DE3711016C2

DE3711016C2 -

Info

Publication number: DE3711016C2
Application number: DE3711016A
Authority: DE
Inventors: Robert Mitchell Cedar Grove N.J. Us Crowl; Daru Oakland Calif. Us Young
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1986-04-04
Filing date: 1987-04-02
Publication date: 1990-08-02
Also published as: ES2004133A6; IT1203851B; ATA82487A; FR2606422A1; NO871409D0; CH676004A5; IL82088A; AU7103287A; CA1341249C; FR2606422B1; NL192275C; IL82088A0; KR870010189A; GB8707971D0; IT8719973A0; JPS62244393A; NZ219837A; US4925784A; BE1001973A5; ES2009350A6

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 und 2 angegebenen Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die mit mindestens einer determinanten Gruppe des HTLV-III gag-Proteins und des HTLV-III env-Proteins übereinstimmt, sowie deren DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 3 und 4. Ein Protein mit der Bezeichnung gag/env, welches Teile des Strukturproteins (gag) und des Hüllproteins (env) des HTLV-III Virus einschließt, welcher das verursachende Agenz von AIDS (acquired immune deficiency syndrome) ist, ist Gegenstand vorliegender Erfindung. Dieses Protein kann durch organisch-synthetische Methoden oder durch die Anwendung rekombinanter DNA Techniken, bei denen die erforderlichen Gensequenzen mittels eines Vektors in einen verträglichen einzelligen Wirtsorganismus eingeschleust werden, hergestellt werden.

1985 wurden nahezu 8000 Menschen mit AIDS diagnostiziert, und die Zahl ist seither ständig gestiegen. Man rechnet mit weiteren fünfzehntausend Fällen im Jahre 1986, und es ist nicht ausgeschlossen, daß sich die Zahl der Fälle im Jahre 1987 erneut verdoppelt [New York Times Magazine, 2. März 1986, S. 42]. AIDS wird charakterisiert durch das Auftreten schwerer opportunistischer Infektionen einhergehend mit einem Angriff auf das Immunsystem des Körpers [Gottlieb et al., New Eng. J. Med. 305, 1425 (1981)]. Die Krankheit wurde bei homosexuellen Männern , Patienten, die Bluttransfusionen erhielten, Drogensüchtigen, die die Drogen intravenös applizieren, und aus Haiti und Zentralafrika stammenden Personen festgestellt [Piot et al., Lancet 11, 65 (1984)].

Man nahm an, daß das auslösende Agenz viralen Ursprungs sei, weil die epidemiologische Verbreitung von AIDS mit der einer übertragbaren Krankheit übereinstimmte. Mindestens drei Retroviren wurden von kultivierten T-Zellen verschiedener AIDS-Patienten oder von weißen Blutzellen krankheitsgefährdeter Personen isoliert. Ferner wurde ein neuer menschlicher Retrovirus mit der Bezeichnung LAV (lymphadenopathy- associated virus) als AIDS verursachendes Agenz entdeckt. Dieser Virus wurde von einem Lymhadenopathie-Patienten isoliert, daher der Name [Montagnier et al., in Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, R. C. Gallo et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 363-370 (1984)].

Weitere menschliche Retroviren, insbesondere zwei Untergruppen des menschlichen T-Zell Leukämie/Lymphoma/Lymphotropischen Virus, Typ I [Poiesz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7415 (1980)] und III [Popovic et al., Science 224, 497 (1984)] wurden ebenfalls isoliert. Noch ein weiterer Virus, der ARV-Virus (AIDS-associated retrovirus) wurde als auslösendes Agenz erkannt [Levy et al., Science 225, 840 (1984)]. Sowohl der HTLV-III- als auch der ARV- Retrovirus besitzen biologische und seroepidemiologische Eigenschaften, die mit dem LAV übereinstimmen [Levy et al., supra, Popovic et al., supra]. Folglich wurden mindestens drei Retroviren als verursachende Agenzien von AIDS postuliert: LAV, ARV und HTLV-III. In dieser Anmeldung werden sie kollektiv als AIDS-Viren bezeichnet. Da der HTLV-III Virus als Prototyp dieser Virusgruppe gilt, bezieht sich die Bezeichnung "Determinante Gruppe, die mit den Sequenzen eines HTLV-III-Virusproteins übereinstimmt" auf die Proteinsequenzen aller drei AIDS-Viren.

Ein Grund für die Schwierigkeiten bei der Bestimmung des tatsächlichen AIDS verursachenden Agenz war die Kreuzreaktion verschiedener retroviraler Antigene mit Serenproben von AIDS-Patienten. Zum Beispiel zeigten Serenproben von AIDS- Patienten Reaktionen mit Antigenen des HTLV-I [Essex et al., Science 220, 859 (1983)] und HTLV-III [Sarngadharan et al., Science 224, 506 (1984)] Virus. Hüllproteingenprodukte von HTLV-III Viren zeigten Kreuzreaktivität mit Antikörpern in Seren von erwachsenen T-Zell Leukämie-Patienten [Kiyokawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6202 (1984)]. Erwachsene T-Zell Leukämien (ATL) unterscheiden sich von AIDS darin, daß HTLV-I T-Zell Malignitäten verursacht, die durch ein unkontrolliertes Wachstum von T-Zellen charakterisiert sind. Bei AIDS gibt es statt eines Zellwachstums den Zelltod. Diese cytopathischen Eigenschaften von HTLV-III Viren waren entscheidend bei der endgültigen Bestimmung des spezifischen retroviralen Ursprungs dieser Krankheit.

Das verursachende Agenz von AIDS wurde unter Verwendung von immortalisierten menschlichen Neoplasmen-T-Zell-Linien (HT) isoliert, welche mit für AIDS charakteristischen cytopathischen und von AIDS-Patienten isolierten Retroviren infiziert wurden. Seroepidemiologische Tests, bei denen diese Viren verwendet wurden, zeigten eine vollständige Korrelation zwischen AIDS und dem Vorhandensein von Antikörpern gegen virale HTLV-III Antigene [Montagnier et al., supra; Sarngadharan et al., supra; Schüpbach et al., Science 224, 503 (1984)]. Außerdem fand man heraus, daß nahezu 85% der Patienten mit Lymphadenopathie Syndrom und ein hervorstechender Anteil asymptomatischer homosexueller Männer in AIDS endemischer Umgebung zirkulierende Antikörper gegen HTLV-III in sich trugen. Zusammengefaßt sprechen diese Daten dafür, daß die HTLV-III Viren als hauptsächliche AIDS verursachende Agenzien anzusehen sind.

Bis zur erfolgreichen Züchtung des AIDS-Virus unter Verwendung der H-9 Zell-Linie konnte das env-Protein des AIDS-Virus weder isoliert, noch charakterisiert oder synthetisiert werden. Dies lag hauptsächlich daran, daß der Virus cytopathisch ist und seine Isolierung deshalb nicht möglich war [Popovic et al., supra]. Sobald jedoch eine menschliche T-Zell-Linie entdeckt wurde, die gegen die cytopathischen Wirkungen des Virus resistent war, konnte die molekulare Klonierung der AIDS proviralen DNA durchgeführt werden.

Das Bedürfnis nach genauen und schnellen Methoden für die Diagnose von AIDS in menschlichem Blut und in anderen biologischen Körperflüssigkeiten und das Bedürfnis nach einer Methode zur Verhinderung der Krankheit durch Impfung ist sehr groß. Alle zur Zeit verfügbaren Testmethoden sind jedoch fehlerhaft. Das CDC (Center for Disease Control) hat sogar darauf hingewiesen, daß die momentan verfügbaren Testmethoden ausschließlich zur Untersuchung von Blutproben auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen HTLV-III verwendet werden sollten. Das CDC ging sogar noch weiter indem es erklärte, daß die zur Zeit verfügbaren ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay) Testmethoden nicht für die generelle Untersuchung von Risikogruppen oder als Diagnose- Test für AIDS verwendet werden sollten [Federal Register 50(48), 9909, 12. März 1985].

Bei früher angewendeten AIDS-Testmethoden hat man versäumt, ein spezifisches antigenes Protein des verursachenden Agenz für AIDS zu verwenden. Die zuerst verwendeten Proteine stammten von einem viralen Lysat. Da dieses Lysat aus menschlichen, mit dem Virus infizierten Zellen hergestellt wurde, enthielt es sowohl menschliche, als auch virale Proteine. Die Herstellung eines reinen Antigens aus viralem Protein ist sehr schwierig. Die bisher verwendeten Antigene brachten daher sowohl falsch positive als auch falsch negative Ergebnisse [Budiansky, Natur 312, 583 (1984)]. Die durch die Verwendung solcher Protein/Peptid-Lysate entstandenen Fehler könnten durch die Verwendung einer zur Bindung von AIDS-Antikörpern geeigneten Verbindung, die im wesentlichen frei von Nicht-AIDS spezifischen Proteinen ist, verhindert werden. Verbindungen aus im wesentlichen reinen AIDS Hüll- und Strukturproteinen können als Antigene verwendet werden.

Sowohl das Hüll- als auch das Strukturprotein des HTLV-III Virus besitzen determinante Gruppen, die die Untersuchung und Diagnose auf AIDS-Viren und/oder den Schutz durch Impfung gegen AIDS-Viren ermöglichen würden. Und Personen, die mit HTLV-III Viren in Berührung gekommen sind, und die demzufolge AIDS-gefährdet sind oder die die Krankheit haben, können durch die Existenz von Antikörpern gegen das virale Strukturprotein (gag) und/oder das Hüllprotein (env) identifiziert werden [Sarngadharan et al., Science 224, 506 (1984)].

Die Verfügbarkeit einer wirksamen Testmethode zur Bestimmung des AIDS-Virus oder von Partikeln davon im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten ist ebenfalls wichtig. Groopman et al. [Blood 66, 742 (1985)] haben berichtet, daß Antikörper gegen AIDS-Viren nicht immer im Blut von AIDS- Kranken vorhanden sind. Groopman et al. haben einen Patienten mit AIDS und einen weiteren mit AIDS ähnlicher Krankheit (ARC) untersucht, deren Blutproben Antikörper-negativ waren, von denen aber HTLV-III Viren gezüchtet werden konnten.

Vor kurzem wurde die rekombinante DNA-Technologie auf das AIDS-Problem angewendet. Die Klonierung und Expression des HTLV-III env-Gens wurde von Crowl et al. [Cell 41, 979 (1985)] und von Chang et al. [Biotechnology 3, 905 (1985)] beschrieben. Dowbenko et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985)] haben das HTLV-III Strukturprotein in E. coli. exprimiert.

Durch Anwendung solcher Verfahrenstechniken der Gentechnologie erhielt man gereinigte, virale Antigene, die sicher und zuverlässig sind und deren Herstellung weniger kostspielig ist. Noch besser wäre jedoch die Verfügbarkeit eines viralen Proteins mit determinanten Gruppen des HTLV-III env-Proteins und des HTLV-III gag-Proteins. Ein solches Protein wäre ein außergewöhnlich wirksames Mittel für den Nachweis von AIDS-Antikörpern und könnte als Grundlage für eine Reihe von genauen diagnostischen Tests und für mögliche Impfungen gegen den AIDS-Virus dienen.

Deshalb wurde ein neues Protein mit der Bezeichnung gag/env, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit mindestens einer determinanten Gruppe des HTLV-III gag- Proteins und des HTLV-III env-Proteins übereinstimmt, durch die Anwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt. Dieses Protein gestattet den Nachweis von AIDS-Antikörpern oder AIDS-Viren in menschlichen Seren oder anderen biologischen Körperflüssigkeiten und kann als Impfstoff Menschen vor AIDS schützen. Das neue gag/env-Protein der vorliegenden Erfindung ist durch die in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder funktionelle Teile davon charakterisiert.

Die Erfindung liefert ferner DNA-Sequenzen, die das gag/env-Protein der vorliegenden Erfindung kodieren. Rekombinante Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten, einzellige Organismen zur Herstellung des gag/env-Proteins der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren zur Herstellung solcher DNA-Sequenzen, rekombinanter Vektoren und einzelliger Organismen werden ebenfalls erläutert. Es werden auch Methoden zur Expression, Isolierung und Reinigung des gag/env-Proteins der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das so hergestellte gag/env- Protein kann mit den Methoden dieser Erfindung für eine Anzahl wichtiger immunologischer Prozesse verwendet werden.

Es gibt wichtige Vorteile bei der Verwendung des gag/env-Proteins der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur Verwendung von separaten gag- und env-Proteinen. Das env- Protein selbst ist ausgesprochen unlöslich, was die Reinigung erschwert. Die Kombination der beiden Proteine ergibt jedoch ein Produkt, das besser löslich ist und dessen Reinigung einfacher ist. Massenproduktion und Reinigung sind ebenfalls einfacher, wenn nur ein einziges Molekül isoliert werden muß. Schließlich ermöglicht das gag/env-Protein die Entwicklung eines diagnostischen Tests der spezifischer ist als solche mit separaten gag- und env-Proteinen.

Obwohl das gag/env-Protein aus HTLV-III gewonnen wurde, muß man wissen, daß die diagnostischen und immunoprophylaktischen Methoden zur Erkennung jedes der anderen viralen Agenzien, die im Zusammenhang mit AIDS stehen, wie z. B. LAV (lyphadenopathy-associated virus) und ARV (AIDS-associated Retrovirus), verwendet werden können, da Crowl et al. [Cell 41, 979 (1985)] gezeigt haben, daß Proteine dieser viralen Agenzien immunologisch mit den HTLV-III-Viren verwandt sind und Aminosäuresequenzsegmente gemeinsam haben.

Die folgende detaillierte Beschreibung und die folgenden Figuren tragen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung bei:

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung von Expressions- Plasmiden, die die Synthese von gag (obere Abbildung) und gag/env (untere Abbildung) Proteinen bewirken. Die Restriktionsschnittstellen, welche das gag- und env-Gen begrenzen sind gezeigt und die schraffierte Region kennzeichnet das env-Segment des gag/env-Fusionsgens. Bei beiden Plasmiden ist die Transkription unter der Kontrolle des λP_L Promoters. Die Translationssignale kommen vom Plasmid pEV-vrf2.

Fig. 2 offenbart die Nukleotidsequenz des gag/env Fusionsgens (mit ausgewählten Positionsnummern und Restriktionsschnittstellen) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des gag/env-Proteins.

Fig. 3 zeigt die Analyse des in E. coli exprimierten gag/env-Proteins mittels Elektrophorese. Die Spur 1 zeigt die Coomassie-blau gefärbten Gesamtproteine von Zellen enthaltend das rekombinante Plasmid, welches das gag/env- Fusionsgen codiert und von Kontrollzellen. Die Spuren 2 und 3 zeigen die Western-Blot-Analyse der gleichen Gesamtproteine, die entweder mit Kaninchen-Antikörpern gegen das env-Peptid 500-511 (Spur 2) oder mit Schafs-Antikörpern gegen das gag-Peptid p24 (Spur 3) abgetastet wurden. Die Immunkomplexe in den Spuren 2 und 3 wurden durch einen zweiten Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase gekoppelt war, sichtbar gemacht. Bei allen drei Spuren bezieht sich "g/e" auf das gag/env-Protein und "c" auf eine negative Kontrollprobe, die zum Aufzeigen der Spezifität verwendet wurde. Die Beweglichkeiten der Molekulargewichtsstandards (in kD) sind gezeigt, und die Positionen des gag/env- Proteins sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Die Methoden der vorliegenden Erfindung enthalten eine Anzahl von Verfahrensschritten, die in logischer Folge die folgenden Maßnahmen umfassen:

(1) Identifizierung und Isolierung der Gene, die das gag- und env-Protein oder Fragmente davon kodieren,
(2) Einschleusen dieser Gene oder Genfragmente in einen passenden Vektor zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, der ein gag/env-Fusionsgen enthält,
(3) Transfer des rekombinanten Vektors in einen verträglichen einzelligen Wirtsorganismus,
(4) Selektion und Kultivierung von transformierten Wirtszellen, die die eingeschleusten Gensequenzen replizieren und exprimieren können,
(5) Identifizierung und Reinigung des Genprodukts.

Isolierte HTLV-III-Viren können sowohl als Quelle für das gag-Gen, als auch für das env-Gen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel haben Dowbenko et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985)] ein 2.2 Kilobasenpaare- enthaltendes Fragment der 5′-Region des viralen Genoms als Quelle für das gag-Gen verwendet. Andererseits kann auch genomische DNA von Zellen, in welche das provirale HTLV-III Genom integriert wurde, als Genquelle dienen [Shaw et al., Science 226, 1165 (1984)]. Crowl et al. [Cell 41, 979 (1985)] haben solche genomische DNA von mit HTLV-III infizierten H9-Zellen verwendet um das env-Gen zu erhalten.

Alternativen zur Isolierung der gag- und env-Gene beinhalten aber sind nicht beschränkt auf die chemische Synthese der entsprechenden Gensequenzen und die Herstellung von DNA, die zu den von den entsprechenden Genen hergestellten Boten-RNAs komplementär ist.

Ungeachtet ihrer Herkunft, können gag- und env-Proteine kodierende DNA-Sequenzen in Bakterien kloniert werden, und Klone, die gag- und env-Gensequenzen enthalten, können mittels bekannter Methoden identifiziert werden. Zum Beispiel können zu diesen Gensequenzen komplementäre DNA(cDNA)- Proben vorbereitet werden und diese dann mittels Hybridisierungstechniken zur Erkennung von Klonen, die die gag- und env-Gene enthalten, verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde mittels eines λ Vektors und XbaI vedauter DNA einer HTLV-III infizierten H9-Zellinie (siehe oben) eine Genbank hergestellt. Klone enthaltend das provirale HTLV-III Genom wurden dann durch Hybridisierung mit HTLV-III cDNA aus dieser Genbank isoliert. Aus einem dieser Klone, λHXB-3 genannt, wurde dann ein 1700 Basenpaare-enthaltendes ClaI/HindII Fragment isoliert, welches die Nukleotide für die meisten der Aminosäuren des gag-Vorläuferproteins kodiert.

Die direkte Quelle für die in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendeten env- Gensequenzen, war ein Derivat des Plasmids pEV3/env 44-640 mit deletierten env-Aminosäureresten 514-524. Diese Deletion führt überraschenderweise zu einem deutlichen Anstieg der Expression des env-Gens. Die env-Gensequenzen, die die Codons 467 bis 640 enthalten, wurden durch BglII/HindIII- Spaltung des Plasmids pEV3/env 44-640 erhalten.

Nach der Identifizierung und Isolierung der HTLV-III gag- und env-Gene werden diese in einen geeigneten Vektor eingebaut, der die für die Transkription und Translation dieser eingeschleusten Gensequenzen notwendigen Elemente enthält. Geeignete Vektoren können aus Segmenten von chromosomalen, nichtchromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen zusammengesetzt sein, wie z. B. verschiedene bekannte Plasmide und Phagen DNAs. Auch Kombinationen von Plasmiden mit Phagen DNAs sind geeignet, wie z. B. Plasmide, die mit Expressionskontrollsequenzen von Phagen ausgestattet wurden. Besonders geeignete Vektoren sind pEV-vrf Plasmide (pEV-vrf1, -2 und -3), SV40, Adenovirus, Hefe-Plasmide, gt-WES-Lambda B, Charon 4A und 28, Lambda-gt-l-lambda B, von M13-abstammende Vektoren, wie z. B. pUC8, 9, 18 und 19, pBR313, pBR322, pBR325, pAC105, pVA51, pACY177, pKH47, pACYC184, pUB110, pMB9, ColE1, pSC101, pm121, RSF2124, pCR1 oder RP4.

Der Einbau der gag- und env-Gene in einen Vektor ist einfach durchzuführen sofern beide Gene und der gewünschte Vektor mit dem(n) gleichen Restriktionsenzym(en) geschnitten werden können, da komplementäre DNA-Enden geschaffen werden. Ist dies nicht möglich, müssen die geschnittenen Enden entweder durch Abbau der überlappenden Einzelstränge oder durch Auffüllen der überlappenden Einzelstränge in stumpfe Enden überführt werden und danach mit einem Enzym, wie z. B. T4 DNA Ligase, verbunden werden. Andererseits kann jede gewünschte Schnittstelle durch Verknüpfung der DNA-Enden mit Verbindungssequenzen (Linkern) hergestellt werden. Solche Linker können spezielle Oligonukleotid-Sequenzen enthalten, die für Restriktionsschnittstellen kodieren. Der geschnittene Vektor und die gag- und env-Gene oder Genfragmente davon können aber auch mittels homopolymeren Enden, wie von Morrow in Methods in Enzymology 68, 3 (1979) beschrieben, modifiziert werden.

Nach erfolgtem Einbau eines der beiden Gene (env oder gag) oder Genfragmenten davon in einen geeigneten Vektor, kann das andere Gen oder Genfragment mittels wohlüberlegter Spaltung mit einem Restriktionsenzym in die unmittelbare Nachbarschaft des ersten Gens oder Genfragments gebracht werden, wodurch ein Fusionsgen entsteht. Bei chemischer Synthese der env- und gag-Gene kann das Fusionsgen selbstverständlich auch direkt hergestellt und als Ganzes in den Vektor eingebaut werden.

In der vorliegenden Erfindung wurde das ClaI/HincII Fragment, welches das gag-Gen des rekombinanten Phagen λHXB-3 (oben beschrieben) enthält, mit ClaI und PvuII gespaltener DNA des E. coli Expressionsplasmids pEV-vrf2, verbunden, um das Expressionsplasmid pEV2/gag 15-512 (Fig. 1, oberer Teil), welches ein 56 kD Protein enthaltend die Aminosäurereste 15-512 des gag-Proteins kodiert, zu isolieren. Die gag-Sequenzen distal (stromabwärts in 3′ Richtung) zur in der Nähe von Aminosäurerest 437 liegenden BglII Restriktionsschnittstelle wurden dann durch eine env-Sequenz in einem BglII/HindIII Fragment eines Derivates des Plasmids pEV3/env 44-640 (mit deletierten Aminosäureresten 514-254) ersetzt, um das Plasmid EV2/gag15-436/env 467-640 Δ 514-524, welches das gag/env- Fusionsgen der vorliegenden Erfindung enthält, zu isolieren (Fig. 1, unterer Teil).

Die Konstruktion des Plasmids pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 wird im Detail in den Abschnitten B bis E des nachstehenden Beispiels beschrieben. Die Nukleotidsequenz des erfindungsgemäßen gag/env-Gens wurde nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert [Methods in Enzymol. 65, 499 (1980)] bestimmt. Die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 2 gezeigt.

Viele der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendbaren Vektoren enthalten einen oder mehrere Selektionsmarker, die zur Selektion der gewünschten Transformanten verwendet werden können. Als Selektionsmarker kommen beispielsweise die von Plasmid pBR322 kodierte Tetrazyklin- und Ampicillinresistenz, die von Plasmid pUC8 kodierte Ampicillinresistenz und β-Galaktosidase-Aktivität oder die von Plasmid pEV-vrf2 kodierte Ampicillinresistenz in Frage. Durch solche Selektionsmarker wird die Selektion von transformierten Wirtszellen vor allem dann sehr erleichtert, wenn diesen die von den Vektoren beigesteuerten Aktivitäten fehlen.

Die in Vektoren eingebauten Nukleotidsequenzen der gag- und env-Genfragmente können Nukleotide enthalten, die nicht Teil der tatsächlichen gag- und env-Gene sind. Andererseits können die Genfragmente nur einen Teil der vollständigen Gene enthalten. Es ist nur erforderlich, daß die in einen Vektor eingebauten Genfragmente die Synthese eines Polypeptids oder Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die mit mindestens einer determinanten Gruppe des gag-Proteins und des env-Proteins übereinstimmt, bewirken.

Die Auswahl eines geeigneten Wirtsorganismus wird von verschiedenen dem Fachmann bekannten Faktoren bestimmt. So spielen beispielsweise Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, Toxizität der Expressionsprodukte, Expressionscharakteristika, notwendige biologische Sicherheitsvorkehrungen und Kosten eine Rolle und es muß ein Mittelweg zwischen allen diesen Faktoren gefunden werden. Schließlich muß man auch wissen, daß nicht alle Wirtszellen bei der Expression individueller rekombinanter DNA-Moleküle gleich effizient sind.

Als geeignete einzellige Wirtsorganismen kommen Pflanzenzellen, Säugerzellen, Hefezellen, Bakterienzellen, z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilis, und Actinomyceten in Frage. Ein besonders bevorzugter Wirtsorganismus der vorliegenden Erfindung ist Escherichia coli Stamm MC 1061 [Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138, 179 (1980)]. Außer diesem Stamm können aber auch andere E. coli K-12 Stämme, die das Plasmid pRK248cIts enthalten, verwendet werden. Zur Verwendung in anderen E. coli K-12 Stämmen kann dieses Plasmid von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen werden. Es wurde dort unter der ATCC Nr. 33 766 hinterlegt und ist allgemein zugänglich. Der E. coli Stamm wurde ebenfalls bei ATCC (ATCC Nr. 53 338) hinterlegt und ist ebenfalls allgemein zugänglich.

Der Transfer von rekombinanten Vektoren in einzellige Wirtszellen kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. In Abhängigkeit des gewählten Vektor/Wirtszell- Systems kann der Transfer mittels Transformation, Transduktion oder Transfektion durchgeführt werden. Nach erfolgtem Transfer können die resultierenden modifizierten Wirtszellen kultiviert und die Expressionsprodukte aus der Kulturbrühe isoliert werden.

Nach der Expression in E. coli ist das gag/env-Protein der vorliegenden Erfindung hauptsächlich in cytoplasmatischen Einschlußkörpern (unlösliche Proteinaggregate) zu finden, was die Reinigung dieses Proteins erheblich erleichtert. Zur Isolierung des gag/env-Proteins werden die Bakterienzellen vorzugsweise mechanisch zerstört oder lysiert und die unlöslichen Proteine werden danach mittels Zentrifugation präzipitiert. Eine weitere wesentliche Reinigung kann dann mittels sequentieller Waschungen des Präzipitats mit steigenden Harnstoffkonzentrationen gefolgt von Standardproteinreinigungsmethoden erreicht werden.

Zur Gewinnung von gag/env-Probenmaterial für analytische Zwecke, z. B. für Polyacrylamidgelelektrophoresen, können die Zellen mittels eines Detergenz, z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS) aufgeschlossen werden. Zur Gewinnung von großen Mengen an gag/env-Protein werden die Zellen vorzugsweise mittels Ultraschall, oder mit mechanischen Mitteln, z. B. der French-Druckzelle, aufgeschlossen.

Der Zellaufschluß kann aber auch mit chemischen oder enzymatischen Mitteln erfolgen. Da zweiwertige Kationen oft die Zellmembranintegrität stabilisieren, führt die Behandlung der Zellen mit geeigneten Chelatbildnern, z. B. EDTA oder EGTA, zu einer Zerstörung der Membran und als Folge davon zu einem Herauslaufen der Proteine aus dem Zellinnern. Zu dem gleichen Ergebnis führt auch die Behandlung der Zellen mit dem Enzym Lysozym, welches die Peptidoglykanstruktur der Zellwand hydrolysiert. Eine weitere Aufschlußmethode, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist die Gefriertaumethode bei der die Zellen mittels abwechselndem Einfrieren und Auftauen aufgeschlossen werden. Diese letztgenannte Methode kann auch mit der Lysozymmethode kombiniert werden.

Nachdem das gag/env-Protein aus den Zellen herausgelöst ist, kann es in der Mischung mittels bekannten Methoden identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Radioimmunoassay oder Enzymimmunoassay unter Verwendung von Antikörpern gegen dieses Protein durchgeführt werden. Vorzugsweise jedoch wird das gag/env-Protein mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot-Analyse identifiziert.

Das gag/env-Protein kann mittels Fällung, z. B. Natrium- oder Ammoniumsulfatfällung, mittels Ultrazentrifugation oder mittels jeder dem Fachmann bekannten Methode konzentriert werden. Für die weitere Reinigung kommen konventionelle Proteinreinigungsverfahren, z. B. Gelfiltration, Ionenaustauscher- Chromatographie, präparative Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln bei niedrigen Temperaturen oder Gegenstromverteilung in Frage.

Beispiel

Das folgende Beispiel illustriert die Erfindung ohne sie zu beschränken. Es illustriert die Methoden zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, der ein gag/env-Fusionsprotein exprimiert, welches Teile des Strukturproteins (gag) und des Hüllproteins (env) des HTLV-III Virus einschließt. Dieser Vektor wurde erfindungsgemäß durch die folgenden Maßnahmen erhalten:

(1) Die DNA-Sequenz, welche die Nukleotide für die Aminosäuren 15-512 des gag-Proteins enthält (alle bis auf die ersten 14 Aminosäurereste), wurde aus dem rekombinanten λ Phagen HXB-3 isoliert und danach mit der DNA des E. coli Expressionsplasmid pEV-vrf 2 verbunden. Das Plasmid das erhalten wurde, wurde Plasmid pEV2/gag 15-512 bezeichnet.
(2) Die DNA-Sequenz, welche die Nukleotide für die Aminosäuren 319-331 des env-Proteins enthält, wurde mittels gezielter Mutagenese innerhalb der env-Protein kodierenden DNA-Sequenz des Expressionsplasmids pEV3/env 44-640 deletiert. Das Plasmid, das erhalten wurde, wurde Plasmid pEV/env 44-640 Δ319-331 bezeichnet.
(3) Mittels gezielter Mutagenese wurden die Nukleotide für die Aminosäuren 514-524 des env-Proteins innerhalb der env-Protein kodierenden DNA-Sequenz des Plasmids pEV/env 44-640 Δ319-331 deletiert. Das Plasmid, das erhalten wurde, wurde Plasmid pEV3/env 44-640 Δ319-331 Δ514-524 bezeichnet.
(4) Ein DNA-Fragment aus Plasmid pEV3/env 44-640 Δ319-331 Δ514-524, das die Aminosäurereste 467-640 Δ514-524 des env-Gens kodiert, wurde mit gespaltenem Plasmid pEV2/gag 15-512 verbunden, wodurch das Plasmid pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ514-524 entstand, welches die Synthese eines gag/env-Fusionsproteins mit den Aminosäureresten 15-436 des gag-Proteins und den Aminosäureresten 467-640 Δ514-524 des env-Proteins bewirkt.

Alle die zuvor beschriebenen Plasmide wurden durch Transformation in den E. coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts vermehrt.

A. Allgemeine Methoden zur Herstellung von rekombinanten Vektoren Isolierung von DNA

Die Methode von Birnboim et al., Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979), wurde zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus 1 ml Übernachtkulturen verwendet. Diese Methode erlaubt die Gewinnung von geringen Mengen Plasmid-DNA aus Bakterienkolonien für analytische Zwecke. Größere Mengen Plasmid-DNA wurden aus 1-Liter Kulturen durch Cäsiumchloridzentrifugation nach einer Standardmethode gewonnen.

Enzymatische Reaktionsbedingungen

Die verwendeten Restriktionsenzyme sowie die verwendete T4 DNA-Ligase wurden von New England Biolabs, Beverly, MA, bezogen. Diese Enzyme wurden unter den vom Hersteller beschriebenen Reaktionsbedingungen eingesetzt.

Eine Restriktionsenzymeinheit ist definiert als Enzymmenge, die zur vollständigen Spaltung von 1,0 µg DNA in 60 Minuten bei 37°C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 0.05 ml benötigt wird. Die Verdauungsgemische enthielten, neben der zu spaltenden DNA, 100 µg/ml Rinderserumalbumin und die folgenden Pufferlösungen:

BglII: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl₂ und 10 mM 2-Mercaptoaethanol (2-ME)
ClaI: 50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.9) und 6 mM MgCl₂
HincII: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 7 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreitol (DTT)
HindIII: 50 mMNaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) und 10 mM MgCl
HpaI: 6 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT
PstI: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) und 10 mM MgCl₂
PvuII: 60 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgCl₂ und 6 mM 2-ME
StuI: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl₂ und 6 mM 2-ME

Die T4 DNA-Ligase Behandlungen wurden bei 16°C in Ligase-Puffer enthaltend die zu ligierende DNA und 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 1.0 mM ATP und 50 µg/ml Rinderserumalbumin, durchgeführt. Eine Ligaseeinheit ist definiert als Ligasemenge, die für die 50%ige Verknüpfung von Lambda HindIII DNA Fragmenten in 30 Minuten bei 16°C, in 10 µl Inkubationsmischung und einer 5′DNA- Enden Konzentration von 0.12 µM (300 µg/ml) benötigt wird.

Reinigung von DNA-Fragmenten mittels Agarosegelelektrophorese

Nach der Verdauung mit den jeweiligen Restriktionsenzymen, wurden die DNA-Fragmente, welche für die Klonierung verwendet wurden, mittels 1%iger Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid (1 µg/ml) angefärbt, die DNA-Fragmente unter UV-Licht ausgemacht und die gewünschten Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Die Gelfragmente wurden mit Hilfe einer Injektionsnadel zerkleinert und das resultierende Homogenisat in 4 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA und 300 mM NaCl resuspendiert. Diese Lösung wurde dann 3 Stunden bei -80°C aufbewahrt, anschließend während 30 Minuten bei 37°C aufgetaut und während 30 Minuten bei 37°C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen 0.45 µ Membranfilter filtriert, auf ein Volumen von 0.25 ml mit sec-Butanol konzentriert und 3 × mit Äthanol enthaltend 10 µg/ml E. coli tRNA (Transfer RNA) als Carrier, präzipitiert.

Kulturmedien

Das M9CA-Medium enthält pro Liter: 100 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 0.5 g NaCl, 1 g NH₄Cl, 1 mM MgSO₄, 0.5% Glucose und 0.5% Casaminosäuren. Der pH-Wert wird auf pH 7.4 eingestellt.

Luria-Brühe (LB) enthält pro Liter: 5 g Bacto-Yeast Extract, 10 g Bacto-Trypton und 10 g NaCl. Der pH-Wert wird auf pH 7.5 eingestellt.

Falls erforderlich, werden 15 µg/ml Tetracyclin und 50 µg/ml Ampicillin zugegeben.

Transformation und Isolierung von transformierten Bakterienzellen

Die Transformation des E. coli Stammes MC 1061 (pRK248cIts) wurde unter modifizierten Bedingungen, wie von Kushner [in Genetic Engineering, eds. Boyer et al., Elsevier/North-Holland, Amsterdam, S. 17 (1978)] beschrieben, wie folgt durchgeführt:

200 ml Bakterienkulturen wurden in LB bei 30°C bis zu einem A₆₀₀-Wert zwischen 0.5 und 1.0 aufgezogen, dann wurden die Zellen sedimentiert (6000 U/min) und in 50 ml 10 mM Morpholinopropan-Sulfonsäure (MOPS), pH 7.0, und 10 mM RbCL resuspendiert. Die Zellen wurden erneut sedimentiert und anschließend in 30 ml 10 mM MOPS (pH 6.5), 50 mM CaCl₂ und 10 mM RbCL resuspendiert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 0°C wurden die Zellen sedimentiert, in 6 ml 10 mM MOPS (pH 6.5) und 50 mM CaCl₂, 10 mM RbCL, 15% Glycerin resuspendiert, auf 40 Eppendorf-Gefäße verteilt (300 µl/Gefäß) und bei -80°C eingefroren.

Die Transformation wurde, wie im folgenden beschrieben, durchgeführt:

100 µl der eingefrorenen Zellen wurden aufgetaut und dann in Gegenwart von 10 µl Ligationsmischung enthaltend 100 µg DNA während 30 Minuten bei 0°C, 2 Minuten bei 37°C und 2 Minuten bei 0°C inkubiert. Durch Zugabe von 0.1 bis 0.5 ml LB wurden die Zellen anschließend während 60 Minuten bei 22°C inkubiert. Je 20 µl Zellsuspension wurden dann auf LB-Platten gebracht, die 50 µl/ml Ampicillin enthielten, und während 20 Stunden bei 30°C inkubiert.

Zellwachstum und Induktion der Genexpression

E. coli MC1061 Kulturen enthaltend das Plasmid pRK248cIts und ein gewünschtes Expressionsplasmid wurden in M9CA-Medium bei 30°C bis zur Mitte der exponentiellen Phase wachsen gelassen und dann zur Inaktivierung des λP_L Repressors während 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Jeweils 1 ml-Proben wurden zentrifugiert und die Zellkuchen zur Vorbereitung der nachfolgenden Analysen in Tris-Glycin-Puffer (pH 7.4) und 10% Glycerin resuspendiert.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot-Analyse

Die in Tris-Glycin-Puffer resuspendierten Zellen wurden mit dem gleichen Volumen 2 × Probenpuffer [Lämmli, Nature 227, 680 (1970)] vermischt, während 5 Minuten bei 95°C inkubiert und mittels 12.5% SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, wie von Lämmli (siehe oben) beschrieben, aufgetrennt. Danach wurden die Proteine während 6 Stunden in Gegenwart von 12.5 mM Tris-HCL (pH 7.4), 96 mM Glycin, 20% Methanol und 0.01% SDS mittels Elektrophorese bei 95 V aus dem Gel auf 0.1 µ Nitrocellulosefilter transferiert. Die Western-Blot-Analyse wurde dann wie von Towbin et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350 (1979)] beschrieben, durchgeführt.

Gezielte Mutagenese

Die gezielte Mutagenese ("site-directed mutagenesis") wurde nach der von Morinaga et al., [Biotechnology 2, 636 (1984)] beschriebenen Methode durchgeführt. Die bei der Mutagenese verwendeten synthetischen Oligonukleotide wurden unter Verwendung eines automatischen Syntheseapparates nach der Phosphit-Methode [Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981); Matteuci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] hergestellt und wie von Maxam et al. [Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] beschrieben, mittels Polyacrylamidelektrophorese gereinigt.

Koloniehybridisierungsmethode

Die Koloniehybridisierungen wurden wie von Grunstein et al., [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 72, 3961 (1975)] beschrieben durchgeführt, unter Verwendung von nach der Methode von Maniatis et al. [Cell 15, 687 (1978)] hergestellten 5′-³²Pmarkierten synthetischen Oligonukleotiden als Sonde.

B. Konstruktion des Plasmids pEV2/GAG 15- 512

Wie vorstehend kurz beschrieben, wurde für die Konstruktion des endgültigen Plasmids, welches das gag/env-Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung exprimiert, zuerst das Plasmid pEV2/gag 15-512 konstruiert, welches die Nukleotide für die Aminosäuren 15-512 des gag-Gens enthält. Zur Herstellung des Plasmids pEV2/gag 15-512 wurden zuerst 50 µg DNA des rekombinanten λ Phagen HXB-3 isoliert, welcher das provirale HTLV-III Genom enthält. Die isolierte λ HXB-3 DNA wurde dann mit je 50 Einheiten der Restriktionsenzyme ClaI und HincII während 120 Minuten bei 37°C behandelt und ein gewünschtes 1700 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann in 0.1 × TE Puffer [1 mM Tris-HCL (pH 7.4) und 0.1 mM EDTA] zu einer Endkonzentration von 0.03 pMol/µl resuspendiert.

2 µg des E. coli Expressionsplasmids pEV-vrf2 wurden mit je 5 Einheiten der Restriktionsenzyme ClaI und PvuII während 1 Stunde bei 37°C behandelt und das 1700 Basenpaare- enthaltende Fragment das den λ P_L Promotor enthält, wurde mittels 1% Agarose-Gelelektrophorese isoliert und nach Äthanolpräzipatation zu einer Endkonzentration von 0.03 pMol/µl resuspendiert.

Das verwendete Plasmid pEV-vrf2 ist ein Derivat des frei zugänglichen Plasmids pBR322 [ATCC Nr. 31 344]. Die Herstellung des Plasmids pEV-vrf2 wurde von Crowl et al. [Gene 38, 31 (1985)] detailliert beschrieben. Der verwendete rekombinante λ Phage HXB-3 wurde von Shaw et al. [Science 226, 1165 (1984)] beschrieben. Dieser Phage wurde mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken unter Verwendung einer HTLV-III infizierten H-9 Zellinie, wie bereits oben beschrieben, erhalten. Eine für die vorliegende Arbeit geeignete HTLV-III infizierte Zellinie, ist die Zellinie H9/HTLV-III B. Diese Zellinie ist bei der American Type Culture Collection unter der ATCC Nr. CRL 8 543 deponiert worden. Außer der genannten H9/HTLV-III B Zellinie kann jedoch jede beliebige HTLV-III infizierte Zellinie als Quelle für das HTLV-III Genom verwendet werden, da die Kenntnis der DNA Sequenz des HTLV-III Genoms [Shaw et al., wie oben] die Synthese von Hybridisierungssonden erlaubt, die zur schnellen Identifizierung von HTLV-III Genomen geeignet sind.

300 pMole des aus λ HXB-3 erhaltenen gag/ClaI-HincII Fragments wurden mit 0.03 pMolen des aus pEV-vrf2 erhaltenem ClaI-PvuII Fragments vereint und unter Verwendung von 200 Einheiten T4 DNA Ligase während 18 Stunden bei 15°C in einem Gesamtvolumen von 10 µl miteinander verbunden. Die DNA des Reaktionsgemisches wurde dann zur Transformation von E. coli Stamm MC1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts verwendet. Die Bakterien wurden auf LB-Agarplatten gebracht, die Ampicillin enthielten, und während 18 Stunden bei 30°C inkubiert. Es wurden verschiedene Plasmid-DNAs isoliert und mit BglII, PstI oder HindIII wurde das Vorhandensein der erwarteten Fragmentgröße bestätigt. Ein Plasmid, pEV/gag 15-512 bezeichnet, wurde auf seine Fähigkeit gag-Vorläuferprotein zu exprimieren, wie im folgenden beschrieben, getestet. Mit dem Plasmid pEV/gag 15-512 transformierte Zellen wurden aufgezogen und zur Expression des gag-Vorläuferproteins bei 42°C induziert. Die Expressionsprodukte wurden dann mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot-Analyse, wie oben beschrieben, analysiert.

Es wurde festgestellt, daß die mit den Plasmid pEV/gag 15-512 transformierten und induzierten Zellen Proteine liefern, welche auf dem Gel als zwei Hauptbanden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 56 und 53 Kd wandern. Die Größe des vollständigen gag 15-512 Proteins ist ungefähr 56 Kd. Jede der Hauptbanden reagierte mit anti-gag-Protein Antikörpern. Ferner wurden auch geringe Mengen an Proteinen mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet, die ebenfalls mit den oben genannten Antikörpern reagierten.

C. Konstruktion des Plasmids pEV3/env 44-640 Δ319-331

Die in das endgültige Plasmid der vorliegenden Erfindung integrierte env-Gensequenz wurde in zwei Schritten, wie in diesem Abschnitt und im folgenden Abschnitt D beschrieben, mittels gezielter Mutagenese hergestellt:

Das Expressionsplasmid pEV3/env 44-640 [Crowl et al., Cell 41, 979 (1985)] bewirkt die Synthese eines 68 Kd HTLV-III env-Proteins. Die DNA-Sequenz dieses Plasmids, die für die Aminosäuren 319-331 des env-Proteins kodiert, wurde unter Verwendung eines 18-mer synthetischen Oligonukleotids mit der Sequenz 5′-GCA TTT GTT AAC AGT-3′ mittels der oben beschriebenen gezielten Mutagenese deletiert. Dieses Oligonukleotid wurde so ausgewählt, daß es die Nukleotide, welche die Aminosäurereste 318 und 332 des env-Proteins kodieren, unmittelbar benachbarte. Auf diese Weise wurden 39-Basenpaare der env-Sequenz deletiert und eine neue, nur einmal vorkommende HpaI Restriktionsschnittstelle geschaffen. Die StuI und HindIII Schnittstellen des Plasmids pEV3/env 44-640 wurden zur Öffnung der Schlaufe des Heteroduplex verwendet.

Plasmid DNAs, die mit dem ³²P-markierten synthetischen Oligonukleotid im Koloniehybridisierungstest (siehe oben) hybridisierten, wurden zur Transformation von E. coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts verwendet. Es wurden verschiedene Plasmid DNAs isoliert und das Vorhandensein der neuen, nur einmal vorkommenden HpaI Restriktionsschnittstelle getestet. Ein Plasmid mit den gewünschten Eigenschaften wurde pEV3/env 44-640Δ319-331 genannt.

D. Konstruktion des Plasmids pEV3/env 44-640 Δ319-331 Δ514-524

Eine zweite Deletion innerhalb der env-Protein kodierenden DNA-Sequenz des Plasmids pEV3/env 44-640 Δ319-331 wurde unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids mit der Sequenz 5′-AGA GCA GTG GCA GCA GGA-3′ mittels gezielter Mutagenese, wie oben beschrieben, geschaffen. Dieses Oligonukleotid brachte die Nukleotide, welche die Aminosäurereste 513 und 525 des env-Proteins kodieren, in unmittelbare Nachbarschaft, wodurch die Deletion der Nukleotide, welche die Aminosäurereste 514-524 des env-Proteins kodieren, unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen HpaI und HindIII ermöglicht wurde.

Plasmid DNAs, die mit dem ³²P-markierten synthetischen Oligonukleotid hybridisierten, wurden zur Transformation von E. coli Stamm MC 1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts verwendet. Es wurden verschiedene Plasmid DNAs isoliert und das Vorhandensein der 33-Basenpaare-Deletion mittels Restriktionsenzymanalyse mit HpaI und HindIII getestet. Zusätzlich wurde die 33-Basenpaare-Deletion durch Sequenzierung nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert [Methods Enzymol. 65, 499 (1980)] bestätigt. Ein Plasmid mit der gewünschten Deletion wurde pEV3/env 44-640 Δ319-331 Δ514-524 genannt.

Wie vorstehend bereits bemerkt, führte die Δ514-524 Deletion zu einer signifikanten Erhöhung der env-Protein Expression.

E. Konstruktion des Plasmids pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ514-524

2 µg DNA des E. coli Plasmids pEV2/gag 15-512 wurden gleichzeitig mit 5 Einheiten des Restriktionsenzyms ClaI und 4 Einheiten des Restriktionsenzyms BglII behandelt und ein gewünschtes ungefähr 1300 Basenpaare-enthaltendes Fragment, das die Aminosäurereste 15-436 des gag-Proteins kodiert, wurde mittels 1% Agarose-Gelelektrophorese, wie oben beschrieben, isoliert. Weitere 2 µg DNA des E. coli Plasmids pEV2/gag 15-512 wurden gleichzeitig mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI und 5 Einheiten des Restriktionsenzyms ClaI behandelt und ein gewünschtes 1 Kb-enthaltendes Fragment, das den λ P_L Promoter enthielt, wurde, wie vorstehend beschrieben, isoliert, 0.3 µg DNA des E. coli Plasmids pEV3/env 44-640 Δ319-331 Δ514-524 wurden gleichzeitig mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms PstI und 4 Einheiten des Restriktionsenzyms BglII behandelt und ein gewünschtes ungefähr 4 Kb-enthaltendes Fragment, das die Aminosäurereste 467-640 Δ514-524 des env-Proteins kodiert, wurde, wie vorstehend beschrieben, isoliert.

Je 300 pMole der drei obigen DNA-Fragmente wurden vereint und unter Verwendung von 200 Einheiten T4 DNA-Ligase während 18 Stunden bei 15°C miteinander verbunden. Die DNA des Reaktionsgemisches wurde dann zur Transformation von E. coli Stamm MC1061 enthaltend Plasmid pRK248cIts verwendet. Die Bakterien wurden auf LB-Agarplatten gebracht, die Ampicillin enthielten. Es wurden 12 verschiedene Ampicillin- resistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNA isoliert und das Vorhandensein der erwarteten Fragmentgrößen durch Restriktionsenzymanalyse mit PvuII getestet. Es wurde festgestellt, daß 11 davon die erwarteten 3505 und 2882 Basenpaare- enthaltenden PvuII-Fragmente besaßen. Zwei der positiven Transformanten wurden dann auf ihre Fähigkeit gag/env-Fusionsprotein zu exprimieren getestet. Diese Transformanten wurden aufgezogen und zur Expression bei 42°C induziert. Die Expressionsprodukte wurden dann mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot-Analyse, wie oben beschrieben, analysiert.

Die erste Doppelspur in Fig. 3 zeigt die Gesamtprotein- Analyse von E. coli MC1061 Zellen enthaltend das rekombinante Plasmid, welches das gag/env-Fusionsgen kodiert (g/e) und von E. coli Kontrollzellen (c). Die Doppelspuren 2 und 3 zeigen die Western-Blot-Analyse der Gesamtproteine der gleichen Zellen unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern, die gegen die Aminosäurereste 500-511 des env-Proteins gerichtet sind (Doppelspur 2) oder von polyklonalen Schafs-Antikörpern, die gegen das p24 gag-Protein gerichtet sind (Doppelspur 3). Die letztgenannten Antikörper sind im Handel erhältlich. Das p24 gag-Protein wurde von Dowbenko et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985)] detailliert beschrieben. Die Immunkomplexe in den Doppelspuren 2 und 3 wurden mittels eines zweiten Antikörpers, der mit Meerrettichperoxidase gekoppelt war, sichtbar gemacht. Die Banden der gag/env- Fusionsproteine sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung liegen für den Fachmann im Bereich des Möglichen ohne von ihrem Inhalt abzuweichen. Beispielsweise, kann das Gen, welches das gag/env-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, durch Nukleotid-Substitution verändert werden (durch Gebrauch der Sequenzinformation des HTLV-III Genoms) so daß ein etwas anderes, aber funktionell gleiches, Fusionsprotein exprimiert werden kann. Ein solches verändertes Protein würde immer noch im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen, vorausgesetzt es besitzt mindestens eine determinante Gruppe, die mit gag- und env-Proteinsequenzen eines HTLV-III Virus übereinstimmt.

Claims

1. Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die mit mindestens einer determinanten Gruppe des HTLV-III gag-Proteins und des HTLV-III env-Proteins übereinstimmt.

2. Proteine gemäß Anspruch 1 mit der Aminosäuresequenz oder funktionelle Teile davon.

3. Eine DNA-Sequenz, die ein Protein gemäß Anspruch 1 oder 2 kodiert.

4. Eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 3, welche die Nukleotidsequenz oder Teilsequenzen davon einschließt.