DE3686717T2

DE3686717T2 - Immuntestverfahren.

Info

Publication number: DE3686717T2
Application number: DE8686906453T
Authority: DE
Inventors: Yukio Horikawa; Satoshi Ibaraki; Seiichi Iwamoto; Hiroshi Kanno
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1985-11-05
Filing date: 1986-10-30
Publication date: 1993-01-28
Anticipated expiration: 2006-10-31
Also published as: WO1987002780A1; EP0245509A1; DE3686717D1; ATE80467T1; EP0245509B1; JPS62106369A; EP0245509A4

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immuntestverfahren, wobei in Fibroin eingeschlossene, immobilisierte Antikörper oder Antigene wiederholt in dem Test eingesetzt werden.

Stand der Technik

Es entspricht allgemeiner Praxis, bestimmte Antigene und Antikörper in einer Probe unter Verwendung einer hochspezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion als Hilfsmittel zur Diagnose oder zur Behandlung bestimmter Erkrankungen zu detektieren oder zu testen. Insbesondere Radioimmunoassys und Enzymimmunoassays finden im Rahmen unterschiedlicher klinischer Tests als Mikroassay-Techniken zunehmend Anwendung.
Aus Gründen der Genauigkeit und Einfachheit werden diese Tests im allgemeinen unter Anwendung der sogenannten "Festphasenmethode" durchgeführt, wobei ein Antikörper (oder Antigen), spezifisch für ein Antigen (oder einen Antikörper) der oder das zu testen ist, durch chemische Bindung, Adsorption oder Einschluß an einem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert wird und wobei der dabei erhaltene immobilisierte Antikörper (oder das Antigen) mit dem zu testenden Antigen (oder Antikörper) komplexiert wird.
Wenn man die immobilisierten Antikörper oder Antigene wiederholt bei den Festphasenimmunoassays anwenden kann, so können wertvolle Substanzen eingespart und in einem automatisierten, kontinuierlichen Testsystem verwendet werden, das eine einfachere Handhabung einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht.
Die US-A-3970429 (Updike) und die US-A-4009005 beschreiben Radioimmunoassay-Systeme, welche für eine kontinuierliche Verwendung in wiederholten Zyklen geeignet sind, wobei ein immobilisierter Antikörper durch Spülen mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Elutionslösung für eine wiederholte Anwendung regeneriert wird. In beiden Fällen umfassen die beschriebenen Regenerationssysteme organische Lösungsmittel. Im Falle der US- A-3970429 wird der Antikörper in Acrylamidgel-Partikeln immobilisiert, während gemäß der US-A-4009005 der Antikörper an einem festen Träger kovalent gebunden wird.
Für eine wiederholte Anwendung eines immobilisierten Antikörpers oder Antigens ist es zwingend erforderlich, daß der während des Tests gebildete Antigen-Antikörperkomplex vollständig dissoziiert werden kann und daß die Immunoreaktivität des immobilisierten Antikörpers oder Antigens nicht deutlich nachläßt.

Beschreibung der Erfindung

Bei den auf oben genanntem Gebiet durchgeführten Untersuchungen wurde gefunden, daß in einem Fibroinfilm eingeschlossene, immobilisierte Antikörper oder Antigene, welche spezifisch sind für ein zu bestimmendes Antigen oder einen zu bestimmenden Antikörper, wiederholt in einem Immunoassay für das Antigen oder den Antikörper angewendet werden können, indem man das Antigen oder den Antikörper und einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen komplexiert, die Menge an zu testendem Antigen oder Antikörper auf Grundlage der Menge an markiertem Antikörper oder Antigen in komplexierter Form bestimmt und den immobilisierten Antikörper oder das immobilisierte Antigen in einer Pufferlösung mit einem pH von etwa 2 bis 4 immergiert, um komplexierte Antigene oder Antikörper von dem immobilisierten Antikörper oder Antigen zu entfernen. Die Immunoreaktivität des immobilisierten Antikörpers oder Antigens erleidet keine signifikanten Verluste, wenn man dieses Verfahren anwendet, so daß der immobilisierte Antikörper oder das immobilisierte Antigen im gleichen Immunoassay wiederholt verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung basiert auf den oben genannten Befunden.

Bevorzugrte Ausführungsform der Erfindung

Immobilisierte Antikörper oder Antigene, welche in Fibroinfilmen eingeschlossen sind und erfindungsgemäß verwendet werden, können anhand des in der japanischen Patentpublikation (Kokai) 60-142259 oder 60-155129 beschriebenen Verfahrens hergestellt werden (vgl. folgende Herstellungsbeispiele). Beide Publikationen beschreiben Verfahren zum Einschluß von Antigenen oder Antikörpern in Fibroinfilmen und die Herstellung derartiger Filme.
Beispiele für Substanzen, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens getestet werden können, sind:
(1) Polypeptidhormone, wie Insulin, Human-Choriogonadotropin, Human-Placentalactogen, luteinisierendes Hormon und Antikörper davon;
(2) Blutserumproteine, wie IgG, IgA, IgM, IgE, α-Fetoprotein, karzinoembryonisches Antigen, Haptoglobulin und die Antikörper davon;
(3) Toxine und Viren, wie z.B. E. coli-Toxin, Choleratoxin, Hepatitisvirus, Rubellavirus, Influenzavirus und Antikörper davon; und
(4) Steroidhormone und Medikamente, wie Estradiol, Progesteron, Testosteron, Phenytoin, Procainamid, Kanamycin, Penicillin, Barbiturate und deren Antikörper.
Bei der Bestimmung der oben beschriebenen Substanzen verwendet man einen immobilisierten Antikörper oder ein immobilisiertes Antigen, spezifisch für ein zu bestimmendes Antigen oder einen zu bestimmenden Antikörper, indem man den spezifischen Antikörper oder das spezifische Antigen in einen Fibroinfilm einschließt.
Der Test kann entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv, d.h. im Sandwich-Verfahren, durchgeführt werden.
Es kann entweder der Antikörper oder das Antigen mit einem Enzym, einen Fluoreszenzmarker oder einem Radioisotop markiert sein.
Beispiele für Pufferlösungen mit einem pH von etwa 2 bis 4 sind Glycin-Salzsäurepuffer und Weinsäure-Natriuinhydroxid- Puffer, jeweils mit einer Konzentration von 0,05 - 0,2 Mol/l. Indem man üblicherweise bei einer Temperatur von 10ºC bis 40ºC 3 - 10 min immergiert, ist es möglich, den Antikörper oder das Antigen in einfacher Weise von dem Antigen oder dem Antikörper und dem markierten Antikörper oder Antigen, die damit komplexiert sind, freizusetzen, ohne deren Immunreaktivität zu beeinträchtigen, so daß eine wiederholte Anwendung im gleichen Immunoassay möglich ist.
Bei einem höheren pH-Wert als dem oben angegebenen Bereich wird eine Antigen/Antikörper-Dissoziation schwieriger, während bei einem pH-Wert niedriger als dem oben angegebenen Bereich der immobilisierte Antikörper oder das immobilisierte Antigen unerwünschterweise denaturiert werden kann.
Die oben erwähnte Dissoziationsreaktion kann durch weiteren Zusatz von 0,5 - 10 Gew.-% eines Neutralsalzes, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Natriumsulfat zum Puffer erleichtert werden.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können die immobilisierten Antikörper oder Antigene in verschiedenen Immunoassays wiederholt eingesetzt werden. Dies wird in den folgenden Testergebnissen gezeigt. Somit können die wertvollen Antikörper oder Antigene nicht nur rezyklisiert werden, sondern können auch einer Verwendung in einem automatisierten, kontinuierlichen Testsystem zur einfachen Handhabung einer großen Probenanzahl angepaßt werden.

EXPERIMENT 1

Wiederholte Tests von Standard-α-Fetoprotein (AFP) unter Verwendung von immobilisiertem monoklonalem Anti-Human-AFP-Antikörper in einem Fibroinfilm

(1) Materialien:

Den gemäß folgendem Herstellungsbeispiel 1 hergestellten Fibroinfilm schneidet man in ein Stück mit den Abmessungen 7 x 12 mm. Den Film verbindet man über eine kurze Kante mit einem Ende eines Polyesterstreifens mit einer Dicke von 200 um (2 mm Breite x 10 cm Länge), wobei man einen Cyanoacrylatkleber verwendet.

(2) Verfahren:

In ein Teströhrchen mit einem Innendurchmesser von 10 mm gibt man 0,5 ml normale Kochsalzlösung, enthaltend 0,5 Gew.-% Rinderserumalbumin (BSA). Der oben erwähnte Fibroinfilm (n=2) wird vollständig in der im Röhrchen befindlichen Flüssigkeit immergiert und 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach Absaugen der Flüssigkeit gibt man 0,5 ml einer Lösung, bestehend aus 80 ng/ml Standard-AFP, 10 Gew.-% Pferdeserum, Peroxidasemarkierten monoklonalen Anti-Human-AFP-Antikörper (erzeugt in Mäusen, jedoch mit einer Erkennungsstelle, welche sich von derjenigen des immobilisierten monoklonalen Antikörpers unterscheidet, 1,2 ug/ml, die Enzymmarkierung erfolgt unter Anwendung der Perjodatmethode, beschrieben in Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 22, 1084 (1974)) und 0,1 Gew.-% BSA in normaler Kochsalzlösung zu dem Teströhrchen hinzu und inkubiert 1 h bei 22ºC. Den Film wäscht man dreimal mit destilliertem Wasser und überträgt diesen in ein anderes Teströhrchen mit einem Innendurchmesser von 15 mm. Anschließend gibt man 0,5 ml einer Lösung, bestehend aus 19,1 mM o-Phenylendiamin und 2,45 mM Wasserstoffperoxid in Zitronensäure-Dinatriumphosphatpuffer, pH 5,0, in das Röhrchen und bewahrt dieses im Dunkeln 30 min bei Zimmertemperatur auf. Nach Entfernen des Films gibt man 2 ml 1N Schwefelsäure zum Abstoppen der Reaktion hinzu. Man bestimmt die Absorption bei 492 nm (A&sub4;&sub9;&sub2;) des resultierenden Reaktionsgemisches.
Den aus dem Röhrchen entfernten Film immergiert man 5 min in Puffer (a) gemäß Tabelle I, wäscht mit Wasser und verwendet diesen in einem Blindtest, indem man die obige Prozedur ohne Zugabe von Standard-AFP wiederholt. Dieser Zyklus wird wiederholt durchgeführt.
Als nächstes werden ähnliche Tests durchgeführt, wobei man den in Tabelle I angegebenen Puffer (b) als Dissoziationslösung verwendet.

(3) Ergebnisse:

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt: TABELLE I Mittlere A&sub4;&sub9;&sub2; (n = 2) Dissoziations-Lösung bestehend aus 0,1 M Glycin-HCl Nummern der Tests AFP Konzentration (ng/ml) (a) Bei pH 2.2 enthaltend 1 % NaCl (b) Bei pH 2.9 enthaltend 5% KCl

EXPERIMENT 2

Wiederholter Test auf Standard-Human-Choriogonadotropin (hCG) unter Verwendung eines immobilisierten monoklonalen Anti-hCG- Antikörpers, eingeschlossen in einen Fibroinfilm

(1) Materialien:

Der in folgendem Herstellungsbeispiel 2 hergestellte Fibroinfilm wird zu einem Stück der Größe 1,2 x 0,7 cm zugeschnitten und gemäß Beispiel 1 an einen Polyesterstreifen gebunden.

(2) Verfahren:

Die oben genannten Filme (n=10 bei jeder Konzentration) werden in 0,5 ml einer Reihe von Lösungen mit 0, 10, 30, 100 und 300 mIU/ml Standard-hCG in normaler Kochsalzlösung, jeweils enthaltend 0,1 Gew.-% BSA, immergiert und 1 h bei 25ºC inkubiert. Anschließend wäscht man die einzelnen Filme mit Wasser und re-immergiert diese in 0,5 ml einer Lösung, bestehend aus Meerschweinchen-Peroxidase-markiertem Anti-hCG-Antikörper (1,0 ug/ml, Kaninchen-IgG, markiert gemäß dem Verfahren in Experiment 1) und 0,1 Gew.-% BSA in normaler Kochsalzlösung und inkubiert 1 h bei 25ºC. Nach Waschen mit destilliertem Wasser zur Entfernung von Resten markierten Antikörpers wird mit den Filmen eine enzymatische Entwicklungsreaktion gemäß Experiment 1 durchgeführt. Die A&sub4;&sub9;&sub2; der resultierenden Reaktionsgemische werden jeweils bestimmt.
Die aus den einzelnen Röhren entfernten Filme immergiert man 5 min in Puffer (a) gemäß Tabelle II, wäscht mit Wasser und verwendet diesen im nächsten Durchgang. Man setzt jeden der Filme in beliebiger Weise in den Tests mit der Standard-hCG- Lösungsreihe ein.
Als nächstes führt man vergleichbare Tests unter Verwendung des in Tabelle II angegebenen Puffers (c) als Dissoziationslösung durch.

(3) Ergebnisse:

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt: TABELLE II Mittlere A&sub4;&sub9;&sub2; (n=10) und Variations-Koeffizient (%) Dissoziations-Lösung bestehend aus 0,1 M Glycin-HCl hCG-Konzentration (mIU/ml) (a) Bei pH 2.2 enthaltend 1% NaCl (c) Bei pH 2.9 enthaltend 5% NaCl
Die Erfindung wird anhand der folgenden Herstellungsbeispiele und des Beispiels genauer beschrieben.

HERSTELLUNGSBEISPIEL 1

Herstellung von immobilisiertem monoklonalem Anti-Human-AFP- Antikörper, eingeschlossen in einem Fribroinfilm (vgl. Japanische Patentpublikation (Kokai) 60-155129

(1) Herstellung einer wäßrigen Fibroin-Lösung:

100 g Seidenfasern saugt man mit 5 l einer wäßrigen Lösung von Marseiller Seife (1 Gew.-%) voll und degummiert 3 h bei 80ºC. Nach Waschen mit Wasser saugt man die Fasern mit 5 l einer wäßrigen Lösung von Marseiller Seife (0,5 Gew.-%) voll und degummiert 3 h bei 80ºC, wobei man 72 g Fibroinmaterial erhält, welches im wesentlichen frei von Sericin u. dgl. ist.
Man löst 150 g Calciumchlorid in einem Gemisch aus 100 g Wasser und 80 g Ethanol in einer Mischvorrichtung und erhitzt die Lösung auf 75ºC. Man löst 70 g des oben genannten Fibroinmaterials in obiger Lösung unter 1-stündigem Rühren und verdünnt anschließend mit 180 g heißem Wasser (75ºC). Nach Abkühlen dialysiert man die erhaltene Fibroinlösung in einer Hohlfaser-Dialysevorrichtung gegen Leitungswasser, wobei man 1200 ml einer Fibroinlösung mit einem Gehalt von 5,7 Gew.-% erhält. Die verbleibende Calciumchloridkonzentration beträgt 0,08 Gew.-%.

(2) Herstellung des immobilisierten, monoklonalen Anti-Human- AFP-Antikörpers, eingeschlossen in den Fibroinfilm:

Monoklonalen Anti-Human-AFP-Antikörper (erzeugt in Mäusen), gelöst in normaler Kochsalzlösung in einer Konzentration von 250 um/ml, trägt man in einer Menge von 10 ug Antikörper/cm² auf eine mit einem quadratischen Rahmen umgebene Glasplatte auf und trocknet 3 h bei 15ºC. Nach Zugabe von Glycerin in einer Menge, welche 30 Gew.-% Fibroin entspricht, gießt man die in Schritt (1) hergestellte Fibroinlösung auf die Antikörperschicht und trocknet 10 h bei 20ºC, wobei man einen Fibroinfilm mit einer Dicke von 60 um erhält, in dem monoklonale Anti- Human-AFP-Antikörper eingeschlossen sind.

HERSTELLUNGSBEISPIEL 2

Herstellung von immobilisierten monoklonalen Anti-hCG-Antikörpern, eingeschlossen in einen Fibroinfilm (vgl. Japanische Patentpublikation (Kokai) 60-155129)

Monoklonale Anti-hCG-Antikörper (erzeugt in Mäusen), gelöst in normaler Kochsalzlösung in einer Konzentration von 250 ug/ml, trägt man in einer Menge von 10 ug Antikörper/cm² auf eine mit einem quadratischen Rahmen umgebene Glasplatte auf und trocknet 3 h bei 20ºC.
Die gemäß Herstellungsbeispiel 1 hergestellte Fibroinlösung konzentriert man auf 15,7 Gew.-% und mischt mit einer Menge Glycerin, die 30 Gew.-% Fibroin entspricht.
Das Gemisch gießt man auf die Antikörperschicht und trocknet 8 h bei 20ºC, wobei man einen Fibroinfilm mit einer Dicke von 90 um erhält, der monoklonale Anti-hCG-Antikörper einschließt.

Beispiel

Wiederholte AFP-Immunoassays mit Humansera

Den gemäß Herstellungsbeispiel 1 hergestellten Fibroinfilm mit eingeschlossenen Anti-Human-AFP-Antikörpern schneidet man in einen Streifen der Größe 0,25 x 10 cm. Ein Durchflußtestsystem gemäß Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen wird vorbereitet, indem man den Filmstreifen in ein Glasröhrchen mit einem Innendurchmesser von 0,3 cm und einer Länge von 11 cm gibt, so daß eine Reaktor-Säule gebildet wird.

(1) Erstellung der Standardkurve:

Man füllt die Reaktorsäule mit destilliertem Wasser. Anschließend gibt man 0,7 ml einer Lösungsreihe von 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 ng/ml Standard-AFP in normaler Kochsalzlösung, enthaltend 0,8 ug/ml Catalse-markierten Anti-Human-AFP-Antikörper, wie unten beschrieben, und 0,1 Gew.-% BSA in die Reaktor- Säule und inkubiert 20 min. Man wäscht die Reaktor-Säule, indem man destilliertes Wasser bei einer Flußgeschwindigkeit von 20 ml/min über einen Zeitraum von 1 min durchleitet. Anschließend führt man 0,7 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 17,6 mM Wasserstoffperoxid, in die Reaktor-Säule ein und läßt 5 min reagieren. Das Reaktionsgemisch befördert man dann zu einer galvanischen Sauerstoffelektrodenzelle (Modell AN, hergestellt von Oriental Electric Co., Ltd.), indem man destilliertes Wasser mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min einleitet. Man bestimmt die Potentialzunahme aus der Ablesung des elektrischen Stroms, proportional zur Sauerstoffkonzentration im Reaktionsgemisch.
Nach Beendigung der oben erwähnten Prozedur entfernt man aus dem Film gebundenen Antikörper und gebundenes Antigen, indem man 0,1 M Glycin-HCl-Puf fer (pH 2,5, enthaltend 2% NaCl) mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min 3 min durch die Säule leitet. Anschließend wäscht man die Säule 10 Sekunden mit destilliertem Wasser mit einer Flußgeschwindigkeit von 20 ml/min.
Man wiederholt die oben beschriebenen Prozeduren zweimal für jede Standard-AFP-Konzentration. Man erhält die in Fig. 2 gezeigte Standardkurve.
Sämtliche Prozeduren werden bei Zimmertemperatur durchgeführt.
Den Catalase-markierten Anti-Human-AFP-Antikörper stellt man wie folgt her:
1 mg des oben genannten Antikörpers und 3 mg Catalase (Sigma, aus Rinderleber) löst man in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0. Man gibt 10 ul einer wäßrigen Glutaraldehydlösung (10 Gew.-%) zu der Lösung hinzu. Man läßt das Gemisch 3 h bei 15ºC reagieren. Anschließend gibt man 2 mg Natriumborhydrid hinzu. Nach 30-minütiger Reaktion dialysiert man das Reaktionsgemisch 4 Stunden in einem mit einer Dialysemembran versehenen Rohr gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0. Dieses Reaktionsgemisch reinigt man unter Verwendung einer TSK-Gel G-3000SW-Säule (registrierter Handelsname von TOKYO SODA MFG., INC.) und isoliert die den gewünschten markierten Antikörper enthaltende Fraktion.

(2) Wiederholter AFP-Immunoassay in Humansera:

Eine Probenserie, enthaltend 0, 30, 50, 150 und 300 ng Standard-AFP, stellt man her, indem man AFP in 1 ml Humanserum gesunder Erwachsener gibt (von dem man aus Radioimmunoassays weiß, daß es weniger als 5 ng/ml enthalten). Jede Probenflüssigkeit verdünnt man 10mal mit einer BSA-Lösung (0,1 Gew.-%) in normaler Kochsalzlösung, enthaltend 0,89 ug/ml des oben genannten Catalase-markierten Antikörpers.
Unter Verwendung der oben genannten Reaktorsäule werden die Verfahrensschritte gemäß Teil (1) zweimal für jede Probe wiederholt, wobei man die in Tabelle III zusammengefaßten Ergebnisse erhält. TABELLE III AFP-Zugabe (ng/ml) Mittlerer gefundener AFP-Wert (n=2) (ng/ml)
Wie aus Tabelle III hervorgeht, ist es möglich, AFP in Humansera wiederholt zu bestimmen.

Claims

1. Immuntestverfahren, wobei man einen Antikörper oder ein Antigen, immobilisiert durch Einschluß in einen Fibroinfilm und spezifisch für ein Antigen oder einen Antikörper,das oder der zu testen ist, mit dem zu testenden Antigen oder Antikörper komplexiert, dadurch gekennzeichnet, daß man nach beendeter Verwendung des immobilisierten Antikörpers oder des immobilisierten Antigens im Test diesen oder dieses mit einer Pufferlösung in Kontakt bringt, die einen pH von etwa 2 bis 4 aufweist, um komplexierte Antigene oder Antikörper davon durch Dissoziation zu entfernen, so daß der immobilisierte Antikörper oder das immobilisierte Antigen für einen weiteren solchen Test verwendet werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung eines Antigens, wobei man einen in einen Fibroinfilm eingeschlossenen, immobilisierten Antikörper gegen das Antigen anwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der immobilisierte Antikörper oder das immobilisierte Antigen mit der Pufferlösung bei einer Temperatur von 10ºC bis 40ºC in Kontakt gebracht wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der immobilisierte Antikörper oder das immobilisierte Antigen mit der Pufferlösung 3 bis 10 Minuten in Kontakt gebracht wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Pufferlösung ein Glycin-HCl-Puffer oder ein Weinsäure- Natriumhydroxid-Puffer mit einer Konzentration von 0,05 bis 0,02M ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Pufferlösung 0,5 - 10 Gew.-% eines Salzes enthält, ausgewählt unter Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Natriumsulfat.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Pufferlösung 0,1M Glycin-HCl ist, und 1 - 5 Gew.-% NaCl oder KCl bei pH 2,2 bis 2,9 enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, worin das zu testende Antigen zusätzlich mit einem markierten Antikörper komplexiert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei man:

(a) einen Fibroinfilm mit einem eingeschlossenen, immobilisierten Antikörper, der für das zu testende Antigen spezifisch ist, mit dem Antigen und dem markierten Antikörper in einem Durchflußreaktionsgefäß inkubiert;

(b) aus dem Gefäß die Flüssigphase des Komplexierungsgemisches entfernt und den nicht-komplexierten Label bestimmt;

(c) durch das Reaktionsgefäß mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min 0,1M Glycin-HCl mit einem Gehalt von 2 Gew.-% NaCl 3 Minuten bei pH 2,5 durchleitet; und

(d) den Fibroinfilm mit destilliertem Wasser wäscht.