DE3842174A1 - Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, und mikroorganismen, die dieses gen exprimieren - Google Patents
Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, und mikroorganismen, die dieses gen exprimierenInfo
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Description
Gen und Genstruktur, codierend für eine Aminotransferase,
und Mikroorganismen, die dieses Gen exprimieren.
In der deutschen Patentanmeldung P 38 18 851.1
(HOE 88/F 140) wurde bereits eine neue Aminotransferase
(Transaminase) vorgeschlagen, die aus E. coli DH-1 isoliert
wurde.
Es wurde nun das Gen gefunden, das für diese neue
Transaminase codiert. Die Erfindung bezieht sich somit auf
dieses Gen, Genstrukturen und Plasmide, die dieses Gen
enthalten, sowie transformierte Mikroorganismen, die dieses
Gen exprimieren können. Weitere Aspekte der Erfindung und
ihre bevorzugten Ausgestaltungen ergeben sich aus der
folgenden Beschreibung und aus den Patentansprüchen.
Die Erfindung erlaubt es, das Enzym in größeren Mengen als
nach dem früheren Vorschlag herzustellen, aber auch die
spezifischen Transaminierungsreaktionen mit einem
erfindungsgemäß transformierten Mikroorganismus
durchzuführen. Die Isolierung und Charakterisierung des Gens
erlaubt somit sehr viel effektivere Transaminierungen, als
sie mit dem isolierten Enzym entsprechend dem früheren
Vorschlag möglich sind.
In der deutschen Patentanmeldung P 38 18 581.1 ist das neue
Enzym u. a. durch die Aminosäuresequenz des N-Terminus
charakterisiert. Die ersten 30 dieser Aminosäuren sind im
folgenden wiedergegeben:
Im Bereich der Aminosäuren 4 bis 10 findet sich Methionin,
für das nur ein Triplett codiert, sowie vier Aminosäuren,
die nur durch zwei Tripletts codiert werden. Lediglich
Leucin ist im genetischen Code sechsfach "degeneriert".
Diese Sequenz eignet sich somit besonders gut zur
Konstruktion einer Sonde aus 20 Nucleotiden (20 mer):
Diese Sonde wurde in an sich bekannter Weise nach dem
Phosphoamidit-Verfahren synthetisiert. Weiterhin wurde ein
38 mer des nicht-codierenden Stranges für die
Aminosäuren 15 bis 27 synthetisiert.
Auch dieses Oligonucleotid wurde nach der Phosphoamidit-Methode
synthetisiert.
Diese Sonden wurden zum "Screening" einer Cosmid-Genbank
von E. coli-DH 1 eingesetzt. Hybridisierungspositive Klone
wurden zunächst auf erhöhte L-PPT-Transaminase-Aktivität
getestet und dann durch Restriktionskartierung näher
charakterisiert. Durch Subklonierung und Aktivitätstests von
Teilfragmenten gelang es, die Lages des Gens im Genom einzugrenzen
und anschließend durch Exonuclease-Abbau noch weiter
zu definieren. Durch Klonierung von Restriktionsfragmenten
in geeignete Vektoren konnte die Transaminase-Aktivität
gegenüber dem Ausgangsstamm um das etwa Fünfzigfache erhöht
werden.
Die Ausbeute an Enzym bzw. Enzymaktivität läßt sich durch
die Wahl geeigneter Anzuchtbedingungen noch erhöhen. So hat
beispielsweise der Glucosegehalt im Medium einen
wesentlichen Einfluß: Während bei Konzentrationen bis zu
0,05% die Aktivität deutlich steigt, ergibt sich bei
höheren Konzentrationen ein drastischer Abfall. Auch bei
Kontrollstämmen, die nur die bakterienchromosomale Kopie
des Transaminase-Gens exprimieren, ist diese Abhängigkeit
nachweisbar.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher
erläutert. Prozentangaben beziehen sich hierbei auf das
Gewicht.
Chromosomale DNA aus E. coli-DH 1 wurde gemäß der in Ausubel
et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology:
5.3.2.-5.4.3., 5.7.1.-5.7.3. beschriebenen Methode isoliert,
partiell mit Sau3A gespalten und im Agarose-Gel
größenfraktioniert. DNA-Fragmente in der Größe von etwa
25-40 kb wurden in den mit BamHI geschnittenen Cosmid-Vektor
pTBE [Grosveld, F. G. et al. (1982), Nucleis Acids Research
10: 6715] ligiert und in lambda-Phagen verpackt [Amersham:
in vitro packaging system for Lambda DNA, Code Nr. 334Z,
bzw. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor: 296-299]. Nach Transfektion des
Rezipientenstammes E. coli-DH 1 wurden 2000 Einzelklone
isoliert, was mehreren Genomäquivalenten von E. coli
entspricht. Zum Auffinden des gesuchten Gens in der
angelegten Cosmid-Genbank wurden zwei zu Bereichen der N-terminalen
Aminosäureresequenz des L-PPT-Transaminase-Proteins
korrespondierende Oligonucleotide synthetisiert (20 mer und
38 mer, siehe Text).
Anschließend wurden die aus den Einzelklonen isolierten
Cosmide (entsprechend Maniatis et al.: 331) mit Hilfe einer
BRL "Dot-Blot"-Absaugapparatur an Nitrozellulosefilter
(Schleicher und Schüll BA85) gebunden und mit den
³²p-endmarkierten Oligonucleotiden hybridisiert (Ausubel et al.:
6.4.1.-6.4.4.). Von 4 hybridisierungspositiven Klonen
zeigten 2 im L-PPT-Transaminase-Enzymtest (siehe unten,
Beispiel 2) eine 3- bis 5fach erhöhte Aktivität. Beide
Klone enthielten eine identische 15 kb SalI-Insertion, deren
Restriktionskarte in Fig. 1 dargestellt ist.
Von diesem DNA-Abschnitt wurden ein 5,6 kb HindIII/SalI- und
ein 3,8 kb BamHI/SalI-Fragment, die beide mit den 5′-spezifischen
Oligonucleotiden der L-PPT-Transaminase
hybridisieren, in beiden Orientierungen hinter den E. coli-lac-Promoter
in die Vektoren pUC12 und pMLC12/13 kloniert
[Perbal, B. (1984), A Practical Guide to Molecular Cloning:
259-272] und die rekombinanten Plasmide anschließend auf
Transaminase-Aktivität getestet (Fig. 1). Während die
Enzymaktivitäten der Konstrukte (1) und (2) nur wenig über
dem Hintergrund lagen, zeigten (3) und (4) (pTRANS2 und
pTRANS3), die das gleiche DNA-Fragment in der
entgegengesetzten Orientierung zum lac-Promoter wie (1) und
(2) enthielten, eine etwa 50fach erhöhte L-PPT-Transaminase-Expression.
Daraus ließ sich die
Transkriptionsrichtung des Gens, wie in Fig. 1 dargestellt,
ermitteln.
Die Lage des Transaminase-Gens auf dem 3,8 kb BamHI/SalI-Fragment
wurde durch weitere Restriktionskartierung, sowie
durch Herstellen einer Reihe von ExoIII/S1-Deletionen
[Henikoff, S. (1984), Gene 28: 351-359] genauer festgelegt.
Bei letzterem Verfahren wurde das in pMLC12/13 klonierte 3,8 kb
Fragment jeweils von einem Ende her für verschieden lange
Zeiten enzymatisch abgedaut. Die verkürzten Insertionen
wurden anschließend auf Enzymaktivität getestet. Unter der
Voraussetzung, daß bei nicht mehr aktiven DNA-Fragmenten
Teile des Transaminase-Strukturgens deletiert waren, ließ
sich die Lage des Gens, wie in Fig. 1 unten gezeigt,
feststellen.
In Fig. 2 sind drei verschiedene rekombinante Plasmide
dargestellt, die das klonierte L-PPT-Transaminase-Gen aus
E. coli-DH 1 tragen und in den folgenden Beispielen
verwendet werden.
Das Plasmid pTRANS1 enthält das 15 kb SalI-Insert im Cosmid-Vektor
pTBE und exprimiert die Transaminase unter Kontrolle
des endogenen Promoters. Die beiden anderen Konstrukte sind
Expressionsplasmide mit dem C. coli-lac-Promoter: pTRANS2
enthält das 3,8 kb BamHI/SalI-Fragment in pMLC13, pTRANS3
das 5,6 kb HindIII/SalI-Fragment in pUC12.
E. coli-DH 1-Transformanten mit den rekombinierten Plasmiden
pTRANS1, pTRANS2 und pTRANS3 bzw. den Vektorplasmiden pTBE,
pMLC13 und pUC12 als Kontrolle wurden in 10 ml Kulturen in
LB-Medium [Luria-Bertani-Medium, Maniatis et al. (1982): 68]
mit 50 µg des entsprechenden Antibiotikums (Ampicillin bei
pTRANS1, pTRANS3, pTBE und pUC12 bzw. Chloramphenicol bei
pTRANS2 und pMLC13) für 15 h bei 37°C angezogen.
Anschließend wurden die Zellen für 5 min bei 5000×g
abzentrifugiert, 2mal in je 5 ml 10 mM NaCl, 10 mM
NaPhosphat, (pH=7,5) gewaschen und für den Transaminase-Aktivitätstest
in 1 ml "Reaktionsmix" (5 mM NaCl, 5 mM
NaPhosphat, 30 g/l (3-Carboxy-oxopropyl)-methylphosphinsäure,
90 g/l L-Glutaminsäure, 100 mM Tris/HCl,
pH=8,0) resuspendiert. Die Zellen wurden 1 h bei 37°C
unter Schütteln in dieser Lösung inkubiert und dann für 10 min
bei 95°C denaturiert. Die Reaktionsüberstände wurden im
Aminosäureanalysator (Biotronic Amino Acid Analyzer LC
5001, 3,2×130 mm BTC-2710 Säule) auf gebildetes L-PPT
analysiert.
Die mit den verschiedenen Konstrukten erzielten Raum-Zeit-Ausbeuten
sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Die weitaus
höchsten Enzymaktivitäten wurden mit den beiden
lac-Expressionsplasmiden erreicht, wobei das pUC12-Derivat
pTRANS3, vermutlich wegen der größeren Kopienzahl pro Zelle,
noch besser abschneidet als das pMLC13-Derivat pTRANS2. Mit
pTRANS3 wurden Raum-Zeit-Ausbeuten gemessen, die etwa
60fach über den Ergebnissen der mit pUC12-Vektorplasmid
transformierten Kontrollzellen lagen.
| L-PPT-Produktion in E. coli-DH 1 mit verschiedenen Transaminase-Expressionsplasmiden | |
| Plasmid | |
| Raum-Zeit-Ausbeute (mg L-PPT gebildet/l/h) | |
| pTBE | |
| 100 | |
| pMLC13 | 60 |
| pUC12 | 70 |
| pTRANS1 | 300 |
| pTRANS2 | 2400 |
| pTRANS3 | 4300 |
E. coli-DH 1-pTRANS3 und E. coli-DH 1-pUC12 wurden in 10 ml
LB-Medium ohne Glucose und mit steigenden
Glucose-Konzentrationen (0,01%, 0,05%, 0,1% und 0,5%)
wie in Beispiel 2 angezogen, aufgearbeitet und auf
L-PPT-Transaminase-Aktivität getestet. Das Ergebnis zeigt
die Tab. 2. Sowohl das lac-exprimierte Transaminase-Gen auf
dem Plasmid pTRANS3 als auch das chromosomale Gen aus dem
Kontrollstamm (mit pUC12) wurden durch
Glucosekonzentrationen <0,05% reprimiert. Die maximale
L-PPT-Syntheserate konnte mit 0,05% Glucose im Medium
erzielt werden.
E. coli-DH 1-pTRANS3 und E. coli-DH 1-pUC12 wurden wie in
Beispiel 3 angezogen. Die gewaschenen und in 1 ml 10 mM
NaCl, 10 mM NaPhosphat (pH=7,5) resuspendierten Zellen
wurden durch 5×20 sec Ultrabeschallung aufgeschlossen und
Aliquots gleicher Proteinmengen dieser Rohextrakte auf ein
12,5%iges SDS/Polyacrylamid-Gel aufgetragen [Laemmli, V. K.
(1970), Nature 227: 680].
Im Proteinmuster der Extrakte aus E. coli-DH 1-pTRANS3
erscheint das überexprimierte L-PPT-Transaminase-Protein als
zusätzliche Bande von 43 000 Dalton. Diese fehlt im
Expressionsstamm in der Probe mit 0,5% Glucose im
Anzuchtmedium sowie im Kontrollstamm E. coli-DH 1-pUC12 mit
0,05% Glucose.
Claims (6)
1. Gen für eine L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure
(L-PPT)-spezifische Transaminase, gelegen auf einem
3,8 kb BamHI/SalI-Fragment aus dem Genom von E. coli-DH 1.
2. Gen nach Anspruch 1, charakterisiert durch die
Restriktionskarte gemäß Fig. 1.
3. Plasmid, enthaltend ein Gen nach Anspruch 1 oder 2.
4. Mikroorganismus, enthaltend ein Plasmid nach Anspruch 3.
5. E. coli, enthaltend ein Plasmid nach Anspruch 3.
6. Verfahren zur stereoselektiven Produktion von L-PPT aus
(3-Carboxy-3-oxopropyl)-methylphosphinsäure durch
Transaminierung mit Mikroorganismen, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach Anspruch 4
oder 5 eingesetzt wird.
Priority Applications (17)
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|---|---|---|---|
| DE3842174A DE3842174A1 (de) | 1988-12-15 | 1988-12-15 | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, und mikroorganismen, die dieses gen exprimieren |
| DE3932015A DE3932015A1 (de) | 1988-12-15 | 1989-09-26 | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts |
| AT89122939T ATE95237T1 (de) | 1988-12-15 | 1989-12-12 | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, und mikroorganismen, die dieses gen exprimieren. |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| US9834802B2 (en) | 2016-03-02 | 2017-12-05 | Agrimetis, Llc | Methods for making L-glufosinate |
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1988
- 1988-12-15 DE DE3842174A patent/DE3842174A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-12-14 ZA ZA899557A patent/ZA899557B/xx unknown
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9834802B2 (en) | 2016-03-02 | 2017-12-05 | Agrimetis, Llc | Methods for making L-glufosinate |
| US10260078B2 (en) | 2016-03-02 | 2019-04-16 | Agrimetis, Llc | Methods for making L-glufosinate |
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Also Published As
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