DE3784646T2 - Gammabestrahlung einer kollagen-mineral-mischung. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft die Herstellung von Implantaten und Prothesen zur Reparatur von hartem Gewebe, bestehend aus Collagen und einem Mineral. Insbesondere werden Gemische aus Atelopeptid fibrillär rekonstituiertem Collagen vermischt mit einem Calciumphosphatmineral und die Gemische werden mit γ-Strahlung behandelt, um sowohl die biologischen als auch die Handhabungseigenschaften zu verbessern.
• Es wurde ein weiter Bereich an Materialien vorgeschlagen zur Verwendung zur Reparatur von hartem Gewebe. Fur gewichttragende Bereiche wurden Prothesen, die in der Lage sind, Belastung zu widerstehen, hergestellt aus Metallstäben bis zum rekonstituierten Tierknochen. Verschiedene Packmaterialien wurden auch angewandt zur Verstärkung der Knochenstrukturen, so wie die Verwendung von vernetztem Collagen zur Verstärkung des Alveolarkamms. Es ist erwunscht, eine Vielzahl von Materialien zur Verfügung zu haben, die geeignet sind für verschiedene Arten der Skelett- bzw. Knochenreparatur, da jede Anwendung ihre eigene Kombination von Parametern hat, um das optimale Implantat zu bestimmen. Außerdem sind die physikalischen Handhabungseigenschaften des Materials, wie es von dem medizinischen Praktiker angewandt wird, von Bedeutung, um es dem Arzt zu ermöglichen, ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen, teilweise weil die Leichtigkeit der Handhabung die Erfolgsaussichten bestimmt.
• Es wurden Versuche unternommen, geeignete Materialien aus den hauptsächlichen organischen und anorganischen Komponenten des Knochens, nämlich Collagen und Calciumphosphatmineral herzustellen. Berichte über Versuche, die Collagen/Mineral-Kombination zu verwenden sind zahlreich. Z.B berichteten Lemons, J. et al., beim Second World Congress of Biomaterials in Washington, D.C., 27. April - 1. Mai 1984 über Versuche Collagen zusammen mit handelsüblichem Hydroxyapatit mit Calciumphosphat zur Reparatur von kunstlich verursachten Verletzungen bei Kaninchen zu verwenden. Die Verwendung dieser Gemische führte nicht zu einer Verbindung der verletzten Teile. Ein Kontrollversuch unter Verwendung von frischen autogenen Knochen war jedoch erfolgreich zur Bildung einer Einheit. Ähnlich waren Levy, P. et al J. Periodontal (1981), 50: 303 - 306, nicht erfolgreich bei Ihren Versuchen Collagen/Mineral-Gel-Implantate zu verwenden, um Defekte innerhalb des Knochens in Wurzelkanälen von Hunde- oder Affenzannen zu reparieren. Gross, B.C., et al., Oral Surg (1980), 49: 21-26 berichten über einen begrenzten Erfolg bei der Verwendung von Gemischen aus rekonstituiertem lyophilisiertem Kälberhautcollagen im Gemisch mit einer Hydroxyapatitzubereitung, um das Knochenwachstum durch subperiostale Implantate bei Affen einzuleiten. Verschiedene andere haben über die Verwendung von Collagenformen die deutlich Telopeptide, eine Hauptouelle der Immunogenität von Collagen, enthalten, in Kombination mit Mineralien zur Reparatur von Knochen berichtet. Siehe z.B. Hayashi, K. et al., Arch Orthop Traumat Sura (1982) 99: 265 - 269; Battista, US-PS 4 349 490 (hydratisierte Gelatine): Cruz Jr. US- PS 3 767 437 (mit Calcium ausgefällte Form von Collagen) und Battista, et al., US-PS 3 443 261 (neben Calciumphosphat eine "neue Form" von Collagen, die Mikrokristalle aus aggregierten Tropocollageneinneiten enthält).
• Miyata, et. al., US-PS 4 314 380, verwendeten eine Mineralgrundlage (backbone) die direkt hergestellt worden war durch Behandlung von Tierknochen zur Entfernung aller organischen Materialien, die dann mit einem Atelopeptid-Collagen überzogen wurde. Die japanische Anmeldung J 58/058 041, veröffentlicht am 06. April 1983, beschreibt ein schwammartiges porös es Calciumphosphat-Material mit Poren, das mit Atelopeptid-Collagen behandelt worden ist. Das Collagen stammt von Collagen in Lösung mit einer Konzentration von nicht mehr als 2 Gew.%. Die japanische Anmeldung zeigt die Vorteile von Osteoblasten (Knochenwachstum) in die Poren des Materials und neues Knochenwachstum. Die EP-A-030 583, veröffentlicht am 24. Juni 1981, beschreibt die Verwendung von Collagenfleece im Gemisch mit Hydroxyapatit zur Reparatur von Knochen. Dieses Collagennaterial ist ein Handelsprodukt, das erhalten wird aus Tierhäuten durch proteolytischen Abbau und lyophilisiert und sterilisiert wird durch γ-Strahlung. Diese Collagenzubereitung bildet ein weiches, membranartiges Material, enthält jedoch Telopeptide und ist partiell abgebaut durch die Verarbeitung.
• Die EP-A-164 483, veröffentlicht am 18. Dezember 1985, beschreibt ein Verfahren, von dem angegeben wird, daß es einem Mineral/Collagen- Gemisch biologische Verträglichkeit verleiht. Bei diesem Gemisch wird löslich gemachtes Collagen entweder in Gegenwart von oder vor der Zugabe von einer Calciumphosphatmineral-Komponente vernetzt, bis zum dem Punkt wo es seine Resorptionsfähigkeit und Absorptionsfähigkeit, bezogen auf Körperflüssigkeiten, beibehält und die Vernetzung nicht bis zur Vollständigkeit fortschreiten kann. Die US-A-4 516 276 von Mittelmeier beschreibt die Kombination eines nichtfibrillären, nicht rekonstituierten Collagens zusammen mit Hydroxyapatit.
• Die US-Patentanmeldung Serien Nr. 848 443, eingereicht am 4. April 1986, (entsprechend der EP-A-147 693) und ihre Stammanmeldung US-Serien Nr. 717 072, eingereicht am 28. März 1985, und beide auf den gleichen Anmelder übertragen wie die vorliegende Anmeldung und auf die hier verwiesen wird, beschreiben neue Massen, enthaltend rekonstituiertes fibrilläres Atelopeptid-Collagen im Gemisch mit einem Calciumphosphatmineral. Es sind auch verschiedene Verfahren angegeben, um die Masse fester zu machen, wobei diese Verfahren ein Inkubieren des Gemisches bei speziellen Temperaturen und während spezieller Zeiten, sowie die Behandlung des getrockneten Gemisches mit Wärme umfassen. Das Präparat nach diesen Anmeldungen muß, damit es für die behandelten Patienten nicht infektiös ist, unter aseptischen Bedingungen hergestellt werden, da bei den angegebenen Verfahren keine direkte Sterilisierung vorgesehen ist. Typischerweise führt die aseptische Verarbeitung zu Produkten mit Sterilitätssicherheitsniveaus (das heißt Wahrscheinlichkeit einer nicht sterilen Produkteihheit) zwischen 10&supmin;³ und 10&supmin;&sup4;.
• Das Material, das nach den verschiedenen in den oben angegebenen Anmeldungen beschriebenen Härtungsbehandlungen erzielt wird, besitzt eine Kompressibilität über 6 Newton pro cm² (N/cm²). Sowohl diese Festigkeit als auch eine weitere Verbesserung der Kompressibilitätsindices können erreicht werden durch die dort angegebenen Härtungsverfahren.
• Der Stand der Technik liefert keine geeignete Masse zur Reparatur von Knochendefekten, die leicht und wirksam sterilisiert werden kann, während sie die guten Handhabungseigenschaften beibehält, die erwunscht sind, um einen wirksamen Einsatz des Implantats zu ermöglichen. Das Material sollte gegen Druck beständig sein und noch ausreichend elastisch, um eine Formung an Ort und Stelle zu ermöglichen oder alternativ sollte es, wenn es in einem gewichttragenden Bereich angewandt wird, entsprechend starr sein. Das Verfahren und das erhaltene Produkt nach der vorliegenden Erfindung heilen diesen Mangel des Standes der Technik.
• Die Erfindung nutzt die Vorteile eines Bestrahlungsverfahrens, das bisher nur in Beziehung auf seine Wirkung auf die physikalischen Eigenschaften im Zusammenhang mit Massen, die nur Collagen enthalten, angegeben war. Eine Zusammenfassung der Wirkung von γ-Strahlen auf Collagenstrukturen (Sutures) findet sich z.B. in Artandi, Technical Report # 149, Intl Atomic Energy Agency, Vienna, Manual on Radiation Sterilization of Medical & Bioloaical Materials (1973) Kap. 15, und eine Übersicht über die Wirkung der Strahlung auf Collagen als Gewebekomponente ist veröffentlicht von Bailey, A.J., in Internat Rev Connect Tis (1968), S. 233 - 281. Außerdem beschreibt die PCT- Anmeldung WO8I/00963, daß die physikalische Festigkeit von Collagenmaterialien erhöht werden kann durch Wärmebehandlung und durch Behandlung mit gasförmigem Halogenwasserstoff. Die Anmelderin kennt jedoch keine Offenbarung nach dem Stand der Technik, die die Wirkung von γ-Bestrahlung auf die physikalischen Eigenschaften und Handhabungseigenschaften von Collagen/Mineral-Gemischen zeigt, obwohl γ- Bestrahlung angewandt wurde, um die lyophilisierten Zubereitungen zu sterilisieren, die in der oben erwähnten EP-A- 164 483 angegeben sind, ohne weiteren Kommentar bezüglich der Eigenschaften oder der weiteren Verwendung.
• Die Erfindung liefert ein Verfahren durch das Collagen/Mineral- Zubereitungen wirksam sterilisiert werden können und ihnen gleichzeitig Eigenschaften verliehen werden, die besonders gunstig sind, zur Handhabung des Materials bei der Reparatur von (Knochen) Defekten und für ihr Verhalten als Iinplantate. Der Kern des Verfahrens ist die Bestrahlung der Zubereitung mit ausreichender Gesamtenergie, um die Sterilisierung bis zu dem erforderlichen Grad zu erreichen, wobei die Collagen/Mineral-Zübereitung in einer solchen Form vorliegt, daß die Bestrahlung auch einen zufriedenstellenden Kompressionsmodul ergibt, sowie die gewünschte Kombination von Elastizität und Starrheit. Es kann ein Bereich an erwunschten Eigenschaften erzielt werden, abhängig von der Einstellung der Bedingungen oder des Status bezüglich der relevanten Parameter der Collagen/Mineralprobe während der Bestrahlungszeit.
• Folglich betrifft die Erfindung nach einem Aspekt eine biologisch verträgliche Collagen/Mineralmasse, umfassend ein Gemisch aus 2 bis 40 Gew.% rekonstituiertem fibrillärem Atelopeptid-Collagen und 60 bis 98 Gew.% Calciumphosphatmineral, ausschließlich Feuchtigkeit, wobei die Masse einen Kompressionsmodul (Elastizitätsmodul) von mindestens 10 N/cm² und einen Sterilitätssicherheitsfaktor von 10&supmin;&sup6; oder weniger aufweist und erhältlich ist durch Bestrahlen einer Collagen/Mineralmasse, umfassend ein Gemisch aus 2 bis 40 Gew.% rekonstituiertem fibrillärem Atelopeptid und 60 bis 98 Gew.% Calciumphosphatmineral ausschließlich Feuchtigkeit mit 0,5 bis 4 Mrad γ-Strahlung, das während der Bestrahlung 1 bis 6 % Feuchtigkeit enthält.
• Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung einer biologisch verträglichen Knochenimplantatzübereitung durch Herstellung einer solchen Masse.
• Vorzugsweise besitzt die Collagen/Mineralmasse nach der Erfindung einen Feuchtigkeitsgehalt von 0,5 bis 6 % und/oder der Collagengehalt des Collagen-Calciumphosphatgemisches beträgt 2 bis 5 %. Während der Bestrahlung ist es wichtig, daß der Collagenanteil der Zubereitung ausreichend vernetzt wird oder worden ist, um die physikalischen Eigenschaften zu stabilisieren. Das kann in einer Vielzahl von Wegen erreicht werden, z.B. durch Vorerhitzen der Probe, um eine teilweise Vernetzung zu erreichen, oder durch Einstellung der Feuchtigkeit, unter der die Bestrahlung stattfindet, so daß die Bestrahlung selbst die gewunschte Vernetzung bewirkt. So findet unter diesen Bedingungen nicht nur eine Sterilisierung auf einen Sterilitätssicherheitswert von mindestens so niedrig wie 10&supmin;&sup6; statt, sondern auch eine Einstellung der physikalischen Eigenschaften, indem ein Gleichgewicht erreicht wird zwischen der Vernetzung und dem Abbau aufgrund der Bestrahlung.
• Fig. 1 zeigt ein Diagramm von alternativen Methoden zur Durchführung der Erfindung.
• Fig. 2a zeigt die Wirkung des Feuchtigkeitsgehalts des Collagen/Mineralgemisches auf den Kompressionsmodul bei verschiedenen Stärken der Bestrahlung;
• Fig. 2b zeigt diese Wirkung auf die Trypsinempfindlichkeit.
• Fig. 3a und 3b zeigen die Ergebnisse von unabhängigen Bestimmungen, ähnlich denjenigen der Fig. 2a und 2b.
Arten der Durchführung der Erfindung
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf Collagen/Mineral- Gemische mit definierter Zusammensetzung. Es folgt zunächst eine Diskussion der Art der einzelnen Bestandteile und der Art in der diese zu Gemischen verarbeitet werden.
Die Mineralkomponente
• Die erfindungsgemäßen Massen können eine Vielzahl von Calciumphosphat- Mineralkomponenten enthalten. Wie der Ausdruck hier verwendet wird, bezieht sich "Calciumphosphat-Mineral" auf solche Materialien, die aus Ca&spplus;² Phosphationen bestehen, ungeachtet der Mikrostruktur, dem Protonisierungszustand des Phosphats oder dem Ausmaß der Hydratisierung. Calciumphosphat-Mineralien umfassen einen Vielzahl von Formen, wie die im Handel erhältlichen Formen von Tricalciumphosphat, z.B. Synthograft Tricalcium-phosphat oder von Hydroxyapatit wie Periograf , Alveograf , Interpore , OrthoMatrix HA-1000 , oder OrthoMatrix HA-500 Hydroxyapatitzubereitung. Der Hydroxyapatit oder das Tricalciumphosphat können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, wie solchen, wie sie angegeben sind von Termine, et al., in Arch Biochem Biophys (1970) 140: 307 - 325 oder Hayashi, K. et al., in Arch. Orthop Trauma Surg (1982, a.a.O.). In jedem Fall ist das Mineral allgemein und vorzugsweise nicht biologischen Ursprungs und wird als Pulver mit entsprechender Teilchengröße (mesh) zugeführt. Bevorzugte Teilchengrößen liegen im Bereich von 100 bis 2000 um. Während der Mineralgehalt von Knochen für diesen Zweck gewonnen und gereinigt werden könnte, sind wirtschaftlicher hergestellte und kontrollierte Massen bevorzugt, sowohl aus Gründen der Kosten als auch der Qualität. Wenn feste Blöcke erwunscht sind, werden diese wie unten angegeben aus den Teilchen hergestellt.
Das Collagen
• Die Collagenkomponente der Masse ist fur Ihre Wirksamkeit kritisch. Das zur Verwendung nach der Erfindung geeignete Collagen ist ein gereinigtes fibrilläres rekonstituiertes Atelopeptid-Collagen: Es wird typischerweise aus Haut hergestellt.
• Es wurden zahlreichte Formen von Collagen hergestellt und sie unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften sowie ihrer biologischen Verträglichkeit. Wo nicht die spezielle Teilchengröße innerhalb eines Bereichs von Durchmessern angegeben werden soll, über den ein Gemisch eine Lösung, ein Colloid oder eine Suspension ist, wird der einzige allgemeine Ausdruck "Collagendispersion" verwendet. Dieser Ausdruck bezieht sich auf eine beliebige Collagenzubereitung in wäßrigem Medium, wo die Teilchengröße des Collagens nicht speziell angegeben ist - d.h. die Zubereitung kann eine Lösung, Suspension oder ein Gel sein.
• Natives Collagen besteht hauptsächlich aus einer Tripelhelix-Struktur, enthaltend wiederkehrende Tripletseauenzen, bestehend aus Glycin, das gebunden ist an zwei zusätzliche Aminosäuren, üblicherweise Prolin und Hydroxyprolin. Natives Collagen enthält Bereiche an jedem Ende, die nicht die Glycin-Triplett-Sequenz besitzen und somit keine Helices bilden. Es wird angenommen, daß diese Bereiche für die Immunogenität verantwortlich sind, die mit den meisten Collagenzubereitungen verbunden ist, und die Immunogenität kann abgemildert werden durch Entfernung dieser Regionen, um "Atelopeptid"-Collagen zu erhalten. Dies kann erreicht werden durch einen Abbau mit proteolytischen Enzymen wie Trypsin und Pepsin. Die Nichthelix-Telopeptid-Regionen sind auch verantwortlich für die nativ auftretende Vernetzung, und Atelopeptid-Collagen muß künstlich vernetzt werden, wenn eine Vernetzung erwünscht ist.
• Natürlich vorkommende Collagene wurden in etwa 10 Typen unterklassifiziert, abhängig von der Aminosäuresequenz in den einzelnen Ketten, dem Kohlenhydratgehalt und dem Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Disulfidquerverbindungen. Die üblichsten Untergruppen sind Typ I, der in Haut, Sehnen und Knochen vorhanden ist und von Fibroblasten gebildet wird, sowie Typ III, der sich hauptsächlich in der Haut findet. Andere Typen liegen in spezialisierten Membranen oder Knorpel oder an Zelloberflächen vor. Die Typen I und III enthalten ähnliche Anzahlen an Aminosäuren in ihren Helices und haben eine hohe Homologie; jedoch enthält Typ III, aber nicht Typ I, zwei angrenzende Cysteingruppen an den C-terminalen Enden der Tripelhelix, die in der Lage sind, Querverbindungen bzw. Vernetzungen zwischen den Ketten zu bilden. Daher können Collagenzubereitungen sich aufgrund Ihrer Anfangszusammensetzung, die mit ihrem Ursprung zusammenhängt oder aufgrund ihrer Herstellungsverfahren voneinander unterscheiden. Collagen von Knochen enthält z.B. ausschließlich Collagen vom Typ I, während Collagen aus Haut auch Typ III enthält. Auch können durch das Herstellungsverfahren Telopeptide entfernt oder nicht entfernt werden. So sind sowohl unverändertes als auch "Atelopeptid"-collagen möglich. So können Vernetzungen vorsätzlich erzeugt werden oder zufällig auftreten. Sterilisierung durch γ-Bestrahlung oder durch starke Wärme kann zu einer Vernetzung führen, ohne daß das Ausmaß oder die Art kontrolliert werden, und führen zu einem teilweisen Abbau der Tripelhelix. Eine beabsichtigte Vernetzung kann durch eine Vielzabl von Mitteln durchgeführt werden, einschließlich Behandlung mit Glutaraldehyd. Unterschiede, die von möglicherweise feineren Ursachen herrühren, sind möglicherweise das Ergebnis von Veränderungen in Details des Herstellungsverfahrens. Z.B. kann das Collagen löslich gemacht und wieder ausgefällt werden oder es kann einfach fein zerteilt und in Suspensionen gehalten werden. Wenn das löslich gemachte Material reaggregiert wird, kann die Aggregierung so durchgeführt werden, daß nicht spezifisch gebundene Feststoffe entstehen, oder das Collagen kann wieder zu Fasern rekonstituiert werden, die die native Form simulieren. Außerdem kann natürlich auch der Grad der Reinheit variieren.
• Wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "frei von Verunreinigungen" oder "gereinigt" in Beziehung auf Collagenzubereitungen, auf solche Verunreinigungen, die üblicherweise mit Collagen in nativer Form verbunden sind. So ist Collagen, das aus Kälberhaut hergestellt worden ist, frei von Verunreinigungen wenn andere Bestandteile der Kälberhaut entfernt worden sind, solches aus Knochen, wenn andere Bestandteile des Knochens eliminiert worden sind.
• "Rekonstituiertes" Collagen bezieht sich auf Collagen, das in einzelne Tripelhelix-Moleküle, mit oder ohne Telopeptidausdehnung, zerlegt worden, in Lösung gebracht, und dann erneut zu "fibrillären" Formen zusammengefügt worden ist. In dieser Form bestehen die Fibrillen aus langen dünnen Collagenmolekülen, die mehrfach gegeneinander versetzt sind, um etwa ein Viertel ihrer Länge. Das führt zu einem Fasergefuge, das weiter zu Fasern aggregiert werden kann.
• Collagen, das "im wesentlichen frei von Vernetzungen" ist, bezeichnet Collagen, von dem die Atelopeptide entfernt sind, und das so keine native Fähigkeit zur Bildung von Vernetzungen bzw. Querverbindungen besitzt. Diese Zubereitungen bleiben im wesentlichen vernetzungsfrei, wenn sie nicht absichtlich vernetzt werden, z.B. indem sie mit Glutaraldehyd behandelt oder einer Behandlung unterworfen worden sind, die selbst zu einer Vernetzung führt, z.B. Behandlungen, die häufig für Sterilisierungszwecke angewandt werden, wie hohe Temperaturen und γ- Bestrahlung, wie hier beschrieben, wenn sie unter entsprechenden Bedingungen durchgeführt werden.
• Eine Collagenzubereitung, die für die erfindungsgemäßen Gemische geeignet ist, ist ein Atelopeptid, das zu fibrillärer Form rekonstituiert ist und als Dispersion von 5 bis 100 mg/ml, vorzugsweise etwa 50 bis 70 mg/ml, geliefert wird. Derartige Dispersionen wie Zyderm Collagen Implantat (ZCI), das in Zubereitungen, enthaltend 35 mg/ml Collagen oder 65 mg/ml Collagen in Salzlösung, die von Collagen Corporation, Palo Alto, Californien hergestellt worden sind, sind geeignet. Für die erfindungsgemäßen Mittel werden die ZCI und andere Collagendispersionen ohne Lidocain oder andere sedative Arzneimittel verwendet. "ZCI" bedeutet hier die wäßrige Collagendispersion und nicht die Collagenkomponente per se.
Die Collagen/Mineral-Gemische
• Die erfindungsgemäßen Massen, die am Ende der Strahlung ausgesetzt werden, werden ursprünglich hergestellt durch Vermischen von 50 bis 85 Gew.% Calciumphosphat-Mineralkomponente vorzugsweise 65 bis 75 % Mineralkomponente, wobei der Rest eine Collagendispersion in wäßrigem Medium wie ZCI ist. Angegeben als Verhältnis Mineral zu Collagen (ausschließlich des Wassergehalts der Collagendispersion) enthalten die Gemische 60 bis 98 % Mineral, vorzugsweise 75 bis 98 % Mineral und als Rest Collagen. Die Mittel können einfach hergestellt werden durch sorgfältiges Vermischen der beiden Komponenten zu einer zusammenhängenden Masse. Das Gemisch kann auch in eine gewünschte Form (z.B. Blöcke, Qader, Folien) gegossen werden. Es kann (überlagert) eine Vernetzung durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung von Glutaraldehyd in einer Menge von 0,001 bis 0,1 %, entweder für ein trockenes oder ein naßes Produkt, wie unten näher beschrieben.
• Die Gemische werden dann auf weniger als 1 % Feuchtigkeitsgehalt getrocknet und entweder rehydratisiert oder wärmebehandelt, bevor sie dem Sterilisierungsbestrahlungsverfahren nach der Erfindung, wie unten beschrieben, unterworfen werden. Die prozentuale Zusammensetzung von Collagen/Mineral und Feuchtigkeitsgehalt werden wie folgt berechnet: Prozentgehalte an Collagen und Mineral sind angegeben als Trockengewichte, bezogen auf das Gesamtgewicht dieser beiden Komponenten allein ohne Wasser. Der prozentuale Feuchtigkeitsgehalt ist das Gewicht an Wasser dividiert durch das Gesamtgewicht (Wasser + Collagen + Mineral) x 100.
• Das bei dem Bestrahlungsprozeß entstehende sterilisierte Material kann per se als Mineral/Collagen verwendet werden oder es kann mit weiteren Komponenten vermischt werden, die ebenfalls, wie erforderlich sterilisiert sind, zur Verabreichung (Implantation) an den Patienten. Die Zubereitungen werden, obwohl sie als Collagen und Mineral beschrieben werden, dem Patienten immer in feuchter Form verabreicht und enthalten entweder den inherenten Feuchtigkeitsgehalt des ursprünglichen Gemisches oder sind wieder mit sterilem Wasser oder Salzlösung vor der Verabreichung befeuchtet worden. Außerdem können Komponenten, die geeignet sind, um die Wirksamkeit des Mittels zu verbessern, zugesetzt werden, wie Blut oder Knochenmark. Wie oben angegeben, geben die Prozentsätze an Collagen und Mineral ihre relativen Mengen an und das Collagen/Mineral-Gemisch kann so wenig wie 10 % der gesamten Zubereitung ausmachen, die in einigen Fällen verabreicht wird. Etwaige Zusätze müssen selbst ebenfalls sterilisiert sein oder aus solchen Quellen stammen, bei denen eine Sterilisierung irrelevant ist, wie z.B. im Falle von Blut.
Gewünschte Eigenschaften des Gemisches
• Das Collagen/Mineral-Gemisch selbst muß in Abhängigkeit von seiner Anwendung bestimmte physikalische Eigenschaften besitzen. Speziell muß es elastisch genug sein, um eine gewisse Formung zu ermöglichen, aber muß gleichzeitig ausreichend starr sein, um unter Belastung einer vollständigen Deorganisation bzw. einem Zerfall zu widerstehen. Die Beständigkeit gegen Druck kann gemessen werden als Kompressions- bzw. Druckmodul unter Anwendung einer handelsüblichen Vorrichtung, wie eines Instron Universal Testing Instruments Modell 4202 und nach Richtlinien für die Messung von Druckmodulen, wie sie veröffentlicht sind von der American Society for Testing Materials (ASTM).
• Um diese Messung durchzuführen, werden die Gemische zunächst 5 bis 24 h in physiologische Salzlösung gelegt. Das führt zu relevanteren Daten, da das Material, wenn es implantiert ist, naß ist. Das Gemisch bleibt ausreichend lange in der Salzlösung, um eine vollständige Benetzung sicherzustellen, und es wird dann in die Testvorrichtung gebracht. Wenn das Material elastisch ist, wird es leicht zusammengepreßt bis ein Punkt erreicht ist, an dem es, um das Material weiter zusammenzupressen, notwendig ist, die Eigenstruktur im mikroskopischen Maßstab zu zerstören. Wenn das Material starr ist, wird dieser Punkt bei einer geringeren Verformung erreicht als bei elastischen Materialien. Bei Collagen/Mineral-Gemischen wird die mikroskopische Organisation zunächst durch die Tripelhelix per se aufrecht erhalten, aber auch durch eine Wechselwirkung zwischen den Collagen-Tripelhelixteilen der einzelnen Komponenten der Fibrillen sowie die Bindung der Fibrillen aneinander. Ein Zusammenpressen unter Zerstörung einer dieser Organiations-Komponenten ist schwieriger als ein allgemeines Zusammenpressen mit einer Abnahme des Volumens des Leerraums. Natürlich ist, je stärker organisiert und vernetzter die Collagenketten in dem Mittel sind, ihre mikroskopische Kompression umso schwieriger.
• So zeigt ein hoher Kompressionsmodul (gemessen in N/cm²) einen hohen Grad an Organisation im mikroskopischen Bereich an, speziell eine hohe Vernetzung. Ein niedriger Kompressionsmodul zeigt an, daß die Vernetzung gering ist. Für angemessene physikalische Handhabungseigenschaften und zur Aufrechterhaltung der Integrität als Implantat, ist es wichtig, daß der Kompressionsmodul vernüftig hoch ist, mindestens etwa 10 N/cm² oder darüber und so hoch sein kann wie 35 bis 45 N/cm². Die oberen Grenzen des Kompressionsmoduls werden bestimmt durch die Art der Materialien und es wird angenommen, daß Gemische dieser Art tatsächlich keine Modulwerte von wesentlich mehr als 100 N/cm² unter einer beliebigen Vernetzung erreichen können. In jedem Falle ist es von Bedeutung, um geeignete physikalische Eigenschaften für die erfindungsgemäßen Mittel zu erzielen, daß der Kompressionsmodul über 10 N/cm² liegt und vorzugsweise in einem Bereich von 10 bis 60 N/cm² insbesondere 25 bis 45 N/cm². Das erhaltene Mittel wird nach der Behandlung entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren durch diese Messung untersucht, um klarzustellen, daß die geeignete Druckbeständigkeit erreicht ist.
• Während das Gemisch die Integrität im mikroskopischen Bereich beibehalten muß, muß es auch ausreichend porös und verletzlich sein, um biologische Eigenschaften aufzuweisen, die ein Einwachsen des umgebenden harten Gewebes ermöglichen, und in einigen Fällen sollte es Resorbierbarkeit aufweisen, wenn es einem Patienten implantiert ist. Dies ist jedoch eine Eigenschaft, die optimiert und nicht maximiert werden muß. Es wird angenommen, daß ein mäßiger Grad eines Abbaus der Collagenfibrillen sie geeignet macht, für biologische Prozesse, wenn sie einem Patienten eingesetzt werden.
• Eine in vitro Messung dieser Eigenschaft ist die Zugänglicbkeit der Hydrolyse durch Trypsin oder "Trypsinempfindlichkeit". Um diese Messung durchzuführen, werden die Proben mit der Protease Trypsin behandelt, die nur fragmentierte Teile des Collagenproteins angreifen kann. Das Ausmaß der Hydrolyse wird gemessen durch Fluorescaminbestimmung für lösliche Peptide und die Ergebnisse sind angegeben als Prozentsatz Nichthelix-Collagen. Z.B. und zum Vergleich sind Gelatinezubereitungen von Collagen 100 % nicht helixförmig, Collagen in Lösung ist zu etwa 10 % nicht helixförmig und ZCL ist 10 % nicht helixförmig. Gewünschte Bereiche hängen von der vorgesehenen Verwendung ab.
• Eine alternative Maßnahme zur Fragmentierung im mikroskopischen Bereich ist die Übergangstemperatur, gemessen durch Differential-Scanning-Calorimetry (DSC). Eine Verringerung der Übergangstemperatur zeigt eine Zunahme der Fragmentierung im mikroskopischen Bereich an, in einer Weise ähnlich derjenigen, wie sie durch die Trypsinempfindlichkeit gemessen wird.
• Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Einstellung der obigen Parameter, um optimale physikalische und biologische Verträglichkeitseigenschaften zu erzielen. Das Verfahren führt auch zu einer wirksamen Sterilisierung des Materials, was einen Sterilisierungsgrad von mindestens so wenig wie 10&supmin;&sup6; sicherstellt.
Verfahren der Erfindung
• Die Sterilisierung und Optimierung von physikalischen Eigenschaften werden erreicht, indem die Massen einer Bestrahlung unter Anwendung einer γ-Strahlenquelle im Bereich von 0,5 bis 4 Mrad, vorzugsweise 1 bis 3 Mrad und insbesondere 2,5 bis 3 Mrad, ausgesetzt werden. Es ist bekannt, daß diese Dosen eine Sterilisierung von Zubereitungen, enthaltend nur Collagen, bewirken (siehe Artandi, (a.a.O)). Das Bestrahlungsverfahren selbst wird durchgeführt unter Anwendung von Standardverfahren, die an sich bekannt sind zur Sterilisierung von Nahrungsmitteln, Kosmetika und ähnlichem. Die Bestrahlung wird durchgeführt unter Anwendung einer γ-Strahlenquelle, wie ¹³¹I, ¹³&sup7;Cs oder am üblichsten &sup6;&sup0;Co. Diese Materialien werden in Standardformen geliefert und auf die Proben angewandt unter Anwendung üblicher Standardvorrichtungen von AEC-Lizenznehmern nach den anerkannten Leitlinien. Es wird Bezug genommen auf Process Control Guidelines for Gamma Radiation Sterilization of Medical Devices veröffentlicht von der Assoc. for Advancement of Medical Instrumentation (1984) als AAMI Recommended Practice. Außerdem wird Bezug genommen auf Technical Reports Series 149; "Manual on Radiation Sterilization of Medical & Biological Materials", Intl Atomic Energy Commission, Wien 1973.
• Die wesentlichen Faktoren für die Wirkung der Bestrahlung auf die Probe sind die Gesamtdosis (Mrad) und der Zustand der Probe während der Bestrahlung. Andere Faktoren, wie die Rate, mit der die Energie zugeführt wird, die gesamte Bestrahlungszeit, der Abstand der Probe von der Bestrahlungsquelle usw. sind im allgemeinen irrelevant mit Ausnahme ihrer kombinierten Wirkung auf die Gesamtdosis.
• Der Zustand der Probe, die der Bestrahlung unterworfen wird, ist von höchster Bedeutung und bildet die Grundlage für die vorliegende Erfindung. Die Probe muß entweder den gewünschten Vernetzungsgrad aufweisen bevor sie der Bestrahlung unterworfen wird oder sie muß während der Bestrahlung in einen Zustand gebracht werden, um es zu ermöglichen, daß die Bestrahlung selbst diese Vernetzung bewirkt oder es muß eine Kombination dieser Faktoren angewandt werden.
• Bei dem Verfahren zur Durchführung der Erfindung wird sichergestellt, daß das Gemisch einen Feuchtigkeitsgehalt von 1 bis 6 %, vorzugsweise 1 bis 2 %, während der γ-Bestrahlung aufweist. Das kann besonders bequem erreicht werden, indem das Gemisch zunächst auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 1 % mit Hilfe von trockener Wärme bei 35 bis 45ºC, vorzugsweise 35 bis 37ºC, getrocknet wird und das Gemisch anschließend durch 6 bis 24 h langes Behandeln bei 35 bis 45ºC und 50 bis 95 %iger relativer Feuchtigkeit (RH), vorzugsweise 35 bis 37ºC bei 50 bis 80 % RH, rehydratisiert wird, um den gewünschten Gleichgewichtsfeuchtigkeitsgehalt zu erzielen. Der Feuchtigkeitsgehalt kann nach Standardverfahren gemessen werden, wie sie beschrieben sind von Fischer, K., Angew. Chem. (1935) 48: 394, um sicherzustellen, daß der gewünschte Bereich erreicht ist. Andere Möglichkeiten, den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt zu erreichen, können ebenfalls angewandt und der Wassergehalt wie oben verifiziert werden. Wenn das Gemisch den gewünschten Feuchtigkeitsgehalt aufweist, wird es der angegebenen Strahlendosis ausgesetzt. Die Vernetzung bis zu dem gewünschten Grad tritt dann während der Bestrahlung ein.
• Bei einer alternativen Ausführungsform wird die Vernetzung eingeleitet durch Erhitzen vor der Bestrahlung. Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird die Probe zunächst auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 1 %, oder vorzugsweise 0,5 bis 1 %, wie oben getrocknet und dann 4 bis 24 h auf etwa 60 bis 90ºC, vorzugsweise 70 bis 80ºC, bei 20 bis 80 % relativer Feuchtigkeit, vorzugsweise 50 bis 60 % relativer Feuchtigkeit, erwärmt, um die gewunschte Vernetzung zu erreichen, wie sie gemessen wird durch den Kompressionsmodul. Geeignete Werte für den Kompressionsmodul sind 10 bis 45 N/cm². Alternative Maßnahmen, um diese Vernetzung zu erreichen, sind ebenfalls möglich, einschließlich der Behandlung mit Vernetzungsmitteln wie Glutaraldehyd oder Formaldehyd. In jedem Falle wird die Probe diesen Vernetzungsbehandlungen unterworfen, bis ein geeignetes Maß an Vernetzung, angegeben durch den Kompressionsmodul, erzielt ist. Die Probe wird dann der Strahlung ausgesetzt.
• So wird bei der ersten oben angegebenen Ausführungsform angenommen, daß die Vernetzung während des Bestrahlungsverfahrens auftritt, aufgrund des Vorhandenseins von Feuchtigkeit in der Probe; bei der zweiten Arbeitsweise wird die Vernetzung vor der Bestrahlungsbehandlung durchgeführt und während der Sterilisierung nicht stark erhöht. Es ist jedoch klar, daß eine Kombination der beiden oben erwähnten Behandlungen angewandt werden kann, indem der Grad der Vernetzung bei der Behandlung vor der Bestrahlung verringert wird und der Feuchtigkeitsgehalt der Probe während der Bestrahlung so eingestellt wird, daß das gewünschte Verfahren vervollständigt wird. Die allgemeinen Aspekte der oben angegebenen bevorzugten Verfahren sind in Fig. 1 angegeben.
• Für die Bestrahlungsstufe werden die Massen, die wie oben angegeben für die Bestrahlungsbehandlung entsprechend vorbereitet sind, in Materialien verpackt, die mit γ-Strahlung verträglich sind, um sicherzustellen, daß die Sterilisierung der Proben erhalten bleibt und werden dann einer 0,5 bis 4 Mrad-Bestrahlung nach Standrardverfahren unterworfen. Die Proben sind dann verpackt in einer Form, die geeignet ist zur Rekonstitution unter sterilen Bedingungen und Anwendung bei einem Patienten. Für eine derartige Verwendung wird die Probe aus der Verpackung unter sterilen Bedingungen entnommen und in steriler Salzlösung oder vermischt mit Blut oder Knochenmark nach Wunsch vollgesaugt und für den gewünschten Zweck verwendet.
Verwendung der Masse
• Die erhaltene Masse wird verwendet, um die Knochenmasse zu vermehren und Knochendefekte auszufüllen, z.B. peridontale Knochentaschen, Aushöhlungen nach Zahnextraktion und Kiefernzysten. Ein wichtiges Beispiel für ein Auflageverfahren umfaßt die Verstärkung der Alveolarkante. Die Verfahren für chirurgische Implantationen sind bekannt. Zur Vermerhung der Alveolarkante wird die Masse unter dem Periosteum an Stellen eingesetzt, wo eine Vermehrung der Knochenmasse erwünscht ist. Bei orthopädischen und rekonstruktiven Anwendungen können auch Mineralien in Form von porösen Blöcken angezeigt sein, besonders wenn der Pfropf bzw. Block Spannung aushalten muß. Die Implantation von mit Collagen imprägnierten Blöcken wird ebenfalls nach chirurgischen Standrardverfahren durchgeführt.
Beispiele
• Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sind jedoch nicht zur Begrenzung ihres Umfangs gedacht.
Beispiel 1 Herstellung einer Grundmasse
• Eine Mineral/Collagen-Zubereitung wurde erhalten durch Vermischen von 65 Gewichtsteilen OrthoMatrix HA-1000 Hydroxyapatit mit 35 Gewichtsteilen Zyderm Collagenimplantat (65 mg/ml) ohne Lidocain. (Da ZCI eine 6,5 %ige Zubereitung von Collagen in Salzlösung ist, enthält die Endmasse 65 Teile HA, 2,3 Teile Collagen (0,065 x 35) und 32,7 Teile (35-2,3) Salzlösung, jeweils auf das Gewicht bezogen).
• Das Gemisch wurde gründlich vermischt und Anteile von 0,55 ml zu Blöcken extrudiert und unter einer laminaren Strömungshaube etwa 48 h bei 36 bis 37ºC getrocknet. Die erhaltene Zubereitung besaß einen Feuchtigkeitsgehalt von 0,87 %, gemessen nach dem Verfahren von Fischer, K., Angew. Chem. (1935) 48: 394. Die Masse enthält so 0,87 % Wasser, 3,37 % Collagen und 95,76 % Mineralstoff, jeweils auf das Gewicht bezogen, wie oben definiert.
Beispiel 2 Wirkung des Feuchtigkeitsgehalts
• Die nach Beispiel 1 hergestellten Blöcke wurden in Glasgefäße zur Wiederbefeuchtung gegeben. 20 Gefäße wurden bei 75 % relativer Feuchtigkeit und 35ºC etwa 24 h inkubiert, um Blöcke mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 1,86 % zu erhalten. Zehn dieser Blöcke wurden weiter 95 %iger relativer Feuchtigkeit bei 36 bis 43ºC wahrend 15 1/2 h unterworfen, um einen Feuchtigkeitsgehalt von 5,9 % zu erzielen.
• Die trockenen und wiederbefeuchteten Proben wurden verschiedenen Gesamtstrahlungsmengen im Bereich von 0,5 bis 3 Mrad ausgesetzt. Die Ergebnisse der Bestrahlung auf den Kompressionsmodul sind in Fig. 2a angegeben und die Wirkung auf die Trypsinempfindlichkeit ist in Fig. 2b gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß Proben enthaltend 1,86 % Feuchtigkeit durch das Bestrahlungsverfahren fester wurden in Beziehung auf den Kompressionsmodul während ihre Trypsinempfindlichkeit nicht merklich zunahm. Im Gegensatz dazu zeigten nicht wiederbefeuchtete Proben eine beachtliche Fragmentierung während der Bestrahlung und die Kompressionsfestigkeit wurde nicht meßbar verbessert. (Alle Proben zeigten eine mäßige Abnahme der Übergangstemperatur, gemessen durch DSC).
• Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei diesmal die Proben auf 1,28 % und 1,62 % Feuchtigkeitsgehalt befeuchtet wurden und man erhielt vergleichbare Ergebnisse, wie in den Fig. 3a bzw. 3b gezeigt. Wieder zeigten die Proben mit einem höheren Feuchtigkeitsgehalt eine geringere Fragmentierung während der Bestrahlung, entsprechend der Bestimmung der Trypsinempfindlichkeit, aber eine deutliche Erhöhung des Kompressionsmoduls während der Bestrahlung, wie in Fig. 3a gezeigt.
Beispiel 3 Wirkung der Vorbehandlung mit Wärme
• Die in Beispiel 1 hergestellten Proben wurden in Glasgefäße gegeben und 16 Gefäße mit einem Stopfen verschlossen und 48 h bei 80ºC und 50 bis 70 % RH behandelt. Die Wirkung der Bestrahlung auf diese wärmebehandelten Proben wurde verglichen mit nicht wärmebehandelten Proben, die jedoch den ursprünglichen Feuchtigkeitsgehalt von 0,87 % enthielten. Die Trypsinenpfindlichkeit der wärmebehandelten Proben nahm von einem Wert der 10 % nicht helixförmiges Collagen für nichtbestrahlte Proben zeigt auf ein Gehalt von 60 % nicht helixförmigen Bestandteilen für mit 3 Mrad bestrahlten Proben zu, im Gegensatz zu einer verhältnismäßig geringen Zunahme der Fragmentierung von 3 % Nichthelix-Charakter auf etwa 25 % bei 3 Mrad für die nicht wärmebehandelte Probe. Die Kompressionsfestigkeit der Probe wurde meßbar erhöht durch Wärmebehandlung und betrug etwa 35 N/cm² vor der Bestrahlung und behielt diesen Wert während der Bestrahlung bei.
• In einem getrennten Versuch wurden Proben, enthaltend 0,87 % Feuchtigkeit, nur 6 1/2 h auf 80ºC bei 50 bis 70 % RH erwärmt und zeigten ebenfalls einen Kompressionsmodul von 35 N/cm².
• So scheint es, daß die wärmebehandelten Materialien ihre Fähigkeit, Druck zu widerstehen, nach der Bestrahlung beibehalten, während sie eine erhöhte Trypsinempfindlichkeit zeigen.
Beispiel 4 Wirkung der Wärmehärtung allein
• Es wurden Proben wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das extrudierte Gemisch 72 h bei 26 bis 34ºC und 90 bis 95 % relativer Feuchtigkeit vor dem Trocknen, wie oben beschrieben, behandelt wurde, um einen Feuchtigkeitsgehalt von 0,48 bis 0,49 % zu erreichen. Wenn dieses präinkubierte Gemisch während unterschiedlicher Zeitdauern auf 80ºC bei 50 bis 70 % RH erhitzt wurde, zeigte es eine konsistente Zunahme in dem Kompressionsmodul von 15 N/cm² ohne Wärmebehandlung auf 25 N/cm² nach 4 h bei 80ºC, 30 N/cm² nach 8 h und 14 N/cm² nach 12 h. Daher ist die Wärmebehandlung wirksam zur Erhöhung der Kompressibilität von getrockneten Proben, ebenso wie die Anwendung von Strahlung, es tritt jedoch nicht notwendigerweise eine Sterilisierung auf.

Claims (14)

1. Biologisch verträgliche Collagen/Mineral-Masse, umfassend ein Gemisch enthaltend 2-40% rekonstituiertes fibrilläres Atelopeptidcollagen und 60-98% Calciumphosphatmineral, bezogen auf das Gewicht, ausschließlich Feuchtigkeit, wobei die Masse einen Druckmodul von mindestens 10 N/cm² und einen Sterilitäts-Sicherheitsfaktor von 10&supmin;&sup6; oder darunter aufweist, und das erhältlich ist durch Bestrahlen einer Collagen/Mineral-Masse, umfassend ein Gemisch aus 2-40% rekonstituiertem fibrillärem Ate1opeptid und 60-98% Calciumphosphatmineral, bezogen auf das Gewicht, außer Feuchtigkeit, und die während der Bestrahlung 1-6% Feuchtigkeit enthält, mit 0,5-4 Mrad γ -Strahlung.

2. Masse nach Anspruch 1, die einen Feuchtigkeitsgehalt von 0,5-6% aufweist.

3. Masse nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Collagengehalt des Gemisches 2-5% beträgt.

4. Masse nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die einen Druckmodul von 25-45 N/cm² aufweist.

5. Verfahren zur Herstellung eines biologisch verträglichen Knochenimplantats mit einem Druckmodul von mindestens 10 N/cm² und einem Sterilitäts-Sicherheitsfaktor von 10&supmin;&sup6; oder darunter, wobei das Verfahren umfaßt die Bestrahlung einer Collagen/Mineral-Masse, umfassend ein Gemisch aus 2-40% rekonstituiertem fibrillärem Atelopeptidcollagen und 60-98% Calciumphosphatmineral, bezogen auf das Gewicht, ausschließlich Feuchtigkeit, und die während der Bestrahlung 1-6% Feuchtigkeit enthält, mit 0,5-4 Mrad γ-Strahlung.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Masse während der Bestrahlung 1-2% Feuchtigkeit enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, umfassend das Trocknen einer Collagen/Mineral-Masse auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 1% und Rehydratisieren der Masse auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 1-6% vor der Bestrahlung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, umfassend das Rehydratisieren der Masse bei 35-45ºC und 50-95% RH während 6-24 h.

9. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, umfassend die Wärmebehandlung einer Masse, enthaltend 0,5-1% Feuchtigkeit, um eine Vernetzung zu erreichen, entsprechend einem Druckmodul von 10-45 N/cm² vor der Bestrahlung.

10. Verfahren nach Anspruch 9, umfassend die Wärmebehandlung der Masse während 4-24 h bei 60-90ºC und 20-80% RH.

11. Verfahren nach einein der Ansprüche 5 bis 10, wobei die Strahlungsdosis 1-3 Mrad beträgt.

12. Verfahren, um eine Collagen/Mineral-Masse mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 1-6% zu erhalten, wobei das Verfahren umfaßt das Trocknen eines Gemisches aus 2-40% rekonstituiertem fibrillärem Atelopeptidcollagen und 60-98% Calciumphosphatmineral, bezogen auf das Gewicht, ausschließlich Feuchtigkeit, auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 1%, und Rehydratisieren durch Inkubieren bei 35-45ºC und einer relativen Feuchtigkeit von 50-80%.

13. Collagen/Mineral-Masse nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12 zur Verwendung bei einem Verfahren der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Operation oder Therapie.

14. Verwendung einer Collagen/Mineral-Masse nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder hergestellt nach einem Verfahren nach einein der Ansprüche 5 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Operation oder Therapie.