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Die Erfindung betrifft die Verwendung von Interleukin-1 zur Induktion
der Entwicklung multipotenter hämopoetischer Zellpopulationen, insbesondere
zur Förderung der Differenzierung und Proliferation hämatopoetischer
Stammzellen.
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Hämopoese bezieht sich auf einen Prozeß gemäß welchem verschiedene
reife Blutzelltypen sich aus bezüglich ihrer Entwicklung multipotenten
Stammzellen, die sich in den hämopoetischen oder blutzellbildenen Geweben
finden, entwickeln. Diese Gewebe finden sich an verschiedenen
Körperstellen, beispielsweise dem Knochenmark, der Milz und der Thymusdrüse. Bei
diesem Verfahren entstehen distinkte Subpopulationen von Progenitorzellen aus
primitiveren undifferenzierten Stammzellen. Anschließende
Entwicklungsereignisse führen zur Differenzierung von reifen Klassen von Blutzellen
(beispielsweise Granulocyten, Monocyten, Eosinophile, Megakaryocyten und
Mastzellen) aus Progenitor-Zellsubpopulationen.
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Jüngste Untersuchungen der Hämopoese begannen die Rolle verschiedener
hormonartiger Proteine oder Wachstumsfaktoren als Effektoren der Hämopoese
zu beleuchten. Wachstumsfaktoren, die frühe Stadien des
Differenzierungswegs regulieren, sind kollektiv als viellinige Wachstumsfaktoren bekannt.
Diejenigen, die an späteren Stadien, bei denen sich spezialisierte
Zelltypen aus Vorläuferzellen entwickeln, beteiligt sind, sind als
linienspezifische Wachstumsfaktoren bekannt. Synergismus zwischen den linienspezifischen
und den viellinigen Wachstumsfaktoren scheint eine Regulatorrolle bei der
Ontogenie der Blutzellen zu spielen.
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Beispielhaft für solche synergistischen Beziehungen sind die
gemeinsamen Aktivitäten des zuvor als Hämopoetin-1 (H-1) bezeichneten
Wachstumsfaktors und bestimmter linienspezifischer Kolonie-stimulierender Faktoren.
H-1 ist ein vielliniger Wachstumsfaktor, der durch seine Fähigkeit, die
Entwicklung mulitpotenter Stammzellen gemeinsam mit anderen
Wachstumsfaktoren zu induzieren, identifiziert wird. In Abwesenheit von GM-CSF oder eines
anderen Kolonie-stimulierenden Faktors zeigt H-1 keine nachweisbaren
Wirkungen in Kulturen von in der Entwicklung primitiven hämopoetischen Zellen.
Jedoch in Anwesenheit von GM-CSF, CSF-1 oder bestimmten anderen
Koloniestimulierenden Faktoren stimuliert H-1 das Zellwachstum und die
Differenzierung der hämopoetischen Zellen, die primitiver sind als die, die durch
irgendeinen der Kolonie-stimulierenden Faktoren allein induziert werden
können. Erste charakterisierende Studien von Hämopoetin-1, das aus
serumfreien
Kulturen von menschlichen Blasenkrebszellen isoliert worden ist und
gemeinsam mit CSF-1, einem Monocyten/Makrophagen-linienspezifischen
Wachstumsfaktor untersucht wurde, wurden von Bartelmez et al., J. Cell. Phys.
122: 370 (1985), Jubinski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2764 (1985)
und Stanley et al., Cell 45: 667 (1986) beschrieben.
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Angesichts der Fähigkeit von Hämopoetin-1 zur Induktion der
Zellentwicklung im frühesten Stadium der Hämopoese entwickelte sich beträchtliches
Interesse an diesem Wachstumsfaktor als therapeutisches Mittel.
Therapeutische Verwertungen für ein Protein mit der dem Hämopoetin-1 zugeschriebenen
Aktivität umfassen die Behandlung von hämatologischen Anomalien als
Ergebnis einer Chemotherapie, einer Behandlung oder Exposition mit Strahlen, die
Verstärkung der Immunantworten gegenüber viralen oder bakteriellen
Pathogenen, die Behandlung von Leukämie und die Verwendung zusammen mit
Knochenmarktransplantaten.
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Interleukin-1-Aktivität (IL-1) kann Proteinen zugeschrieben werden,
die von Makrophagen oder anderen Zelltypen als Antwort auf immunogene
Stimulation freigesetzt werden. Diese Proteinfamilie steht im Zusammenhang mit
einem komplexen Spektrum biologischer Aktivitäten. IL-1 ist ein primäres
immunstimulierendes Signal, das die Thymocyten-Proliferation über die
Induktion der Interleukin-2-Freisetzung induzieren und die Proliferation und
die Reifung von B-Lymphocyten stimulieren kann. Zusätzlich steht IL-1 im
Zusammenhang mit der Prostaglandinbildung und der Induktion von Fieber und
mit der Förderung der Wundheilung. Nützliche Übersichtsartikel in der
Literatur bezüglich IL-1 umfassen Oppenheim et al., Immunol. Today 7:45 (1986)
und Durum et al., Ann. Rev. Immunol. 3:263 (1985).
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Vor der vorliegenden Erfindung wurde nicht beobachtet, daß IL-1 eine
Aktivität als vielliniger hämopoetischer Wachstumsfaktor zeigt. Die
vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, daß die
biologische Aktivität von IL-1 zusammen mit GM-CSF mit der des zuvor als
Hämopoetin-1 bezeichneten Wachstumsfaktors zusammenfällt.
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Ferner zeigen physikalisch-chemische und serologische Kriterien an,
daß IL-1 und Hämopoetin-1 identisch sind. Diese Entdeckung wurde durch
jüngste Erfindungen, die die Bildung von nützlichen Mengen an im
wesentlichen homogenem rekombinanten menschlichen IL-1 ermöglichten, erleichtert.
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Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von IL-1 zur
Herstellung eines Medikaments bereit, worin IL-1 mit einer wirksamen Menge eines
Kolonie-stimulierenden Faktors assoziiert ist, zur Anwendung zur Induktion
der Proliferation und Differenzierung von hämopoetischen Stammzellen in
einem Menschen oder einem anderen Säugetier oder zur Verwendung zur Induktion
der Differenzierung von leukämischen oder lymphomen Zellen im Menschen oder
einem anderen Säuger zur Behandlung von Leukämie oder einem Lymphom.
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Der Kolonie-stimulierende Faktor wird bevorzugt aus GM-CSF, CSF-1, G-
CSF, IL-3, Erythropoetin und EPA, bevorzugter aus GM-CSF, IL-3 und G-CSF
ausgewählt. Das IL-1 kann IL-1α oder β sein und ist im allgemeinen vom
Menschen, gegebenenfalls rekombinant.
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Die IL-1-Aktivität liegt in zwei verwandt entfernten Proteinen, die
hier als IL-1α und IL-1β (March et al., Nature 315: 641 (1985)) bezeichnet
sind. Beide Moleküle werden normalerweise als größere Vorläufer mit
Molekulargewichten von etwa 30.000 Daltons synthetisiert, die anschließend
proteolytisch verarbeitet werden, wodurch reife Formen mit Molekulargewichten
von etwa 17.500 Daltons entstehen. Jedoch ist im Gegensatz zu IL-1α der
größere Vorläufer von IL-1β vor der proteolytischen Spaltung in die reife
Form nicht biologisch aktiv. Alle aktiven Formen von Il-1α und IL-1β sind
erfindungsgemäß nützlich. Die hierin verwendeten Ausdrücke "Interleukin-1"
und "IL-1" beziehen sich kollektiv auf natürliche und rekombinante Formen
sowohl von IL-1α als auch von IL-1β. Zusätzlich umfaßt der Ausdruck
Proteine mit Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen denen nativer Formen von
Säuger-IL-1α und IL-1β identisch sind, die eine biologische Aktivität
bezüglich der Hämopoese besitzen, die der der nativen Formen gemeinsam ist.
Eine wesentliche Identität der Aminosäuresequenzen bedeutet, daß die
Sequenzen identisch sind oder sich durch eine oder mehrere
Aminosäureänderungen (Deletionen, Additionen oder Substitutionen), die keine ungünstige
funktionelle Verschiedenheit zwischen dem synthetischen Protein und der
nativen Form verursachen, unterscheiden.
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Der durch die Beschreibung in generischem oder kollektivem Sinn
verwendete Ausdruck "Kolonie-stimulierender Faktor" bezieht sich auf eine
Familie von Lymphokinen, die Progenitorzellen, die sich im Knochenmark
finden, zur Differenzierung in reife Blutzelltypen induzieren. Spezifische
Kolonie-stimulierende Faktoren oder CSFs, die unter die zuvor genannte Klasse
fallen, umfassen die folgenden:
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(1) Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF);
Cantrell et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 6250 (1985);
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(2) Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF); Nicola et
al., J. Biol. Chem. 258: 9017 (1983); Souza et al., Science 232: 61 (1986);
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(3) Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF oder CSF-1);
Kawasaki et al., Science 230: 291 (1985); Stanley et al., J. Cell. Biochem.
21: 151 (1983);
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(4) Interleukin-3 (IL-3); Yang et al., Cell 47: 3 (1986);
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(5) Erythropoetin (Epo); Miyake et al., J. Biol. Chem. 252: 5558
(1977); und
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(6) Erythroid-potenzierende Aktivität (EPA; auch bekannt als BPA oder
Burst-fördernde Aktivität); Westbrook et al., J. Biol. Chem. 259: 9992
(1984), Gasson et al., Nature 315: 768 (1985).
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Die einzelnen CSFs können aus Medien, die von bestimmten Zellinien
konditioniert wurden, gereinigt werden oder in einigen Fällen von
rekombinanten Organismen oder Zellen exprimiert werden. GM-CSF kann nach dem in
der EPA 183350 beschriebenen Verfahren kloniert und exprimiert werden. Auf
die Offenbarung dieser Anmeldung und die zuvor zitierten Artikel wird
hiermit Bezug genommen.
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IL-1β kann aus Zellkulturen von peripheren Blutleukocyten, im
wesentlichen wie in EPA 165654 beschrieben, gereinigt werden. Jedoch zeigten
jüngste Versuche, daß die rekombinanten Formen von IL-1α und IL-1β (rIL-1α
und rIL-1β) effizient unter Verwendung bakterieller Expressionssysteme
gebildet werden. Somit werden diese Formen bevorzugt. Einzelheiten der
Bildung nach diesen Techniken werden in den folgenden Absätzen gegeben.
1. Herstellung von rIL-1α und rIL-1β
A. Konstruktion bakterieller Expressionsvektoren
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Reifes IL-1α und IL-1β kann in E. coli unter Kontrolle des
PL-Promotors des λ-Phagen und des thermolabilen Repressors cI857ts exprimiert
werden. Expressionsplasmide für die Bildung von rIL-1α und rIL-1β können aus
dem Plasmid pPLc28 (ATCC 53082) und dem Plasmid pKK223-3 (im Handel
erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und Plasmiden, die
den IL-1α-Klon 10A (March et al., supra; ATCC 39997) und den IL-1β-Klon IL-
1-14 (ATCC 39925) wie folgt hergestellt werden.
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Zur Bildung eines Expressionsvektors für IL-1α wird ein 3'-Ende des
IL-1α-Gens, das sich von Ser ¹¹³ (Nukleotide 337-339) bis Ala²&sup7;¹
(Nukleotide 811-813) erstreckt, in den Expressionsvektor pPLC28 inseriert.
Dies wird durch Herausschneiden eines 499-Basenpaar langen
AluI-NdeI-Fragments aus dem 10A-Klon erreicht, an welches der folgende synthetische
Oligonukleotidlinker angeheftet wird:
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Dieser Linker umfaßt die AluI- und EcoRI-Enden einer
Ribosomenbindungsstelle und ein ATG-Startcodon zusätzlich zu der IL-1α
Ser¹¹³-Ser¹¹&sup7;-Sequenz. pPLc28 wird anschließend vollständig mit EcoRI und NdeI abgebaut und
das entstandene größere Fragment wird durch Agarosegelelektrophorese
isoliert.
Der Linker, der 10A-Klon und die Plasmidfragmente werden
anschliessend unter Verwendung der T4-Ligase fusioniert, wobei ein
Expressionsplasmid, das hier als pILPα bezeichnet wird, erhalten wird. Weitere Details der
Bildung von pILPα können in der Beschreibung der EPA 188,864 gefunden
werden, worauf hiermit Bezug genommen wird.
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Das enstandene Konstrukt wird anschließend zur Transformation des E.
coli Stammes ΔH1(ATCC 33767; Castellazi et al., Molec. gen. Genet. 117:
211) mit Ampicillinresistenz unter Verwendung von Standardtechniken
verwendet. Zur Expression des Plasmid-erzeugten IL-1α-Gens werden Kulturen von
transformiertem ΔH1 in L-Bouillon ohne Ampicillin gezüchtet. Wenn die
Kulturen einen A&sub7;&sub2;&sub0; von etwa 0,5 erreichen, wird die Kulturtemperatur auf etwa
43ºC zur Förderung der Derepression des thermolabilen PL-Promotors erhöht.
Nach einer Stunde bei der erhöhten Temperatur werden die Zellen durch
Zentrifugation gewonnen und in einem Trockeneis-/Methanolgemisch
blitzgefroren. Die IL-1α-Aktivität in den Zellextrakten kann entweder durch die
Thymozyten-Mitogenese oder durch IL-1-Konversionsassays, beschrieben von
Conlon, J. Immunol. 131: 1280 (1983), Kronheim et al., J. Exp. Med. 161: 490
(1985) und auch in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Patentanmeldung Nr.
721,765, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, bestimmt
werden. Einzelheiten zu diesen Reinigungsverfahren sind im folgenden gegeben.
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rIL-1β kann über Konstruktion eines analogen Plasmids, das hier als
pILPβ bezeichnet wird, gebildet werden. Dieser Vektor wird aus pILPc
(March et al., supra), der durch Ersatz des BamHI/EcoRI-Fragments von
pKK223-3 mit einem Sau3A/EcoRI-Fragment aus pPLc28, welches den
λ-PL-Promotor enthält, gebildet wird, zusammengebaut. Dieses Plasmid wird
anschliessend vollständig mit EcoRI und PstI abgebaut und das größte Fragment wird
dann an (1) ein 669-Basenpaar langes HpaII/PstI-Fragment aus pIL-1-14 (ATCC
39925), welches das menschliche IL-1β-Gen (Ala¹¹&sup7; bis zum COOH-Terminus,
codiert für das aktive Protein) enthält und (2) an das folgende
synthetische EcoRI/HpaI-0ligonukleotid:
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ligasiert.
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Das Plasmid pILPβ wird anschließend zur Transformation von E. coli
ΔH1 oder anderen Zellen, die einen thermolabilen Repressor der
PL-Transkription enthalten, verwendet. Nach Wachstum bis zu A&sub7;&sub2;&sub0; von etwa 0,5 wird
Expression des rIL-1β-Gens durch Hitzeinduktion, wie zuvor beschrieben,
erhalten. Die rIL-1β-Aktivität, wie im Fall von rIL-1α, kann unter Verwendung
der Thymozyten-Mitogenese oder von IL-1-Konversionsassays, wie oben
zitiert, identifiziert werden.
B. Proteinreinigung
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Das allgemeine Reinigungsschema, das verwendet wird, um ein homogenes
Protein zu ergeben, besteht aus einer ersten Säureextraktion aus
Zellpellets, gefolgt von einer SPS (Sulphopropyl-Sephadex ;
Pharmacia)-Säulenchromatographiestufe und Elution von einer DEAE-Sephacel (Pharmacia)-Säule.
Säulenfraktionen, die rIL-1α enthalten, werden anschließend auf
Phenylsepharose CL-4B (Pharmacia) aufgebracht, während diejenigen, die rIL-1β
enthalten, auf eine Procion-Red-Agarosesäule (Bethesda Research Laboratories,
Gaithersburg, Maryland, USA) zur abschließenden Reinigung aufgebracht
werden. Sterile Puffer werden während des Reinigungsprotokolls verwendet, um
das Produkt vor Verunreinigung durch Endotoxin zu schützen. Die
chromatographischen Fraktionen können auf die Proteinkonzentration mittels des
Gesamtprotein-Assays von Bio-rad (Bio-rad Laboratories, Richmond, California,
USA) überwacht werden, und der Reinigungsprozeß wird durch SDS-PAGe wie von
Kronheim, J. Exp. Med. 161: 490 (1985) beschrieben oder durch eine andere
geeignete Technik bewertet. Die IL-1-Aktivität der Säulenfraktionen kann
durch die zuvor angegebenen IL-1-Assays bestimmt werden.
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Versuche, bei denen der pH des ersten Extraktionspuffers variiert
wurde, zeigen an, daß die Extraktion von rIL-1α aus E. coli
Zellsuspensionen bei pH 2,8 zur Präzipitation signifikanter Mengen der verunreinigenden
Proteine führt, während sie eine gute Gewinnung von rIL-1α ermöglicht.
Jedoch können auch Puffer mit einem pH/pH-Werten zwischen 2,0 und 3,5 mit
Erfolg verwendet werden. Ähnliche Versuche mit rIL-1β zeigten, daß der pH 3,9
optimal für die Präzipitation unerwünschter Proteine ist, während rIL-1β
solubilisiert wird.
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Es können jedoch auch Extraktionspuffer mit einem pH zwischen 3,5 und 4,5
erfolgreich verwendet werden. Der optimale pH für diesen ersten
Extraktionsschritt kann zwischen den Fermenterchargen variieren. Aus diesem Grund
wurden Testläufe in kleinem Maßstab verwendet, um den optimalen pH zu
bestimmen, insbesondere wenn große Materialmengen verwendet werden.
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Um die erste Säureextraktion zu erzielen, werden Zellpellets, die,
wie oben beschrieben, erhalten wurden, in 30 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8
enthaltend 5mM EDTA und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) suspendiert,
so daß etwa 20 ml Puffer verwendet werden, um das aus etwa 2,5 Litern
E.coli Kultur erhaltene Pellet zu suspendieren. Die entstandene Suspension
wird schnell in einem Trockeneis/Methanol-Bad gefroren und aufgetaut. Als
nächstes werden 200 ml 30 mM Natriumcitratpuffer beim gewählten pH, welcher
5 mM EDTA und 250 ug/ml Lysozym enthält, den Suspensionen zugesetzt. Die
entstandenen Säuresuspensionen werden 60 Minuten in einem Wasserbad von
37ºC inkubiert. Nach der Inkubation werden die Extrakte schnell in einem
Trockeneis/Methanol-Bad gefroren, aufgetaut und dann bei 4ºC 45 Minuten bei
38000 x g zentrifugiert. Die Überstände werden anschließend sorgfältig zum
Gebrauch im nächsten Reinigungsschritt dekantiert.
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Überstände aus der vorausgehenden Extraktionsstufe werden dann auf
eine SPS C-25-Säule, die mit 0,1% Triton X-100 (Polyoxyethylenäther; Sigma
Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) und 10% fötalem Kälberserum zur
Reduktion nichtspezifischer Absorption von IL-1-Aktivität, an das Harz
präkonditioniert wurde, aufgebracht. Zuerst wird der pH der Rohextrakte auf
etwa 4,0 durch Zugabe von 1,0 N NaOH erhöht, und anschließend werden die
entstandenen Lösungen auf 20 x 2,5 cm Säulen, die zuvor mit 10 mM
Natriumcitrat, pH 4,0 equilibriertes SPS C-25 enthielten, aufgebracht. Die Säulen
werden mit 3 Säulenvolumina 10 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer
(MES) pH 5,0 gewaschen, und das gewünschte Protein wird von der Säule mit
10 mM Tris-HCl, pH 8,1 eluiert. 10 ml Fraktionen werden gewonnen, mittels
SDS-PAGE analysiert und bei 4ºC zur weiteren Reinigung gelagert.
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Fraktionen mit IL-1-Aktivität aus der vorherigen Stufe werden
vereinigt und auf 15 x 2,5 cm Säulen, welche zuvor mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,1
equilibriertes DEAE-Sephacel enthielten, aufgebracht. Die DEAE-Säulen
werden mit 5 Säulenvolumina des Startpuffers gewaschen und mit linearen NaCl-
Gradienten in insgesamt zwei Säulenvolumina eluiert. Um rIL-1α zu eluieren,
wird ein Gradient im Bereich von 0-600 mM NaCl verwendet; für rIL-1β wird
ein Gradient von 0-400 mM NaCl verwendet (beide Gradienten in 10 mM Tris-
HCl, pH 8,1). 5 ml Fraktionen werden gesammelt, mittels SDS-PAGE
analysiert, und bei 4ºC zur weiteren Reinigung gehalten.
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rIL-1α enthaltende Fraktionen werden durch Zugabe von ausreichend
festem Ammoniumsulfat für eine Endkonzentration von 0,5 M behandelt. Die
entstandene Lösung wird dann auf eine 30 x 2,5 cm Säule, welche mit 10 mM
Tris-HCl-Puffer auch 0,5 M an Ammoniumsulfat, pH 8,1 equilibriertes Phenyl-
Sepharose CL-4B enthält, aufgebracht. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumina
Startpuffer gewaschen und mit einem ansteigenden linearen Gradienten von
Ammoniumsulfat, welcher bei 0,5 M startet und bei 0 M in etwa 3
Säulenvolumina endet, eluiert. Schließlich wird die Säule mit etwa 100 ml 10 mM Tris-
HCl, pH 8,1 eluiert. 10 ml Fraktionen werden gewonnen, und diejenigen, die
rIL-1α enthalten, werden vereinigt und durch wiederholtes Aufbringen auf
SPS C-25, wie von Kronheim et al., supra beschrieben, konzentriert. rIL-1α
wird unter Verwendung von 10 mM Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
bei pH 8,2 eluiert.
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Fraktionen mit rIL-1β aus dem DEAE Säulenschritt werden 1:4 in 10 mM
Tris-HCl Puffer, pH 8,1 verdünnt, um die Ionenstärke auf weniger als 40 mM
zu reduzieren, anschließend auf eine 20 x 2,5 cm Säule mit
Procion-Red-Agarose, die zuvor mit 10 mM Tris-HCl Puffer, pH 8,1 equilibriert worden war,
aufgebracht. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumina Startpuffer gewaschen und
anschließend mit einem linearen Gradienten in 5 Säulenvolumina im Bereich
von 0 bis 1 M NaCl in 10 mM Tris-HCl Puffer, pH 8,1, eluiert. 10 ml
Fraktionen werden gewonnen, analysiert und dann wie für rIl-1α oben
beschrieben, konzentriert. Das gereinigte rIL-1α und rIL-1β werden bei -70º
gelagert.
C. Assay zur Induktion der hämopoetischen Zellen
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Um die Aktivität des hämopoetischen Wachstumsfaktors zu untersuchen,
werden Proben auf ihre Fähigkeit, zusammen mit einem speziellen CSF, die
Proliferation der nichtadhärenten Knochenmarkszellen von Mäusen nach
Verabreichung von 5-Fluoruracil zu induzieren, bewertet. 0bwohl GM-CSF in dem im
folgenden beschriebenen Assay verwendet wird, könnten andere
Kolonie-stimulierende Faktoren verwendet werden, um die induktive Aktivität bezüglich
hämopoetischer Zellen zu detektieren.
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8 - 12 Wochen alten C3H/Hej-Mäusen (Jackson Laboratory) wird 5-
Fluoruracil in einer Dosierung von 150 mg/kg iv verabreicht. Am Tag nach
dieser Behandlung werden die Tiere getötet und die Oberschenkel- und
Unterschenkelknochen werden entnommen. Das Muskelgewebe wird entfernt und die
Knochen werden bei 4ºC in Medium gehalten. Das während des Assayverfahrens
verwendete Medium ist RPMI 1640, das mit 10% Pferdeserum (HS), welches 25-
50 ug/ml Penicillin, Streptomycin und Gentamycin und 5 x 10&supmin;&sup5; M
2-Mercaptoethanol enthält, supplementiert ist. Die erste Gewinnung von
Knochenmarkszellen wird jedoch in Medium ohne Serum durchgeführt.
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Eine Spritze wird mit kaltem Medium gefüllt und die Gelenkkapseln
oder Enden der Knochen werden mit einer Schere entfernt. Die Markszellen
werden aus den Knochen durch Injektion von Medium durch eine 25 Gauge-Nadel
herausgepresst. 4 ml Medium werden für jeden 0berschenkelknochen verwendet,
während 2 ml für jeden Unterschenkelknochen verwendet werden. Die
Zellklumpen werden anschließend durch dreimalige Passage durch eine 18 Gauge-Nadel
aufgebrochen. Als nächstes werden die Zellen einmal durch eine 22
Gauge-Nadel geleitet und anschließend durch eine 25 Gauge-Nadel in ein
Polypropylenreagenzglas gepreßt. Die entstandene Suspension wird dann bei 1000-2000
UpM bei 6-10ºC zentrifugiert. Die Zellen werden dann gewonnen und in
frischem Medium mit Serum resuspendiert, wodurch sich eine Konzentration von 6
x
10&sup5; lebensfähigen kernhaltigen Zellen pro ml ergibt.
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Die Zellen werden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten mit
flachem Boden in einem Volumen von 50 ul gegen eine Verdünnungsserie der zu
untersuchenden Proben platiert. Jede Probe enthält in einem Volumen von 50
ml mit Medium verdünnte Probe, die 20 Einheiten/ml GM-CSF enthält, das
mittels HPLC von Cantrell et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:6250 (1985) und
auch in der EPA 183,350 beschrieben ist, gereinigt worden ist. Auf die
Offenbarungen dieser Druckschriften wird hiermit Bezug genommen. Als negative
Kontrolle werden Kavitäten, die nur GM-CSF enthalten, verwendet.
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Als positive Kontrolle werden Proben mit konzentrierten Überständen
kultivierter HBT 5637 adhäsiver menschlicher Blasenkrebszellen (ATCC HTB9),
schrittweise verdünnt in 20 Einheiten/ml GM-CSF, verwendet. Um Medium mit
H-1 Aktivität zu erhalten, werden die Zellen bis zur Konfluenz in RPMI-1640
Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) supplementiert ist,
gezüchtet. Nach Konfluenz der Zellen wird das Medium abgegossen und mit frischem
RPMI-1640, welches 0,1% FCS enthält, ersetzt. Die Zellen werden
anschliessend 72 Stunden in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; in Luft kultiviert.
Das entstandene konditionierte Medium wird dann gewonnen und bei 2000 x g
zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen und sofort verwendet oder
für späteren Gebrauch gefroren. Das Medium kann durch Präzipitieren der
Proteine mit Ammoniumsulfat (80%ige Sättigung) und anschließendes
Resuspendieren und Dialysieren in PBS, pH 7,2 bei 4ºC konzentriert werden.
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Die Platten, die die zu untersuchenden Proben enthalten, werden bei
37ºC in 5% CO&sub2; 72 Stunden lang inkubiert. Nach Ende dieser Zeitspanne
werden die Zellen durch Zugabe von 74 kBq (2 uCi)3H-Thymidin (Du Pont,
Wilmington, Delaware, USA) 2590-2960 GBq/mM (70-80 Ci/mM) in 25 ul 16-18
Stunden lang gepulst. Die Zellen werden auf Glasfaserfiltern gewonnen, mit
destilliertem entionisiertem Wasser lysiert, und auf die aufgenommene
Radioaktivität durch Flüssigscintillationsmessung untersucht. Die Einheiten für
die H-1-Aktivität werden bezüglich der positiven Kontrollstandards gezählt.
Die Aktivitätseinheiten sind definiert als reziproker Wert der Verdünnung,
die erforderlich ist, um 50% maximale cpm bezüglich des Standards zu
ergeben.
D. Verabreichung von IL-1
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von IL-1 zur
Herstellung eines Medikaments, worin IL-1 mit einer effektiven Menge eines
Kolonie-stimulierenden Faktors assoziiert ist. Zur Durchführung der
vorliegenden Erfindung wird gereinigtes IL-1 verwendet, um einen therapeutisch
wirksamen Dosisspiegel zu ergeben. Effektive Dosisspiegel werden durch
Beginnen der Behandlung mit niedrigeren Dosisspiegeln und Erhöhen der Mengen
von verwendeten IL-1, bis Proliferation und Differenzierung der
hämopoetischen Zellen erzielt werden, bestimmt. Im allgemeinen liegen die
therapeutischen Dosen im Bereich von 10 bis 1 000 000 Einheiten H-1-Aktivität pro
kg Körpergewicht zusammen mit 10 bis 1 000 000 Einheiten pro kg Aktivität
an Kolonie-stimulierendem Faktor. Der verwendete Kolonie-stimulierende
Faktor kann GM-CSF, G-CSF, CSF-1, IL-3, Epo oder EPA, oder ein Gemisch der
Kolonie-stimulierenden Faktoren, je nach dem beabsichtigten therapeutischen
Ergebnis sein.
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Die Injektion bietet den praktischsten Verabreichungsweg entweder
intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal an. Neutral gepufferte
Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gemischt mit konspezifischem Serum Albumin
sind geeignete Verdünnungsmittel. Bevorzugt werden konspezifische Formen
von IL-1 verwendet.
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Das folgende Beispiel beschreibt serologische und
physikalisch-chemische Studien, die zeigen, daß IL-1 und der zuvor als Hämopoetin-1 bekannte
Faktor identisch sind.
Beispiel 1
1. Gemeinsame Reinigung der H-1 und IL-1-Aktivität aus HBT CM
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Konditioniertes Medium (CM), gewonnen aus HBT Zellkulturen, wurde
unter Verwendung einer hohlfaserigen Ultrafiltrationsvorrichtung mit einem
molekularen Ausschlußvolumen von 10 000 Dalton konzentriert. Das
entstandene konzentrierte CM wurde auf 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 0,01% Tween 20
(Polyoxyethylensorbitan-monolaurat, Sigma) eingestellt und mit einer
Aufschlämmung von Sepharose CL-6B-200 in dem gleichen Puffer bei 4ºC in
Kontakt gebracht. Festes Ammoniumsulfat wurde anschließend langsam der
Aufschlämmung unter Rühren zugesetzt. Es ergab sich eine Endkonzentration mit
etwa 75%iger Sättigung. Das entstandene Gemisch ließ man über Nacht stehen,
und anschließend wurde das Harz durch Vakuumfiltration gewonnen und in eine
Säule gegossen. Die Säule wurde mit einem Gradienten im Bereich von 3 M bis
0 M Ammoniumsulfat in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,2% Tween 20 eluiert. Die
Fraktionen wurden gewonnen, gegen einen geeigneten Puffer dialysiert und
auf H-1-Aktivität durch den 5-Fluoruracil-Knochenmark-Assay, wie oben
beschrieben, untersucht. Aktive Fraktionen (etwa 136 ml) wurden vereinigt und
auf eine 1,6 x 11 cm (22 ml) Säule, welche zuvor mit 1M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 20 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 0,02% Tween 20 equilibriertes Phenylsepharose CL-4B
enthielt, aufgebracht. Die Säule wurde anschließend mit einem Volumen des
Equlibrierungspuffers gewaschen und mit einem Gradienten von 1 M bis 0 M
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;
eluiert. 10 ml Fraktionen wurden gewonnen, gegen geeignete Puffer
dialysiert und sowohl in dem 5-Fluouracil-Knochenmarks-Assay als auch in
den Il-1-Konversions-Assays untersucht. Die Spitzenaktivitäten in jedem
Assay wurden in übereinstimmenden Fraktionen beobachtet.
2. Vergleich der H-1 Aktivität, die aus HBT-CM gereinigt wurde und von
gereinigtem rekombinantem IL-1α und IL-1β in dem 5-Fluouracil-Knochenmarks-
Assay und dem IL-1-Konversions-Assay
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Fraktionen mit H-1 Aktivität aus dem oben beschriebenen
Reinigungsverfahren, ebenso wie ein Immunpräzipitat mit H-1 Aktivität aus HBT-CM
wurden in dem IL-1-Konversions-Assay und den 5-Fluoruracil-H-1-Assays
untersucht. Proben von gereinigtem, rekombinantem IL-1α und IL-1β (10 ug/ml)
wurden in ähnlicher Weise untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 1 dargestellt:
Tabelle 1: Assay-Vergleich der Aktivitäten von H-1 aus HBT-CM und rekombinantem IL-1α und IL-1β
Probe
IL-1 Aktivität U/ml
H-1 Aktivität U/ml
Rohkonzentrat von HBT
Sepharose CL-6B (Spitze)
Phenyl Sepharose (Spitze)
Immunpräzipitat
Rekombinantes IL-1α
Rekombinantes IL-1β
3. Immunpräzipitation der H-1 Aktivität aus HBT-CM Phenylsepharose
Fraktionen mit Polyklonalem Kaninchen Anti IL-1α und Anti IL-1β
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Anti-IL-1α und Anti-IL-1β Antiseren wurden im Präzipitat der aus HBT-
CM gereinigten H-1-Aktivität wie folgt verwendet. 200 ul Antisera (Anti-IL-
1α, Anti-IL-1β, oder ein Gemisch) verdünnt 1:50 oder 1:500 in 1640 Medium,
welches 1mg/ml Rinderserum Albumin enthielt, wurde zu 200 ul gereinigtem H-
1 in einem 1,5 ml verschlossenen Reagenzglas gegeben. Die entstandene
Lösung wurde 30 Minuten bei 4ºC unter sanftem Schütteln inkubiert. 200 ul
Protein A Agarose (20% in 1640 Medium; Bio-rad) wurden anschließend jedem
Reagenzglas zugesetzt und die Reagenzgläser wurden über Nacht bei 4ºC
inkubiert. Jedes Reagenzglas wurde anschließend 3 Minuten bei 4ºC
zentrifugiert, und die Überstände wurden dekandiert und für den Assay aufbewahrt.
Das Agarose-Pellet in jedem Reagenzglas wurde anschließend zweimal mit 400
ul 1640 Medium, welches 10% FCS enthielt, gewaschen und dann mit 400 ul 0,1
M Glycin/HCl, pH 3 in Kontakt gebracht. Die entstandenen Gemische wurden 30
Minuten bei 22ºC unter sanftem Schütteln inkubiert und zentrifugiert. Die
Überstände, die von den Antiseren gebundenes Protein enthielten, wurden
gewonnen und mittels der 5-Fluouracil- und IL-1-Konversions-Assays
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2: Immunpräzipitation und Gewinnung von H-1 und IL-1 Aktivität unter Verwendung von Anti-IL-1α und Anti-IL-1β Antiseren
(H-1-Aktivität und IL-1-Aktivität in U/ml)
Überstände
Glycin-HCl Extrakte
Antisera
Keines
Vorblutserum
Anti-IL-1α
Anti-Il-1β
Beides
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Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigen, daß Anti-IL-1α H-1 und IL-1
Aktivitäten, die aus HBT-CM gereinigt wurden, präzipitiert wie mittels der
IL-1-Konversions- und 5-Fluoruracil-Knochenmark-Proliferations-Assays
gemessen wird. Die gebundene Aktivität kann in einem Glycin-HCl-Extrakt
gewonnen werden. Keine H-1-Aktivität konnte detektiert werden, die nicht
mittels Anti-IL-1α präzipitiert wurde. Die Antisera gegen IL-1β banden auch
etwas die H-1-Aktivität.
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Ein Protein-Elektrophorese/Immunblottingexperiment (Western Blot)
wurde durchgeführt, worin eine Proteinprobe, die H-1-Aktivität aus HBT-CM
enthielt, der Größe nach mittels Gelelektrophorese aufgetrennt wurde, auf
ein Substrat überführt wurde und Anti-IL-1α exponiert wurde. Die
Proteinbanden auf dem Substrat, das den Antikörper band, wurden anschließend unter
Verwendung von Peroxydasekonjugiertem Anti-Mouse IgG und einer geeigneten
Anfärbung detektiert. Dieses Experiment zeigte, daß die Proteinprobe eine
Komponente enthielt, die von Anti-IL-1α gebunden wurde, und ein
Molekulargewicht zeigte, das sich von dem von gereinigtem rekombinantem IL-1α nicht
unterscheiden ließ.