DE3735872A1 - Apparatus for fractionating an analytical sample - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a device accordingly the preamble of claim 1.
Elektrophoretische Trennverfahren zur Zerlegung von bei spielsweise Proteingemischen in unterschiedliche Kom ponenten sind grundsätzlich bekannt. Hierbei findet eine Trennung geladener Teilchen entsprechend deren Beweglich keit bzw. elektrophoretischer Wanderungsfähigkeit in einem elektrischen Feld statt. Die Wanderung der Teilchen kann in einer Dispersion oder an einem sonstigen Träger medium erfolgen.Electrophoretic separation process for the disassembly of for example protein mixtures in different com components are generally known. Here one finds Separation of charged particles according to their mobility speed or electrophoretic migration ability in an electrical field instead. The migration of the particles can be in a dispersion or on another carrier medium.
Die Wanderungsfähigkeit wird maßgeblich vom Ladungszu stand der Teilchen bestimmt, welcher seinerseits durch den pH-Wert dessen Umgebung beeinflußt wird. Eine Bewe gung der Teilchen in einem Medium findet hiernach so lange statt, bis der sogenannte isoelektrische Punkt erreicht ist.The ability to migrate is largely determined by the cargo the particle was determined, which in turn was determined by the pH value of the surroundings. A move Particles in a medium are then found for so long until the so-called isoelectric point is reached is.
Es sind zweidimensionale elektrophoretische Trennverfahren bekannt, bei welchen in einem ersten Schritt, nämlich der ersten Dimension in einem länglichen, beispielsweise zylinderförmigen Gelkörper durch Einstellung unterschied licher pH-Werte in dessen Längsrichtung eine erste Zer legung und isoelektrische Fokussierung einzelner Kompo nenten einer Analysenprobe vorgenommen wird. Diese erste Zerlegung der Probe findet in einer ersten Vorrichtung statt. Um die genannten, in Längsrichtung des Gelkörpers voneinander getrennten Komponenten der Probe noch weiter aufzuspalten, wird der genannte Gelkörper nunmehr in eine zweite Vorrichtung eingebettet, wobei durch Anlegen eines elektrischen Feldes senkrecht zur Längsrichtung des genannten Gelkörpers nunmehr die einzelnen Komponenten in eine flächenhafte Gelschicht überführt werden und nochmals entsprechend ihrer elektrophoretischen Bewegungs fähigkeit innerhalb der letztgenannten Gelschicht aufge spalten werden. Diese letzte Gelschicht enthält das Ana lysenergebnis als zweidimensionales Flächenmuster, welches einer unmittelbaren Auswertung zugänglich ist.They are two-dimensional electrophoretic separation processes known, in which in a first step, namely the first dimension in an elongated, for example cylindrical gel body distinguished by setting pH values in the longitudinal direction of a first Zer placement and isoelectric focusing of individual compos an analysis sample is made. This first Disassembly of the sample takes place in a first device instead of. To the above, in the longitudinal direction of the gel body separate components of the sample even further split, the gel body is now in a second device embedded, being by applying of an electric field perpendicular to the longitudinal direction of the said gel body now the individual components be transferred into a flat gel layer and again according to their electrophoretic movement ability within the latter gel layer will split. This last gel layer contains the ana lysing result as a two-dimensional surface pattern, which is available for immediate evaluation.
Von Nachteil bei dieser bekannten zweidimensionalen Un tersuchtungstechnik ist jedoch, daß der dem ersten Trenn vorgang zugeordnete, die isoelektrisch fokussierten Kom ponenten enthaltende Gelkörper zwischen zwei Trennvor richtungen bewegt werden muß, welches den Untersuchungs vorgang verzögert und auch angesichts der geringen Sta bilität des Gelkörpers problematisch ist.A disadvantage of this known two-dimensional Un tesuchtungstechnik is that the first separation assigned to the process, the isoelectric focused Com gels containing components between two separators directions must be moved, which the investigation process is delayed and also in view of the low sta bility of the gel body is problematic.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zum elektrophoretischen Zerlegen einer Analysenprobe zu ent werfen, bei welcher unter Vermeidung der dem Stand der Technik eigenen Nachteile ein durch flächenhafte Abbildung charakterisiertes Analysenergebnis schnell und einfach erzielbar ist. Gelöst ist diese Aufgabe bei einer gattungs gemäßen Vorrichtung durch die Merkmale des Kennzeichnungs teils des Anspruchs 1.It is the object of the invention to provide a device for electrophoretic disassembly of an analytical sample throw at which while avoiding the state of the Technology has its own disadvantages due to extensive mapping characterized analysis result quickly and easily is achievable. This task is solved with a genus appropriate device by the features of the labeling part of claim 1.
Erfindungswesentlich ist, daß beide aufeinanderfolgenden Trennvorgänge der zweidimensionalen Elektrophorese in einer einzigen Vorrichtung zusammengefaßt sind, so daß eine Bewegung des Trennschicht- bzw. Gelkörpers der "ersten Dimension" während des Analysenvorgangs entfällt. Die genannten Einrichtungen zur Erzeugung zueinander senk recht gerichteter elektrischer Felder können räumlich grundsätzlich beliebig angeordnet sein - sie müssen nur nacheinander aktivierbar sein. Die Verfahrenstechnik der isoelektrischen Fokussierung der Komponenten der Analysen probe im Rahmen eines ersten Trennvorganges, nämlich der genannten "ersten Dimension" kann grundsätzlich in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. In dieser Betriebs phase wird die genannte zweite Einrichtung unwirksam sein. Dies kann auf vielfältige Weise geschehen. Beispielsweise kann in dieser Betriebsphase die der Fokussierung dienende Gelschicht mit Abstand von den dem Trennvorgang der "zwei ten Dimension" dienenden Gelschichten angeordnet sein. Während der Durchführung des Trennvorgangs der "zweiten Dimension" ist hingegen die erste der beiden genannten Einrichtungen unwirksam.It is essential to the invention that both are successive Separation processes of two-dimensional electrophoresis in are combined in a single device so that a movement of the interface or gel body There is no "first dimension" during the analysis process. The above-mentioned devices for generating each other quite directed electric fields can be spatial basically be arranged in any order - they just have to be activated one after the other. The process engineering of isoelectric focusing of the components of the analyzes sample as part of a first separation process, namely the called "first dimension" can basically in itself be carried out in a known manner. In this operating phase, said second facility will be ineffective. This can be done in a variety of ways. For example In this operating phase, the one used for focusing Gel layer at a distance from the separation process of the "two th dimension "serving gel layers. While performing the "second Dimension "is the first of the two mentioned Facilities ineffective.
Die Merkmale der Ansprüche 3 und 4 stellen eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung des Erfindungsgegenstands dar. Die beiden seitlichen Gelschichten stehen in unmittel barem Flüssigkeitskontakt mit der in den seitlichen Behältern angeordneten Pufferlösungen. Zur Durchführung des Trennverfahrens der zweiten Dimension werden hierbei lediglich die zwischen den drei Gelschichten befindlichen beiden Zwischenräume mit einem schnell poly merisierbaren Gel ausgefüllt, so daß die in der mittleren Gelschicht enthaltenen Komponenten entsprechend der Rich tung des elektrischen Feldes aus diesem austreten, können, um in der genannten Richtung entsprechend deren Beweg lichkeit weiter aufgespalten zu werden.The features of claims 3 and 4 represent a particular advantageous embodiment of the subject of the invention. The two lateral gel layers are in immediate liquid contact with the in buffer solutions arranged in the side tanks. To Implementation of the separation process of the second dimension only those between the three gel layers two spaces with a fast poly merizable gel filled in so that the one in the middle Components contained in the gel layer according to the Rich electrical field can emerge from it, to move in the direction mentioned according to their ability to be further split.
Die Beaufschlagung der die Gelschichten haltenden Glas platten mit einem Kühlmedium gemäß den Merkmalen des Anspruchs 5 bringt den Vorteil mit sich, daß im Rahmen der Trennvorgänge hohe elektrische Feldstärken eingesetzt werden können, wodurch der Zerlegungsvorgang beschleunigt werden kann. Im Bedarfsfall kann auf diesem Wege jedoch auch eine genaue Temperierung der Glasplatten erreicht werden.The loading of the glass holding the gel layers plates with a cooling medium according to the characteristics of the Claim 5 has the advantage that in the frame high electrical field strengths can be accelerated, which accelerates the disassembly process can be. If necessary, however, this way exact tempering of the glass plates also achieved will.
Die Merkmale der Ansprüche 5 bis 8 sind auf vorteilhafte aparative Merkmale der erfindungsgemäßen Vorrichtung ge richtet, welche sich durch einen kompakten, an dem Krite rium der einfachen Handhabbarkeit orientierten Aufbau auszeichnet. So ist die aufrechte Anordnung der Glasplatten insoweit von Vorteil, als hierdurch die Einbringung der einzelnen Analysenprobe erleichtert wird.The features of claims 5 to 8 are advantageous aparative features of the device according to the invention ge which is characterized by a compact, on the Krite rium of easy handling oriented structure distinguished. This is the upright arrangement of the glass plates to the extent that the introduction of the individual analytical sample is facilitated.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf das in den Zeichnungen dargestellte Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. Es zeigen:The invention will now be described with reference to the embodiment shown in the drawings are explained. Show it:
Fig. 1 eine perspektivische Darstellung eines teilweise geöffneten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung; Figure 1 is a perspective view of a partially opened embodiment of the device according to the invention.
Fig. 2 eine Draufsicht auf eine vollständige Vorrichtung entsprechend dem Pfeil II der Fig. 1. FIG. 2 shows a top view of a complete device according to arrow II of FIG. 1.
Mit 1 ist in Fig. 1 ein eine Glasplatte 2 teilweise umge bender Rahmen bezeichnet, der mit letzterer einen geschlos senen Hohlkörper bildet und über die Anschlußbehrungen 3, 4 mit einem Kühlmittel durchströmt wird. Der Rahmen 1 kann beispielsweise als Plexiglaskörper ausgebildet sein. 1 in Fig. 1, a glass plate 2 partially surrounding frame is referred to, which forms a closed-end hollow body with the latter and is flowed through with a coolant via the connection bores 3 , 4 . The frame 1 can be designed, for example, as a plexiglass body.
Mit 5, 6 sind beiderseits der Rahmen 1 aufrecht angeord nete quaderförmige Behältnisse bezeichnet, die auf einem gemeinsamen Bodengestell 7 aufgelagert sind. Die Behält nisse 5, 6 weisen jeweils zwei vertikal mit Abstand über einander angeordnete Anschlußöffnungen 8, 9 auf. Die Be festigung der Behältnisse 5, 6 an dem Bodengestell 7 ist nicht näher dargestellt und kann an sich beliebig ausgeführt sein. Mit 10 ist eine, den rückwärtigen Abschluß der gesamten Vorrichtung bildende, die Behältnisse 5, 6 miteinander verbindende Abschlußplatte bezeichnet, welche ebenfalls auf dem Bodengestell 7 aufgelagert ist.With 5 , 6 on both sides of the frame 1 upright angeord designated rectangular containers are referred to, which are supported on a common base frame 7 . The container nisse 5 , 6 each have two vertically spaced connection openings 8 , 9 . Be the attachment of the containers 5 , 6 on the base frame 7 is not shown in detail and can be carried out as desired. Numeral 10 denotes an end plate, which forms the rear end of the entire device and connects the containers 5 , 6 , and which is also supported on the base frame 7 .
Die Behältnisse 5, 6 dienen jeweils der Aufnahme einer Pufferlösung, in welche zeichnerisch nur schematisch ange deutete Elektroden 11, 12 hineinragen. Diese Elektroden 11, 12 stehen mit einer zeichnerisch nicht dargestellten Spannungsquelle in Verbindung.The containers 5 , 6 each serve to hold a buffer solution, into which electrodes 11 , 12 , which are only shown schematically, protrude. These electrodes 11 , 12 are connected to a voltage source, not shown in the drawing.
An die Anschlußbohrungen 8, 9 ist jeweils zeichnerisch nicht dargestellte, eine Pumpe sowie eine Kühleinrichtung um fassende Kreislaufführung angeschlossen, so daß die in den Behältnissen 5, 6 enthaltene Pufferlösung auch im Betrieb der Vorrichtung auf einer vorgebbaren Temperatur gehalten werden kann.At the connection bores 8 , 9 is not shown in the drawing, a pump and a cooling device connected to comprehensive circuit, so that the buffer solution contained in the containers 5 , 6 can be kept at a predetermined temperature even during operation of the device.
Das Bodengestell 7 weist eine trogartige Ausnehmung 13 auf, die der Aufnahme einer Elektrodenlösung dienen des Behältnis bildet.The base frame 7 has a trough-like recess 13 , which forms the receptacle for receiving an electrode solution.
Wie aus Fig. 2 hervorgeht, sind insgesamt zwei im wesent lichen identische, jeweils aus einem Rahmen 1 und einer Glasplatte 2 bestehende Systeme innerhalb der erfindungs gemäßen Vorrichtung vorgesehen. Zwischen diesen beiden Systemen befinden sich - wie in Fig. 1 im einzelnen erkenn bar ist - insgesamt drei Gelschichten 14, 14′ und 14′′, die vor der bestimmungsgemäßen Benutzung der Vorrichtung zwischen die Glasplatten 2 gebracht werden. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, daß zwischen die Glas scheiben Gummistreifen gelegt werden, anschließend die Gellösungen in die verbleibenden Zwischenräume eingegossen werden und wobei nach Polymerisation der Gellösungen die genannten Gummistreifen entfernt werden. Beiderseits der Gelschicht 14′ befinden sich in diesem Stadium Zwischen räume 15, 16, so daß die Gelschichten 14 bis14′′ unterein ander nicht in Berührung stehen.As is apparent from Fig. 2, a total of two essentially union, each consisting of a frame 1 and a glass plate 2 systems are provided within the device according to the Invention. Between these two systems are - as can be seen in Fig. 1 in detail - a total of three gel layers 14 , 14 'and 14 '', which are brought between the glass plates 2 before the intended use of the device. This can be done, for example, by placing rubber strips between the glass panes, then pouring the gel solutions into the remaining spaces and, after the gel solutions have polymerized, the rubber strips mentioned being removed. Both sides of the gel layer 14 'are at this stage between spaces 15 , 16 , so that the gel layers 14 to 14 ''are not in contact with each other.
Die Gelschichten 14 und 14′′ hingegen haben auf ihren, den Behältnissen 5, 6 zugekehrten Enden Kontakt zu den in diesen Behältnissen enthaltenen Pufferlösungen. Die nähere Gestaltung dieser Verbindungen kann jedoch grundsätzlich beliebig ausgebildet sein und ist in der Zeichnung nicht näher dargestellt. Jeweils der ober- und der unterseitige Abschluß der Gelschicht 14′wird durch ein Kontaktgel 17 gebildet, welches in ein Rohrelement 18 eingesetzt ist, das seinerseits dichtend in jeweils eine, die ober- bzw. unterseitigen Rahmen durchdringende Bohrung 19 eingesetzt ist. Während das untere Rohrelement 18 in die genannte trogartige Ausnehmung 13 des Bodengestells 7 und damit in die in diesem gehaltene Elektrodenlösung eintaucht, ist das obere Rohrelement 18 mit einem zeichnerisch nicht dargestellten, ebenfalls eine Elektrodenlösung enthaltenden Behältnis in Verbindung bringbar.The gel layers 14 and 14 '', however, have on their, the containers 5 , 6 facing ends contact the buffer solutions contained in these containers. However, the detailed design of these connections can in principle be of any design and is not shown in the drawing. In each case the top and the bottom of the gel layer 14 'is formed by a contact gel 17 which is inserted into a tubular element 18 , which in turn is sealingly inserted into a respective bore 19 penetrating the top and bottom frames. While the lower tube element 18 is immersed in the said trough-like recess 13 of the base frame 7 and thus in the electrode solution held therein, the upper tube element 18 can be connected to a container, also not shown in the drawing, which also contains an electrode solution.
Das durch die beiden Rahmen 1, die Behältnisse 5, 6 und das Bodengestell 7 gebildete Gesamtsystem ist - von den dargestellten funktionalen Verbindungen abgesehen - im übrigen dichtend verschraubt. The overall system formed by the two frames 1 , the containers 5 , 6 and the base frame 7 is - apart from the functional connections shown - screwed in a sealing manner.
Die nach der Methode der Elektrophorese zu untersuchende Analysenprobe wird vor Beginn der Untersuchung in die Gelschicht 14′ eingebracht. Dies kann erfindungsgemäß da durch geschehen, daß beim Gießen dieser Schicht an deren Oberseite eine Aussparung verbleibt, in welche die Analy senprobe eingebracht wird, so daß letztere durch die Gelschicht 14′ unterschichtet wird. Eine andere Möglich keit besteht darin, daß beim Gießen der Gelschicht 14′ eine Aussparung belassen wird, welche durch die in diese eingefüllte Analysenprobe teilweise ausgefüllt wird, wo bei nach erfolgter Polymerisation der Rest der verblei benden Aussparung mit einer der übrigen Gelschicht 14′ entsprechenden Substanz ausgegossen wird.The analytical sample to be examined by the method of electrophoresis is introduced into the gel layer 14 'before the start of the investigation. This can be done according to the invention by the fact that when this layer is poured, a recess remains at the top into which the analyte sample is introduced, so that the latter is undercoated by the gel layer 14 '. Another possibility is that when casting the gel layer 14 'a recess is left, which is partially filled by the analytical sample filled into it, where after polymerization the rest of the remaining recess with one of the remaining gel layer 14 ' corresponding substance is poured out.
Im folgenden wird kurz auf die Wirkungsweise der erfin dungsgemäßen Vorrichtung eingegangen werden:The following briefly explains how the inventions work device according to the invention:
Es wird vorausgesetzt, daß die genannten Gelschichten 14, 14′ und 14′′ mit der Analysenprobe in geeigneter Weise zwischen die Glasplatten verbracht worden sind, daß letztere zwischen die Behältnisse 5, 6 plaziert worden sind, so daß das untere Rohrelement 17 in die in der Aus nehmung 13 befindliche Elektrodenlösung eintaucht, in den seitlichen Behältnissen 5, 6 befindet sich eine Pufferlösung, welche mit den Gelschichten 14 und 14′′ in Verbindung steht, wobei jedoch die Zwischenräume 15, 16 beiderseits der zentralen Gelschicht 14′ leer sind. An das obere Rohrelement 17 wird nunmehr ein ebenfalls eine Elektrodenlösung enthaltendes Behältnis angeschlossen, wobei die in letzterem enthaltene Elektrodenlösung beispiels weise stark basisch und die in der Ausnehmung 13 befind liche Elektrodenlösung stark sauer eingestellt ist. Beide letztgenannte Elektrodenlösungen wirken mit Elektroden unter schiedlicher Polarität zusammen, die wiederum mit einer Spannungsquelle in Verbindung gebracht werden. Entsprechend der Polarität und Intensität des sich in der Gelschicht 14′ ausbildenden elektrischen Feldes sowie des sich entlang der Gelschicht 14′ ändernden ph-Wertes findet eine dementsprechende Bewegung der einzelnen Ladungsträger der Analysenprobe statt, so daß sich entlang der Gel schicht 14′ parallel zu der Richtung X eine für die zu untersuchende Analysenprobe charakteristische, von der elektrophoretischen Wanderungsfähigkeit abhängige Vertei lung der einzelnen Komponenten der Probe ergibt. Nachdem der Endzustand dieses ersten, innerhalb der Gelschicht 14′ ablaufenden Trennvorganges erreicht ist, werden über zeich nerisch nicht dargestellte Bohrungen die beiderseits der Gelschicht 14′ bestehenden Zwischenräume 15, 16 mit einer schnell polymerisierenden Gellösung ausgefüllt, so daß nunmehr ein Kontakt der Gelschicht 14′ mit den übrigen Gelschichten 14 und 14′′ besteht. Gleichzeitig wird die Verbindung der Gelschicht 14′, insbesondere der Kontakt gele 17 mit den diesen zugeordneten Elektrodenlösungen unterbrochen. Über das, nunmehr die Gelschichten 14, 14′ und 14′′ durchdringende, mittels der Elektroden 11, 12 erzeugte elektrische Feld findet nunmehr eine zweite Trennung entsprechend der elektrophoretischen Wanderungs fähigkeit der einzelnen, in der Gelschicht 14′ fokussierten Komponenten statt, so daß sich nunmehr in der Richtung Y senkrecht zu der Richtung X ein charakteristisches, eine weitere Unterscheidung einzelner Stoffe ermöglichendes Flächenmuster innerhalb der Gelschicht 14 ergibt. Die weitere Auswertung zwecks weiterer Differenzierung des in der Gelschicht 14 erzeugten Musters kann anschließend in an sich bekannter Weise erfolgen.It is assumed that the gel layers 14 , 14 'and 14 ''mentioned have been suitably placed with the analysis sample between the glass plates, that the latter have been placed between the containers 5 , 6 , so that the lower tube element 17 into the in From the recess 13 located electrode solution, in the side containers 5 , 6 there is a buffer solution which is connected to the gel layers 14 and 14 '', but the spaces 15 , 16 on both sides of the central gel layer 14 'are empty. To the upper tube element 17 , a container containing an electrode solution is now connected, the electrode solution contained in the latter being, for example, strongly basic and the electrode solution located in the recess 13 being strongly acidic. Both of the latter electrode solutions interact with electrodes of different polarity, which in turn are connected to a voltage source. Corresponding to the polarity and intensity of the electric field which forms in the gel layer 14 'and the pH value which changes along the gel layer 14 ', there is a corresponding movement of the individual charge carriers of the analysis sample, so that there is parallel to the layer 14 'along the gel layer Direction X gives a distribution of the individual components of the sample which is characteristic of the analytical sample to be examined and which is dependent on the electrophoretic migration capacity. After the final state of this first, within the gel layer 14 'running separation process is reached, the interstices 15 , 16 on both sides of the gel layer 14 ' are filled with a rapidly polymerizing gel solution, so that now contact of the gel layer 14 'via holes not shown. with the remaining gel layers 14 and 14 ''. At the same time, the connection of the gel layer 14 ', in particular the contact gel 17 with the electrode solutions assigned to it, is interrupted. About the, now the gel layers 14 , 14 'and 14 ''penetrating, generated by the electrodes 11 , 12 electric field now takes place a second separation according to the electrophoretic migration ability of the individual, in the gel layer 14 ' focused components, so that Now, in the direction Y perpendicular to the direction X, a characteristic surface pattern within the gel layer 14 , which enables further differentiation of individual substances, results. The further evaluation for the purpose of further differentiation of the pattern generated in the gel layer 14 can then take place in a manner known per se.
Man erkennt aus der vorangegangenen Darstellung, daß aus gehend von einer Analysenprobe in einem einzigen Arbeits gang, nämlich ohne daß das Gel 14′ der ersten Dimension gehandhabt werden muß, eine zweidimensionale Zerlegung deren Komponenten durchgeführt wird, welche zu einem charakteristischen flächenhaften Muster in einer Gel schicht führt.It can be seen from the preceding illustration that starting from an analytical sample in a single operation, namely without the gel 14 'having to be handled in the first dimension, a two-dimensional decomposition of its components is carried out, which leads to a characteristic two-dimensional pattern in a gel layer leads.
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