DE3781672T2

DE3781672T2 - Indirekte kolorimetrische detektion eines analyten in einer probe unter zuhilfenahme des verhaeltnisses von lichtsignalen.

Info

Publication number: DE3781672T2
Application number: DE8787305385T
Authority: DE
Inventors: Gary H Krauth
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1987-01-12
Filing date: 1987-06-17
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2007-06-18
Also published as: DK272687D0; EP0278149B1; FI88340C; AU600274B2; AU7377187A; ES2035062T3; JPS63180858A; NZ220508A; FI88340B; US4954435A; DE3781672D1; DK272687A; FI872432A0; EP0278149A3; FI872432A; CA1284947C; GR3006083T3; EP0278149A2; JPH067129B2; DK169710B1

Description

1. Gebiet der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ermittlung eines Analyts in einer Probe und betrifft spezieller ein Verfahren für die Konzentrationsmessung eines Analyts in einer Probe unter Verwendung eines Enzymimmunoassays durch indirekte kolorimetrische Ermittlung.

2. Beschreibung des Hintergrundes.

Assays für die kolorimetrische Ermittlung von Analyten sind üblich und gut bekannt. Insbesondere werden Enzymimmunoassays (EIA) und Enzym-gebundene Immunosorbens-Assays (ELISA) für die kolorimetrische Ermittlung eines in einer Testprobe vorhandenen Antigens (Analyts) verwendet. Bei diesen Enzymimmunoassay-Verfahren werden gegen das Testantigen oder den Analyt spezifische Antikörper an eine feste Phase gebunden, die gewöhnlich ein klares oder transparentes Plastikröhrchen ist. Bei vielen, aber nicht allen dieser Enzymimmunoassays erfolgt eine Sandwich- Bildung zwischen dem Festphasen-Antikörper, dem Antigen und dem enzymmarkierten Antikörper, so daß die Menge des an die Festphase gebundenen enzymmarkierten Antikörpers direkt proportional der Antigenkonzentration in der Probe ist. Überschüssige, nicht umgesetzte Reagentien werden normalerweise aus dem Röhrchen ausgewaschen, und Substrat wird zugegeben, um die Enzymreaktion zu bewirken.
Neben der Sandwich-Bildung, die typischerweise mit Protein- Antigenen erfolgt, können kompetitive Tests durchgeführt werden. Eine begrenzende Menge an Antikörper wird auf die feste Phase gebracht, und sowohl Probe als auch ein enzymmarkiertes Hapten werden gleichzeitig inkubiert. Wenn kein Analyt in der Probe ist, bindet das enzymmarkierte Hapten maximal an die feste Phase. Mit steigender Menge an Analyt in der Probe konkurriert es mit dem enzymmarkierten Hapten um die Bindung an die feste Phase, so daß das Ausmaß an enzymmarkierter Hapten-Bindung der Analyt-Konzentration umgekehrt proportional ist. Kompetitive Assays oder Tests können sowohl für Haptene als auch Protein-Analyte durchgeführt werden, aber nur Protein-Analyte sind einem Assay oder Test des Sandwich-Typs zugänglich.
Bei kolorimetrischen Ermittlungs- oder Nachweistechniken kann das Substrat eine chromogene Substanz aufweisen, die auf das Enzym anspricht, so daß die chromogene Substanz aktiviert wird. Dadurch wird genügend Farbe in der Flüssigkeitslösung innerhalb des Röhrchens gebildet, die ermittelt oder nachgewiesen werden kann. Tests dieser Art werden häufig durch Messen der Farberzeugung innerhalb des Röhrchens durch Verwendung eines Spektrophotometers vervollständigt. Für den Fall, daß Fluorochrome als nachzuweisende Substanzen verwendet werden, können Fluoreszenzmikroskope sowie Fluorometer für die Durchführung der Testmethoden verwendet werden. Ein Enzymimmunoassay unter Verwendung von Tetramethylbenzidin (TMB) als Chromogen beim kolorimetrischen Nachweis eines Antigens ist in der US-PS 4 503 143 beschrieben.
Bei der Verwendung eines Spektrophotometers für die kolorimetrische Ermittlung eines Analyts in einer Probe bestehen eine Anzahl von Faktoren, die den Nachweis von mit der chromogenen Reaktion verbundenem Licht beeinflussen können. Beispielsweise ist die Lichtquelle für einen in das die zu testende Probe enthaltende Röhrchen einfallenden Lichtstrahl häufig eine Lampe, z. B. eine Wolfram-Lampe, wie in der US-PS 4 516 856 beschrieben. Es ist nicht ungewöhnlich, Schwankungen in der Lampenleistung zu haben, die das in einem Spektrophotometer nachgewiesene Licht oder in einem Photomultiplier zum Nachweis von Fluoreszenzemissionen gesammeltes Licht beeinflussen können. Die Anordnung des die zu testende Probe enthaltenden Röhrchens kann von Test zu Test unterschiedlich sein, was auch einen Einfluß auf die Testergebnisse hat. Weitere Faktoren, wie die Länge des Lichtweges und die optische Qualität des Röhrchens, können von Test zu Test Unterschiede hervorrufen, die die Testergebnisse beeinflussen. Es wird davon ausgegangen, daß eine Technik, die die vorgenannten Variablen bei kolorimetrischen Nachweismethoden korrigiert oder vermeidet, bei der Verbesserung der Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit dieser Testverfahren äußerst wünschenswert wäre.
Verbesserungen bei fluorometrischen Tests sind in der US-PS 4 495 293 beschrieben worden. Doch ist Aufgabe des vorgenannten Patents, Verbesserungen bei der Fluoreszenzintensität des emittierten Lichts zu schaffen, was mit der Konzentration des Liganden in Beziehung steht. Eine andere Technik für die Tests auf Makromoleküle durch Immunonephelometrie ist von DeGrella et al. in "A Nephelometry System for the Abbott TDxTM", Clin. Chem. 31/9, 1474-1477 (1985), beschrieben. Eine nephelometrische Methode für die Überwachung chromogener Reaktionen ist in dieser Veröffentlichung beschrieben, sie stützt sich auf Streuungsenergiedämpfung zur Messung von Serumproteinen. In dem Artikel von DeGrella et al. finden sich jedoch keine Lehren oder Empfehlungen, die für ein Korrigieren der Variablen, wie oben ausgeführt, die die Testmessungen beeinflussen, nützlich wären.
Folglich wird immer noch nach Verbesserungen bei Tests gesucht, die sich auf den kolorimetrischen Nachweis der Analyte von Intresse stützen. Die vorliegende Erfindung ist auf eine solche Verbesserung gerichtet.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren unter Verwendung eines Enzymimmunoassays für die Messung der Konzentration eines Analyts in einer Probe durch indirekte kolorimetrische Ermittlung zur Verfügung gestellt, umfassend:
a) Kombinieren eines Peroxidase markierten Antikörperkonjugats, einer nach einem Analyt zu testenden Probe und eines an die inneren Oberflächen eines transparenten Plastikrohrs gebundenen Antikörpers, so daß das Analyt sich mit dem gebundenen Antikörper und dem Konjugat zur Bildung eines immunologischen Komplexes in fester Phase verbindet;
b) Beimischen einer Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid enthaltenden flüssigen Lösung in das genannte Rohr, um eine Reaktion mit dem immunologischen Komplex hervorzurufen und das Tetramethylbenzidin für eine kolorimetrische Antwort zu aktivieren;
c) Beifügen einer sauren, Teilchen enthaltenden Lösung, die die Reaktion beendet und als Ergebnis eine stabile Teilchensuspension hervorruft, zu der Mischung;
d) Durchleiten eingestrahlten Lichtes durch das Rohr in die Suspension hinein bei einer Vielzahl von Wellenlängen, wobei eine erste Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes im wesentlichen bei 450 nm liegt, wo aktiviertes Tetramethylbenzidin durch Absorption die von dem eingestrahlten Licht gestreute Lichtmenge als eine Funktion der zunehmenden Konzentration des vorhandenen Analytes dämpft, und eine zweite Wellenlänge von der ersten Wellenlänge spektral entfernt ist, bei der im wesentlichen keine Dämpfung der Lichtstreuung bei der Zunahme der Analytkonzentration auftritt;
e) Ermitteln des durch die Suspension bei der ersten und zweiten Wellenlänge gestreuten Lichtes und Bilden eines Verhältnisses der beiden betreffenden Wellenlängen; und
f) Vergleichen der Größe des gebildeten Verhältnisses mit der Größe eines Verhältnisses, das einer Lichtstreuungsermittlung zugeordnet ist, wenn die Schritte (a) bis (e) mit Proben ausgeführt werden, die bekannte Konzentrationen des Analytes beinhalten, wodurch die Analytkonzentration in der Probe gemessen wird.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die Konzentrationsmessung eines Analytes in einer Probe unter Verwendung eines Enzym-Immunoassays durch indirekte kolorimetrische Ermittlung zur Verfügung gestellt, umfassend das:
a) Kombinieren eines Peroxidase markierten Antikörperkonjugats, einer nach einem Analyt zu testenden Probe und eines an die inneren Oberflächen eines transparenten Plastikrohrs gebundenen Antikörpers, so daß das Analyt sich mit dem gebundenen Antikörper und dem Konjugat zur Bildung eines immunologischen Komplexes in fester Phase verbindet;
b) Beimischen einer Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid enthaltenden flüssigen Lösung in das Rohr, um eine Reaktion mit dem immunologischen Komplex hervorzurufen und das Tetramethylbenzidin für eine kolorimetrische Antwort zu aktivieren;
c) Beifügen eines ersten Fluorophors zu der Mischung, um Fluoreszenz bei oder nahe der Absorptionsmaxima von aktiviertem Tetramethylbenzidin als eine Funktion der zunehmenden Konzentration des in der Probe vorhandenen Analytes hervorzurufen;
d) Beifügen eines zweiten Fluorophors zu der Mischung, das im wesentlichen, keine Dämpfung seiner Fluoreszenz zeigt, wenn die Analytkonzentration zunimmt und bei einer spektral von der des aktivierten Tetramethylbenzidin entfernten Wellenlänge Fluoreszenz hervorruft;
e) Durchleiten eingestrahlten Lichts durch das Rohr in die zuletzt erwähnte Mischung hinein bei einer Vielzahl von Wellenlängen, wobei die Wellenlängen eine Wellenlänge bei oder nahe den Absorptionsmaxima von aktiviertem Tetramethylbenzidin und die Anregung des ersten und zweiten Fluorophors bewirkende Wellenlängen aufweisen;
f) Ermitteln der durch die Fluorophore ausgestrahlten Fluoreszenz und Bilden eines Verhältnisses der zwei Fluoreszenzwellenlängen; und
g) Vergleichen der Größe des gebildeten Verhältnisses mit der Größe eines Verhältnisses, das der Fluoreszenzermittlung zugeordnet ist, wenn die Schritte (a) bis (f) mit Proben ausgeführt werden, die bekannte Konzentrationen des Analytes beinhalten, wodurch die Analytkonzentration in der Probe gemessen wird.
Nach den Grundsätzen der vorliegenden Erfindung erfolgt die kolorimetrische Ermittlung unter Anwendung indirekter Techniken, wie des Sammelns von Lichtstreuungs- oder Fluoreszenz-Signalen. Die Prüfung des Verhältnisses von Licht liefert ein System, das das Ausmaß an in einem Test, wie einem Enzymimmunoassay, gebildeter Farbe, indirekt mißt. Weiter liefert die Verwendung eines Verhältnisses von Lichtsignalen, wobei ein Signal des Verhältnisses das Reporter- oder Meldesignal und das andere ein Referenz- oder Bezugssignal ist, einen Korrekturmechanismus zum Verhindern solcher Variabler, wie Fluktuation bei der abgegebenen Lampenleistung, Schwankungen in der Anordnung, im Durchmesser oder der optischen Qualität des Röhrchens. Ferner überwindet die Verwendung des oben beschriebenen Verhältnisses auch Unterschiede in der Konzentration des teilchenförmigen Materials, das dem Gemisch für Lichtnachweiszwecke zugesetzt wird, wenn Dämpfung der Lichtstreuung angewandt wird. Ein weiterer Vorteil der Zugabe von teilchenförmigem Material zu dem obigen Gemisch ist der, daß die Teilchen ausgewählt werden können, um eine stabile Suspension zu bilden, deren Lichtstreuung oder sonstiges Lichtsignalvermögen Temperatur-unempfindlich ist.
Daher erlaubt die vorliegende Erfindung die indirekte kolorimetrische Ermittlung der Analytkonzentration durch Messung des Grades der Lichtsignal-, vorzugsweise Lichtstreuungs- oder -Fluoreszenz-Dämpfung. Außer dem Negieren der problematischen Variablen, wie oben erwähnt, erlaubt die bevorzugte erfindungsgemäße Methode einen empfindlichen Nachweis des Analyts von Interesse, da niedrige Konzentrationen der bevorzugten, bei der vorliegenden Methode verwendeten chromogenen Substanzen den Grad der Lichtstreuung oder Fluoreszenz beeinflussen. Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der nachfolgenden näheren Beschreibung.

Kurze Beschreibung der Figuren.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Messung der Lichtstreuung bei drei Wellenlängen als Funktion der Konzentration von oxidiertem Tetramethylbenzidin (TMB);
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung von zwei Verhältnissen unterschiedlicher Wellenlängen von Lichtstreuung, gemessen als Funktion der Konzentration an oxidiertem Tetramethylbenzidin (TMB), nach den Grundsätzen der vorliegenden Erfindung;
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung eines Verhältnisses der Lichtstreuung, gemessen als Funktion der Konzentration an Humanchoriongonadotropin (hCG), unter Ausführung der Grundsätze der vorliegenden Erfindung bei einem Enzymimmunoassay;
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung eines Verhältnisses von Lichtstreuung, gemessen als Funktion der Konzentration an Human-luteinisierendem Hormon (hLH), unter Ausführung der Grundsätze der vorliegenden Erfindung bei einem Enzymimmunoassay;
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung eines Verhältnisses von Fluoreszenzsignalen, gemessen als Funktion der Konzentration an Humanchoriongonadotropin (hCG), unter Ausführung der Grundsätze der vorliegenden Erfindung bei einem Enzymimmunoassay;
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung eines Verhältnisses von Fluoreszenzsignalen, gemessen als Funktion der Konzentration an Human-thyroidstimulierendem Hormon (hTSH), unter Ausführung der Grundsätze der vorliegenden Erfindung bei einem Enzymimmunoassay; und
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung eines Verhältnisses von Fluoreszenzsignalen, gemessen als Funktion der Konzentration an Thyroxin (T&sub4;), unter Ausführung der Grundsätze der vorliegenden Erfindung bei einem Enzymimmunoassay des kompetitiven Typs.
Es liegt in der Natur der vorliegenden Erfindung, eine Verbesserung vorzugsweise jener Enzymimmunoassays zu liefern, die chromogene Substanzen für die kolorimetrische Ermittlung von Analyten, einschließlich Antigenen und Antikörpern, einsetzen. Die durch die vorliegende Erfindung geschaffenen Verbesserungen stehen jedoch, wie oben ausgeführt, im Zusammenhang mit einer Technik, die die durch den Test erzeugte Farbe indirekt bestimmt, um die Analytkonzentrationen der Probe zu bestimmen.
Statt sich auf die direkte Messung der Farberzeugung unter Verwendung eines Spektrophotometers oder dgl. zu stützen, wendet die vorliegende Technik Fluoreszenz- oder Lichtstreuungsmessungen bei der Bestimmung der in der Probe vorliegenden Analytmenge an. Es wurde festgestellt, daß der Grad des von der dem Test unterzogenen flüssigen Probe gestreuten Lichts oder der von ihr emittierten Fluoreszenz als Funktion der Konzentration der beim Enzymimmunoassay verwendeten chromogenen Substanz gedämpft werden kann. Eine solche Dämpfung tritt ein, wenn die Wellenlänge des einfallenden Lichts die gleiche oder im wesentlichen die gleiche oder ähnlich der von der chromogenen Substanz maximal absorbierten Wellenlänge ist. Daher steigt mit steigender Konzentration der chromogenen Substanz das Ausmaß der Absorption einfallenden Lichts, während der Grad der Lichtstreuung oder Fluoreszenz abnimmt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete chromogene Substanz ist ein Tetramethylbenzidin (TMB) in Wasserstoffperoxid. Wenn TMB als Substrat in einem Enzymimmunoassay eingesetzt wird, bei dem das Enzym Peroxidase ist, wandelt das Enzym das TMB in Gegenwart eines Co-Substrats, Wasserstoffperoxid, in eine oxidierte Form um. Bei neutralem pH zeigt oxidiertes TMB zwei Absorptions-Hauptmaxima im sichtbaren Bereich des Spektrums. Ein Absorptionsmaximum ist bei etwa 450 nm, das andere Maximum praktisch bei 655 nm zentriert. Nach Ansäuern mit einer starken, nichtoxidierenden Säure verschwindet die Absorption bei 655 nm, während die Bande bei 450 nm bleibt, aber mit höherem Extinktionkoeffizienten (s. E.S. Bos et al., 3,3',5,5'- tetramethylbenzidine as an Ames Test Negative Chromogen for Horse-Radish Peroxidase in Enzyme Immunoassay, Journal of Immunoassay 2, 187 (1981)).
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird, anstelle der Messung der von der chromogenen Substanz, TMB, gebildeten Farbe, ein Lichtsignal, wie Lichtstreuung, nachgewiesen. Der Zusatz einer Lichtstreuungsquelle, wie von in der Flamme erzeugten Siliciumdioxid-Teilchen oder Polystyrol-Mikroperlen, zu dem oxidierten TMB, führt zu einer Dämpfung der Lichtstreuung, gemessen bei 450 nm, als Funktion der Menge an vorhandenem oxidiertem TMB und somit zur indirekten Messung der Analytkonzentration der getesteten Probe. Die Dämpfung der Lichtstreuung, gemessen bei 450 nm, als Funktion der Konzentration an oxidiertem TMB ist in Fig. 1 veranschaulicht. Die Schwächung der Lichtstreuung bei 450 nm steht in Beziehung zu den Absorptionseigenschaften der chromogenen Substanz. Eigentlich steigt mit steigender Konzentration an oxidiertem TMB das Ausmaß an Lichtabsorption, und das Ausmaß an Lichtstreuung sinkt, wenn die Wellenlänge des einfallenden Lichts die gleiche ist wie die Wellenlänge der Maximumabsorption des oxidierten TMB, in diesem Falle bei 450 nm. Andererseits ist Fig. 1 zu entnehmen, daß das bei zwei anderen Wellenlängen, von der Wellenlänge maximaler Absorption des TMB spektral entfernt, gemessene Streulicht über den angegebenen Konzentrationsbereich hinweg nicht gedämpft wird. Tatsächlich kann, da die Ermittlung der Lichtstreuung bei 560 und 660 nm über den Konzentrationsbereich hinweg praktisch konstant bleibt, die Lichtstreuung bei diesen beiden Frequenzen als internen Bezugs-Wellenlängen verwendet werden, da ihre Größen von der Konzentration der lichtabsorbierenden Substanz unabhängig sind. Folglich kann mit dem bei der Wellenlänge maximaler Absorption der chromogenen Substanz und bei einer anderen, von der Wellenlänge maximaler Absorption spektral entfernten Wellenlänge, die unabhängig von der Konzentration der chromogenen Substanz ist, gemessenen Lichtstreuung ein Verhältnis gebildet werden. Diese Lichtstreuungsverhältnisse, bestimmt als Funktion der Konzentration an oxidiertem TMB, sind in Fig. 2 veranschaulicht.
In Fig. 2 ist zu ersehen, daß zwei Verhältnisse gemessen worden sind, eines bei 450 nm/560 nm und das andere bei 450 nm/660 nm. Diese beiden Verhältnisse vollziehen die in Fig. 1 veranschaulichte Dämpfungskurve des oxidierten TMB nach. Fig. 2 jedoch zeigt, daß die Genauigkeit des 450 nm/556 nm- Verhältnisses etwas besser ist als das 450 nm/660 nm- Verhältnis. Daraus wird verständlich, daß Lichtstreuung bei anderen Frequenzen als 560 nm und 660 nm gemessen werden kann, um Verhältnisse zu bilden, bei denen eine der Wellenlängen von der Konzentration der chromogenen Substanz unabhängig ist. Durch die Erstellung des Verhältnisses von Lichtstreuung bei solchen Frequenzen, wie in Fig. 2 veranschaulicht, wird eine interne Korrektur für das Ermittlungs- bzw. Nachweissystem geschaffen, die Unterschiede in der Licht-Weglänge, optischen Qualität des Probenröhrchens, Röhrchenanordnung, Schwankungen in der Ausgangsleistung der Lampe und selbst Unterschiede in der Konzentration der der Probe zugesetzten Lichtstreuungsquelle negiert.
Eine andere indirekte kolorimetrische Technik für die Ermittlung bzw. den Nachweis eines Analyts in einer Probe umfaßt die Verwendung von zwei Fluorophoren. Statt die Lichtstreuungseigenschaften der die chromogene Substanz, wie TMB, enthaltenden flüssigen Lösung zu messen, wird die Fluoreszenz gemessen. Einer der Fluorophore dient als Reporter- oder Meldesignal, während der andere Fluorophor als Referenz- oder Bezugssignal dient.
Die bei dieser Lösung verwendeten Fluorophore werden so ausgewählt, daß ihre jeweiligen Wellenlängen der Anregung und Emission spektral wesentlich voneinander getrennt sind. Unter Beachtung dieses Merkmals wird das als Reporter bzw.
Melder dienende Fluorophor so gewählt, daß seine Wellenlängen der Anregung und Emission an oder praktisch nahe den Extinktionsmaxima der chromogenen Substanz liegen. Beispielsweise liegen, wie oben ausgeführt, die Extinktionsmaxima von oxidiertem TMB bei 450 nm. Es wurde festgestellt, daß der Grad der Fluoreszenz als Funktion der Konzentration der chromogenen Substanz, wie z. B. des oxidierten TMB, gedämpft wird, wenn die Wellenlänge entweder der Anregung oder der Emission des Fluorophors an oder praktisch nahe der Wellenlänge liegt wie die, die maximal von dem oxidierten TMB absorbiert wird. Mit steigender Konzentration der chromogenen Substanz steigt das Ausmaß der Absorption einfallenden Lichts, während der Grad der Fluoreszenz abnimmt.
Andererseits wird der zweite Fluorophor so ausgewählt, daß er eine von der die Absorptionsmaxima der chromogenen Substanz verkörpernden Wellenlänge spektral entfernte Wellenlänge der Anregung oder Emission hat. Die Messung der von dem zweiten oder Referenz-Fluorophor in einem Spektralbereich emittierten Fluoreszenz, der das Absorptionsspektrum der chromogenen Substanz nicht überlappt, ist unabhängig von der Konzentration der absorbierenden Spezies. Durch Prüfen des Verhältnisses der Fluoreszenz des Reporter-Fluorophors an oder praktisch nahe der Wellenlänge maximaler Extinktion der chromogenen Substanz zu der des Referenz-Fluorophors in einem vom Absorptionsspektrum der chromogenen Substanz spektral entfernten Bereich liefert eine Meßtechnik, die das Ausmaß an in einem Enzymimmunoassay erzeugter Farbe indirekt mißt.
Die Stützung auf das Verhältnis von Fluoreszenzsignalen, wobei ein Fluorophor der Reporter und der andere Fluorophor die Referenz ist, liefert die gleichen vorteilhaften Merkmale wie das zuvor beschriebene Lichtstreuungsverhältnis für die indirekte kolorimetrische Ermittlung des Analyts in einer Probe.
Wird die Fluoreszenzverhältnis-Technik angewandt, ist die bevorzugte chromogene Substanz TMB, die, wenn oxidiert, ein Absorptionsmaximum praktisch bei 450 nm hat. Eine Anzahl von Fluorophoren steht zur Verfügung, die eine Wellenlänge der Anregung oder Emission an oder praktisch gleich den Absorptionsmaxima von oxidiertem TMB haben. Beispielsweise sind Cumarin 343, 9-Aminoacridin-Hydrochlorid und 8- Methoxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (MPT) gute Beispiele für Reporter-Fluorophor, wobei MPT bevorzugt ist. MPT wird bei etwa 395 nm angeregt und hat eine Peak-Emission bei etwa 430 nm. Diese Wellenlängen liegen relativ nahe den Absorptionsmaxima von oxidiertem TMB bei 450 nm.
Verschiedene Fluorophore können auch als Referenz- oder Bezugsfluorophore ausgewählt werden, darunter Oxazin 170- Perchlorat und, vorzugsweise Sulforhodamin 101 (SR 101). SR 101 wird bei 589 nm angeregt und liefert eine Peak-Emission bei etwa 605 nm. So ist ersichtlich, daß die Anregungs- und Emissionswellenlängen von SR 101 von der Wellenlänge der Absorptionsmaxima des oxidierten TMB sowie den Wellenlängen der Anregung und Emission des Reporter-Fluorophors, wie MPT, spektral wesentlich getrennt oder entfernt sind. Diese spektrale Trennung ermöglicht die Ermittlung oder den Nachweis eines Fluoreszenz-Signals, was unabhängig von der Konzentration der absorbierenden Spezies ist.
Weiter sollte hinsichtlich des Referenz-Fluorophors dieser so gewählt werden, daß keine oder praktisch keine Dämpfung des Signals in Relation zu den unterschiedlichen Konzentrationen der chromogenen Substanz, wie TMB, vorliegt. In dieser Hinsicht dient der Referenz-Fluorophor als internes Bezugssystem, das eine Anzahl Faktoren korrigiert, einschließlich Röhrchenanordnung, Röhrchendurchmesser oder optischer Qualität. Daher sollte bei der Auswahl der jeweiligen Reporter- und Referenz-Fluorophore der Reporter-Fluorophor eine Dämpfung seines Fluoreszenzgrades als Funktion der Konzentration der chromogenen Substanz an oder nahe seinen Absorptionsmaxima haben, während der Grad der Fluoreszenz des Referenz-Fluorophors als Funktion der Konzentration der chromogenen Substanz relativ konstant bleiben sollte. Bemerkt sei, daß manche Fluorophore, wie SR 101, als Referenz-Fluorophore dienen können, so lange der Grad der Fluoreszenz als Funktion der chromogenen Substanz kurzzeitig nach Zugabe des stoppenden Reagens, z. B. weniger als 2 min, einigermaßen konstant bleibt.
Für eine Reihe von Analyten sind Enzymimmunoassays die Tests der Wahl für die indirekten kolorimetrischen Ermittlungsmethoden gemäß der Erfindung. Beispielsweise werden Analyte, wie Humanchoriongonadotropin (hCG) beim Schwangerschaftstest von Frauen bestimmt; luteinisierende Hormone (hLH) werden beim Test der Fruchtbarkeit von Frauen getestet; Thyroid-stimulierendes Hormon; Thyroxin; und Assays zum Testen bestimmter Bakterien und Mikroorganismen werden unter Anwendung von Enzymimmunoassays und kolorimetrischen Ermittlungs- bzw. Nachweistechniken durchgeführt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Ermittlung oder den Nachweis der vorerwähnten Analyte beschränkt, da solche Analyte lediglich beispielhaft für die vielen verschiedenen Arten von Analyten sind, die unter Anwendung der erfindungsgemäßen indirekten Lichtermittlungstechniken gemessen werden können.
Zusätzlich zur Verwendung von TMB in Wasserstoffperoxid als chromogener Substanz ist klar, daß andere chromogene Substanzen erfindungsgemäß verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen Techniken, wie oben beschrieben, können auf verschiedene Enzym- oder Substratsysteme durch Messen der Lichtstreuung oder -Fluoreszenz an oder nahe der Wellenlänge maximaler Extinktion der chromogenen Substanz und Referenzieren bei einer Wellenlänge, die von ihrem Absorptionsspektrum entfernt ist und von der Konzentration des Analyts von Interesse unabhängig ist, angewandt werden. So umfassen neben TMB weitere repräsentative chromogene Substanzen die Benzidine, o-Phenylendiamin, o-Tolidin und ABTS.
Bei den hier betrachteten EIA-Arbeitsweisen wird das Enzym zum Markieren des Analyts, wie eines Antikörpers oder Antigens, und zum Katalysieren der chromogenen Reaktion eingesetzt. Wünschenswerte Enzyme sind die Oxidoreductasen, insbesondere die Häm-Enzyme, einschließlich Catalase und Peroxidase. Diese Enzyme haben charakteristische Absorptionsspektren aufgrund ihrer prosthetischen Häm- Gruppen und zeigen vorübergehende Änderungen in ihren Spektren nach Mischen mit Wasserstoffperoxid, ihrem Substrat. Ein besonders erwünschtes Enzym, das TMB katalysiert, ist Meerrettich-Peroxidase.
Bezüglich der Teilchen, die der Testprobe als Quelle für Lichtstreuung zugesetzt werden, stehen eine Anzahl von Alternativen zur Verfügung. Mikroteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich zwischen 0,010 und 0,014 um liegen bevorzugt in der flüssigen Lösung vor, durch die Licht gelenkt wird, so daß, wenn das Licht diese Teilchen trifft, ein Streueffekt resultiert. Mikroperlen, wie die aus Polystyrol oder anderen Materialien etwa gleicher Dichte wie die Dichte von Wasser sind als Quelle für die Schaffung des Lichtstreueffekts geeignet. Vorzugsweise haben solche Mikroperlen praktisch keine Sekundäremissionseigenschaften, die die Anzeigen oder Ablesungen verzerren oder verfälschen können. Am meisten bevorzugt jedoch wurde gefunden, daß Mikroteilchen im oben genannten Größenbereich aus in der Flamme gebildetem Siliciumdioxid erfindungsgemäß äußerst zufriedenstellend wirken. Es wurde gefunden, daß eine Verdünnung von solchem Siliciumdioxid in Zitronensäure eine Lichtstreuungsreaktion liefert, die linear mit der Konzentration an in der Flamme gebildetem Siliciumdioxid bis hinauf zu 0,3 % (Gew./Vol.) linear verläuft. Tatsächlich kann die Menge an verschiedenen Röhrchen zugesetztem solchem Siliciumdioxid variieren, ohne die Lichtstreuungswerte zu beeinflussen, da die Messung der Lichtstreuung als ein Verhältnis solche Unterschiede kompensiert.
Wohlbekannte Enzymimmunoassay-Techniken können hier angewandt werden. Z.B. weist ein Teströhrchen oder dergleichen, typischerweise aus klarem oder transparentem Kunststoff, einen an seine inneren Oberflächen gebundenen Antikörper für das Antigen oder den Analyten von Interesse auf. In einem oder mehreren Schritten werden ein Enzymmarkiertes Antikörper-Konjugat und eine auf den Analyten zu testende flüssige Probe im Röhrchen zusammengebracht, so daß der Analyt an den gebundenen Antikörper und an das Konjugat bindet und einen immunologischen Komplex in fester Phase bildet. Dieser immunologische Komplex ist repräsentativ für eine Sandwich-Formation, die zwischen dem Festphasen-Antikörper, dem Analyten und dem Enzymmarkierten Antikörper eintritt, so daß die Menge des an die feste Phase gebundenen Enzym-markierten Antikörpers der Analytkonzentration in der Probe direkt proportional ist. Nicht-umgesetzte Reagentien werden üblicherweise aus dem Röhrchen ausgewaschen, und Substrat wird dann zugesetzt, um die Enzymreaktion zu starten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Enzymreaktion die Zugabe sowohl von Wasserstoffperoxid als auch TMB zum Röhrchen, wodurch das TMB aktiviert (oxidiert) wird, was im Röhrchen nach einer gegebenen Zeit zur Farbbildung führt. Die Konzentration des oxidierten TMB im Röhrchen ist der Analytkonzentration in der Probe direkt proportional. Dann wird eine saure Lösung in das Röhrchen gegeben, um die Enzymreaktion zu beenden. Tests dieses Typs können durch Messen des Lichtsignals unter Verwendung eines Spektrophotometers oder Fluorometers wiedergegeben werden. Diese Farbnachweisinstrumente sind gut bekannt und umfassen typischerweise eine Lampe als Lichtquelle, eine Stufe oder Vorrichtung zum Halten des Teströhrchens, eine Photomultiplier-Röhre und Optiken zum Nachweis des Lichts. Soweit Streulicht in jeder Richtung nachgewiesen werden kann, kann die Anordnung der Lichtnachweiseinrichtungen innerhalb des Instruments variieren. Ist z. B. ein Fluorometer zu verwenden, wird die Fluoreszenz unter 90º relativ zum einfallenden Lichtstrahl nachgewiesen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann die Optik des Fluorometers so modifiziert werden, daß Lichtstreuung anstelle von Fluoreszenz unter 90º relativ zum einfallenden Lichtstrahl nachgewiesen wird. Inspektrophotomern kann Farbe in Vorwärtsrichtung relativ zum einfallenden Lichtstrahl gemessen werden; solche Instrumente können modifiziert werden, um Streuung statt Farbe in Vorwärtsrichtung nachzuweisen. Lichtstreuung kann ebenso in anderen Richtungen nachgewiesen werden.
Wenn als Lichtquelle eine Lampe, wie eine Wolframlampe, verwendet wird, liefert sie typischerweise einen spektralreichen Lichtstrahl mit Wellenlängen zwischen 350 nm und 800 nm. Bei einem solchen spektralreichen Licht kann es nötig sein, den Lichtstrahl auf der einfallenden Seite des Teströhrchens oder auf der Streuseite oder auf beiden zu filtern. Durch Verwendung der geeigneten Filter kann das höchst-mögliche Signal, ob Lichtstreuung oder Fluoreszenz, bei der Wellenlänge maximaler Absorption durch die chromogene Substanz erhalten werden. Auswahl und Anordnung der geeigneten Filter hängt von der chromogenen Substanz der Wahl ab, da die Wellenlänge der Dämpfung und die Referenzwellenlänge von Substanz zu Substanz variieren kann. Filterauswahl und -anordnung kann vom Fachmann auf dem Optikgebiet leicht vorgenommen werden.
Die folgenden Beispiele sind beispielhaft für die erfindungsgemäßen Techniken, es ist aber klar, daß die Erfindung als nicht darauf beschränkt zu verstehen ist.

Beispiel I

Ein für Licht transparentes Polystyrol-Röhrchen war auf seinen inneren Oberflächen mit Anti-hCG überzogen. In dieses Röhrchen wurden 100 ul einer 1:50 Verdünnung antihCG-Peroxydase-markierten Konjugats und 100 ul einer auf hCG zu testenden und dieses vermutlich enthaltenden flüssigen Probe gegeben. Die Reaktion konnte 30 min bei 37ºC ablaufen, und das Inkubat wurde dann abgesaugt. Nach jeweils dreimaligem Waschen des Röhrchens mit 2 ml 0,05% Tween in Wasser wurden 200 ul Substrat, sowohl Tetramethylbenzidin (TMB) als auch Wasserstoffperoxid enthaltend, zugegeben, und das Gemisch konnte 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Das Röhrchen wurde dann mit 1 ul Zitronensäure, 0,3% (Gew./Vol.) in der Flamme gebildeter Siliciumdioxidteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 0,014 um enthaltend, versetzt. Das Röhrchen wurde dann in ein optisch modifiziertes Fluorometer gesetzt und Licht durch die Röhrchenwandungen in die Suspension gelenkt. Bei 90º relativ zum einfallenden Lichtstrahl gestreutes Licht wurde sowohl bei 450 nm als auch bei 560 nm nachgewiesen, und die Ergebnisse wurden als Verhältnis der beiden Wellenlängen ausgedrückt. Eine Standardkurve wurde unter Anwendung der gleichen Schritte, wie oben ausgeführt, mit bekannte Konzentrationen an hCG enthaltenden Proben erstellt, und die damit verbundenen Daten sind in der Kurve in Fig. 3 wiedergegeben. Durch Vergleich des Verhältnisses der unbekannten Probe, ausgedrückt durch das Instrument, mit dem Verhältnis der Standardkurve von Fig. 3 wurde die hCG-Konzentration in der unbekannten Probe bestimmt.

Beispiel II

Ein für Licht transparentes Polystyrol-Röhrchen hatte mit anti-hLH überzogene Oberflächen. In das Röhrchen wurden 100 ul einer 1:50-Verdünnung von anti-hLH-Peroxidase-markiertem Konjugat und 100 ul einer auf hLH zu testenden und dieses vermutlich enthaltenden Probe gegeben. Die Reaktion konnte 1 h bei 37ºC ablaufen, und das Inkubat wurde dann abgesaugt. Das Röhrchen wurde dreimal mit 2 ml von jeweils 0,05% Tween® in Wasser gewaschen. In das gewaschene Röhrchen wurden 200 ul Substrat gegeben, die sowohl Tetramethylbenzidin (TMB) als auch Wasserstoffperoxid enthielten, und die Reaktion konnte 30 min bei Raumtemperatur ablaufen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 1M Zitronensäure mit 0,3% (Gew./Vol.) Teilchen in der Flamme gebildeten Siliciumdioxids mit einem durchschnittlichen Teilchenmesser von etwa 0,014 um beendet. Das Röhrchen wurde in ein Fluorometer-Instrument eingesetzt, das optisch so modifiziert war, daß unter 90º relativ zum einfallenden Lichtstrahl aufgefangene Lichtstreuung erfaßt wurde. Lichtstreuung wurde sowohl bei 450 nm als auch bei 560 nm nachgewiesen und die Ergebnisse wurden als Verhältnis der Lichtstreuung bei den beiden Wellenlängen ausgedrückt. Eine Standardkurve wurde erstellt, in der die Verhältnisse als Funktion bekannter Konzentrationen an hLH gemessen wurden. Diese Standardkurve ist in Fig. 4 veranschaulicht. In der Testprobe wurde das Verhältnis von Lichtstreuung, ausgedrückt durch das Instrument, mit der Standardkurve von Fig. 1 verglichen, so daß die Konzentration an hLH in der unbekannten Probe ermittelt werden konnte.

Beispiel III

Ein für Licht transparentes Polystyrol-Röhrchen hatte mit anti-hCG überzogene innere Oberflächen. In dieses Röhrchen wurden 100 l einer 1:200-Verdünnung von anti-hCG- Peroxidase-markiertem Konjugat und 100 ul einer auf hCG zu testenden und dieses vermutlich enthaltenden flüssigen Probe gegeben. Die Reaktion konnte 15 min bei 37ºC ablaufen, und das Inkubat wurde dann abgesaugt. Nach dreimaligem Waschen des Röhrchens mit jeweils 2 ml 0,05% Tween® in Wasser, wurden 200 ul Substrat, sowohl TMB als auch Wasserstoffperoxid enthaltend, in jedes Röhrchen gegeben. Das TMB enthielt 1,7 uM MPT und 8,6 uM SR 101. Dieses Gemisch konnte 15 min bei 37ºC inkubieren. In das Röhrchen wurden dann 0,8 ml 1 M Zitronensäure gegeben. Das Röhrchen wurde sodann in ein Fluorometer gebracht, das ein 395 nm-Filter auf der Anregungsseite und ein 430 nm-Filter auf der Emissionsseite für den MPT-Fluorophor aufwies. Das Fluorometer hatte ein 589 nm-Filter auf der Anregungsseite und ein 605 nm-Filter auf der Emissionsseite für den Fluorophor SR 101. Licht einer Lampe wurde durch die Wandungen des Röhrchens in die Lösung gerichtet. Fluoreszenz wurde bei 430 nm und 605 nm nachgewiesen, und die Ergebnisse wurden als Verhältnis der beiden Wellenlängen ausgedrückt. Unter Anwendung der gleichen Schritte, wie oben ausgeführt, wurde eine Standardkurve mit Proben mit bekannten Konzentrationen an hCG erstellt, und die damit verbundenen Daten sind in der Kurve in Fig. 5 wiedergegeben. Durch Vergleich des Fluoreszenzverhältnisses der unbekannten Probe, ausgedrückt durch das Instrument, mit dem Verhältnis der Standardkurve von Fig. 5 wurde die hCG-Konzentration in der unbekannten Probe bestimmt.

Beispiel IV

Bei einer Arbeitsweise ähnlich den vorhergehenden Beispielen wurde ein Röhrchen mit Anti-hTSH überzogen. In dieses Röhrchen wurden 100 ul einer 1:200-Verdünnung von anti-hTSH-Peroxidase-markiertem Konjugat und 200 ul einer auf hTSH zu testenden und dieses vermutlich enthaltenden Probe gegeben. Die Reaktion konnte 30 min bei 37ºC ablaufen, und das Inkubat wurde dann abgesaugt. Das Röhrchen wurde dreimal mit je 2 ml 0,05% Tween® in Wasser gewaschen. In das gewaschene Röhrchen wurden 300 ul Substrat, TMB und Wasserstoffperoxid enthaltend, und die beiden obigen Fluorophore, MPT und SR 101, gegeben. Die Reaktion konnte 7 min bei 37ºC ablaufen, und sie wurde durch Zugabe von 0,8 ml 1 M Zitronensäure gestoppt. Das Röhrchen wurde im Fluorometer, wie in Beispiel III beschrieben, abgelesen, und die Ergebnisse wurden als Verhältnis von MPT/SR 101 zur Konzentration von hTSH, ursprünglich in der Probe, ausgedrückt. Typische Ergebnisse sind in Fig. 6 veranschaulicht.

Beispiel V

Ein für Licht transparentes Polystyrol-Röhrchen hatte mit Anti-T&sub4; überzogene Oberflächen. In das überzogene Röhrchen wurden 300 ul einer 1:15000-Verdünnung von Peroxidasemarkiertem T&sub4;-Konjugat und 25 ul einer auf T&sub4; zu testenden und dieses vermutlich enthaltenden Probe gegeben. Die Reaktion konnte 15 min bei 37ºC ablaufen, und das Inkubat wurde dann abgesaugt. Das Röhrchen wurde sechsmal mit je 0,5 ml 0,5% Tween®-20 in Wasser gewaschen. In das gewaschene Röhrchen wurden 300 ul Substrat, TMB und Wasserstoffperoxid enthaltend, und die beiden Fluorophore MPT und SR 101 gegeben. Die Reaktion konnte 15 min bei 37ºC ablaufen und wurde durch Zugabe von 0,8 ml 1 M Zitronensäure gestoppt. Das Röhrchen wurde dann in einem Fluorometer, wie in Beispiel III beschrieben, abgelesen, und das Verhältnis von MPT/SR 101 wurde als Funktion der ursprünglich in das Röhrchen gegebenen T&sub4;-Menge aufgetragen. Typische Daten sind in Fig. 7 veranschaulicht.
Somit stützt sich die vorliegende Erfindung auf das Verhältnis von Lichtsignalen für die indirekte kolorimetrische Ermittlung eines Analyts von Interesse. Die Anwendung der Verhältnis-Technik, wie hier beschrieben, liefert einen internen Korrekturmechanismus, der Unterschiede in der Länge des Lichtwegs, optischer Qualität des Röhrchens, Röhrchenanordnung, Änderungen in der Ausgangsleistung der Lampe und ähnlicher Faktoren, die die Optik des Systems beeinflussen, negiert. Bei herkömmlicher Kolorimetrie werden Unterschiede, wie Schwankungen in der Lampenleistung und Weglänge, typischerweise durch Einsatz eines Doppelstrahl-Spektrometers und abgestimmter Küvetten für alle Messungen korrigiert. Da der erfindungsgemäß verwendete Detektor keinen Doppelstrahl und für jede Messung eine andere Küvette verwendet, dienen die hier beschriebenen Verhältnis-Techniken als wirksame Möglichkeit zum Minimieren dieser Effekte.

Claims

1. Verfahren für die Konzentrationsmessung eines Analytes in einer Probe unter Verwendung eines Enzym Immunoassays durch indirekte kolorimetrische Ermittlung mit den Schritten:

a) Kombinieren eines Peroxidase markierten Antikörperkonjugats, einer nach einem Analyt zu testenden Probe und eines an die inneren Oberflächen eines transparenten Plastikrohrs gebundenen Antikörpers, so daß das Analyt sich mit dem gebundenen Antikörper und dem Konjugat zur Bildung eines immunologischen Komplexes in fester Phase verbindet;

b) Beimischen einer Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid enthaltenden flüssigen Lösung in das genannte Rohr, um eine Reaktion mit dem immunologischen Komplex hervorzurufen und das Tetramethylbenzidin für eine kolorimetrische Antwort zu aktivieren;

c) Beifügen einer sauren, Teilchen enthaltenden Lösung, die die Reaktion beendet und als Ergebnis eine stabile Teilchensuspension hervorruft, zu der Mischung;

d) Durchleiten eingestrahlten Lichtes durch das Rohr in die Suspension hinein bei einer Vielzahl von Wellenlängen, wobei eine erste Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes im wesentlichen bei 450 nm liegt, wo aktiviertes Tetramethylbenzidin durch Absorption die von dem eingestrahlten Licht gestreute Lichtmenge als eine Funktion der zunehmenden Konzentration des vorhandenen Analytes dämpft, und eine zweite Wellenlänge von der ersten Wellenlänge spektral entfernt ist, bei der im wesentlichen keine Dämpfung der Lichtstreuung bei der Zunahme der Analytkonzentration auftritt;

e) Ermitteln des durch die Suspension bei der ersten und zweiten Wellenlänge gestreuten Lichtes und Bilden eines Verhältnisses der beiden betreffenden Wellenlängen; und

f) Vergleichen der Größe des gebildeten Verhältnisses mit der Größe eines Verhältnisses, das einer Lichtstreuungsermittlung zugeordnet ist, wenn die Schritte (a) bis (e) mit Proben ausgeführt werden, die bekannte Konzentrationen des Analytes beinhalten, wodurch die Analytkonzentration in der Probe gemessen wird.

2. Verfahren aus Anspruch 1, bei dem das Analyt aus der aus Humanchoriongonadotropin und luteinisierendem Hormon bestehenden Gruppe gewählt ist.

3. Verfahren für die Konzentrationsmessung eines Analytes in einer Probe unter Verwendung eines Enzym Immunoassays durch indirekte kolorimetrische Ermittlung mit den Schritten:

b) Beimischen einer Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid enthaltenden flüssigen Lösung in das Rohr, um eine Reaktion mit dem immunologischen Komplex hervorzurufen und das Tetramethylbenzidin für eine kolorimetrische Antwort zu aktivieren;

c) Beifügen eines ersten Fluorophors zu der Mischung, um Fluoreszenz bei oder nahe der Absorptionsmaxima von aktiviertem Tetramethylbenzidin als eine Funktion der zunehmenden Konzentration des in der Probe vorhandenen Analytes hervorzurufen;

d) Beifügen eines zweiten Fluorophors zu der Mischung, das im wesentlichen keine Dämpfung seiner Fluoreszenz zeigt, wenn die Analytkonzentration zunimmt und bei einer spektral von der des aktivierten Tetramethylbenzidin entfernten Wellenlänge Fluoreszenz hervorruft;

e) Durchleiten eingestrahlten Lichts durch das Rohr in die zuletzt erwähnte Mischung hinein bei einer Vielzahl von Wellenlängen, wobei die Wellenlängen eine Wellenlänge bei oder nahe den Absorptionsmaxima von aktiviertem Tetramethylbenzidin und die Anregung des ersten und zweiten Fluorophores bewirkende Wellenlängen aufweisen;

f) Ermitteln der durch die Fluorophore ausgestrahlten Fluoreszenz und Bilden eines Verhältnisses der zwei Fluoreszenzwellenlängen; und

g) Vergleichen der Größe des gebildeten Verhältnisses mit der Größe eines Verhältnisses, das der Fluoreszenzermittlung zugeordnet ist, wenn die Schritte (a) bis (f) mit Proben ausgeführt werden, die bekannte Konzentrationen des Analytes beinhalten, wodurch die Analytkonzentration in der Probe gemessen wird.