DE3750474T2

DE3750474T2 - Bestimmung von Bakteriuria.

Info

Publication number: DE3750474T2
Application number: DE3750474T
Authority: DE
Inventors: Edwards S Hyman
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2007-06-13
Also published as: ATE110787T1; EP0294529B1; DE3750474D1; EP0294529A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zum Nachweis von abnormen Bakterien-Gehalten und sie betrifft die Behandlung von Patienten, die an rheumatoider Arthritis, einer essentiellen Hypertension und anderen Krankheiten leiden, bei denen eine signifikante Bakteriurie nachgewiesen wurde mit dem erfindungsgemäßen Probenpräparat, die nach bekannten Verfahren nicht leicht hätte nachgewiesen werden können.
Unter günstigen Bedingungen sind Bakterien in einem wäßrigen Medium unter dem Mikroskop bei nur 100-facher Durchmesservergrößerung sichtbar, in der Regel werden sie jedoch bei 1000-facher Durchmesservergrößerung nach dem Trocknen und Anfärben mit geeigneten Farbstoffen sichtbar gemacht. Beide Verfahren der Sichtbarmachung werden bisher bei der Urinuntersuchung angewendet. Viel gebräuchlicher ist jedoch der Nachweis von Bakterien im Urin (Harn), indem man sie in einem geeigneten Kulturmedium wachsen läßt, bis die Kolonien für das bloße Auge sichtbar sind. Durch Auszählen der Kolonien und Multiplizieren mit der Urinverdünnung kann unter der Annahme, daß eine Kolonie ein einzelnes Bakterium oder ein Bakterien-Cluster in der ursprünglichen Probe darstellt, kann die Anzahl der Bakterien in einem cm³ Urin bestimmt werden.
Die Direktmikroskopier- und Kultivierungsverfahren sind jeweils mit Fehlern behaftet. In den letzten 20 bis 25 Jahren wurde die direkte Sichtbarmachung von Bakterien im Urin großenteils aufgegeben zugunsten der Verfahren, bei denen Bakterien kultiviert und die Bakterienkolonien ausgezählt werden. Praktisch alle Untersuchungen über die Signifikanz der Bakteriurie basieren nämlich auf der Kultivierung des Urins und die direktmikroskopische Untersuchung des Urins ist heute lediglich ein schnelles, jedoch ungenaues Reihenuntersuchungsverfahren, das hilfreich sein kann, weil es mit den Kultivierungsverfahren in Korrelation gesetzt werden kann.
Jedes Kultivierungsverfahren bedingt jedoch, daß die Bakterien in einem Labor in dem ausgewählten Medium und innerhalb der festgelegten Zeit wachsen können. Wenn die Bakterien beschädigt oder abgetötet sind, wenn sie den Körper verlassen, dann können sie nicht wachsen. Es gibt viele Gründe, warum Bakterien im Urin geschädigt sein können. Durch die Abwehrverfahren des Wirtes werden Bakterien geschädigt. Die Ionenkonzentration oder Osmolalität der Lösung kann schädigend wirken. Das Oxidationspotential von Urin ist in der Regel zu hoch (beispielsweise +0,22 bis +0,25 Volt). Es kann ein schädliches Stoffwechselprodukt im Urin vorhanden sein (es wurden Human-Antikörper bereits im Urin identifiziert und es wurde nachgewiesen, daß sie sich auf den Bakterien im Urin abscheiden). Einer oder viele dieser Faktoren kann (können) bewirken, daß ein gegebenes Bakterium in vitro nicht lebensfähig ist. Schließlich wachsen die Bakterien auch dann nicht, wenn das verwendete Medium für das Wachstum der vorhandenen speziellen Organismen ungeeignet ist.
Durch Anfärben und Betrachten unter einem Mikroskop kann leicht gezeigt werden, daß viele der Bakterienformen, die unter dem Mikroskop zu finden sind, zu dem Zeitpunkt, als die Probe erhalten wurde, nicht am Leben waren. So enthalten beispielsweise einige keine Nucleinsäure, eine für das Leben wesentliche biochemische Komponente. Sollten alle Bakterien in einer gegebenen Probe frei von einer Nucleinsäure sein, dann wird keines wachsen und die Urinkultur bleibt steril. Tatsächlich ergeben viele Urinproben von kranken Patienten, die eine riesige Anzahl von Bakterien enthalten, keine sich entwickelnde Bakterienkultur im bakteriologischen Labor des Krankenhauses. Wenn das Labor "kein Wachstum" angibt, läßt der Kliniker möglicherweise die Möglichkeit einer signifikanten Bakteriurie außer acht und damit die Möglichkeit einer Infektionsursache. Dennoch können diese toten, geschädigten oder anspruchsvollen Bakterien, obgleich sie in der Kultur nicht wachsen, in vivo die Erkrankung des Patienten verursacht oder verschlimmert haben.
Hinsichtlich der direkten Untersuchung des Urins muß darauf hingewiesen werden, daß, obgleich Bakterien im Urin bei nur 100-facher Durchmesservergrößerung sichtbar sein können, die Größe des Bildes nicht der einzige Gesichtspunkt ist. Sollten nämlich die optische Dichte und der Brechungsindex eines toten Bakteriums nahe bei denjenigen des Mediums liegen, dann würde es im gewöhnlichen Lichtmikroskop nicht nachgewiesen. Es kann sichtbar gemacht werden durch Anfärben oder möglicherweise durch eine spezielle Beleuchtung (aber selbst dann können runde Bakterien nicht unterschieden werden von anderen nahezu runden Teilchen, wie z. B. Kristallen). Nach dem derzeitigen Verfahren wird der Urin bei 100- bis 400-facher Durchmesservergrößerung untersucht, er wird aber auch getrocknet und in spezieller Weise behandelt, um so die Bakterienstruktur beizubehalten und zu konservieren durch Anfärben. Insbesondere wurde jetzt gefunden, daß Urin Lipide enthält, die als Detergentien wirken. Sollten sie auf dem Objektträger verbleiben, wenn ein wäßriger Farbstoff auf den Objetträger aufgebracht wird, dann wird ein Großteil des Sediments (einschließlich der Bakterien) von dem Objetträger heruntergewaschen und das Präparat geht verloren. Dies ist ein Hauptgrund dafür, warum frühere Versuche, die Bakteriurie zu untersuchen, fehlgeschlagen sind. Wenn man einen Objetträger, der nach dem Standardverfahren behandelt worden ist, mit einem anderen vergleicht, der vor dem chemischen Fixieren mit einem Lipidlösungsmittel gewaschen worden ist, so findet man, daß nach dem Anfärben viel mehr Sediment auf dem gewaschenen Objetträger zu finden ist. Der größte Teil des Sediments ist bei der Standard-Vorbehandlung ausgewaschen worden. Ein Chromatogramm der entfernten Lipide zeigt mehrere Lipide im Bereich der Polarität der Phospholipide (z. B. Lecithin, Phosphatidylserin und dgl., wobei diese Substanzen als Detergentien wirken), sie enthalten jedoch keine merklichen Mengen an Phosphor und sind daher keine Phospholipide. Standardverfahren zur Vorbehandlung und Anfärbung von Urinproben, wie z. B. dasjenige nach US-A-4 225 669 (Melnick), ergeben keine vorsorgliche Entfernung dieser Lipide.
Erfindungsgemäß wird eine Lipidwäsche angewendet zur Entfernung von Substanzen aus dem Urin, welche die Retention von Bakterienzellen nach dem wäßrigen Anfärben stören könnten. Daran schließt sich eine chemische Fixierung an zur weiteren Fixierung der Probe an dem Glas-Objektträger. Dank des hier angewendeten verbesserten Proben-Vorbehandlungsverfahrens konnte gezeigt werden, daß bestimmte Erkrankungen von bisher unbekannter oder ungewisser Ethiologie mit einer Bakteriurie im Zusammenhang stehen, die nach den bekannten Verfahren nicht nachgewiesen wurde. Die Anwendung einer antibiotischen Therapie, die für die nachgewiesenen Organismen geeignet ist, kann dann therapeutische Vorteile bei der klinischen Erkrankung bieten. Diese Verbesserung ist ein starker Hinweis auf einen kausalen Zusammenhang.
Zu den Erkrankungen, die meistens von der Anwendung einer antibiotischen Therapie nach dem Nachweis einer Bakteriurie gemäß der vorliegenden Erfindung profitieren, gehören beispielsweise: die rheumatoide Arthritis (und die damit verwandte Bursitis, Tendonitis, Temporo-Mandibular- Arthritis, Sacroiliacal-Arthritis, das Carpal-Tunnel-Syndrom, die temporale Arteritis, der palindromische Rheumatismus) und die "essentielle" Hypertension.
Obgleich nur eine begrenzte Anzahl von Fällen untersucht, diagnostiziert und erfolgreich behandelt worden ist, wird angenommen, daß die vorliegende Erfindung auch relevant sein kann für die Behandlung anderer Erkrankungen oder Zustände, wozu die folgenden gehören: rheumatisches Fieber, systemische Lupus erythematodes, Sclerodermie, klassische Migräne, transiente (vorübergehende) ischämische Anfälle (TIA) des Gehirns, der Mitralklappen-Prolaps, Steine im Urintrakt, die reversible Abnahme der Nierenfunktion, "Brittle" (labiler) -Diabetes mellitus, Lymphagitis, die sich manifestiert als chronische Brawny-Anschwellungs- oder bakterielle -Elephantiasis, andere nicht erklärbare Ödeme, Proteinurie oder Abgeschlagenheit und viele Fälle von diffusen Rückenschmerzen.
Die vorstehend beschriebene Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von Bakterien, insbesondere Kokken, im Urin - im allgemeinen von mehr als 20 Kokken pro cm³ - ist nützlich als generelle diagnostische Methode, die bei der Diagnose der oben aufgezählten Erkrankungen oder Zustände angewendet werden sollte. Wenn einmal Kokken gefunden worden sind, wird eine wirksame Menge eines gegenüber den Kokken wirksamen Antibiotikums verabreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum direkten mikroskopischen Nachweis von Bakterien (einschließlich der toten und beschädigten Bakterien) in einer Urinprobe, das umfaßt das chemische Fixieren und Anfärben der Bakterien und das Betrachten der Bakterien unter dem Mikroskop, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Lipid-Komponenten aus der Probe entfernt werden durch Kontaktieren derselben vor dem Fixieren mit einem Lipid-Lösungsmittel.
In den beiliegenden Zeichnungen ist die Fig. 1 ein schematisches Diagramm, das die Stufen bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert.
Die Untersuchungs- und Vorbehandlungsstufen der derzeit bevorzugten Ausführungsform werden nachstehend beschrieben.

1) Zentrifugieren:

Bei der üblichen Praxis wird Urin zentrifugiert mit einer relativen Zentrifugalkraft (RCF) von etwa dem 1000-fachen der Schwerkraft oder weniger. Allgemein wird die RCF nicht angegeben, in mehrdeutiger Form angegeben oder angegeben in Form der Anzahl der Umdrehungen pro Minute einer gegebenen Zentrifuge, ohne den Radius des Rotors anzugeben. Das Zentrifugieren der Proben war früher häufig unzureichend. Theoretisch kann es sein, daß ein kleines Teilchen sich innerhalb irgendeiner Zeit bei einer zu niedrigen RCF nicht abscheidet (nicht sedimentiert) (beispielsweise Kolloide). In der Praxis werden einige Bakterien bei der RCF der "klinischen Zentrifuge" nicht sedimentiert. Beschädigte Bakterien können eine niedrigere Dichte haben, die sich derjenigen des Urins nähert, der selbst in bezug auf seine Dichte von Probe zu Probe variiert. Häufig ist es wichtig, eine RCF anzuwenden, die hoch genug ist, um alle Bakterien zu sedimentieren. Vorzugsweise wird der Urin 10 bis 15 min lang bei dem 4000-fachen der Schwerkraft zentrifugiert. Das Röhrchen kann zweckmäßig konisch sein mit einem Volumen von 15 bis 50 ml, je nach Zentrifuge.

2) Dispergieren:

Nach dem Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit wird das Sediment in der zurückbleibenden klaren Flüssigkeit (etwa 0,1 ml in einem üblichen konischen 15 ml-Röhrchen) dispergiert und die Suspension wird auf einem sauberen Glas-Objektträger ausgebreitet.

3) Betrachten im nassen Zustand:

Das Sediment wird ohne Deckplättchen bei 100- bis 400-facher Durchmesservergrößerung betrachtet (ein Deckplättchen kann Formkörper (Kristalle) und andere geformte Elemente beschädigen und die Entfernung des Deckplättchens kann erforderlich sein, um den Objektträger anzufärben).

4) Trocknen:

Der Objektträger wird dann langsam getrocknet, beispielsweise unter dem Luftstrom eines mit geringer Leistung betriebenen Haartrockners.

5) Entfernung von Lipiden:

Die Lipide, die nun im Urin gefunden wurden, liegen im Bereich der Polarität der Phospholipide. Vorzugsweise werden sie herausgewaschen mit einer Mischung aus reinem Methanol und einem halogenierten Kohlenwasserstoff (z. B. 1,1,1-Trichlorethan) in einem Verhältnis 50 : 1.

6) Fixieren:

Obgleich verdünnter Glutaraldehyd in Methanol verwendbar ist, werden die Strukturen von Zellen und beschädigten Bakterien besser konserviert, wenn anschließend eine Lösung von Kupferphthalocyanin in Methanol aufgebracht wird.

7) Waschen:

Der Objektträger wird vorzugsweise mit reinem Methanol gewaschen, um restliches Kupferphthalocyanin zu entfernen.

8) Anfärben:

Es kann eine konventionelle nicht-fluoreszierende Färbung, beispielsweise die Gram-Färbung, ebenso angewendet werden wie eine Gegenfärbung, wie eine Safranin-Färbung. Der Objektträger wird getrocknet und ohne ein Deckplättchen bei 1000-facher Durchmesservergrößerung untersucht.
Sollte der Urin beträchtliche Mengen an Glucose (beispielsweise bei einem nicht eingestellten Diabetiker) enthalten, dann trocknet die Glucose innerhalb der Zwischenräume des Sediments auf dem Objektträger ein und das Sediment wird durch den Glutaraldehyd (GTL) oder durch das Kupferphthalocyanin (CuP) in Methanol nicht fixiert. Diese Glucose löst sich wieder auf, wenn eine wäßrige Färbung angewendet wird und in dem Maße wie sie sich wieder auflöst, setzt sie das Sediment frei. Entsprechend gilt dann, wenn der Urin 30 mg % oder mehr lösliches Protein (Albumin und dgl.) enthält, daß dieses lösliche Protein stört. Im Gegensatz zu der Glucose wird dieses Protein durch den GTL und das CuP fixiert und bildet einen spröden Film auf dem Objektträger. Große Teile dieses Films brechen ab in dem Anfärbungsverfahren. Selbst dann besteht eine deutliche Neigung, daß der freigesetzte Film die geformten Elemente (insbesondere die Bakterien) zurückläßt, die auf dem Objektträger fixiert bleiben. Dieser Teil des homogenen Films aus Protein, der auf dem Objektträger verbleibt, wird genauso gefärbt wie die geformten Elemente und während der Untersuchung auf Bakterien unter Verwendung des Ölobjektivs (1000-fache Vergrößerung), kann der gefärbte Proteinfilm Bakterien und wichtige geformte Elemente in dem Sediment (weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen, tubuläre Epithelzellen und Formkörper) verdecken. Da die Bakterien in der Regel nachweisbar sind entweder im Innern des Proteins oder im Bereich des von dem Proteinfilm freien Objektträgers, geht das Präparat nicht vollständig verloren.
Zusätzlich zu den Urinen, die übermäßige Mengen an Glucose und Protein enthalten, enthalten einige wenige Urine ein anderes lösliches Nicht-Lipid-Material (möglicherweise Phosphate), das an dem Objektträger nicht fixiert wird und welches das Sediment aus dem Objektträger freisetzt. Alle diese Urine können nach dem Waschen des Sediments besser untersucht werden. Häufig bleibt genügend Sediment in dem für die anfängliche Zentrifugierung verwendeten Teströhrchen zurück, um ein Waschen durchführen zu können.
Bei einer Modifikation des Verfahrens wird somit anstelle der obigen Stufe 2 das Sediment mit einer Lösung, vorzugsweise einer ionischen Lösung, insbesondere einer schwach hypertonischen Lösung gegenüber dem Plasma (wie z. B. einer 0,2 molaren NaCl-Lösung), gewaschen, die durch ein 0,22 um-Filter filtriert worden ist, um sie bakteriologisch steril und teilchenfrei zu machen.
Um das verdichtete Sediment des frischen Urins (bei der oben angegebenen üblichen Vorbehandlung) zu waschen, wird es in etwa 3 ml Waschlösung dispergiert und beispielsweise mit 4000 g 5 min lang zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird dekantiert und das Sediment wird mit weiteren 3 ml gewaschen. Das zweimal gewaschene Sediment wird auf einem Objektträger ausgebreitet, auf dem bei geringer Vergrößerung (100-fach) die geformten Elemente (Kristalle, weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen, tubuläre Epithelzellen, Bakterien) leichter erkennbar sind als das gewaschene Sediment. Nach dem Trocknen auf dem Objektträger haftet das gewaschene Sediment sehr gut an dem Glas durch die Entfettung, Fixierung und Anfärbung. Das oberflächliche Aussehen des nach Gram gefärbten Objektträgers ist unterschiedlich (dichter und rot anstelle von blau), weil ein Teil des Materials (vermutlich Glycoprotein), das sich mit Kupferphthalocyanin blau färbt, entfernt worden ist. Die Gram-Färbung ist jedoch nicht verändert. Gram-positive Bakterien haben noch die positive Färbung. Da jedoch der größte Teil des Proteins und der Glucose entfernt worden ist, sticht das Gram-negative Sediment (Bakterien, Zellen, Formkörper (Kristalle)), das vorher durch die ähnliche homogene Färbung des ausgefällten löslichen Proteins verdeckt war, nun hervor.
Da eine dicke Ablagerung von Kupferphthalocyanin ultraviolettes Licht absorbiert, kann dieses Fixierungsmittel nicht für eine UV-fluoreszierende Färbung verwendet werden. Die Stufe Nr. 6 kann so modifiziert werden, daß sie eine UV-Fluoreszenz-Färbung erlaubt, indem man entweder die Glutaraldehyd-Konzentration oder die Dauer der Einwirkung des Fixierungsmittels erhöht. Dann kann der Objektträger mit dem UV-fluoreszierenden Färbemittel angefärbt werden, beispielsweise mit einer stabilisierten Lösung von Acridin-Orange. Acridin-Orange und die meisten ähnlichen kationischen Farbstoffe haben selbst eine fixierende Wirkung und so kann die Anwendung der UV-fluoreszierenden Färbung in einigen Fällen angewendet werden als Ersatz für die Verwendung eines Fixiermittels.
Bei einer weiteren Modifikation des erfindungsgemäßen Probenpräparierungsverfahrens werden unlösliche Proteine durch Bakterien- oder Fungi-Proteasen oder durch proteolytische Enzyme tierischen Ursprungs, wie kristallines Trypsin und Chymotrypsin, entfernt. Das Enzym kann nach dem Fixieren des Sediments an dem Objektträger verwendet werden, vorzugsweise wird es jedoch vor dem Waschen verwendet.
Ein nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren präparierter Objektträger kann nach dem Fixieren mit GTL, jedoch vorzugsweise vor dem Fixieren mit CuP mit einem proteolytischen Enzym behandelt werden. Es wird einfach eine Lösung des Enzyms in einer Salzlösung auf den Objekt träger aufgebracht. Der Objektträger wird bei Raumtemperatur oder bei 37ºC inkubiert, mit der Salzlösung gewaschen, erneut fixiert und angefärbt.
Es ist bevorzugt, das Sediment mit dem Enzym in dem Teströhrchen zu behandeln, bevor das Fixiermittel zugegeben wird. Frischer Urin wird 10 bis 15 min lang bei 4000 g ohne Fixiermittel oder Konservierungsmittel zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und zu dem Sediment wird kristallines Trypsin (oder eine starke Lösung von bakterieller Protease) zugegeben. Nach dem Rühren wird das Röhrchen 10 min lang (vorzugsweise bei 37ºC) inkubiert und dann 5 min lang bei 4000 g zentrifugiert. Die anfallende neue überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und das Sediment wird wie oben 2 mal gewaschen.
Durch die Behandlung wird ein Teil der unlöslichen Proteine entfernt. Dabei treten zwei Vorteile auf: erstens wird ein Teil des Sediments entfernt, die Bakterien und sogar Bakterienabbauprodukte, Zellen und Formkörper (Kristalle) werden ausgespart. Dies stellt eine Möglichkeit zur Konzentrierung des wichtigen Sediments, wie z. B. von Bakterien, dar. Zweitens ändert sich die Färbung einiger Bakterien. Höchst bemerkenswert ist das Auftreten von Gram-positiven Kokken in Sedimenten, die in ihren ungewaschenen oder gewaschenen Präparaten nur Gram-negative Kokken enthielten. Da das Gram-positive Material eigentümlich ist für die Zellwand dieser Bakterien, ist es sehr unwahrscheinlich, daß jedes der beiden proteolytischen Enzyme die Zellwandbedingungen für eine positive Färbung (Beibehaltung des jodierten Kristallviolett) schaffen. Statt dessen ist es sehr wahrscheinlich, daß jedes proteolytische Enzym ein Protein entfernt hat, beispielsweise einen Human-Antikörper, der an der Bakterienzellwand haftete, der verhinderte, daß der Gram-positive Farbstoff in das Innere der Zellwand eindrang oder darin fixiert wurde.
Bei noch anderen Ausführungsformen wird das Urinsediment mit anderen Enzymen oder Antikörpern behandelt, um zusätzliche Informationen zu gewinnen. Zu den Enzymen, die auf diese Weise verwendet werden können, gehören Amylase (zur Entfernung von Kohlenhydrat-Polymeren), DNasen, RNasen, Lipasen, Lecithinasen, Sphingomyelinasen, Sialasen, Neuraminidasen und Hyaluronidasen. Zu den Farbstoffen, die verwendet werden können, gehört Acridin-Orange, das verwendet werden kann, um Nucleinsäuren durch Fluoreszenz nachzuweisen. Zu den Antikörpern, die verwendet werden können, gehören markiertes (beispielsweise fluoreszierendes) Anti-Human-IgG, das polyklonal oder monoklonal sein kann, um die Anwesenheit des Human-IgG auf den Bakterien des Sediments nachzuweisen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden stets kleine Kokken gefunden in dem Urin von Patienten mit verschiedenen Formen von rheumatoider Arthritis, systemischer Lupus erythematodes und rheumatischem Fieber und den nachgewiesenen Fällen von Patienten mit Migräne, Bursitis, Tendonitis, temporaler Arteritis und anhaltenden diffusen Rückenschmerzen. Es scheint, daß eine große Gruppe von scheinbar nicht miteinander verwandten Erkrankungen durch diesen Versuch umklassifiziert werden zu Erkrankungen, die mit dem Auftreten von kleinen Kokken im Urin im Zusammenhang stehen und daß aufgrund der günstigen Effekte einer antibakteriellen Behandlung diese Umklassifizierung bedeutsam sein kann. Die oben angegebenen, jeweils unterschiedlichen Erkrankungen können einfach Antworten auf die gleiche bakterielle Invasion oder auf ähnliche bakterielle Invasionen sein und die Vielseitigkeit (oder die unterschiedlichen Erkrankungen nach der derzeitigen Klassifikation) kann einfach sein eine Vielzahl von Antworten durch den Human-Wirt auf eine gegebene Invasion.
Darüber hinaus kann dieses neue Präparationsverfahren angewendet werden zum Nachweis der Assoziation von größeren oder beschädigten ("explodierten") Kokken im Urin von Patienten, die an Hypertension, transienten (vorübergehenden) ischämischen Attacken (Anfällen) (TIA) des Gehirns und in den wenigen gesehenen Fällen an einem Mitralklappen-Prolaps und einer IgA-Nephropathie leiden. Wiederum können diese scheinbar nicht miteinander im Zusammenhang stehenden Erkrankungen einfach verschiedene Antworten auf die Invasion durch diese Bakterien sein. Den meisten dieser Erkrankungen ist nämlich eine frühe Verletzung der feinen Arterien in den betroffenen Organen gemeinsam.
In zahlreichen Fällen von nachgewiesener rheumatoider Arthritis (RA) wurde ebenfalls eine große Anzahl von kleinen Kokken im Urin gefunden. 26 Fälle der gesehen RA enthielten jeweils kleine Kokken in dem Urin in großer Anzahl, häufig Hunderte von Kokken pro Ölimmersionsfeld bei 1000- facher Vergrößerung und in jedem Fall wurde eine signifikante Verbesserung der Erkrankung mit einer antibakteriellen Therapie ohne irgendeine andere Änderung der Medikation festgestellt. In einigen Fällen trat sogar eine vollständige Remission der Erkrankung unter Verschwinden der Bakteriurie auf.

Claims

1. Verfahren zum direkten mikroskopischen Nachweis von Bakterien in einer Urinprobe, welches umfaßt chemisches Fixieren und Anfärben der Bakterien und mikroskopisches Beobachten der Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidkomponenten vor dem Fixieren durch Kontakt mit einem Lipidlösungsmittel aus der Probe entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe mindestens mit 3500-facher Schwerkraft zentrifugiert wird, um die Bakterien in der Probe vor dem Entfernen der Lipidkomponenten zu sedimentieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Zentrifugieren bei 3500- bis 4000-facher Schwerkraft durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Lipidlösungsmittel Methanol oder ein Gemisch aus Methanol und halogenierten Kohlenwasserstoffen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Lipidlösungsmittel ein Gemisch aus Methanol und 1,1,1-Trichlorethan ist.

6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches umfaßt:

a) Zentrifugieren der Probe mit ausreichender Kraft und ausreichender Zeit, um die Bakterien zu sedimentieren,

b) Abtrennen des Sediments vom Überstand

c) Sprühen des Sediments auf eine Oberfläche,

d) Trocknen des Sediments,

e) Waschen des getrockneten Sediments auf der Oberfläche mit einem Lipidlösungsmittel, um die Lipidkomponenten aus dem Sediment zu entfernen,

f) chemisches Fixieren des Sediments,

g) Anfärben des fixierten Sediments, und

h) mikroskopisches Beobachten des angefärbten Sediments.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das abgelagerte Sediment naß beobachtet wird ohne Abdeckverschiebung bei 100 bis 400 Durchmesservergrößerung.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin das abgelagerte Sediment mit einer ionischen Lösung gewaschen wird, wobei die Lösung durch einen Filter geleitet wurde, um diese bakteriologisch steril und teilchenfrei zu machen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin unlösliche Proteine durch Inkubieren des Lipidlösungsmittel/gewaschenes Sediment mit Protease aus Bakterien oder Pilzen oder proteolytischen Enzym vor oder nach dem Fixieren entfernt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Enzym kristallines Trypsin oder Chymotrypsin ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin das Sediment in Kontakt gebracht wird mit einem markierten anti-human IgG-Antikörper, um die Gegenwart von menschlichem IgG auf den Bakterien des Sediments zu zeigen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Antikörper mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin das Lipidlösungsmittel/gewaschenes Sediment mit Acridin-Orange in Kontakt gebracht wird, um Nucleinsäuren durch Fluoreszenz zu zeigen.