andererseits stellte man
bei Aminopyrin ein Wirkungspeak 30 Minuten nach der oralen
Verabreichung und 10 bis 20 Minuten nach der intravenösen
Verabreichung fest.
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Die analgetische Wirkung von Plasmaextrakt, erhalten von
normalen Mäusen, wurde dann bei SART-gestreßten Mäusen
untersucht.
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VV (800 mg/kg) und Aminopyrin (120 mg/kg) wurden jeweils
oral normalen Mäusen verabreicht und Blutproben wurden
nach 15, 30, 60, 120 und 180 Minuten genommen und das
Plasmaextrakt wurde in gleicher Weise wie vorher angegeben
hergestellt. Jedes der so hergestellten Extrakte wurde
intravenös SART-gestreßten Mäusen verabreicht und die
analgetische Wirkung wurde nach 20 Minuten gemessen,
welches die Peak-Aktionszeit ist, wenn man die
Arzneimittel direkt intravenös verabreicht. Es wurde
festgestellt, daß die analgetische Wirkung 60 Minuten
nach der Verabreichung von VV und 30 Minuten nach der von
Aminopyrin auftrat, genauso als wenn VV oder Aminopyrin
direkt oral verabreicht wurden.
(2) Analgetische Wirkung von Plasmaextrakt
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Plasmaextrakt wurde aus Blutproben, die 60 Minuten nach
einer oralen Verabreichung von VV und 30 Minuten nach
einer oralen Verabreichung von Aminopyrin genommen worden
waren, hergestellt und jeweils intravenös den SART-
gestressten Mäusen in einer Menge von 10 ml/kg
verabreicht. Die analgetische Wirkung wurde nach 20
Minuten gemessen und die Ergebnisse werden in der
nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1
Extrakt, erhalten von normalen Mäusen Aminopyrin Extrakt, erhalten von SART-gestreßten Mäusen Aminopyrin
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¹): Anzahl der Mäuse mit einem analgetischen Index von 1,5 oder
mehr/Gesamtzahl der getesteten Mäuse
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*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001: Signifikant verschieden
von den jeweiligen Kontrollwerten; Werte sind das Mittel ±S.E.
TESTBEISPIEL 2 - Wirkung der Verlängerung der Schlafzeit,
verursacht durch Thiopental
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Testarzneimittel und Plasmaextrakt wurden jeweils
intravenös normalen Mäusen verabreicht, Thiopental
(40 mg/kg) wurde dann intravenös nach einer bestimmten
Zeit verabreicht, und die Schlafzeit wurde gemessen, wobei
man den Verlust des "Righting"-Reflexes als Index nahm,
und die Rate der Schlafzeitverlängerung (%) wurde gemäß
der nachfolgenden Gleichung berechnet:
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Schlafverlängerungsrate (%) A/B·100-100
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wobei bedeuten
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A: Schlafzeit der Testgruppe
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B: Schlafzeit der Kontrollgruppe
(1) Zeitablauf der durch Thiopental verursachten,
schlafverlängernden Wirkung
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VV und Diazepam wurden jeweils oral normalen Mäusen
verabreicht und die Wirkung, die Schlafzeit, die durch
Thiopental verursacht wurde, zu verlängern (40 g/kg;
intravenöse Verabreichung) wurde nach bestimmten
Zeitabläufen untersucht.
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Es wurde gezeigt, daß das Peak der
Schlafzeitverlängerungswirkung 60 Minuten nach der
Verabreichung von sowohl VV als auch von Diazepam erreicht
wurde.
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Aufbauend auf dieser Tatsache wurde die Abhängigkeit der
Schlafzeitverlängerungswirkung von der Dosis des
Arzneimittels untersucht, indem man intravenös Thiopental
60 Minuten nach einer oralen Verabreichung von VV und
Diazepam und unmittelbar nach der intravenösen
Verabreichung von VV verabreichte. Die Wirkung von
Plasmaextrakt, das von normalen Mäusen erhalten wurde, die
Schlafzeit, die durch Thiopental verursacht wurde, zu
verlängern, wurde dann untersucht.
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VV (800 mg/kg) und Diazepam (0,8 mg/kg) wurden jeweils
oral normalen Mäusen verabreicht und Blutproben wurden
nach 15, 30, 60, 120 und 180 Minuten genommen und das
Plasmaextrakt wurde in gleicher Weise wie vorher
hergestellt. Jedes der so hergestellten Extrakte wurde
intravenös normalen Mäusen zur Untersuchung der
Schlafzeitverlängerungswirkung verabreicht.
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Es wurde gefunden, daß die wirksamste Wirkung 30 bis 60
Minuten nach der Verabreichung von Diazepam erzielt wurde,
genauso als wenn VV oder Diazepam direkt oral verabreicht
wurden.
(2) Schlafzetiverlängerungswirkung des
Plasmaextrakts
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Plasmaextrakt wurde aus Blutproben hergestellt, die 60
Minuten nach der oralen Verabreichung von VV oder Diazepam
erhalten wurden, und jede wurde intravenös normalen Mäusen
in einer Menge von 10 ml/kg verabreicht. Die erzielte
Schlafzeitverlängerungswirkung wird in der nachfolgenden
Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Plasmaextrakt Schlafzeit Verlängerungsrate Extrakt, erhalten von normalen Mäusen Diazepam
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*p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001: signifikant verschieden
von den jeweiligen Kontrollwerten; Werte sind das Mittel ±S.E.
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Aus den Ergebnissen der vorher angegebenen Analgesie-Tests
und Tests für die Schlafzeitverlängerung (Testbeispiele 1
und 2) geht hervor, daß, wenn alle Arzneimittel geprüft
wurden (VV, Aminopyrin und Diazepam) das deproteinisierte
Plasmaextrakt, das erhalten wurde von einem Tier, an
welches ein Arzneimittel oral verabreicht wurde, die
pharmakologische Wirkung des Arzneimittels zeigt
(Analgesie oder Schlafzeitverlängerungswirkung), wenn man
es intravenös einem Testtier verabreicht. Dies zeigt
deutlich, daß das oral verabreichte Arzneimittel im
Eingeweidetrakt absorbiert und in das Blut übernommen
wurde.
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Darüber hinaus haben Untersuchungen über die Peak-
Aktionszeit (die Zeit nach der oralen Verabreichung, bei
welcher die Plasmaextrakte die kräftigste Wirkung zeigen)
enthüllt, daß diese mit der Peak-Aktionszeit, die man
erhält, wenn man das Arzneimittel direkt oral verabreicht,
übereinstimmt. Diese Übereinstimmung zwischen den beiden
Peak-Aktionszeiten beweist auch, daß das Arzneimittel
durch den Eingeweidetrakt absorbiert und in das Blut
übergegangen ist und dadurch seine Wirkung zeigt.
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Weiterhin zeigt die dosisabhängige Wirkung des
Plasmaextrakts, wie sie in den Beispielen gezeigt wird,
die Möglichkeit, die Menge abzuschätzen, in welcher die
aktiven Bestandteile in das Blut übergegangen sind.
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Die Tatsache, daß VV, welches eine biologische
Zubereitung ist, das eine Vielzahl von aktiven Komponenten
enthält, nachweislich im Blut absorbiert wird, zeigt, daß
das erfindungsgemäße Verfahren sehr wirksam ist, die
Absorptionsverteilung von Arzneimitteln, wie biologischen
Arzneimitteln, natürlichen Arzneimitteln und rohen
Arzneimittel-Zubereitungen, die eine große Anzahl von
aktiven Bestandteilen besitzen und deshalb mittels
üblicher analytischer Methoden nicht bestimmt werden
können, zu bestimmen.