DE3785614T2

DE3785614T2 - Antigenisches peptid der 28kd proteingruppe aus s. mansoni und sein verfahren zur isolierung, monoklonale antikoerper, die mindestens ein epitop dieses peptids erkennen und verwendungen fuer die induzierung der synthese von neutralisierenden antikoerpern.

Info

Publication number: DE3785614T2
Application number: DE8787401554T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marc Balloul; Andre Capron; Jean-Marie Grzych; Raymond Pierce
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1987-07-02
Publication date: 1993-08-12
Anticipated expiration: 2007-07-03
Also published as: ES2056834T3; EP0251933A1; JPS63258598A; DK340887A; FR2601037A1; ATE88639T1; PT85248A; PT85248B; FR2601037B1; DK340887D0; EP0251933B1; JPH08140694A; DE3785614D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid isoliert aus der Gruppe der Proteine mit 28 kD von S. mansoni, die ein oder mehrere Epitope tragen, und ein Verfahren zu ihrer Isolierung, sowie monoclonal Antikörper, die die so isolierten antigenen Peptidfraktionen erkennen können, und therapeutische Zusammensetzungen, die die Synthese von neutralisierenden Antikörpern induzieren können, wobei die Zusammensetzungen dieses Peptid allein oder zusammen mit anderen geeigneten Substanzen enthalten.
BALLOUL et Al. [MOLECULAR AND BIOCHEMICAL PARASITOLOGY, 17 (1985) Seiten 105-114] haben die in-vitro-Synthese eines Antigens, das aus einem Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 28 kD besteht, und einen isoelektrischen Punkt zwischen 6,3 und 6,8 besitzt und das aus einem in-vitro- Translationsprodukt von Gesamt-RNA von Schistosoma mansoni besteht, beschrieben.
Die Autoren verfolgten ihre Recherche mit dem Ziel, aus diesen Polypeptiden mit 28 kD das peptidische Epitop oder die peptidischen Epitope, die für die antigenen Eigenschaften verantwortlich sind, zu isolieren und zu identifizieren.
Es ist bekannt Peptide, die aus aus SDS-Gelen isolierten Proteinen bestehen, durch Teilabbau der Proteine mittels einer Protease in einem SDS-haltigen Puffer zu analysieren; man erhält stabile Teilabbauprodukte, die aus zahlreichen Peptiden bestehen, deren Molekulargewichte ausreichend hoch sind, daß es möglich ist, sie auf 15%igen SDS-Acrylamidgelen abzutrennen [CLEVELAND et Al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMTSTRY, 252, Seiten 1102-1106, (1977)].
Die Erfinder versuchten, aus der Gruppe der Proteine mit 28 kD von S. mansoni das Peptid oder die Peptide, das bzw. die die antigene Anti-Schistosomaaktivität trägt bzw. tragen, die das 28 kD-Protein zeigt, zu isolieren, und wandten zu diesem Ziel Techniken zur Isolierung von Peptidfragmenten durch Proteolyse, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, an.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung eines, mindestens ein Epitop tragenden Peptids durch Proteolyse, dadurch gekennzeichnet, daß man die Proteine der Gruppe der Antigene mit 28 kD von S. mansoni der Wirkung der Protease V8 in einem Tris-HCl-Puffer mit pH 6,8, der SDS enthält, unterwirft, man die proteolytische Reaktion durch Zugabe eines Gemisches aus 2-Mercaptoethanol und SDS stoppt, anschließend das Gemisch für kurze Zeit zum Sieden auf 100ºC bringt, um ein Peptid zu gewinnen, dessen antigene Aktivität man mit Hilfe von Antikörpern eines polyclonalen Serums oder von monoclonalen Antikörpern verifiziert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der enzymatische Abbau der Proteine mit 28 kD durch die Protease V8 während 30 Minuten bei 30ºC durchgeführt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enhält das Gemisch, das zum Stoppen der proteolytischen Reaktion verwendet wird, 2-Mercaptoethanol im Verhältnis von 1 ul auf 3 ul 10%iges SDS.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Tris-HCl-Puffer, in dem die Proteine der Gruppe der Antigene mit 28 kD gelöst sind, ein 100 mM bis 125 mM Puffer und enthält 0,08 bis 0,12% SDS.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Verifizierung der antigenen Aktivität der durch Proteolyse isolierten Peptide, die durch "Western Blotting" mit Hilfe eines polyclonalen Anti- 28 kD-Serums der Ratte, des Kaninchens oder eines Analogen davon durchgeführt wird, mit Hilfe von durch Peroxidase markierten Antikörpern gegen die Immunglobuline der Ratte, des Kaninchens, der Maus oder Analogen ein 6 kD-Peptid- Epitop nach.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Verifizierung der antigenen Aktivität des durch Proteolyse isolierten Peptids, die mittels "Western Blotting" mit Hilfe eines monclonalen Anti-28 kD-Antikörpers durchgeführt wird, ein 8 kD-Peptid- Epitop nach.
Gegenstand der Erfindung ist ein Peptidfragment, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus Proteinen der Gruppe der Antigene mit 28 kD von S. mansoni durch schonende Proteolyse isoliert wird, daß es ein Molekulargewicht von 6 kD besitzt und daß es von einem polyclonalen Anti-28 kD-Serum eines Kaninchens, einer Ratte oder eines Analogen davon erkannt wird.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Peptidfragment, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus Proteinen mit 28 kD von S. mansoni durch schonende Proteolyse isoliert wird, daß es ein Molekulargewicht von 8 kD besitzt und daß es von monoclonalen Anti-28 kD-Antikörpern des Isotyps IgG2a (W2AD12) erkannt wird.
Noch weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Hybridom mit der Bezeichnung M5BD9, das monoclonale Antikörper vom Isotyp IgM liefert, die das 28 kD-Antigen erkennen. Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Hybridom mit der Bezeichnung W2AD12, hinterlegt bei der CNCM am 9. Mai 1986 unter der Nummer I-553, das monoclonale Antikörper vom Isotyp IgG2a, welche eine Bande entsprechend einem 8 kD-Peptidfragment, isoliert durch schonende Proteolyse des 28 kD-Polypeptids von S. mansoni, erkennen, liefert.
Erfindungsgemäß werden die Hybridome M5BD9 und W2AD12 nach dem folgenden Verfahren erhalten:
Die monoclonalen Antikörper gegen die Gruppe der Proteine mit 28 kD von Schistosoma mansoni wurden durch homologe Zellhybridisierung Ratte x Ratte unter Verwendung der Myelomaquelle der Ratte LOU IR983F [Bazin et coll. 1980 Ann. Immunol. (Institut Pasteur) 131 D: 359] und der Milzzellkultur der Ratte LOU immunisiert durch 50 ug der Gruppe der 28 kD-Proteine von S. mansoni in Gegenwart von vollständigem Freundschen Adjuvanz durch zwei subkutane Injektionen zu 25 ug mit einem 15-tägigen Intervall erhalten.
Nach Fusion wurden die Zellen, die Anti-28 kD-Antikörper erzeugen, durch radioimmunologische Tests auf Platten selektioniert. Ein Homogenat eines adulten Wurms wird auf Polyvinylplatten fixiert, anschließend mit in den Kulturüberständen der Hybride vorhandenen Antikörpern in Kontakt gebracht. Die Antigen-Antikörper-Bindung wird anschließend durch Zugabe eines zweiten mit Iod 125I markierten Antikörpers gegen IgG der Ratte nachgewiesen. Die in diesem Test positiven Zellen werden nach dem Verfahren der limitierten Verdünnung cloniert.
Gegenstand der Erfindung ist unter anderem eine Impfzusammensetzung gegen S. mansoni, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens ein aus Proteinen der Antigengruppe mit 28 kD von S. mansoni durch schonende Proteolyse isoliertes Peptid zusammen mit einem geeigneten Träger enthält.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzung enthält sie mindestens ein Peptidfragment von 6 kD und/oder 8 kD zusammen mit einem geeigneten Träger.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzung enthält sie mindestens ein aus S. mansoni durch schonende Proteolyse isoliertes 28 kD- Peptidfragment, das mit dem Epitop des 28 kD-Antigens von S. mansoni assoziiert ist, zusammen mit einem geeigneten Träger.
Das Epitop des Antigens mit einem Molekulargewicht von 28 kD ist ein Oligosaccharid, das Gegenstand der französischen Patentanmeldung Nr. 86 06281 vom 30. April 1986 im Namen der Anmelderin ist.
Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Ausführungen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.
Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens und Beispielen zur Charakterisierung der antigenen Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids besser verstanden.
Es ist jedoch zu verstehen, daß dieses Ausführungsbeispiel nur zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung angegeben ist und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen soll.

BEISPIEL 1 - HERSTELLUNG DES AUS DER GRUPPE DER PROTEINE MIT 28 KD VON S. MANSONI ISOLIERTEN PEPTIDS

Schritt I: Herstellung des 28 kD-Antigens von S. mansoni

Adulte Würmer von S. mansoni (Stamm Portorica), gewonnen durch Perfusion der Vena Porta bei Goldhamstern, wurden in einem PBS-Puffer in einem Homogenisator POTTER-ELVEHSEM homogenisiert, und das Homogenisat wurde bei 5000 Umdrehungen/Minute 20 Minuten lang zentrifugiert.
Ungefähr 2 mg Antigene wurden auf den 13%igen Polyacrylamidgelen in Schichten fraktioniert, wobei das diskontinuierliche Puffersystem von Laemmli [beschrieben von LAEMMLI, NATURE (1970), 227, Seiten 680-685] verwendet wurde.
Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit COOMASSIE-Brillantblau eingefärbt. Die gefärbten Banden wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und in ein Elutionsgel, bestehend aus Gelstücken auf einem Träger, überführt.
Die Elution wurde mit 40 bis 60 Volt während 6 bis 12 Stunden durchgeführt. Die Elutionsgeschwindigkeit ist eine Funktion des Prozentsatzes des Trenngels und der molekularen Größe der Proteine, die eluiert werden. Die Wanderung der Proben wurde an der Grenzfläche der 2M-NaCl-Glycerinschichten gestoppt.
Wenn alle Peptide in die Glycerinschicht eluiert wurden, wurde die Elektrophorese gestoppt und die Proben wurden mit Hilfe einer PASTEUR-Pipette entnommen. Die Proben wurden dann gegen Wasser dialysiert, um SDS und Salze zu entfernen, und wurden anschließend durch Lyophilisation konzentriert. Die fraktionierten Proteine wurden dann auf einem 13%igen Polyacrylamidgel in Schichten reanalysiert.
Die Proteine mit einem Molekulargewicht mit 28 kD, die durch die soeben beschriebene Fraktionierungstechnik erhalten wurden und die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine Antikörperantwort induzieren und daß ihr Antiserum 28 kD-Antigene entsprechend unter den in-vitro-Translationsprodukten sowohl der RNA des adulten Wurms als auch der RNA der Schistosoma von S. mansoni entspricht, präzipitiert, werden zurückgehalten, um gemäß nachstehendem Schritt II behandelt zu werden.

Schritt II: Isolierung eines Peptids der 28 kD-Proteine von S. mansoni durch Proteolyse

10 ug der 28 kD-Proteine werden in 30 ul 125 mM Tris-HCl Puffer (pH 6,8), der 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, aufgelöst.
1 ug der Protease V8 wird zugesetzt, und der enzymatische Abbau des 28 kD-Antigens wird 30 Minuten lang bei 37ºC im Wasserbad durchgeführt.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ul 2-Mercaptoethanol und 3 ul 10%iges SDS gestoppt. Das Gemisch wird auf 100ºC im Wasserbad 6 Minuten lang erhitzt.
Man gewinnt die Proben, die aus einem Peptid bestehen, deren antigene Eigenschaften bestimmt werden.

BEISPIEL 2 - ANALYSE DER ANTIGENEN ANTWORT DES PEPTIDS VON BEISPIEL 1

10 ug des in Beispiel 1 erhaltenen Peptids werden auf ein 20%iges Polyacrylamidgel aufgebracht. Das so fraktionierte Peptid wird auf ein Nitrocelluloseblatt, wie von TOWBIN et Al. [1984, J. Immunol. Methods 72, Seite 471] beschrieben, überführt. Das Nitrocelluloseblatt wird zuerst durch eine 3%ige BSA-Lösung, die durch 10 mM Mono- und Dinatriumphosphat (pH 7,2), enthaltend 0,15 M NaCl - 50 ul Antikörper, gepuffert ist, gesättigt, wobei die Antikörper Antikörper eines polyclonalen Ratten- oder Kaninchenserums sind oder polyclonale oder monoclonale Ascitesantikörper oder Antikörper erhalten aus einem Hybridom, insbesondere dem Hybridom W2AD12, M5BD9, sind.
Man beläßt das Antigen und die Antikörper eine Nacht lang bei Umgebungstemperatur in Kontakt, um einen "Western Blot" zu erhalten, der dreimal 30 Minuten lang in Phosphatpuffer gewaschen wird.
Die mit Peroxidase markierten Antikörper (bereitgestellt von PASTEUR PRODUCTION), die entweder gegen die Kaninchenimmunglobuline (im Falle von polyclonalen Antikörpern) oder gegen Rattenimmunglobuline (im Falle von monoclonalen Antikörpern) gerichtet sind, werden anschließend hinzugefügt und 2 Stunden lang mit dem "Blot" inkubiert. Drei neue Waschungen werden durchgeführt und das Vorliegen von Immunkomplexen wird durch Zugabe einer Lösung, die 20% kaltes Methanol, 30 mg 4-Chlor-1-naphtol, 0,1% H&sub2;O&sub2; auf 100 ml 0,15 M NaCl Phosphatpuffer enthält, nachgewiesen.
Das "Western Blotting" ist in der beigefügten Figur 1 dargestellt, worin:
- der Block 1 in seinem unteren Teil, das durch Proteolyse isolierte erfindungsgemäße Peptid und in seinem oberen Teil die 28 kD-Proteine zeigt;
- der Block 2 den mit einem gesunden Kaninchenserum erhaltenen "Blot" zeigt;
- der Block 3 den mit monoclonalen Antikörpern aus dem Hybridom W2AD12 erhaltenen "Blot" zeigt;
- der Block 4 den mit einem polyclonalen Anti-28 kD-Kaninchenserum erhaltenen "Blot" zeigt.
Dieses "Western Blotting" zeigt, daß die monoclonalen Antikörper W2AD12, die eine zytotoxische Aktivität gegen die postinfektionelle Larve von Schistosoma mansoni trägt, ein 8 kD-Fragment, abgeleitet von dem 28 kD-Protein erkennt.
Die Erkennung durch einen Antikörper der anaphylaktischen Klasse legt die Wichtigkeit dieses Peptids bezüglich der Induktion einer Schutzantwort gegen S. mansoni nahe.
Das Epitop, das von einem 6 kD-Fragment getragen wird und das von dem Kaninchenserum erkannt wird, wird nicht von dem monoclonalen Antikörper der Ratte erkannt, was nahe legt, daß das Erkennen dieses oder jenes Epitops des 28 kD-Antigens spezifischer Art ist.

BEISPIEL 3 - KONTROLLE DER ERKENNUNG DES ERFINDUNGSGEMÄSSEN ANTIGENEN PEPTIDS DURCH MONOCLONALE ANTIKÖRPER

A. Die Suche nach einem Peptidepitop beschränkter Größe unter den Proteolyseprodukten des 28 kD-Antigens gestattet den Nachweis eines 8 kD-Fragments, das spezifisch von monoclonalen Antikörpern vom IgG2a Isotyp erhalten aus dem Hybridom W2AD12, erkannt wird.
Die zytotoxische Aktivität (in der nachstehenden Tabelle I erläutert) dieses monoclonalen Antikörpers in in-vitro- Tests unter Einbeziehung von Eosinophilen legt die Bedeutung des bzw. der Epitop(e), das bzw. die durch dieses 8 kD-Peptid getragen wird (werden), nahe. TABELLE I Zytotoxizität in Abhängigkeit von Eosinophilen Untersuchung des monoclonalen Antikörpers W2AD12 Antikörperquellea Prozentsatz der Zytotoxizitätb ± S.D. - Serum der Ratte mit subkutanen Tumoren des Hybrids W2AD12 - Serum der Ratte mit subkutanen Tumoren der Zellen IR983F - Serum der Ratte, die mit dem 28 kD-Protein immunisiert wurde - Serum der Ratte, die nach 4 Wochen durch S. mansoni infiziert wurde - Serum von gesunden Ratten
Die Zytotoxizitätstests wurden nach den von Capron et Coll. [Eur. J. Immunol., 8, 127-133, 1978] beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
a) Die Schistosoma werden während 18 Stunden in Gegenwart von 100 ul verschiedener Seren (Endverdünnung 1/16) erhitzt eine Stunde auf 56ºC, vorsensibilisiert.
b) Der Prozentsatz der Zytotoxizität (Mittelwert + Abweichung vom Mittelwert) wird nach 48-stündiger Inkubation der in Gegenwart von peritonealen Zellen von gesunden Ratten sensibilisierten Schistosoma gemessen (Verhältnis Effektorzellen/Zielzelle = 6000/1).
Das Anti-28 kD-Kaninchenserum erkennt nicht das oder die Epitop(e), das bzw. die von diesem Peptid getragen wird bzw. werden, aber erkennt ein anderes 6 kD-Peptid.
Der monoclonale Antikörper von W2AD12 erkennt die zwei Peptide der 28 kD-Antigengruppe.
B. Der monoclonale Antikörper vom Isotyp IgM, erhalten von dem Hybridom M5BD9, erkennt nur eines der zwei Proteine der 28 kD-Gruppe.
Die beigefügte Figur 2 zeigt die Ergebnisse des "Western Blottings" der Gruppe der 28 kD-Antigene gemäß vorliegender Erfindung mit den monoclonalen Antikörpern von M5BD9, von W2AD12 und mit polyclonalem Kaninchenserum ebenso wie mit den vorstehend beschriebenen.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung eines mindestens ein Epitop tragenden Peptids durch Proteolyse, dadurch gekennzeichnet, daß man die Proteine der Gruppe der Antigene mit 28 kD von S. mansoni der Wirkung der Protease V8 in einem Tris-HCl Puffer mit pH 6,8, der SDS enthält, unterwirft, man die proteolytische Reaktion durch Zugabe eines Gemisches aus 2-Mercaptoethanol und SDS stoppt, anschließend das Gemisch für kurze Zeit zum Sieden auf 100ºC bringt, um ein Peptid zu gewinnen, dessen antigene Aktivität man mit Hilfe von Antikörpern eines polyclonalen Serums oder von monoclonalen Antikörpern verifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den enzymatischen Abbau der Proteine der Gruppen der Antigene mit 28 kD durch die Protease V8 während 30 Minuten bei 30ºC durchführt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch, das zum Stoppen der proteolytischen Reaktion verwendet wird, 2-Mercaptoethanol im Verhältnis von 1 ul auf 3 ul 10%iges SDS enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Tris-HCl Puffer, in dem die Proteine der Gruppe der Antigene mit 28 kD gelöst sind, ein 100 mM bis 125 mM Puffer ist und 0,08 bis 0,12 % SDS enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verifizierung der antigenen Aktivität der durch Proteolyse isolierten Peptide, die durch Western Blotting mit Hilfe eines polyclonalen Anti-28 kD-Serums der Ratte, des Kaninchens oder eines Analogen davon durchgeführt wird, mit Hilfe von durch Peroxidase markierten Antikörpern gegen die Immunglobuline der Ratte, des Kaninchens, der Maus oder Analogen ein 6 kD-Peptid nachweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verifizierung der antigenen Aktivität des durch Proteolyse isolierten Peptids die mittels Western Blotting mit Hilfe eines monoclonalen Anti-28 kD-Antikörpers durchgeführt wird, ein 8 kD-Peptid nachweist.

7. Peptidfragment, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Proteinen der Gruppe der Antigene mit 28 kD von S. mansoni durch schonende Proteolyse nach Anspruch 5 isoliert wird, daß es ein Molekulargewicht von 6 kD besitzt und daß es von einem polyclonalen Anti-28 kD-Serum eines Kaninchens, einer Ratte oder eines Analogen davon erkannt wird.

8. Hybridom mit der Bezeichnung W2AD12, hinterlegt bei der CNCM am 9. Mai 1986 unter der Nummer I-553, dadurch gekennzeichnet, daß es monoclonale Antikörper vom Isotyp IgG2a, welche die Gruppe der Antigene mit 28 kD von S. mansoni erkennen, erzeugt.

9. Peptidfragment, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Proteinen der Gruppe der Antigene mit 28 kD von S. mansoni durch schonende Proteolyse nach Anspruch 6 isoliert wird, daß es ein Molekulargewicht von 8 kD besitzt und daß es von monoclonalen Anti-28-kD-Antikörpern des Isotyps IgG2a, erzeugt von dem Hybridom W2AD12, definiert in Anspruch 8, erkannt wird.

10. Impfzusammensetzung gegen S. mansoni, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein aus Proteinen der Antigengruppe mit 28 kD von S. mansoni durch schonende Proteolyse isoliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit einem geeigneten Träger enthält.

11. Impfzusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Peptidfragment von 6 kD und/oder 8 kD nach einem der Ansprüche 7 oder 9 zusammen mit einem geeigneten Träger enthält.

12. Impfzusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein aus S. mansoni durch schonende Proteolyse isoliertes Peptidfragment, das mit dem Epitop des 28 kD-Antigens von S. mansoni assoziiert ist, ebenso wie einen geeigneten Träger enthält.