DE3689779T2

DE3689779T2 - Plättcheninhibierender Teil eines monoklonalen Antikörpers.

Info

Publication number: DE3689779T2
Application number: DE3689779T
Authority: DE
Inventors: Barry S Coller
Original assignee: New York University NYU; Research Foundation of the State University of New York
Current assignee: New York University NYU; Research Foundation of the State University of New York
Priority date: 1985-06-14
Filing date: 1986-05-23
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2006-05-24
Also published as: CA1297816C; EP0206533B1; JP2524978B2; EP0206533A3; DE3689779D1; EP0206533A2; JPS6229995A; HK1007746A1

Description

Blutplättchen, die auch als Thrombocyten bekannt sind, dienen im menschlichen Körper dazu, für die Blutgerinnung zu sorgen, wenn die Blutversorgung einem möglichen Blutverlust ausgesetzt wird, d. h. im Falle von Trauma, Abschürfungen und anderen Verletzungen, die zu Blutungen führen. Blutplättchen interagieren schnell mit verletzten Blutgefäßen und miteinander, um sowohl das Ausfließen von Blutzellen zu verhindern, als auch die Bildung eines Blutpfropfs zu erleichtern, in den sie mit eingewoben werden, so daß jegliche "Lecks" im Gefäßsystem abgedichtet werden. Bei bestimmten Krankheitszuständen jedoch, beispielsweise bei einer Thrombose, ist es wünschenswert und sogar notwendig, die Blutplättchenfunktion zu inhibieren. Der Thrombus kann nämlich entweder das Blutgefäß verschließen und so dem Gewebe, das durch dieses Blutgefäß mit Blut versorgt wird, Schaden zufügen (z. B. Herzmuskelinfarkt, Schlaganfall nach Gefäßoperation etc.) oder die Blutplättchen und anderes gerinnungsfähiges Material kann sich von dem Thrombus abspalten und sich weiter unterhalb in Fließrichtung in Blutgefäßen ablagern, die andere Teile des Körpers versorgen (z. B. venöse Thrombose mit Lungenembolie, vorübergehende ischämische Anfälle, Amaurosis fugax, Schlaganfälle bei Kunstherzen, etc.).
Die Medikamente, die gegenwärtig verwendet werden, um der Blutplättchenfunktion entgegenzuwirken, leiden an einem Mangel an Wirksamkeit und/oder Spezifität. Es besteht demnach nach wie vor ein Bedarf an neuen und verbesserten Medikamenten, die bei Krankheiten, die durch Thrombosen gekennzeichnet sind, die Blutplättchenfunktion inhibieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers, das die Blutplättchenfunktion inhibiert. Das Fragment wurde durch proteolytischen Verdau des monoklonalen Antikörpers 7E3 hergestellt, geeigneterweise mit Papain oder Pepsin. Der monoklonale Antikörper 7E3 wurde auf folgende Weise hergestellt. Menschliche Blutplättchen wurden in Mäuse injiziert. Die Milz der Mäuse wurde entfernt und deren Zellen mit Zellen einer Mausmyelomzellinie nach einer Modifikation der Technik von Levy et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81 (1978), 164) fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden inkubiert und dann anschließend in HAT-Medium, in dem nicht-fusionierte Zellen nicht wachsen können, weiter inkubiert. Die Zellen wurden dann ausverdünnt und in einem Screening- Verfahren auf Anti-Fibrinogenrezeptor-Aktivität gescreent. Ein bestimmter Klon der Klasse IgG&sub1;, genannt 7E3, wurde ausgewählt, der mit normalen menschlichen Blutplättchen und mit Blutplättchen vom Hund, nicht jedoch mit thrombasthenischen Blutplättchen oder menschlichen Blutplättchen, deren GPIIb/IIIa-Komplex mit EDTA disassoziiert worden war, reagiert, der langsam mit nicht aktivierten menschlichen Blutplättchen und schneller mit ADP-aktivierten menschlichen Blutplättchen reagiert, und der die durch ADP induzierte Interaktion von Fibrinogen mit Blutplättchen vollständig blockiert.
Coller B.S. et al. beschreiben in J. Clin. Invest. 72 (1983), 325-338 einen monoklonalen Antikörper der Subklasse IgG2a, bezeichnet als 10E5. Dieser Antikörper 10E5 wurde durch intraperitoneale Injektionen von menschlichen Blutplättchen in eine Balb/c-Maus hergestellt. Anschließend wurden Milzzellen der Maus mit den Zellen der nicht-sekretorischen Balb/c-Mausmyelom-Zellinie X63-Ag 8.653 fusioniert. Es wird beschrieben, daß der Antikörper 10E5 und F(ab')&sub2;-Fragmente davon die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchenoberflächen blockieren. Es wird jedoch keine therapeutische Verwendung für den Antikörper 10E5 vorgeschlagen.
Oster Z.H. et al. beschreiben in PNAS 82 (1985), 3465-3468 einen ungespaltenen monoklonalen Antikörper, bezeichnet mit 7E3, der die Wechselwirkung zwischen Fibrinogen-beschichteten Beads und Blutplättchen sowohl vom Menschen als auch vom Hund inhibiert. Die Hybridoma-Zellinie 7E3 wurde gemäß dem Verfahren hergestellt wie bei Coller B.S. et al. (1983) a.a.O. beschrieben. Bezüglich Fragmenten des Antikörpers 7E3 und irgendeiner therapeutischen Verwendung des Antikörpers wurden keine Offenbarungen gemacht.
Die Balb/c-Mausmyelom-Zellinie X63-Ag 8.653 ist bei Kearney J.F. et al. J. Immunol. 123 (1979), 1548-1550 beschrieben.
Kornecki et al., Thrombosis Research 34 (1984), 35-49 beschreiben einen monoklonalen Antikörper aus der Maus, bezeichnet mit MAI 23, der die Bindung von Fibrinogen an ADP-stimulierte menschliche Blutplättchen inhibiert. MAI 23 reagiert jedoch nicht mit Blutplättchen vom Hund.
In den Abbildungen 1, 2 und 3 zeigen die Teile
a) Graphen, in denen die Veränderung der optischen Dichte von Blutplättchenreichem Plasma dargestellt ist, eine Minute nach ADP-Zugabe zu Blut, das zuvor mit den F(ab')&sub2;-Fragmenten zu gegebenen Intervallzeitpunkten behandelt worden war; Graphen, in denen die Anzahl der pro Blutplättchen gebundenen Moleküle ¹²&sup5;1-7E3 (x10&supmin;³) zu bestimmten Intervallzeitpunkten nach Zugabe des Fragments dargestellt sind.
Abbildung 4 (a-d) ist eine zusammenhängende Reihe von Graphen, die für einen Testhund Aorta-Blutdruck und den Blutfluß im Ramus circumflexus nach Verabreichung der F(ab')&sub2;-Fragmente in Abhängigkeit von der Zeit zeigen.
Abbildung 5 zeigt in einem Graph die Änderung der optischen Dichte in Abhängigkeit von der Zeit bei der Reaktion auf ADP vor und nach F(ab')&sub2;-Infusionen.

a) Herstellung

Der monoklonale Antikörper 7E3 wurde entsprechend den Verfahren wie nachstehend beschrieben, hergestellt:
Mit Citrat behandeltes Blutplättchen-reiches Plasma wurde in Übereinstimmung mit der Methode von Coller et al., (Blood 47 (1976), 841) hergestellt, in einem geeigneten Puffer suspendiert und mit komplettem Freund'schem Adjuvans gemischt. Injektionen von etwa 1 · 10&sup8; bis 5 · 10&sup8; gewaschenen Blutplättchen wurden sechsmal in wöchentlichen Zeitabständen intraperitoneal in Balb/c-Mäuse injiziert. Eine siebte gleichartige Injektion ohne Adjuvans wurde in demselben Zeitintervall intravenös gegeben. Drei Tage später wurde die Maus getötet, die Milz entfernt, die Zellen vereinzelt und mit Zellen einer Balb/c-Mausmyelom-Zellinie nach der Methode von Levy et al., a.a.0. fusioniert. Bei dieser Methode wurden die Milzzellen und die Myelomzellen in einem Verhältnis von 3,9 : 1 zusammen pellettiert, das Pellet in Polyethylenglykol (35%) in RPMI 1640-Medium suspendiert und danach sofort bei niedriger Geschwindigkeit abzentrifugiert. Die Lösung wurde dann auf etwa 25% ihrer vorherigen Konzentration mit RPMI 1640-Medium verdünnt, die Zellen resuspendiert, erneut zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Der Überstand wurde dann in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft in RPMI 1640-Medium inkubiert, das mit fötalem Kälberserum angereichert worden war. Danach wurde eine gewöhnliche Selektion in üblicher Weise durchgeführt, indem HAT-Medium zugefügt wurde und eine Aliquotierung in Mikrotiter-Wells (-Näpfe) erfolgte. Nach zwei Wochen wurden die Überstände der Wells, die Wachstum zeigten, auf Anti-Fibrinogenrezeptor-Aktivität gescreent. Die auf diese Weise erhaltenen Klone wurden aufgrund verschiedener Eigenschaften ausgewählt. Insbesondere einer, nämlich 7E3, wurde aufgrund bestimmter Eigenschaften ausgewählt.
Die Antikörper wurden aus den Überständen der Wells oder Flaschen aufgereinigt. Als Alternative dazu wurden die Hybridom-Zellen intraperitoneal in Balb/c-Ratten injiziert, die zuvor mit Pristan® behandelt worden waren, und die Antikörper von den Aszitesflüssigkeiten isoliert. Die Antikörper wurden durch Fällung mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gereinigt, in 5 bis 10% des Originalvolumens Natriumphosphatpuffer resuspendiert und gegen denselben Puffer dialysiert. Dann wurde Chromatographie an Protein A-Sepharose CL-4B durchgeführt, die mit Phosphatpuffer equilibriert worden war. Die Elution erfolgte mit Phosphatpuffer, gefolgt von einer Erniedrigung des pH-Wertes mit 0, 1 M Citratpuffern. Der Antikörper 7E3 wurde eluiert, nachdem der pH-Wert auf einen Wert von etwa 6,0 abgesunken war. Die Proteinelution wurde durch UV-Spektroskopie bei 280 nm kontrolliert.
Eine Immundiffusionsanalyse nach Ouchterlony gegen Anti-IgG1-, -IgG2a-, -IgG2b, -IgG3-, -IgM- und -IgA-Seren zeigte, daß ausschließlich IgG1-Antikörper vorlagen.
Gereinigte Antikörper wurden dann über Nacht bei niedrigen Temperaturen, geeigneterweise zwischen etwa 0 und 10ºC, vorzugsweise bei 4ºC gegen einen leicht sauren Salzpuffer mit einem pH-Wert von 3,5 bis 6,5, geeigneterweise etwa 4,0, dialysiert. Danach wurde das frisch angesetzte Pepsin in einer Menge zugegeben, die ungefähr 2 Gew.-% des Antikörpers ausmachte. Die so entstandene Lösung wurde dann bei etwa 37ºC für 12 bis 24 Stunden inkubiert. Der Verdau wurde durch Dialyse der Lösung gegen PBS, pH 7,4, gestoppt. Eine Analyse durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte, daß der Verdau im wesentlichen abgeschlossen war.
Unter etwas anderen Bedingungen kann durch Verdau mit Papain, einem weiteren proteolytischen Mittel, ein Fab-Fragment hergestellt werden, nämlich in 0,1M Acetat, 2mM EDTA, 1 mM Cystein und unter Einschließen von 1% (Gew./Gew.) Papain für 6 bis 8 Stunden bei 37ºC bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6, geeigneterweise bei 5,5.
Die entstandenen F(ab')&sub2;-Fragmente des monoklonalen Antikörpers 7E3 können dann durch Chromatographie an Material wie Protein A-Sepharose CL-4B oder DE- 52 gereinigt werden, um sicherzugehen, daß jegliche restliche Spuren von ungespaltenem monoklonalen Antikörper 7E3 entfernt wurden.

Beispiel I

Antikörperherstellung

Einer Balb/c-Maus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) wurden intraperitoneal sechs wöchentliche Injektionen von je 0,2 ml von 3 · 10&sup8; gewaschenen Blutplättchen (mit Citrat behandelte PRP, die zweimal in 0,15 M NaCl, 10 mM Tris/Cl, 10 mM EDTA, pH 7,4 [TS-E]) verabreicht, die in 1110 bis 1/20 ihres ursprünglichen Volumens in TS-E resuspendiert und 1 : 1 mit komplettem Freund'schem Adjuvans gemischt worden waren. Die siebte wöchentliche Injektion wurde intravenös in die Schwanzvene gegeben. Sie besaß ein Volumen von 0,3 ml und enthielt 5 · 10&sup8; gewaschene Blutplättchen, die in T-S (ohne EDTA) resuspendiert worden waren. Jede der sieben Blutplättchensuspensionen wurde von einem anderen Spender erhalten. Drei Tage nach der letzten Injektion wurde die Maus durch Genickbruch getötet und die Milz entfernt. Durch Zerzupfen der Milz wurde eine Suspension von Milzzellen in RPMI 1640-Medium hergestellt. Nachdem Erythrocyten durch Ammoniumchlorid lysiert worden waren, wurden die Milzzellen mit einer nicht-sekretorischen Balb/c-Mausmyelom-Zellinie (X63-Ag 8.653) fusioniert. Diese war in eingefrorenem Zustand in 10% DMSO und 90% fötalem Kälberserum bis 1 Woche vor der Fusion aufgehoben und dann aufgetaut und in dem üblicherweise verwendeten Kulturmedium kultiviert worden (RPMI 1640, angereichert mit 10% fötalem Kälberserum, 1000 U Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin). Die Fusion wurde entsprechend einer Modifikation der Methode von Levy et al., a.a.O. durchgeführt. Kurz gesagt wurden 2,7 · 10&sup8; Milzzellen und 7 · 10&sup7; Myelomzellen zusammen pelletiert, das Pellet sanft in 2 ml 35%-igem Polyethylenglykol in RPMI 1640- Medium suspendiert, und die Zellen sofort bei 500 g bei 22ºC für 6 Minuten abzentrifugiert. Die Lösung wurde dann mit RPMI 1640 auf eine Polyethylenglykol- Konzentration von 9% verdünnt, die Zellen resuspendiert und sofort für 6 Minuten bei 22ºC und 230 g abzentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeit wurde dann abgenommen, die fusionierten Zellen in RPMI 1640-Medium suspendiert und mit 20% fötalem Kälberserum und 10% 109-Medium (National Collection of Type Cultures) angereichert. Die Zellen wurden in einer Zellkulturflasche ausplattiert und über Nacht bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium durch Zugabe von Hypoxanthin (10&supmin;&sup4;M), Aminopterin (4 · 10&supmin;&sup7;M) und Thymidin (1,6 · 10&supmin;&sup5;M) selektiv für erfolgreich hybridisierte Zellen gemacht. Danach wurden die Zellen in 960 Wells von Mikrotiterplatten aliquotiert (Costar, Data Packaging, Cambridge, Ma.). Zwei Wochen später zeigten 574 Wells Wachstum und die Überstände von 59 Wells waren in einem Screening- Verfahren auf Anti-Fibrinogenrezeptor-Aktivität positiv (siehe unten). Nach weiteren zwei Wochen in Kultur, wurden die positiven Klone in 24-Well-Mikrotiterplatten (Costar) transferiert und mit demselben Medium wie vorstehend genannt, jedoch ohne Aminopterin, ernährt. Die Klone wurden expandiert und die Zellen, die weiterhin Anti-Fibrinogenrezeptor-Antikörper herstellten, wurden in 90% fötalem Kälberserum und 10% DMSO suspendiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Die Klone wurden sowohl durch Endverdünnungstechnik als auch durch Kultivierung in Softagar subkloniert, um Monoklonalität zu garantieren.
Aszitesflüssigkeit, die reich an 7E3-Antikörpern war, wurde durch intraperitoneale Injektion von 5 · 10&sup6; Hybridzellen, die zweimal in 0,15 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 (PBS) gewaschen worden waren, in Pristan-vorbehandelte Balb/c-Mäuse hergestellt.

Beispiel II

Screening Verfahren

35 ul PRP (platelet rich plasma; Blutplättchen-reiches Plasma; eingestellt auf 3 · 10¹¹ Blutplättchen/Liter) und 35 ul Kulturüberstand-Medium (oder Aszitesflüssigkeit), die getestet werden sollten, wurden zusammen für 2 bis 60 Minuten in einem Well einer Mikrotiter-Platte mit Rundboden (Linbro Chemical Co., Hamden, Ct.) inkubiert. Dazu wurden dann 5 ul einer Suspension mit Beads, die mit Fibrinogen beschichtet worden waren, hinzugegeben und die Platte auf einen rotierenden Schüttler (engl.: rotator; Tekator V, American Scientific Products, Edison, N.J.) für 5 Minuten bei 280 Upm durchmischt. Die Wells wurden von der Unterseite mit Hilfe einer Vorrichtung mit Vergrößerungsspiegel (Cooke Microtiter System, Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Va.) betrachtet. Wells mit Kulturmedium, das nicht zum Kultivieren von Zellen verwendet worden war, zeigten deutliche Agglutination der Beads (bewertet als 4 +), wohingegen-Medium von Kulturüberstand oder von Maus-Aszitesflüssigkeiten von positiven Klonen die Agglutination inhibierte, was zu niedrigeren Werten führte (0 bis 3+).

Beispiel III

Antikörperreinigung

Kulturüberstände wurden bei 4ºC mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt und auf 1/20 bis 1/10 ihres ursprünglichen Volumens in 0,1 M Natriumphosphat- Puffer, pH 8,0 resuspendiert. Nach Dialyse gegen denselben Puffer wurden die Proben auf eine 0,8 · 15,9 cm-Säule mit Protein A-Sepharose CL-4B aufgetragen, die mit Phosphat-Puffer equilibriert worden war (nachdem sie sowohl mit dem Phosphat-Puffer und einem 0,1 M Citrat-Puffer, pH 3,0 gewaschen worden war). Die Säule wurde mit Phosphat-Puffer eluiert bis die optische Dichte des Eluats auf die Basislinie zurückkehrte. Danach wurde eine schrittweise Elution mit 0,1 M Citrat-Puffern mit pH-Werten von 6,0, 4,5, 3,5 und 3,0 erreicht, wie bei Ey et al., Immunochemistry 15 (1978), 429 beschrieben. 7E3-lmmunglobuline wurden bei einem pH-Wert von 6,0 eluiert. Die Elution der Proteine wurde mittels der Bestimmung der optischen Dichte bei 280 nm kontrolliert und geeignete Fraktionen vereinigt und gegen T-S mit 0,05% Natriumazid dialysiert. Die Antikörperkonzentration wurden mittels der Absorption bei 280 nm abgeschätzt, wobei die Formel A1% = 15 zugrunde gelegt wurde.

Beispiel IV

Herstellung des Fragments

Der monoklonale Antikörper 7E3 wurde entsprechend der Verfahren, die in den vorstehenden Beispielen beschrieben wurden, hergestellt.
Der gereinigte Antikörper wurde dann über Nacht bei ca. 4ºC gegen 0,2 M Natriumchlorid/0,2 M Acetat, pH 4,0, dialysiert. Danach wurde frisch angesetztes Pepsin (1 mg/ml) in einer Menge hinzugegeben, die ca. 2 Gew.-% des Antikörpers entsprach. Die so entstandene Lösung wurde dann bei etwa 37ºC für 12 bis 24 Stunden inkubiert. Der Verdau wurde durch Dialyse der Lösung gegen PBS, pH 7,4 gestoppt. Analyse mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte an, daß der Verdau im wesentlichen abgeschlossen war.
Die so erhaltenen F(ab')&sub2;-Fragmente des monoklonalen Antikörpers 7E3 können dann weiter durch Chromatographie an Material wie Protein A-Sepharose CL-4B oder DE-52 gereinigt werden, um sicherzugehen, daß jegliche restliche Spuren an ungespaltenem monoklonalen Antikörper 7E3 entfernt wurden.

Beispiel V

Funktionstests

Die F(ab')&sub2;-Fragmente des monoklonalen Antikörpers wurden dann bezüglich der Inhibition der Blutplättchenfunktion nach folgender Methode getestet:
Es wurden drei Hunde verwendet. Hund Nr. 1 erhielt eine Gesamtdosis von 0,17 mg/kg in Form von drei Injektionen, die mit einstündigem Abstand gegeben wurden. Eine Blutprobe, die eine Stunde nach der letzten Injektion genommen wurde, zeigte folgendes:
1) einen Rückgang von 61% in bezug auf den maximalen Grad der durch 4 mADP induzierten Aggregation (Tmax);
2) eine Anzahl von Blutplättchen von 220.000/ul (Kontrolle (t = 0) = 236.000); und
3) 45.400 gebundene Moleküle ¹²&sup5;I-7E3 pro Blutplättchen (Kontrolle = 56.400), was darauf hindeutet, daß 11.000 Moleküle F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers 7E3 pro Blutplättchen gebunden sind.
Hund Nr. 2 erhielt eine einzelne Dosis von 0,57 mg/kg. 1,5 Stunden später war die Tmax, induziert durch ADP, um 68%, und die Anzahl der Moleküle ¹²&sup5;I-7E3, die pro Blutplättchen gebunden war, um 59% (von 62.500 auf 25.400) abgesunken. Nach 4 Stunden wurde eine Reduktion von Tmax von 84% und eine Reduktion der gebundenen Moleküle (22.500) um 64% beobachtet. Die ursprüngliche Zählung von 265.000 Blutplättchen sank auf 253.000 nach 1 ,5 Stunden und auf 213.000 nach 4 Stunden, ging jedoch wieder auf 242.000 nach 20 Stunden zurück. Keiner der beiden Hunde zeigte spontane Blutungen.
Ein dritter Hund erhielt 0,8 mg/kg Fragment, wie in Abb. 3 gezeigt. Diese Testergebnisse zeigen, daß das F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers 7E3 auf dramatische Weise die Blutplättchenfunktion in vivo inhibieren kann, ohne eine ausgeprägte Thrombocytopenie hervorzurufen.
Es ist offensichtlich, daß eine Vielzahl von Modifikationen sowohl bei den Materialien, als auch bei den Methoden verwendet werden kann, ohne daß vom Zweck und der Absicht der vorliegenden Offenbarung abgewichen wird.

Beispiel VI

In vivo-Tests

Das Modell zur zyklischen Reduktion des Blutflusses ist zuvor detailliert beschrieben worden (Folts, J.D., E.B. Crowell, Jr., und G.G. Rowe: Platelet Aggregation in Partially Obstructed Vessels and its Elimination with Aspirin. Circulation 54 (1976), 365-370; Folts, J.D.: Experimental Arterial Platelet Thrombosis, Platelet Inhibitors and their Possible Clinical Relevance. Cardiovasc. Rev. Rep. 3 (1982), 370-382; Folts, J.D., Gallagher, K., and Rowe, G.G.: Blood Flow Reductions in Stenosed Canine Coronary Arteries: Vasospasm or Platelet Aggregation. Circulation 65 (1982), 248-255). Der Inhalt dieser Veröffentlichungen wird hiermit durch Zitierung in die Beschreibung mit eingeführt. Kurz gesagt wird entweder der Ramus circumflexus der Koronararterie eines anästhesierten Hundes oder die Carotis eines anästhesierten Affen freipräpariert und ein elektromagnetischer Meßfühler wird daran angebracht, um den Blutfluß zu messen. Die Arterie wird ungefähr zu 70% stenosiert, indem ein 3 bis 4 mm langer einengender Plastikzylinder mit geeignetem Innendurchmesser um das Äußere der Arterie gelegt wird. Zyklische Verminderungen des Blutflusses aufgrund von Blutplättchenthrombus-Bildung beginnen dann entweder spontan oder nachdem eine zusätzliche intimale Schädigung durch kurzes Quetschen (ca. 1 Sekunde) der Arterie mit einer Gefäßklemme (engl.: hemostat) hervorgerufen wird. Innerhalb mehrerer Minuten sinkt der Blutfluß in dem Gefäß auf ein kritisches Niveau. Danach steigt der Blutfluß schlagartig wieder auf das Ursprungsniveau an, entweder durch spontane Embolisierung des Blutplättchen-Thrombus oder durch Embolisierung, die durch sanftes Schütteln des Zylinders hervorgerufen wird. Sind sie einmal eingestellt, dann bleiben die zyklischen Verringerungen des Blutflusses bestehen, falls nicht anderweitig eingegriffen wird. Frequenz und Amplitude der Verringerung des Blutflusses können zeitweise durch intravenöse Infusionen von 0,5 ug/kg/min Epinephrin für 10 Minuten verstärkt werden.
Das experimentielle Protokoll bestand darin, zunächst Blutproben zu gewinnen, die zur Antikoagulation mit entweder 0,01 Volumen 40%-igem Natriumcitrat (für die Blutplättchenaggregation und für die Bindung von ¹²&sup5;I-7E3) oder 0,037 Volumina 269 mM EDTA (für die Zählung der Blutplättchen) behandelt worden waren, und dann den chirurgischen Eingriff vorzunehmen. Nachdem die zyklischen Verminderungen des Blutflusses eingestellt waren, wurde eine weitere Reihe von Blutproben gewonnen und der Antikörper (0,7 bis 0,8 mg/kg) wurde intravenös als Bolus- Injektion infundiert. Eine letzte Reihe von Blutproben wurde 30 Minuten nach Infusion des Antikörpers genommen. Die Zählung der Blutplättchen im Blutplättchen-reichen Plasma wurde unter dem Mikroskop nach Verdünnung und Lyse der Erythrocyten (Unopette, Becton-Dickinson) durchgeführt, und die Gesamtzahl der Blutplättchen im Blut wurde mittels eines elektronischen Partikel-Zählgerätes (engl.: electronic resistive particle counter; S + IV, Coulter Electronics, Hialeah, FL.) bestimmt.

Ergebnisse

Zyklische Verringerungen im Blutfluß wurden bei 4 Hunden und 4 Affen gefunden. Bei allen 4 Hunden und 4 Affen führte Infusion von F(ab')&sub2;-Fragmenten zu einer kompletten Beendigung der zyklischen Verringerungen des Blutflusses und zu einer Wiederherstellung des Blutflusses auf die Werte der Kontrolle in einem Zeitraum von 10 Minuten oder weniger (Abb. 4). Bei den Hunden korrelierte die Wiederherstellung des coronaren Blutflusses mit dem Verschwinden von ST-Segment-Abweichungen (engl.: ST segment deviations) im Elektrokardiogramm, was zeigt, daß die myokardiale Blutarmut behoben worden war. Die zyklischen Verringerungen des Blutflusses konnten nicht durch Epinephrin-Infusionen von 0,5 oder 1 ug/kg/min für 10 Minuten, durch Erhöhung des intimalen Schadens durch wiederholtes kurzes Quetschen des Blutgefäßes mit einer Gefäßklemme, durch Durchleiten von Strom (1 bis 2 mA) durch den Zylinder oder eine Kombination dieser Stimuli (Abb. 4) wiederhergestellt werden. Histologische Untersuchungen der Blutgefäße post mortem bestätigte das Vorhandensein ausgeprägter intimaler Verletzungen.
Durch die Antikörper-Infusion wurde die Blutplättchen-Aggregation infolge von ADP-Einwirkung (≤ 25 uM) in allen acht Tieren praktisch vollständig unterbunden, wohingegen die Formwechselreaktion erhalten blieb (Abb. 5). Bei einem Hund und einem Affen wurden ¹²&sup5;I-7E3-Antikörper-Bindungsstudien durchgeführt. Bei beiden Tieren waren 84% der GPIIb/IIIa-Rezeptoren durch die F(ab')&sub2;-Fragmente blockiert (Hund = 34.300 gebundene Moleküle ¹²&sup5;I-7E3 pro Blutplättchen vor Infusion und 5.500 danach; Affe = 49.700 gebundene Moleküle vorher und 8.100 danach). Die Anzahl der gezählten Blutplättchen sank um weniger als 15% in den drei getesteten Tieren. Keines der Tiere zeigte eine signifikante Veränderung bezüglich Puls oder Blutdruck nach Antikörper-Infusion. Es gab keine klaren Anzeichen für ausgeprägte Blutungen, die von den Operationsstellen nach Antikörper-Infusion hätten stammen können, obwohl keine objektiven Daten bezüglich Blutverlustes ermittelt wurden.

Claims

1. Monoklonales Antikörperfragment, das eine Antigenbindungsstelle aufweist und von einem monoklonalen Antikörper der Klasse IgG1 ableitbar ist, der von einem Hybridom aus Zellen von einer Maus-Myelomlinie und Milzzellen einer zuvor mit menschlichen Blutplättchen immunisierten Maus erhältlich ist, welches Antikörperfragment

(a) die Blutplättchenfunktion hemmt;

(b) Thrombose hemmt;

(c) mit normalen menschlichen Blutplättchen und mit Hunde-Blutplättchen reagiert;

(d) nicht mit thrombasthenischen menschlichen Blutplättchen reagiert, deren GPIIb/IIIa-Komplex mit EDTA disassoziiert ist;

(e) langsam mit nicht-aktivierten Blutplättchen und rascher mit ADP- aktivierten Blutplättchen reagiert, und

(f) die durch ADP induzierte Wechselwirkung von Fibrinogen mit Blutplättchen blockiert.

2. Fragment nach Anspruch 1, worin das Hybridom durch Fusion von X63- Ag 8.653 Balb/c-Maus-Myelomzellen und Milzzellen von einer Balb/c- Maus erhältlich ist.

3. Fragment nach Anspruch 1 oder 2, welches ein F(ab')&sub2;-Fragment oder ein Fab-Fragment ist.

4. Fragment nach Anspruch 3, welches ein F(ab')&sub2;-Fragment ist.

5. Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Hybridom als 7E3 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB8832 bezeichnet wird.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Fragments nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.

7. Verfahren, welches die Verwendung eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Blutplättchenaggregation umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das der Reihe nach folgende Schritte umfaßt:

i) das Immunisieren von Mäusen mit menschlichen Blutplättchen;

ii) das Entfernen der Milz aus den genannten Mäusen und die Herstellung einer Suspension aus den genannten Milzzellen;

iii) das Fusionieren der genannten Milzzellen mit Maus-Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionspromotors;

iv) das Verdünnen und Kultivieren der fusionierten Zellen in getrennten Näpfen in einem Medium, das die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht unterstützt;

v) das Bewerten des Überstands in jedem ein Hybridom enthaltenden Napf hinsichtlich des Vorhandenseins von Antikörpern gegen den Fibrinogenrezeptor;

vi) das Auswählen und Klonieren eines Hybridoms, das einen Antikörper erzeugt, der:

(a) die Blutplättchenfunktion hemmt;

(b) Thrombose hemmt;

(d) nicht mit thrombasthenischen menschlichen Blutplättchen reagiert, oder mit menschlichen Blutplättchen, deren GPIIb/IIIa-Komplex mit EDTA disassoziiert ist;

(e) langsam mit nicht aktivierten Blutplättchen und rascher mit ADP-aktivierten Blutplättchen reagiert, und

vii) das Gewinnen des Antikörpers aus dem Überstand über den genannten Klonen und/oder das Übertragen der genannten Klone intraperitoneal in Mäuse und das Ernten des malignen Aszites oder des Serums aus den genannten Mäusen, welcher/es Aszites oder Serum den gewünschten Antikörper enthält,

viii) das Verdauen des genannten Antikörpers mit einem proteolytischen Mittel, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Papain und Pepsin besteht,

ix) das Gewinnen des genannten Fragments aus dem Gemisch des Verdaus.