DE3751842T2

DE3751842T2 - Modifizierter, menschlicher Gewebeplasminogenaktivator und seine Herstellung

Info

Publication number: DE3751842T2
Application number: DE3751842T
Authority: DE
Inventors: Adair John Hotchkiss; John Vincent O'connor; Michael Walter Spellman
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-03-18
Filing date: 1987-03-17
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2007-03-18
Also published as: GB8706249D0; EP0238304A2; ATE139569T1; ES2088860T3; NZ219654A; NO871086D0; FR2597883A1; GR3020850T3; FR2597883B1; DE3708681A1; AU602510B2; NO172133B; DD258999A5; PT84493A; EP0238304B1; DK135887A; DE3751842D1; AU7008887A; PT84493B; JPS62282582A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige menschliche Gewebe- Plasminogenaktivatoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie keine funktionelle Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117 aufweisen. Die vorliegenden neuartigen menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivatoren sind im Vergleich zum nativen Zustand bezüglich der funktionellen Kohlenhydratstruktur an den Aminosäureresten 184 und/oder 448 ansonsten nicht modifiziert. Überraschenderweise behielten die neuartigen menschlichen Cewebe-Plasminogenaktivatoren im Vergleich zu ansonsten nativem Material im wesentlichen ihre volle biologische Aktivität bei und weisen in vivo eine unerwartet erhöhte Halbwertszeit auf.

Hintergrund der Erfindung

Menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator wandelt Plasminogen in Plasmin um. Das so erzeugte Plasmin spaltet proteolytisch jene Fibrinmatrizen, die das Rückgrat von Blutgerinnseln bilden. Der menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator führt dadurch die Auflösung von Blutgerinnseln herbei und eignet sich demnach zur Behandlung verschiedener thrombolytischer Störungen.
Die Abkürzung t-PA für menschlichen Cewebe-Plasminogenaktivator ("tissue-type plasminogen activator") wurde aufgrund eines Vorschlags beim "XXVIII. Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostatis", Bergamo, Italien, 27. Juli 1981, übernommen. Hierin bezeichnen die Ausdrücke "menschlicher Gewebe- Plasminogenaktivator", "t-PA", "menschlicher t-PA" oder "Gewebe- Plasminogenaktivator" den menschlichen, exogenen (Gewebe-)Plasminogenaktivator, der z.B. durch Extraktion aus natürlicher Quelle und Reinigung [siehe Collen et al., EP- A-41.766 (veröffentlicht am 16. Dezember 1981 auf der Grundlage der ersten Einreichung am 11. Juni 1980) und Rijken et al., Journal of Bio. Chem. 256, 7035 (1981), hierin durch Verweis aufgenommen] sowie durch rekombinante Zellkultursysteme hergestellt wird, die gemeinsam mit dessen Aminosäuresequenz sowie dessen physikalischen und biologischen Eigenschaften z.B. in EP-A-93.619 (veröffentlicht am 9. November 1983 auf der Grundlage der ersten Einreichung am 5. Mai 1983, hierin durch Verweis aufgenommen) beschrieben werden.
US-A-4.326.033 berichtet über die Ausweitung der Halbwertszeit von Urokinase durch chemische Modifikation ihrer Kohlenhydratstruktur. Urokinase unterscheidet sich immunologisch von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator. Es besteht weder durch US-A-4.326.033 noch durch irgendeine andere Veröffentlichung Anlaß zu der Annahme, daß derartige Kohlenhydrat-Modifikationen von Urokinase auf andere Glykoproteine anwendbar sind. Beispielsweise verringert die Entfernung von Sial insäure aus Ceruloplasmin dessen Halbwertszeit dramatisch, allerdings übt eine identische Behandlung von Transferrin, einem weiteren Serumglykoprotein, keinen signifikanten Einfluß auf die Halbwertszeit aus. (Sharon, Complex Carbohydrates, Addison-Wesley Pub. Co., S.194-196(1975); siehe auch Ashwell et al., Adv. Enzymology 41, 99 (1974) und Alexander et al., Science 226, 1328 (1984).
In der Internationalen Anmeldung WO 84/01786, veröffentlicht am 10. Mai 1984 auf der Grundlage einer ersten Einreichung am 28. Oktober 1982, wird eine ungezielt durchgeführte Modifikation von Gewebe-Plasminogenaktivator beschrieben, die zu einem Molekül mit verringerter biologischer Aktivität und einer dieser Veröffentlichung zufolge erhöhten Halbwertszeit (im Vergleich zum unmodifizierten Polypeptid) führt. Das einzige Beispiel betrifft die Behandlung eines teilweise gereinigten menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators mit Natriumperiodat, wodurch ein Produkt entsteht, das laut dieser Veröffentlichung etwa 70-90% der ursprünglichen (unmodifizierten) Aktivität aufweist. In WO 84/01786 finden sich keinerlei Hinweise auf die Einschätzung der Beschaffenheit und die Charakterisierung der im nativen Material und vor allem in der dadurch gebildeten, modifizierten Form vorhandenen Kohlenhydratstrukturen. Es ist bekannt, daß Periodat durch Oxidation alle Kohlenhydratstrukturen modifiziert oder stört, ohne daß es zu deren gleichzeitigen, substantiellen Entfernung aus der Aminosäurebindung käme.
Weiters gibt es in WO 84/01786 keine Hinweise darauf, wieviele derartige Strukturen menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator besitzt oder wie der tatsächliche Kohlenhydrat-Aufbau aussieht - weder der unmodifizierten noch der modifizierten Version. Das mit Periodat behandelte Molekül wurde daher höchstwahrscheinlich durch Oxidation aller Kohlenhydratstrukturen ungezielt, auf keine bestimmte Stelle abzielend modifiziert.
EP-227.462 offenbart di Erzeugung von t-PA-Mutanten, die an Glykosylierungsstellen sowohl an den Positionen 117-11 9 als auch 184-186 modifiziert werden, um ihre spezifische Aktivtät zu verändern.
EP-178.105 offenbart das Klonieren von Uterus-t-Pa, wodurch in eukaryotischen Zellen teilweise oder nicht-glykosylierter t-PA erzeugt wird.
In letzter Zeit wurde darüber berichtet, daß sich die in vivo-Clearance-Raten von glykosyl iertem und deglykosyliertem menschlischem Gewebe-Plasminogenaktivator nicht signifikant unterschieden, worauf sich der Schluß aufdrängte, daß die Clearance- Rate von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator durch die Abwesenheit von Kohlenhydraten nicht beeinflußt wird (Larsen et al., Proteases in Biological Control and Biotechnology, UCLA Symposium Park City, Utah, 9-14. Februar 1986. Siehe Little et al., Biochemistry 23, 6191(1984).

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun entdeckt, daß menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator eine spezifische Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117 aufweist, die sich beträchtlich von den Kohlenhydratstrukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 unterscheidet, und die bei vollständiger Entfernung (bzw. mit Adsnähme der an die Asn-Aminosäure gebundenen N-Acetylglucosamin-Gruppe) zu neuartigen menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivatoren führt, die im wesentlichen ihre volle biologische Aktivität beibehalten und unerwarteterweise in vivo eine erhöhte Halbwertszeit aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivatoren einschl ießl ich der Behandlung von t-PA mit Endoglykosidase, um die funktionelle Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117 zu ei iminieren, wobei die Gewebe-Plaminogenaktivatoren ansonsten funktionell unmodifizierte Kohlenhydratstrukturen (an den Aminosäureresten 184 und/oder 448) sowie eine im wesentlichen vollständig beibehaltene biologische Aktivität und eine erhöhte in vivo-Halbwertszeit aufweisen (im Vergleich zu "nativem" menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator mit einer intakten Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur Herstellung und die Verwendung von biologisch aktiven menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator- Äquivalenten, die sich in der gesamten Sequenz durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden, jedoch das gleiche Kohlenhydratmuster aufweisen wie die jeweiligen, neuartigen, menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivatoren der Erfindung. Die vorliegende Erfindung betrifft weiters zugehörige rekombinante Vektoren, Kulturen und Verfahren, die sich zur Herstellung der erfindungsgemäßen menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivatoren eignen.
Ein derartiges, im Schutzbereich der Erfindung enthaltenes menschliches Gewebe- Plasminogenaktivator-Äquivalent ist eine sogenannte Einzelketten-Mutante, worin die Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 275 und 276 durch Eliminierung der von proteolytischen Enzyme erkannten Aminosäuresequenz zerstört wird. Die Eliminierung der Sequenz erfolgt durch Abänderung spezifischer Aminosäuren, beispielsweise durch stel lenspezifische Mutagenese der zugrunde iegenden DNA-Codons gemäß dem weiter unten beschriebenen Verfahren.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt eine SDS-PAGE unter Comassie-Färbung von unbehandeltem (Reihe 1) und mit Endo H behandeltem (Reihe 2) menschlichem Gewehe-Plasminogenaktivator. Das hochmolekulare Band ist einkettiger t-PA; die anderen Hauptbänder sind Kringle (KI), Kringle II (KII) und Protease (P).
Fig. 2 zeigt Glykosidase-Spaltungen von reduziertem, carboxymethyliertem t-PA. Reihe 1: -N-Glykanase; Reihe 2: +N-Glykanase; Reihe 3: -Endo H; Reihe 4: +Endo H. Bänderidentifikation wie in Fig. 1.
Fig. 3 stellt eine Restriktionskarte von Ausgangsplasmid pUCPAΔHD dar.
Fig. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der mit Trichloressigsäure (TCA) fällbaren Radioaktivität für den menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator als Vergleich ( ) und für den menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator, der dem Endo H-Verfahren ohne das Enzym unterzogen wurde ( ), sowie für den mit Endo H behandelten menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator ( ). Die Daten sind Mittelwerte +/- S.D. (n = 5).
Fig. 5 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der mit Trichloressigsäure (TCA) fällbaren Radioaktivität für menschlichen t-PA als Vergleich ( ) und für Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-t- PA ( ).
Fig. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der mit Trichloressigsäure (TCA) fällbaren Radioaktivität für menschlichen t-PA als Vergleich ( ) und für Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;- Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA ( ).

Ausführliche Beschreibung

A. Allgemeines

Es wurde festgestellt, daß die Kohlenhydratstruktur an Äminosäurerest 117 des menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators die folgende Art von Zusammensetzung aufweist:
während die Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 die folgenden Arten von Zusammensetzungen aufweisen:
Abkürzungen: Man - Mannose; Gal - Galactose; Fuc - Fucose; GlcNAc - N- Acetylglucosamin; Sia - Sialinsäure; R - H oder Sia2 T 3Gal T 4GlcNAc.
Es sollte betont werden, daß die obigen Strukturen zwar für die Arten der auf deni menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator vorhandenen, N-gebundenen Oligosaccharide repräsentativ sind, die vorliegende Erfindung allerdings nicht auf die gezeigten Strukturen beschränkt ist. Jede Glykosylierungsstelle enthält wahrscheinlich mehrere eng verwandte, nicht-identische Strukturen. Dies ist als Mikroheterogenität bekannt, eine übliche Eigenschaft von Glykoproteinglykanen [Siehe J. Biol. Chem. 260, 4046 (1985)]. Beispielsweise können mannose-reiche Oligosaccharide hinsichtlich der Zahl vorhandener Mannose-Einheiten variieren. In komplexen Oligosacchariden kann die Mikroheterogenität Unterschiede bezüglich des Verzweigungsgrades sowie der Anzahl an Resten von Sialinsäure, Fucose, Galactose und N-Acetylglucosamin umfassen. Eine derartige Mikroheterogenität liegt auch im Schutzbereich der Erfindung.
Die Struktur mit hohem Mannose-Gehalt an Aminosäure 117 unterschied sich nicht nur bezüglich der Struktur von den komplexeren Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448, sondern auch dahingehend, daß ihre vollständige, funktionelle Entfernung ohne gleichzeitige Modifikation der Strukturen an 184 und 448 zu einem vollständig biologisch aktiven menschlichen Gewebe-Flasminogenaktivator mit erhöhter in vivo- Halbwertszeit führte.
Entfernung der funktionellen Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117 bedeutet vollständige Entfernung (z.B. indem das Glykosylierungssignal durch stellengerichtete Mutagenese zerstört wird, siehe unten) oder substantielle Entfernung (z.B. durch Behandlung mit Endoglykosidase, die beispielsweise zu einem intakten, mit Asn&sub1;&sub1;&sub7; verbundenen N-Acetylglucosamin-Rest führen kann). Eine funktionell unmodifizierte Kohlenhydratstruktur an den Aminosäureresten 184 und/oder 448 bezieht sich entweder auf die Beibehaltung der intakten Struktur(en) oder der im wesentlichen vollständigen derartigen Struktur(en), so daß diese zu nativem Protein funktionell gleichwertig sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Entfernung der funktionellen Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117 durch stellenspezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA des Glykosylierungssignals Asn-X-Ser/Thr, worin X jede beliebige Aminosäure sein kann. Im Fall des Gewebe-Plasminogenaktivators ist die dieses Signal darstellende Sequenz Asn&sub1;&sub1;&sub7; (Ser&sub1;&sub1;&sub8;) Ser&sub1;&sub1;&sub9;. Die Entfernung der funktionellen Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117 führt demnach (beispielsweise durch Mutagenese der diesen Aminosäureresten entsprechenden Codons) zur Zerstörung der Signalfunktionalität. Insbesondere kann die Mutagenese aul repräsentativen Codons des Signals erfolgen, so daß z.B. elli menschlicher Gewebe- Plasminogenaktivator mit einem anderen Aminosäurerest als Asparagin (Asn) an Position 117 und/oder einem anderen als Serin (Ser) oder Threonin (Thr) an Position 119 oder mit einem Prolin (Pro) an Position 118 erzeugt wird. In den bevorzugtesten Ausführungsformen wird - angesichts der engen Strukturähnlichkeit - Asparagin&sub1;&sub1;&sub7; durch Glutamin oder - angesichts einer analogen Sequenz im zweiten Kringle-Bereich - Serin&sub1;&sub1;&sub9; durch Methionin ersetzt.
Die Mutagenese erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, z.B. gemäß den Verfahren nach Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468 (1983). Beispielsweise führt die Änderung des für Asparagin kodierenden Codons AAC all Position 117 zu CAA oder CAG (erfordert zwei Nukleotid-Abänderungen) dazu, daß das Expressionsprodukt Glutamin an Position 117 enthält. Andere hierin enthaltene Mutationen ergeben sich aus der Analyse des genetischen Codes.
Ein alternatives Verfahren zur Entfernung des funktionellen Kohlenhydrats an Aminosäurerest 117 umfaßt die Verwendung einer Endoglykosidase, wie z.B.
Endoglykosidase H, die in der Lage ist, die mannose-reiche Kohlenhydratstruktur an Aminosäurerest 117 (Asn) (im wesentlichen) zu entfernen, ohne die komplexen Strukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 funktionell zu beeinflussen. Diese Behandlung erfolgt wiederum gemäß an sich bekannten Verfahren, z.B. nach dem Verfahren von Tarentino et al., J. Biol. Chem. 249, 811(1974) und Trimble et al., Anal. Biochem. 141, 515(1984).

B.Beispiele

Beispiel 1

Es wurde stellenspezifische Mutagenese eingesetzt, uni einen Expressionsvektor, der eine DNA operabet umfaßt, die für Gewebe-Plasminogenaktivator mii einem Glutamin- Aminosäurerest an Position 117 kodiert, wie folgt zu konstruieren:

a. Oligonukleotid-Konstruktion

Es 24-Mer-Oligonukleotid mit der Sequenz 5"-TGC-ACC-AGG--C*A*A*-AGC- AGC-GCG-3' (24-Mer Q117) wurde mittels des Phosphotriester-Verfahrens nach Creä et al., Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980) synthetisiert. Die Sternchen zeigen das mutierte Codon an (Asn bis GIN).

b. Konstruktion einer rekombinanten M13-Schablone

Plasmid pUCPAΔHD (Fig. 3) ist ein Derivat des als pETPFR bezeichneten Plasmids (auch als pPADHFR-6 bezeichnet, geoffenbart in EP-A-93.619, siehe oben) mit den folgenden Modifikationen: 1) 1 66 bp der untranslatierten 5'-DNA wurden unter Verwendung von Exonuklease Bal31 vom 5'-Ende des t-PA-Gens abgetrennt; 2) eine Hindlil-Stele an das neue 5'-Ende des t-PA-Gens angefügt; 3) ein Polylinker, der Erkennungsstellen für EcoRl, Sacl, Smal, BamHl, Xbal, SalI und Pvull enthält, wurde am 5'-Ende des frühen SV40-Promotors hinzugefügt, der die t-PA-Expression steuert; 4) die HindIII-Stel an Position 3539 von pETPFR wurde durch eine Klenow-Füllreaktion zerstört.
Plasmid PUCPAΔHD (Fig. 3) wurde mit Smal gespalten und das Fragment mit etwa 2, kb, welches das t-PA-Gen bis Codon Nr. 507 enthielt, wurde mittels PAGE und Elektroelution des Fragments aus dem Gel isoliert. Der Vektor M13mp10 (Messing, Methods in Enzymology 101, 20 [1983]) wurde auch mit Smal gespalten, einmal mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und erneut in 50 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDIA (TE) suspendiert. Das etwa 2,0 kb-Fragment von pUCPAΔHD wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in den mit Smal gespaltenen Ml 3mpl 9 ligiert und die resultierende DNA dazu verwendet, E.coli JM1O1 zu transformieren. Der resultierende Phage wurde isoliert, die Gegenwart der Einfügung bestätigt und deren Ausrichtung durch Restriktionsanalyse von Phagen-Minipreps bestimmt. Ein rekombinanter Phage, M13/t-PA-SMA, wurde zur nachfolgenden Mutagenese als Schablone ausgewählt.

c. Mutagenesereaktion

Der Mutagenese-Primer (24-Mer Q117) wurde an einstrangige M13/t-PA-SMA-DNA anneliert und mit E.coli-DNA-Polymerase-Klenow-Fragment in Gegenwart von DNTP s und T4-DNA-Ligase behandelt, um in vitro Heteroduplex-RF-Moleküle zu bilden (siehe Adelman et al., DNA 2,183 [1983]). Diese Moleküle dienten dazu, E.coli-Stamm JM101 (ATCC Nr. 33876) zu transformieren; Phagen, welche die gewünschte Mutation enthielten, wurden unter Verwendung des Mutagenese-Primers als Sonde durch Fleck- Hybridisierung nachgewiesen. (Adelman et al., DNA 2, 183 [1983]). Ein mutierter Phage wurde isoliert und als M13/t-PA-SMA-GLN 117 bezeichnet.

d. Subkonieren der GLN1 1 7-t-PA-Mutante in Expressionsplasmid pUCPAΔHD

Doppelstrangige DNA des Phagen M13/t-PA-SMA-GLN117 wurde mit Smal, Bglli und Apal gespalten und das etwa 1,4 kb-Fragment mittels PAGE gereinigt. Dieses Fragment wurde dann dazu verwendet, das korrespondierende Fragment in pUCPAΔHD zu ersetzen.
Die das t-PA-Genfragment enthaltenden, rekombinanten Plasmide wurden identifiziert.
Die Plasmide M119 und Q117 wurden wie folgt in Chozellen ohne DHFR eingebracht und amplifiziert (Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77, 4216 [1980]): 1) Plasmid-DNA wird nach dem Kalziumphosphat-Fällungsverfahren von Graham et al., J. Virol. 52, 455 (1973), in die Zeilen eingebracht; 2) in selektivem Medium [Medium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin (-HGT)] gebildete Kolonien werden durch Nachweis von Plasmin-Bildung indirekt auf t-PA-Expression getestet, was durch die Spaltung von Fibrin auf einer Agarpiatte mit Fibrin und Plasminogen bestimmt wird (siehe Granellia et al., J. Exp. Med. 148, 223 [1978]); 3) fünf der am stärksten positiven Klone werden mittels eines ELISA-Assays quantitativ auf die Menge an pro Zelle sekretiertem t-PA getestet; 4) der die größte Menge an t-PA sekretierende Klon wird wie folgt auf Methotrexat (MTX) enthaltende Platten aufgebracht: 2 x 10&sup5; Zellen werden auf 100 mm-Platten mit 50,100 oder 250 nM MTX aufgebracht; 5) fünfin MIX entstehende Klone werden extrahiert und quantitativ (durch ELISA) wie in obigem Schritt 3) getestet; 6) der die größte Menge an t-PA sekretierende Klon wird wie in obigem Schritt 4) auf höhere MTX-Konzentrationen enthaltende Platten aufgebracht, gefolgt von einem quantitativen Assay von fünf entstehenden Klonen und der Auswahl des am meisten t- PA produzierenden Klons.
Die obige Vorgangsweise des Amplifizierens und Screenens wird wiederholt, bis aus der resultierenden Zellinie keine Steigerungen der t-PA-Produktion erzielt werden und der korrespondierende mutierte t-PA zur späteren Verwendung abgetrennt wird.

Beispiel 2

Eine ähnliche Vorgangsweise wie in Beispiel 1 wurde angewandt, um unter Verwendung eines 24-Mers mit der Sequenz 5'-CC-AAC-TGG-AAC-AGC-A*T*G*- GCG-TTG-G-3' (24-Mer-M119) die entsprechende Met&sub1;&sub1;&sub9;-Mutante zu bilden, um pUCPAΔHD-M119 zu erhalten. Die Herstellung der entsprechenden M119-Mutante durch Expression erfolgt wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Es wurde wie folgt eine Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA-Mutante gebildet:
Das wie oben hergestellte Plasmid pUCPAΔHD wurde mit BglII und Scal gespalten und das etwa 763 bp-Fragment (entspricht den Codons 1 bis 254 der Gewebe Plasminogenaktivator-DNA-Sequenz) in an sich bekannter Weise mittels SDS-PAGE gereinigt.
Menschliche t-PA-DNA wurde aus den Plasmiden pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet) und pA25E10 erhalten. Die Herstellung dieser beiden t-PA-Plasmide wird in der oben angeführten und hierin durch Verweis aufgenommenen EP-A-093.619 beschrieben.
Plasmid PA25E10 enthält Sequenzen, die für die letzten 508 Aminosäuren des t-PA- Gens kodieren, sowie 772 Basenpaare des untranslatierten 3'-Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit Sacl und BglII gespalten, um ein 744 bp-Fragment zu produzieren, das nach oben beschriebenen Standardverfahren isoliert wurde. Dieses Fragment enthält die Codons für die t-PA-Aminosäuren 411 bis 527 und einen Teil des untranslatierten 3 Bereichs.
Plasmid pPADHFR-6 enthält das gesamte Struktur-Gen für t-PA und einen Teil des untranslatierten 3'-Bereichs. Dieses Plasmid wurde mit Sacl und Bglli gespalten, um ein 1.230 bp-Fragment zu bilden, das isoliert wurde. Dieses Fragment enthält Codons für die ersten 410 Aminosäuren der reifen Form von t-PA.
Diese Fragmente wurden nach Standardverfahren miteinander ligiert und mit BglII gespalten. Es wurde ein 1.974 bp-Fragment mit Codons für die gesamte reife t-PA- Sequenz und einen Teil des untranslatierten 3'-Bereichs isoliert. Doppelstrangiger M13mp8 [Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Hrsg. A. Walter, Elsevier, Amsterdam (1981), S.1431 wurde mit Bamhl gespalten und an den mit BGlII gespaltenen t-PA anneliert, um M13mp8PABglII zu bilden. E.coli- JM 101-Zellen (ATCC Nr.33876) wurden mit der doppelstrangigen replikativen Form von M13mp8PABglII transformiert. Die einstrangige und die doppelstrangige (RF) Form von M13mp8PABglII können aus mit diesem Phagen infizierten E.coli JM 101-Zellen isoliert werden. Die einstrangige Form diente zur stellenspezifischen Mutagenese von t- PA.
Das Strukturgen von menschlichem t-PA wurde durch stellenspezifische Mutagenese modifiziert, um t-PA mit Aminosäure-Substitutionen an verschiedenen Positionen zu exprimieren. Ein synthetisches Oligonukleotid wurde z.B. mittels des Festphasen- Phosphotriester-Verfahrens nach Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978), hergestellt und zur stellenspezifischen Mutagenese herangezogen: Primer 2C9 Glu DNA-Sequenz
Das hierin durch Verweis aufgenommene, allgemeine Verfahren nach Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), diente zur Schaffung eines t-PA-Klons, der die mutierte Sequenz des synthetischen Primers enthielt. Der mutierte t-PA-Klon M13RF2C9 wurde durch Verwendung des Primers gebildet, der die Mutation für die obige einzelne Aminosäure enthielt.
Im Plasmid pPADHFR-6 (auch als pETPFR bezeichnet - siehe EP-A-93.619 oben) steht die Expression des nativen t-PA-Strukturgens unter der Steuerung des frühen Promotors für SV40-I-Antigen. Dieser Promotor steuert auch die Expression des DHFR-Gens. Ein Vektorfragment 1 wurde durch Isolieren des großen Fragments erhalten, das durch Spaltung von pPADHFR-6 mit Bgh und Bsteli gebildet wurde. Ein weiteres Fragment 2 wurde durch Isolieren des 400 bp-t-PA-Fragments erhalten, das durch Spaltung von pPADHFR-6 mit BGLII und BSTXI entstand. Ein 1.141-bp-t-PA-Fragment 3 mit der gewünschten Mutation wurde durch Spaltung von RF-DNA aus dem mutierten t-PA-Klon M13RF2C9 mit BstXI und BstEII erhalten. Die Fragmente 1 und 2 wurden mit Fragment 3 ligiert. Das DNA-Gemisch wurde dazu verwendet, E.coli zu transformieren, um den eukaryotischen Expressionsvektor pPADHFR-6 2C9 zu ergeben.
Plasmid pPADHFR-6 2C9 (hergestellt wie oben bzw. in EP-A-199574, veröffentlicht am 29. Oktober 1986, beschrieben) enthält eine DNA-Sequenz, die für die Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-Gewebe-Plasminogenaktivator-Mutante kodiert. Es wurde mit Scai unj Apal gespalten und das Fragment mit etwa 630 bp (entspricht den Codons 254 bis 466 der Gewebe-Plasminogenaktivator-DNA-Sequenz) in an sich bekannter Weise mittels SDS-PAGE gereinigt.
Die beiden BGlII-Scal- (pUCPAΔHD) und Scal-Apal- (pPADHFR-6 2C9) Fragmente wurden in das große BglII-(bp 531)-Apal-(1926 bp)-Fragment aus gespaltenem pUCPAΔHD ligiert und das resultierende Plasmid, das mutierte Glutamin&sub1;&sub1;&sub7; Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA-DNA enthielt, in üblicher Weise eineni Miniscreenen unterzogen. Das resultierende Plasmid wurde wie oben in DHFR-freie CHO-Zellen eingebracht und in diesen amplifiziert und der entsprechende mutierte t-PA zur späteren Verwendung getrennt.

Beispiel 4

Die Aminosäuresequenz von t-PA enthält vier potentielle, N-gebundene Glykosylierungsstellen [Asn-X-Ser/Thr; Ann. Rev. Biochem. 41, 673 (1972)]. Es handelt sich dabei um die Asparagin-Reste 117, 184, 218 und 448. Es stellte sich jedoch heraus, daß Position 218 in t-PA nicht glykosyliert ist. Position 184 ist in Typ I-t-PA, nicht aber in Typ II-t-PA glykosyliert [Biochemistry 23, 3701(1984)].
Die Trennung mittels Gelfiltrations-Chromatographie von mit Pronase gespaltenem rt-PA ergab zwei Klassen von N-gebundenen Oligosacchariden (Tabelle 1). Die Zusammensetzung des höhermolekularen Materials stimmte mit fucosylierten Komplex- Oligosacchariden überein. Das niedermolekulare Material wies die für ein kleines, mannose-reiches Oligosaccharid erwartete Zusammensetzung auf (wahrscheinlich Man&sub6;GlcNAc&sub2;).
Die Befestigungsposition des mannose-reichen Oligosaccharids wurde durch Verwendung glykosidischer Enzyme unterschiedlicher Spezifitäten bestimmt. Die verwendeten Enzyme waren Endo-β-N-acetylglucosaminidase H (Endo H; Genzyme, Inc.), die mannose-reiche Oligosaccharide entfernt, jedoch keinen Einfluß auf Komplex- Oligosaccharide hat, sowie Peptid-N-Glykosidase F (N-Glykanase; Genzyme, Inc.), die sowohl Oligosaccharide mit hohem Mannose-Gehait als auch jene vom Komplex-Typ entfernt. Der für diese Versuche verwendete t-PA war mit Plasmin in die zweikettige Form umgewandelt und dann reduziert und carboxymethyliert worden.
SDS-PAGE trennte den reduzierten, carboxymethylierten, zweikettigen rt-PA in Kringle (Glykosylierung bei 117 und 184), Kringle II (Glykosylierung bei 117) und Protease (Glykosylierung bei 448) auf. Die Spaltung von t-PA mit N-Glykanase bewirkt ein Zusammenlaufen der Kringle-Banden an einer Position mit etwas größerer Mobilität als Kringle II und bewirkt auch eine erhöhte Mobilität der Protease (Reihe 2, Fig. 2). End0 H-Spaltung von t-PA erhöht die elektrophoretische Mobilität jeder Kringle-Bande, beeinflußt jedoch nicht die Mobilität der Protease-Bande (Reihe 4, Fig. 2). Das Endo H- Ergebnis zeigt, daß Kringle I und II jeweils ein mannose-reiches Oligosaccharid enthält; dieses muß sich an Rest 117 befinden, der einzigen Position, die sowohl bei Kringle als auch bei Kringle II glykosyliert ist. Die Endo H-Behandlung wandelt Kringle 1 nicht in Kringle II um; daher enthält Rest 184, der bei Kringle I allerdings nicht bei Kringle II glykosyliert ist, ein Komplex-Oligosaccharid. Position 448 muß auch eine komplexe Struktur enthalten, da die N-Glykanase-Behandlung die Mobilität des Protease- Abschnitts von rt-PA erhöht, während Endo H keine Auswirkung hat. Tabelle 1 Kohlenhydrat-Zusammensetzung von Oligosaccharid-Fraktionen aus mit Pronase gespaltenem t-PAa Probe Komplex-Typc Man nose-reicher Typd a Abkürzungen: Fuc = Fucose, Man = Mannose, Gal = Galactose, GlcNAc = N- Acetylglucosamin, Sia = Sialinsäure b Thiobarbitursäure-Assay c Bezogen auf 3 Mannose d Bezogen auf 2 GlcNAc

Beispiels

Endo-β-N-acetyiglucosaminidase H (Endo H) wurde von Genzyme, Inc. erstanden. SDS- PAGE erfolgte nach dem Verfahren von Laemmli, Nature 227, 680 (1970). 0,8 mg menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator (hergestellt wie in EP-A-93.619, siehe oben) (in 0,2 ml Formulierungspuffer, bestehend aus 0,2 M Argininphosphat, pH 6, mit 0,01% Tween 80) wurde mit Endo H (0,1 Einheiten in 0,05 nil 25 mM Natriumphosphat, pH 6) und Natriumazid (0,02%) vermischt. Die Probe wurde 20 Stunden lang bei 370 inkubiert. Es wurde eine menschliche Gewebe- Plasminogenaktivator-Vergleichsprobe gebildet und in gleicher Weise inkubiert, außer daß Natriumphosphat-Puffer (0,05 ml von 25 ml) an die Stelle der Endo H-Lösung trat. Nach der Inkubation wurden die Proben mit Formulierungspuffer auf ein Gesamtvolumen von 0,75 ml verdünnt und gegen den gleichen Formulierungspuffer weitgehend dialysiert. Die Proben wurden filtriert (0,4 µm HV-Filter, Amicon) und bei 4ºC gelagert.
Die Deglykosylierung wurde nach Reduktion und Carboxymethylierung mittels SDS- PAGE überwacht. Aliquote des so hergestellten menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivators (0,05 mg in 0,01 ml Formulierungspuffer) wurden mit 25 mM Natriumphosphat (pH 6, 0,015 ml) und 2x Laemmli-Probenpuffer mit 20 mM Dithiothreitol (0,025 ml) vermischt. Die Proben wurden 5 min lang auf 95ºC erhitzt und abgekühlt. lodessigsäure (0,015 ml einer 0,67 M Lösung in 1 N NH&sub4;OH) wurde zugegeben und die Proben in der Dunkelheit 3 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die reduzierten, carboxymethylierten Proben wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
Bei dieser Analyse wird unbehandelter, zweikettiger, menschlicher Gewebe- Plasminogenaktivator als Vergleich in drei Hauptbänder aufgetrennt, die Kringle 1 (Glykosylierung an Positionen 117 und 184), Kringle II (Glykosylierung an Position 117) und Protease (Reihe 1, Fig. 1) entsprechen. Die Endo H-Spaltung von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator erhöht die elektrophoretische Mobilität jedes Kringle- Bands, beeinflußt jedoch die Mobilität des Protease-Bands (Reihe 2, Fig. 1) nicht.
Die fibrinolytische Aktivität von mit Endo H behandeltem menschlichem Gewebe- Plasminogenaktivator wurde durch den in vitro-Gerinnsel-Lyse-Assay nach Collen et al., J. Clin. Path. 21, 705 (1968), untersucht. Die Aktivität von mit Endo H behandeltem menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator war in diesem Assay von jener des unbehandelten Vergleichs nicht zu unterscheiden.
Die menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator-Proben wurden gemäß dem Iodperlen-Verfahren [Markwell, Anal. Biochem. 125, 427 (1982)] zu einer spezifischen Aktivität von etwa 2 µCi/µg iodiert. Der verwendete Puffer setzte sich jeweils aus Arginin, 0,2 M, und Citrat, 0,1 M, (pH 6,0) sowie Iween 80, 0,01%, zusammen. Alle Proben wurden vor der Iodierung gegen diesen Puffer dialysiert. Der pH-Wert wurde vor der Iodierung mit Iris-Base auf 8,2 eingestellt. Das Iodierungsgemisch wurde dann über eine mit pH 6,0-Puffer äquilibrierte PD-10-Säule (Pharmacia) geschickt, die radioaktiven Proben aus dem Hohlraumvolumen wurden gesammelt, SDS-PAGE durchgeführt und das getrocknete Gel autoradiographiert. Die Autoradiographie der markierten menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivatoren zeigte, daß mehr als 95% der Radioaktivität vom menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator aufgenommen worden war.
Jeder markierte menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator wurde mit unmarkiertem Material bei einem Verhältnis von 1:200 (Gewichtstei le markiert:unmarkiert) vermischt und intravenös als Bolus in Hasen injiziert, die in jedem Ohr einen Arterienkatheter aufwiesen. Jeder Hase erhielt 1 mg/kg an unmarkiertem und 10 µCi/kg an markiertem menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator. Der unmarkierte menschliche Gewebe- Plasminogenaktivator wurde als Träger für die Spurenmenge an markiertem menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator verwendet, um therapeutische Mengen zu erzielen und Änderungen der Pharmakokinetik zu vermeiden, die sich aufgrund der Konzentrationsabhängigkeit in den Clearance-Wegen ergeben könnten. Reihen von arteriellen Blutproben wurden über einen Zeitraum von 26 min abgenommen und sofort in Röhren gefüllt, die ein lyophilisiertes Gemisch aus D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketen (PPACK) und EDTA in Endkonzentrationen von 1 µM bzw. 4,8 mM enthielten. Die Röhren wurden auf Eis gelegt und das Plasma abgetrennt. In jeder Plasmaprobe wurden die mit Trichloressigsäure (TCA) fällbare Radioaktivität (intakter menschlicher Gewebe- Plasminogenaktivator) sowie die Gesamtradioaktivität gemessen. Der immunreaktive menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator wurde auch durch ein Sandwich-ELISA- Verfahren gemessen, das polyklonale Antikörper verwendete und eine wirksame Empfindlichkeit von zumindest 30 ng/ml aufwies.
Zwei Arten von Daten wurden aus in vivo-Clearance-Untersuchungen in Hasen gewonnen. Ein Datentyp rührt vom immunreaktiven menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivator her, der ein Maß für die Clearance des unmarkierten Materials sein sollte. Der zweite Datentyp ist die mit TCA fällbare Radioaktivität, die mehr als 95% des intakten menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators darstellt. Die Kurven der Plasmakonzentration über der Zeit aus den Zählungen der immunreaktiven und der TCA-fällbaren Radioaktivität wurden an die geeigneten multiexponentiellen Modelle angepaßt und die abgeleiteten pharmakokinetischen Parameter verglichen.

Beispiel 6

Pharmakokinetik von mit Endo H behandeltem menschlichem Gewebe Plasminogenaktivator

Die pharmakokinetischen Profile des mit Endo H behandelten menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivators und des menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators als Vergleich, sowie eines zweiten Vergleichs eines menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivators, der den gleichen Reaktionsbedingungen wie der mit Endo H behandelte menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator in Abwesenheit von Enzym ausgesetzt worden war, sind in Fig. 4 dargestellt. Die im wesentlichen identischen Profile der beiden Vergleiche zeigen, daß die Manipulationen, die notwendig waren, um den Einfachzucker an 117 zu entfernen, nicht zur Änderung der Clearance des menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators beitrugen. Der mit Endo H behandelte menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator wird viel langsamer abgebaut. Die Analyse der Daten zeigt, daß eine Zunahme in der α-Phasen-Clearance-Rate zusätzlich zu einer Zunahme der Nullzeit-extrapolierten Konzentration für die β-Phase feststellbar ist. Der mit Endo H behandelte menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator besitzt eine verstärkte Bio-Verfügbarkeit, die durch das Integral des Produkts aus Zeit und Konzentration gemessen wird; dies ist ein relativ annahmefreies Maß für die Bio- Verfügbarkeit, die als Fläche unter der Kurve bezeichnet und durch die Endo H- Behandlung um einen Faktor von etwa 2 erhöht wird.
Jede Versuchsgruppe erhielt eine Trägerdosis von unmarkiertem menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator. In keinem Fall unterschieden sich die pharmakokinetischen Profile des unmarkierten menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivators jeder untersuchten Versuchsgruppe. Dies stellt einen inneren Vergleich dar, um zu bestätigen, daß die für eine bestimmte Gruppe ausgewählten Hasen nicht viel leicht ungewöhnliche Clearance-Eigenschaften aufwiesen.

Pharmakokinetik von Gln&sub1;&sub1;&sub7;-t-PA- und Gln&sub1;&sub1;&sub7;-Glu&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA-Mutanten

Die Pharmakokinetik von Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-t-PA und menschlichem t-PA als Vergleich ist in Fig. 5 dargestellt. Der Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-t-PA wird viel langsamer abgebaut als der Vergleich.
Ein ähnliches Profil zeigt sich beim Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA (hergestellt wie in Beispiel 3), wie in Fig. 6 dargestellt.

Fibrinbindungs-Eigenschaften

Die Fibrinbindung ist ein äußerst wichtiger Faktor, der vermutlich direkt mit der Fibrinspezifität in Zusammenhang steht, die menschlicher Gewebe- Plasminogenaktivator in vivo besitzt. Die Fibrinbindung des mit Endo H behandelten menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators wurde mittels zweier Vorgangswei sen bewertet. Die erste umfaßt das Einfangen von menschlichem Gewebe- Plasminogenaktivator durch Fibrin, das auf einen Napfin einer Standard- Mikrotiterschale aufgetragen wurde; jeder Napf wird dann gewaschen und eine Lösung aus Plasminogen und einem chromogenen Substrat für Plasmin (S-2251, Kabi) zugegeben. Die erzeugte Farbe ist proportional zur Menge an menschlichem Gewebe- Plasminogenaktivator, die im ersten Schritt eingefangen wird (Angles-Cano, Ihrombosis and Haemostasis 54, 171 [1985]). Die zweite Art von Assay bezüglich der Fibrinbindung mißt (mittels ELISA) die Menge an menschlichem Gewebe- Plasminogenaktivator, die in Lösung verbleibt, wenn Ihrombin einer Lösung aus plasminogenfreiem Fibrinogen und menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator zugegeben wird (Rijken et al., J. Bio. Chem. 257, 2920 [1982]). Es ist derzeit unklar, durch welchen Assay die in vivo-Folgen der Fibrinbindung des veränderten menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators geeignet vorhersagbar sind. Auf der Grundlage der Daten aus den beiden Assays kann geschlossen werden, daß der mit Endo H behandelte menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator eine zumindest unveränderte, wenn nicht sogar verbesserte Fibrinspezifität aufweist.
In ähnlicher Weise zeigten die Fibrinbindungs-Versuchsdaten von Glutaminll&sub1;&sub1;&sub7;- Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA aus Beispiel 3, daß der Glutamin&sub1;&sub1;&sub7;-Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;-t-PA dem Glutaminsäure&sub2;&sub7;&sub5;4-PA ähnelt und dem t-PA-Vergleich hinsichtlich Fibrinstimulation und spezifischer Aktivität überlegen ist.

Beispiel 7

Die wie in Beispielen 1 und 2 hergestellten und beschriebenen Gln&sub1;&sub1;&sub7;- und Met&sub1;&sub1;&sub9;- Mutanten werden jeweils auf fibrinolytische Aktivität untersucht, wobei die Ergebnisse ähnlich sind wie beim mit Endo H behandelten Material (siehe oben). Die Pharmakokinetik jeder Mutante ähnelt, relativ zu den menschlichen Gewebe- Plasminogenaktivatoren als Vergleiche, wie oben beschrieben, ebenfalls jener des mit Endo H behandelten Materials.

Beispiel 8

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen zu bilden, wobei das hierin erhaltene, menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator-Produkt in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel und deren Formulierung unter Miteinbeziehung von anderen menschlichen Proteinen, z.B. menschliches Serumalbumin, werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben (hierin durch Verweis aufgenommen). Solche Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des vorliegenden Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge an Vehikel, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen herzustellen, die sich zur effektiven Verabreichung an den Wirt eignen.
Beispielsweise kann der menschliche Gewebe-Plasminogenaktivator der Erfindung parenteral an Versuchspersonen verabreicht werden, die an kardiovaskulären Erkrankungen leiden. Die Dosierung und die Dosierungsraten können mit jenen übereinstimmen, die derzeit in klinischen Untersuchungen anderer kardiovaskulärer Ihrombolytika zum Einsatz kommen, z.B. etwa 1-2 mg/kg Körpergewicht ais intravenöse oder intraarterielle Dosis über einen Zeitraum von 1,5-12 Stunden bei Patienten, die an Myokardinfarkt, Lungenembohe usw. leiden.
Als ein Beispiel für eine geeignete Dosierungsform kann ein Fläschchen, das 50 mg menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 enthält, mit 50 ml sterilem Wasser zur Injektion rekonstituiert und mit eineni geeigneten Volumen an 0,9%-iger Natriumchlorid-Injektionslösung vermischt werden.
Die verlängerte Halbwertszeit von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator kann beispielsweise für eine rasche intravenöse Injektion geeignet sein. Dies würde komplizierte Verabreichungsverfahren überflüssig machen und könnte die Möglichkeit der Verwendung von t-PA in Umgebungen mit beschränkter medizinischer Ausrüstung, wie z.B. in einem Krankenwagen mit paramedizinischem Personal, erhöhen. Eine verlängerte Halbwertszeit von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator kann auch die Anwendung geringerer, zuverlässigerer Anfangsdosen ermöglichen und thrombolytisch wirkungsvolle Plasminmengen über einen Zeitraum von bis zu 45 Minuten oder länger aufrechterhalten. Eine längere Halbwertszeit von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator kann auch für eine Langzeittherapie mit niedrigeren Dosen, die zur Vermeidung der Reokklusion nach einer erfolgreichen akuten Thrombolyse erforderlich sein kann, oder für eine längere Ihrombolyse geeignet sein, die eventuell in Fällen von peripherem Gefäßverschluß notwendig ist.

Claims

für die Vertragsstaaten BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA), der im Vergleich zu nativem t-PA im wesentlichen die volle biologische Aktivität beibehalten hat und in vivo erhöhte Halbwertszeit aufweist, welches Verfahren die Behandlung von t-PA mit Endoglykosidase umfaßt, welche die funktionelle Kohlenhydratstruktur eliminiert, die in nativem t-PA bei Aminosäurerest 117 auftritt, mit der allerdings die funktionell unmodifizierten Kohlenhydratstrukturen bei den Aminosäureresten 184 und 448 beibehalten werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der t-PA in einkettiger Form vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Aminosäuresequenz so mutiert wird, daß die Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 275 und 276 zerstört wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der t-PA an Position 275 einen Glutaminsäurerest aufweist.

5. Verwendung von menschlichem t-PA, der (a) eine Mutation aufweist, welche die Glykosylierungsstelle nur bei Aminosäurerest 117-119 zerstört, und (b) gegebenenfalls eine Mutation aufweist, um die Spaltstelle bei den Aminosäureresten 275-276 zu eliminieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung im Vergleich zu einer Zusammensetzung mit nativem t-PA im wesentlichen die volle biologische Aktivität beibehält und in vivo erhöhte Halbwertszeit aufweist.

6. Verwendung von menschlichem t-PA, (a) dem funktionelle Kohlenhydratstrukturen an Aminosäurerest 117 fehlen, (b) der ansonsten funktionell unmodifizierte Kohlehydratstrukturen an den Aminosäureresten 184 und 448 aufweist, und (c) der gegebenenfalls eine Mutation aufweist, um die Spaltstelle an den Aminosäureresten 275-276 zu eliminieren, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung im Vergleich zu einer Zusammensetzung mit nativem t-PA im wesentlichen die volle biologische Aktivität beibehält und in vivo erhöhte Halbwertszeit aufweist.

7. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin der t-PA an Position 117 eine andere Aminosäure als Asparagin aufweist.

8. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin der t-PA an Position 119 eine andere Aminosäure als Serin oder Threonin aufweist.

9. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin der t-PA an Position 117 Glutamin aufweist.

10. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin der t-PA an Position 119 Methionin aufweist.

11. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin der t-PA an Position 118 Prolin aufweist.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 11, worin der t-PA in einkettiger Form vorliegt.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin der t-PA an Position 275 Glutaminsäure aufweist.

14. Verwendung nach Anspruch 12, worin der t-PA an Position 117 Glutamin und an Position 275 Glutaminsäure aufweist.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, worin der t-PA über rekombinante DNA-Expression von rekombinanter DNA erzeugt wird, die für den menschlichen t-PA kodiert und an Position 117 ein Codon aufweist, das nicht für die Aminosäure Asparagin kodiert, oder an Position 119 ein Codon aufweist, das nicht für die Aminosäuren Serin oder Threonin kooiert.

16. Pharmazeutische t-PA-Zusammensetzung, die im wesentlichen die volle biologische Aktivität beibehalten hat und in vivo erhöhte Halbwertszeit aufweist, umfassend menschlichen t-PA nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.