DE3609021A1

DE3609021A1 - Chromatographisches trennmedium fuer die schnelle analyse von kleinen proben

Info

Publication number: DE3609021A1
Application number: DE19863609021
Authority: DE
Inventors: David J. Oakland Calif. Burke; Gary S. Livermore Calif. Ott
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1985-03-25
Filing date: 1986-03-18
Publication date: 1986-09-25
Also published as: JPS61257236A; CA1265116A; GB2172812A; GB8607241D0; GB2172812B

Description

360902t

Die Erfindung betrifft chromatographische Trennungen, insbesondere die Trennung von Komponenten in einer flüssigen Probe, die durch ein gepacktes Bett eines festen Trennmediums geleitet wird. Die Erfindung bezweckt insbesondere schnelle analytische Trennungen von Proteingemischen mit kleinen Probengrößen.

Die Trennung von Proteingemischen durch lonenaustauschchromatographie ist bekannt. Die bekannten Medien stellen jedoch nur Kompromisse dar, die präparative Trennungen von Milligrammengen von Proteinen ermöglichen und die zum Eluieren aller Komponenten in einem typischen Gemisch 20 Minuten oder mehr benötigen.

Es besteht ein zunehmendes Bedürfnis nach Trennung von kleineren Proben in kürzeren Zeiten. Dies trifft besonders für klinische Anwendungen zu, bei denen eine große Zahl von Proben in einer schnellen, quantitativen Weise analysiert werden soll. In vielen Fällen sind die verfügbaren Probenmengen sehr gering, so daß eine leistungsfähige Flüssigchromatographie-Säule (HPLC) mit einem kleinen Volumen und einer kurzen Trennzeit erwünscht ist.

Bekannte Materialien, die in diesen Säulen als stationäre Phase verwendet werden, bestehen im allgemeinen aus porösen Trägern mit funktioneilen ionenaustauschenden Gruppen, die an die Oberflächen der Träger gekoppelt sind und die sich zum größeren Teil in den Poren befinden. Als funktioneile Gruppen wurden sowohl isolierte Punktladungen als auch kurze polykationische oder -anionische Ketten verwendet. Obgleich diese Medien für große Säulen geeignet sind, ergeben sie jedoch keine sauberen Trennungen, wenn schnelle Trennungen erforderlich sind.

Es wurde nun gefunden, daß Proben von Proteingemischen mit kleinem Volumen, insbesondere in der Größenordnung von etwa 500 ug Protein oder weniger, insbesondere von etwa 200 ug oder weniger (bezogen auf das geamte Protein) mit hoher Trennschärfe an klei-

nen Säulen in einer ungewöhnlich kurzen Zeit getrennt werden können, wenn ein Trennmedium verwendet wird, das aus einem im wesentlichen nichtporösen inerten festen Träger zusammengesetzt ist, dessen Oberfläche mit polymeren Ketten gekoppelt ist, von denen jede mehrere Bindungsstellen enthält. Auch ohne die stark vergrößerte Oberfläche, die durch die Poren in den bekannten Materialien bedingt ist, sind die Medien gemäß der Erfindung in der Lage, die Proteine in diskrete Banden zu trennen, die nach den üblichen Nachweismethoden eine sehr genaue Analyse in einer ungewöhnlich kurzen Zeit ermöglichen. Die Erfindung ist für eine Vielzahl von Trennmechanismen und Gemischen brauchbar.

'/? Die Erfindung ist durch die Zeichnung erläutert. Es zeigen:

Fig. 1a bis 1e Hämoglobin-Trennchromatogramme, für die eine Reihe von erfindungsgemäßen Trennmedien verwendet wird, wobei sich die Medien hinsichtlich der Anzahl der Bindungsstellen je Volumeneinheit unterscheiden;

Fig. 2a und 2b die gleich Art der Trennung wie in den Fig. 1a bis 1e, jedoch mit unterschiedlichen Säulenlängen;

Fig. 3a bis 3f die gleiche Art der Trennung wie in den Fig. 1a bis 1g, wobei nichtporöse, erfindungsgemäße Medien mit porösen Medien bei verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten der Trägerflüssigkeit verglichen werden;

Fig. 4a und 4b Trennchromatogramme von Ascitesflüssigkeiten von Mäusen, wobei ein erfindungsgemäßes Trennmedium mit einem handelsüblichen Trennmedium verglichen wird;

Fig. 5a bis 5d Chromatogramme, die die Trennung von Ovalbumin aus Rinderserumalbumin zeigen, wobei ein erfindungsgemäßes Trennmedium mit unterschiedlichen Probenmengen verwendet wird;

Fig. 6 ein Chromatogramm des Gemisches von Fig. 1a bis 1e, wobei ein weiteres erfindungsgemäßes Trennmedium verwendet wird;

Fig. 7 ein Chromatogramm eines Hämolysats von roten Blutzellen, wobei ein weiteres erfindungsgemäßes Trennmedium verwendet wird;

Fig. 8a und 8b graphische Darstellungen von quantitativen Analysen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Trennmediums.

Die Trennmedien gemäß der Erfindung sind Medien in fester Phase, vorzugsweise in Form von perlenförmigen Materialien, die zur Verwendeung in der HPLC geeignet sind. Im Gegensatz zu den makroporösen und mesoporösen Medien nach dem Stand der Technik sind die Ausgangsmaterialien, die die funktioneilen Gruppen in den Medien gemäß der Erfindung tragen, im wesentlichen nichtporös; dieser Ausdruck umfaßt auch mikroporöse Medien, d.h. Medien, die durch einen kleinen Teilchendurchmesser, ein geringes Porenvolumen und eine geringe Oberfläche gekennzeichnet sind. Es findet also praktisch die gesamte chromatographische Wechselwirkung zwischen den gelösten Stoffen in der mobilen Phase und der stationären Phase während des Durchganges der mobilen Phase durch das Bett an der äußeren Oberfläche der festen Phase und nicht in den Poren statt. Die Grundmaterialien gemäß der Erfindung haben Teilchendurchmesser zwischen 0,5 und 30 um, vorzugsweise zwischen 1,0 und 10 um. Nach der Stickstoffadsorptions-Desorptions-Analyse (BET-Methode) haben die Grundmaterialien gemäß der Erfindung ein Porenvolumen von weniger als 100, vorzugsweise von weniger als 25 ul je g trockenes Material. Bei Perlen gemäß der Erfindung mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 7 um zeigt die BET-Analyse eine Oberfläche von

2 weniger als 5,0, vorzugsweise von weniger als 1,5 m /g. Perlen mit kleineren Durchmessern haben proportional größere Oberflächen.

Ein Gemisch von Bestandteilen, das als Standard für Gelfiltrationsversuche bezeichnet wird, kann verwendet werden, um die mikroporöse Natur der Trägergrundlage zu zeigen. Die Komponenten haben Molekulargewichte von 1250 (Cyanocobalamin) bis 670 000 (Thyroglobulin). Wenn sie durch eine typische Gelfiltrationssäule, wie Bio-Sil TSK-250 (Wz) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) geleitet werden, trennen sich die Proteine und erscheinen als diskrete Peaks in Abhängigkeit von ihrer Molekülgröße. Wird jedoch das Gemisch durch ein gepacktes Bett mit vergleichbaren Abmessungen geleitet, das aus der erfindungsgemäß verwendeten Trägergrundlage besteht (vor der Derivatisierung), so findet keine Trennung statt, und alle Species erscheinen als einziger Peak. Dies zeigt, daß Species mit Molekulargewichten von 1350 und mehr nicht in die Trägergrundlage eindringen.

Erfindungsgemäß muß die Oberfläche des Trägers in der Lage sein, die vorstehen angegebenen polymeren Ketten kovalent zu koppeln bzw. chemische Derivate zu bilden, um aktive Stellen zu bilden, die in der Lage sind, kovalent zu koppeln. Der unbehandelte Träger enthält also zweckmäßig reaktive Gruppen, z.B. Hydroxylgruppen, Epoxidgruppen, Carboxylgruppen, Acylhalogenid-Seitenketten oder Aldehyde, die frei auf der Oberfläche liegen.

Die Perlen selbst können aus einem organischen oder einem anorganischen Material sein. Beispiele für organische Materialien sind Methacrylatharze, z.B. Poly-(hydroxypropylmethacrylat), Poly-(glycidylmethacrylat) und verschiedene Copolymere davon, einschließlich der Vernetzungsmittel, wie Ethylenglykoldimethacrylat und Diethylenglykoldimethacrylat. Beispiele für anorganische Materialien sind Glas und Kieselsäure (Siliciumdioxid).

Vorzugsweise haben die Träger eine feste Oberfläche, die gegenüber den Substanzen, mit denen sie in Berührung kommt, inert ist und die über einen weiten pH-Bereich inert bleibt. Vorzugsweise hat die Trägergrundlage praktisch keine Bindungsaffinität für

die Substanzen in dem zu trennenden Gemisch, so daß eine nichtspezifische Bindung an andere Teile der Perlen als die funktionellen Gruppen in den polymeren Ketten, die an die Perlenoberfläche gekoppelt sind, vermieden wird. So hat die Trägergrundlage für die Trennung von Proteinen und Nukleinsäuren vorzugsweise einen hydrophilen Charakter, so daß nach ihrer Derivatisierung die freie Oberfläche, d.h. die Oberfläche die während der analytischen Trennungen der Trägerflüssigkeit zugänglich ist, hydrophil ist.

Wie bei der HPLC üblich, ist die Trägergrundlage vorzugsweise aus praktisch sphärischen Perlen zusammengesetzt. Der Teilchendurchmesser kann innerhalb weiter Grenzen variiert werden, was vom Druck und von der Fließgeschwindigkeit im HPLC-System abhängt. Bei den meisten Anwendungen liefern Perlen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,5 bis etwa 30 um, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 10 um, die besten Ergebnisse.

Die polymere Kette, die mit den Perlen gekoppelt ist, kann ein beliebiges Polymer sein, dessen Einheiten funktioneile Gruppen enthalten, die in der Lage sind, mit den in der zu analysierenden Probe vorhandenen Species in Wechselwirkung zu treten. Beispiele für derartige funktionelle Gruppen sind Ionenaustauschplätze (sowohl anionische als auch kationische) und alle anderen Stellen mit einer charakteristischen Bindungsaffinität, wie hydrophobe Stellen, die mit entsprechenden hydrophoben Stellen an den Probespecies reagieren.

Ionenaustausch-Wechselwirkungen werden bevorzugt. Es können beliebige bekannte polymere Ketten, die anionische oder kationische Stellen enthalten, verwendet werden. Beispiele sind Polyethylenimin und Polylysin. Die aktiven Stellen an diesen Ketten können weiter derivatisiert werden, um den anionischen Charakter in einen kationischen Charakter zu ändern und umgekehrt, oder um die Bindungsstärke zu erhöhen oder herabzusetzten. Eine bevorzugte Kette ist Polyethylenimin,

dessen aktive Stellen in mannigfaltiger Weise derivatisiert werden können, beispielsweise durch Hinzufügung von Carboxylgruppen oder Sulfonsäurederivaten oder durch vollständige Methylierung der Stickstoffatome unter Bildung von quaternären Aminen.

Bei bevorzugten Äusführungsformen sind die polymeren Ketten weitgehend verzweigt und aus Einheiten gebildet, von denen jede etwa eine Bindungsstelle enthält. Die Bindungsaffinität und -kapazität der Ketten kann weiterhin durch geeignete Auswahl des Molekulargewichts der Ketten oder ihrer Konzentration an der Trägeroberfläche variiert werden. Im allgemeinen ergeben polymere Ketten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 100 000, vorzugsweise von etwa 250 bis etwa 5000, die besten Resultate. Die Konzentration der Bindungsstellen wird zweckmäßig durch das Gesamt-Bindungsvermögen des Trennmediums gekennzeichnet, und zwar als Äquivalente oder Mikroäquivalente je Volumeneinheit. Es können wirksame Trennungen über einen weiten Bereich von Bindekapazitäten erreicht werden. Ausgedrückt als Chloridbindungsvermögen, werden die besten Ergebnisse im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis etwa 1000 uVal/ml erzielt, wobei etwa 30 bis etwa 350 uVal/ml, insbesondere 70 bis etwa 130 uVal/ml bevorzugt werden.

Obgleich die Erfindung auf eine Vielzahl von Probengemischen anwendbar ist, ist sie besonders für die Trennung von Proteinen, Peptiden und Nucleinsäuren brauchbar. Sehr kleine Probenmengen, insbesondere in der Größenordnung von 500 ug oder weniger, vorzugsweise von etwa 200 ug oder weniger, können mit Hilfe des vorliegenden Systems in einer ungewöhnlich kurzen Zeit getrennt werden, wobei auch die Komponenten noch scharf getrennt werden, die bevorzugte Form des Trennmediums ist ein gepacktes Bett in Form einer Säule mit einem Volumen von etwa 0,1 bis etwa 2,0 cm³, vorzugsweise von etwa 0,2 bis etwa 1,5 cm³. Die Länge der Säule beträgt vorzugsweise bis zu etwa 20 cm, besonders bevorzugt etwa 1,0 bis etwa 10 cm, insbesondere etwa 2,0 bis etwa 7,5 cm.

Die Trennung wird im allgemeinen mit Hilfe einer Trägerflüssigkeit durchgeführt, die mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 0,5 bis etwa 10 ml/min, vorzugsweise etwa 1,0 bis 5,0 ml/min, durch das Bett geleitet wird.

Bei bevorzugten Ausführungsformen, insbesondere für Proteintrennungen, wird die Trennung der Species entweder durch Verwendung eines pH-Gradienten oder eines Salz-Gradienten während der Eluierung verbessert. Der Gradientenwert kann innerhalb weiter Grenzen variieren, was von der zu trennenden Species abhängt. Ein typischer pH-Gradient kann während der Trennung von etwa 4 bis etwa 10 reichen, während ein typischer Salz-Gradient eine Nettozunahme der molaren Konzentration von etwa 0,03 auf etwa 1,0, vorzugsweise von etwa 0,05 auf etwa 0,5 umfassen kann. Bei den meisten Anwendungen wird der Gradient über einen Zeitraum von etwa 0,5 bis etwa 20 Minuten, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 5 Minuten aufrecht erhalten, wobei sich der pH-Wert und/oder die Salzkonzentration mit fortschreitender Trennung verändert. Graduelle oder stufenweise Änderungen der Salzzusammensetzung, z.B. der Austausch eines Anions durch ein anderes, können in einigen Fällen ebenfalls mit Vorteil angewendet werden.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Hinsicht beschränken.

BEISPIEL 1

A. Herstellung der Perlen.

Mikroporöse Polymethacrylat-Perlen wurden aus monomeren Glycidylmethacrylat mit Diethylenglykoldimethacrylat als Vernetzungsmittel nach der folgenden Arbeitsweise hergestellt:

Ein Reaktionskolben wurde mit 2 Liter destilliertem entionisiertem Wasser und 30,0 g (1,5%) Polyvinylalkohol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 1800 hergestellt. Der Kolben wurde auf 40⁰C erwärmt und auf dieser Temperatur gehalten, bis sich das Polymer vollständig gelöst hatte. Dann wurden Natriumdodecylsulfat (36,0 g, 1,5%) und ein Antischaummittel (Dow Corning 544) (2,0 g, gelöst in 18 ml Wasser) der Lösung zugesetzt.

Durch Vereinigung von 240,0 g (1,44 Mol) Glycidylmethacrylat mit 136 g (0,56 Mol) Diethylenglykoldimethacrylat wurde ein Gemisch hergestellt und durch eine Säule aus basischem Aluminiumoxid (Bio-Rad AG-10-Harz, 100 bis 200 mesh) filtriert, um die in den Monomeren vorhandenen Inhibitoren zu entfernen. Nach dem Filtrieren wurden 2,0 g eines radikalischen Initiators zugesetzt, und das ganze Gemisch wurde zu der Polyvinylalkohollösung gegeben.

Das erhaltenen Gemisch wurde 30 min bei 40⁰C und 800 U/min gerührt. Die Temperatur wurde dann über zwei Stunden auf 78°C erhöht und 10 Stunden auf diesem Wert gehalten. Dann wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und mit entionisiertem Wasser verdünnt. Die erhaltenen polymeren Perlen wurden abzentrifugiert, in Wasser suspendiert, eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert, dann wieder suspendiert, gerührt und wieder zentrifugiert. Der erhaltene wasserfeuchte Kuchen wurde in Methanol suspendiert, eine halbe Stunde gerührt und zentrifugiert, und diese Arbeitsweise wurde zweimal wiederholt. Der erhaltene methanolfeuchte Kuchen wurde in Methanol suspendiert, eine halbe Stunde gerührt und zentrifugiert, und diese Arbeitsweise wurde zweimal wiederholt. Der erhaltene methanolfeuchte Kuchen wurde dann zweimal mit Aceton (jeweils mit 2 Volumteilen) und dann zweimal mit 500 ml trockenem Äther gewaschem. Der Filterkuchen wurde anschließend an der Luft eine Stunde getrocknet und dann über Nacht in einen Vakuum-Trockenofen von 40⁰C gebracht. Die erhaltenen Perlen

wurden bis auf einen mittleren Teilchendurchmesser von 7,5 um klassiert. Die BET-Analyse ergab eine Oberfläche von 1,00 m²/g und ein Porenvolumen von 10,5 Mikroliter/g.

B. Derivatisierung.

Polyethylenimin wurde wie folgt an die so hergestellten Perlen gekoppelt.

Ein methanolfeuchter Kuchen aus den Perlen (100 g) wurde in ml einer Lösung von Polyethylenimin (100 g Polyethylenimin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 1800, gelöst in 300 ml Methanol) suspendiert. Die Suspension wurde 16 Std bei 40⁰C geschüttelt, dann mit Methanol verdünnt, zentrifugiert und dekantiert. Die Perlen wurden dann wieder in Methanol suspendiert, zentrifugiert und wiederum dekantiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, und die Perlen wurden zweimal mit 0,5 nHCl gewaschen, und zwar durch Suspendieren, Zentrifugieren und Dekantieren. Nach einer ähnlichen Arbeitsweise wurden die Perlen dann viermal mit gefiltertem entionisiertem Wasser gewaschen.

Das Bindevermögen wurde unter Verwendung von Chloridionen als Bindungsmittel bestimmt. Die Bestimmung wurde so durchgeführt, daß die aktiven Stellen mit Chloridionen gesättigt wurden, indem sie mit Chlorwasserstoffsäure ins Gleichgewicht gesetzt wurden; anschließend wurde mit Wasser gewaschen, worauf die Chloridionen unter Verwendung von konzentriertem Silbernitrat durch Nitrationen (0,5 n) verdrängt wurden. Dann wurde das verdrängte Chlorid mit AgNO- bis zum K^CrO.-Endpunkt titriert.

Nach der vorstehend angegebenen Arbeitsweise wurden Perlen mit einem Chloridbindungsvermögen von 90 _+ 10 pVal/ml Perlen erhalten. Für die folgenden Versuche wurde jedoch eine Reihe von Ansätzen mit unterschiedlichem Chloridbindungsvermögen hergestellt, indem die Konzentration des Polyethylenimins im Reak-

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tionsgemisch verändert wurde, die Werte für das Chloridbindungsvermögen betrugen 36, 74, 95, 133 und 203 uVal/ml.

C. Chromatographische Trennungen

Es wurde ein Gemisch aus Hämoglobin A, F, S und C für die Trennung an den verschiedenen derivatisierten Perlen hergestellt; die Anteile waren wie folgt:

A-41 + 356; F-23 + 2%-, S-20 + 1%; C-16 + 2%.

Die fünf Perlenansätze wurden einzeln in zylindrische Säulen mit einem Innendurchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 30 mm gepackt. Es wurde eine Mischvorrichtung zur Zugabe einer Pufferlösung in eine Säule mit einem linear zunehmenden Salzgradienten vorbereitet. Die verwendeten Pufferlösungen waren in beiden Fällen 10 mM Tris-Chlorid mit einem pH-Wert von 8,5, wobei der NaCl-Gehalt über einen Zeitraum von 5 Min. von Null auf 0,1 M anstieg. Die Trennung wurde mit einer Probe von 20 μΐ (40 ug) und einer Puffer-Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in den Figuren 1a bis 1e angegeben, die den Ausschlag eines Ultraviolett-Detektors mit einer δ-μΙ-Zelle zeigen. Die Werte für das Chloridbindungsvermögen der Packungen waren wie folgt: Fig. 1a - 36 pVal/ml; Fig. 1b - 74 uVal/ml; Fig. 1c - 95 uVal/ml; Fig. 1d - 133 uVal/ml; Fig. 1e - 203 UVal/ml.

BEISPIEL 2

In diesem Beispiel werden Säulen unterschiedlicher Länge im Hinblick auf ihre Eluierungszeiten und Trennfähigkeiten miteinander verglichen.

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Es wurden eine einzige Säule, die der Säule von Beispiel 1 mit einem Chloridbindungsvermögen von 74 uVal/ml entsprach, sowie zwei weitere derartige Säulen, die durch ein Verbindungsstück mit kleinem Totvolumen in Reihe geschaltet waren, zum Trennen des gleichen Hämoglobingemisches (Probenmenge 20 μΐ) wie in Beispiel 1 verwendet. Der Salzgradient in der Trägerflüssigkeit wurde durch zwei Pufferlösungen wie folgt eingestellt: Puffer A: 16 niM Tris-Chlorid, pH 8,5; Puffer B: 20 mM Tris-Chlorid plus 0,2 M NaCl, pH 8,5. Das Gradientenprogramm wurde während der Zeitspanne von 0 bis 9 Minuten nach Zugabe von 0 auf 15% B eingestellt, anschließend während der Zeitspanne von 9 bis 15 Minuten nach Zugabe auf 15 bis 40% B.

Der Nachweis erfolgte in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, und die Ergebnisse sind in den Fig. 2a (Einzelsäule) und 2b (Doppelsäule) angegeben. Die Hämoglobin-Peaks und ihre Retentionszeiten sind für jeden Versuch angegeben. Die Kurven zeigen, daß die längere Säule eine bessere Peak-Auflösung, wenn auch auf Kosten der Analysenzeit und der Bandbreite, ergab.

BEISPIEL 3

In diesem Beispiel wird ein erfindungsgemäßes Trennmedium mit einem bekannten Trennmedium verglichen, um die Überlegenheit des ersteren zu zeigen. Das erfindungsgemäße Trennmedium entsprach dem von Beispiel 2, bei dem anderen handelte es sich um "SynChropak AX-300" (Hersteller Brownlee Labs Inc., Santa Clara, Kalifornien), einem porösen Kieselsäureträger, an dessen Oberfläche Polyethylenimin gekoppelt war und das einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von etwa 10 pm, einen durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 300 A und ein Pikrinsäure-Bindungsvermögen von 656 μΜοΙ/g (entsprechend einem Chlorid-Bindungsvermögen von etwa 850 uVal/ml) hatte.

In jedem Fall wurden Säulen mit den Abmessungen 4,6 χ 30 mm und

Probenvolumen von 20 μΐ verwendet, und zwar mit drei verschiedenen Fließgeschwindigkeiten der Trägerflüssigkeit. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3a bis 3f angegeben, wobei die Fig. 3a bis 3c die derivatisierten Perlen gemäß der Erfindung bei einer Strömungsgeschwindigkeit der Trägerflüssigkeit von 0,5, 1,0 bzw. 2,0 ml/min und die Fig. 3d bis 3f die AX-300-Perlen bei den gleichen Strömungsgeschwindigkeiten zeigen. Es wurden die Pufferlösungen von Beispiel 2 verwendet, wobei folgende Gradientenprogramme verwendet wurden:

Fig. 3a und 3d: 0 bis 10% B über sieben Minuten; Fig. 3b und 3e: 0 bis 50% B über fünf Minuten; und Fig. 3c und 3f: 0 bis 40% B über drei Minuten.

Die Ergebnisse zeigen, daß die nichtporösen Perlen eine bessere Auflösung, Bandbreite und Empfindlichkeit bei allen Strömungsgeschwindigkeiten, insbesondere bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten, haben.

BEISPIEL 4

In diesem Beispiel wird ein erfindungsgemäßes Trennmedium mit einem weiteren bekannten Trennmedium bei der Analyse von IgG in Mäuse-Ascites-Flüssigkeit verglichen, wobei sich wiederum die Überlegenheit des ersteren ergibt. Das erfindungsgemäße Trennmedium war das gleiche wie von Beispiel 2. Bei dem Vergleichsmedium handelte es sich um "Bakerbond", ein Produkt der Firma J.T. Baker, Phillipsburg, New Jersey, das aus einem porösen Kieselsäureträger bestand, an dessen Oberfläche Anionenaustauschgruppen gekoppelt waren und dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser etwa 5 um betrug.

Für das erfindungsgemäße Medium wurde eine Säule mit den Abmessungen 4,6 χ 30 mm verwendet. Die "Bakerbond"-Säule war eine analytische Säule mit den Abmessungen 4,6 χ 250 mm, die bereits

vom Hersteller gepackt war. In beiden Fällen wurden Probenvolumina von 20 μΐ verwendet. Bei dem Test mit den nichtporösen Perlen war die Pufferlösung A 1 6 mM Tris mit einem pH-Wert von 7,5, die Pufferlösung B 20 mM Tris plus 0,5 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,5; es wurde ein Gradientenprogramm von 0 bis 100% B über 20 Minuten mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min verwendet. Bei dem "Bakerbond"-Test war die Pufferlösung A 10 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 6,8, während die Pufferlösung B 500 mM Kaliumphosphat mit einem pH-Wert von 6,4 war; das Gradientenprogramm lief von 0 bis 25% B über 60 Minuten mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min.

Die Nachweiskurve des Tests mit den nichtporösen Perlen ist in Fig. 4a angegeben (mit Retentionszeiten für jeden Peak), während die Nachweiskurve für den "Bakerbond"-Vergleichstest in Fig. 4b angegeben ist. Man erkennt, daß die nichtporösen Perlen ein qualitativ ähnliches Analysenergebnis in einer viel kürzeren Zeit liefern.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel zeigt die Trennung eines Gemisches von Ovalbumin und Rinderserumalbumin unter Verwendung des Trennmediums von Beispiel 2.

Es wurde eine Säule mit den Abmessungen 4,6 χ 30 mm mit vier Proben von 65 bis 650 \xg Gesamtprotein verwendet. Die Pufferlösung A war 10 mM Tris mit einem pH-Wert von 8,0; die Pufferlösung B enthielt zusätzlich 0,5 M NaCl. Das Gradientenprogramm lief von 0 bis 100% B über 15 Minuten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min.

Die Ergebnisse sind in den Fig. 5a bis 5d angegeben, wobei die Probenmengen wie folgt waren: Fig. 5a: 65 ug; Fig. 5b: 130 ug; Fig. 5c: 260 ug; und Fig. 5d: 650 ug. Die Salzgradienten und

Retentionszeiten sind ebenfalls angegeben. Man erkennt, daß wirksame Trennungen in weniger als 15 Minuten erzielt werden, wobei eine Verbreiterung der Peaks bei mehr als etwa 250 ug auftritt.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und Verwendung von PoIy-(hydroxypropylmethacrylat)-Perlen, die mit Polyethylenimin derivatisiert sind.

A. Herstellung der Perlen

Ein Reaktionskolben wurde mit 2 Liter destilliertem, entionisiertem Wasser und 30,0 g (1,5%) Gelvatol (Wz) 20 - 30, einem Polyvinylalkohol (Monsanto Industrial Chemicals Co., St. Louis, MO) beschickt. Der Kolben wurde auf 40⁰C erwärmt und auf dieser Temperatur gehalten, bis sich das Polymer vollständig gelöst hatte. Dann wurde Natriumpyrophosphat (4,0 g, 0,2%) zugegeben.

Durch Vereinigung von 150.0 g (1,04 Mol) Hydroxypropylmethacrylat und 50,0 g (0,25 Mol) Ethylenglykoldimethacrylat wurde ein Gemisch hergestellt. Bei der ersten Substanz handelte es sich um ein Gemisch aus 72% 2-Hydroxypropylmethacrylat und 28% 1-Methy-2-hydroxyethylmethacrylat. Das Gemisch wurde durch eine Säule aus basischem Aluminiumoxid (Bio-Rad AG-10-Harz, 100 - 200 mesh) filtriert, worauf 0,8 g Lauroylperoxid, gelöst in 80 g Cyclohexanol, zugesetzt wurden. Dieses Gemisch wurde dann mit dem wie vorstehend hergestellten Polyvinylalkohol vereinigt.

Das erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 40⁰C und 800 U/min gerührt. Dann wurde die Temperatur über zwei Stunden auf 78^eC erhöht und zehn Stunden auf diesem Wert gehalten. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und anschließend

mit entionisiertem Wasser verdünnt. Die erhaltenen Perlen wurden abzentrifugiert, erneut in Wasser suspendiert, gerührt, zentrifugiert, dann wieder suspendiert, gerührt und wiederum zentrifugiert. Der erhaltene Kuchen wurde in Methanol suspendiert, gerührt, zentrifugiert, wiederum suspendiert, gerührt und erneut zentrifugiert, dann zweimal mit Methanol und zweimal mit trokkenem Äther gewaschen. Der Filterkuchen wurde schließlich an der Luft und dann über Nacht in Vakuum bei 40⁰C getrocknet. Die erhaltenen Perlen wurden auf einen mittleren Teilchendurchmesser von 10 um klassiert. Die BET-Analyse ergab eine Oberfläche von

2
1,16 m /g und ein Porenvolumen von 5,0 μΐ/g.

B. Derivatisierung

40 g Perlen wurden mit trockenem Aceton gewaschen und in Aceton auf ein Volumen von 100 ml suspendiert. Dann wurden umkristallisiertes p-Toluolsulfonylchlorid (50 g) und trockenes, destilliertes Pyridin (50 ml) zugegeben. Der Reaktionskolben wurde dann verschlossen und über Nacht bei 60⁰C geschüttelt. Die Perlen wurden abzentrifugiert, zweimal mit Aceton gewaschen, um das überschüssige p-Toluolsulfonylchlorid und Pyridin zu entfernen und dann wieder in 100 ml Wasser suspendiert. Anschließend wurden 175 ml einer Lösung mit 82 g Polyethylenimin (durchschnittliches Molekulargewicht 1000) gelöst in Wasser, zugesetzt, und der Reaktionskolben wurde zwei Tage bei 40⁰C geschüttelt. Die erhaltenen Perlen hatten ein Chlorid-Bindungsvermögen von 62 uVal/ml.

C. Chromatographische Trennung

Es wurde das Gemisch der Hämoglobine A, F, S und C von Beispiel 1 in Probenmengen von 10 μΐ verwendet.

Die Perlen wurden in eine Säule mit einem Durchmesser von 0,4 cm und einer Länge von 25 cm gefüllt, worauf eine Puffer-Mischvorrichtung wie nach Beispiel 1 vorbereitet wurde, um eine Puffer-

Strömungsgeschwindigkeit durch die Säule von 1,0 ml/min zu erzeugen. Der Puffer enthielt 0,01 M Tris-Chlorid mit einem pH-Wert von 8,0 und NaCl, dessen Konzentration von 0 auf 0,15 anstieg, und zwar über einen Zeitraum von 2 bis 20 Minuten ab Beginn der Trennung. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 als spezifische Absorption bei 415 nm im Detektor als Funktion der Zeit dargestellt. Die größeren Peaks von links nach rechts wurden wie folgt identifiziert, wobei die Retentionszeiten in Klammern angegeben sind: C (7,5 min), S (8,6 min), A (10,2 min), F (13,3 min).

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und die Verwendung eines Kationenaustausch-Trägers durch Succinylierung des nach Beispiel 1 hergestellten Trägers.

Poly-(glycidylmethacrylat)-Perlen, die mit Polyethylenimin derivat isiert waren, wurden nach der in Beispiel 1, Abschnitte A und B beschriebenen Arbeitsweise hergestellt, wobei ein Chlorid-Bindungsvermögen von 90 uVal/ml erhalten wurde. Die Perlen wurden dann zweimal mit 0,5 N HCl, anschließend mehrmals mit Wasser gewaschen. Die Perlen wurden dann wieder in Wasser suspendiert und der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.

Dann wurde ein zehnfacher molarer Überschuß von Bernsteinsäureanhydrid (bezogen auf das Chlorid-Bindungsvermögen) in drei gleichen Mengen unter Rühren zugesetzt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von NaOH auf 6,0 gehalten wurde. Dann ließ man zwei Stunden reagieren. Der Grad der Succinylierung wurde durch Bestimmung des Chlorid-Bindungsvermögens festgestellt. Betrug dieses mehr als 15 uVal/ml, so wurde die Succinylierung wiederholt.

Die erhaltenen Perlen wurden zur Abtrennung von Hämoglobin A₁ aus einem roten Blutzellen-Hämolysat mit 11,9% A₁ verwendet. Es

wurde eine Säule mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 3,0 cm verwendet, wobei ein 0,010 M bis-Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 6,3 mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/min hindurchgeleitet wurde und die NaCl-Konzentration über einen Zeitraum von zehn Minuten von 0 auf 0,05 M anstieg. Das Probenvolumen betrug 20 μΐ.

Der Nachweis erfolgte durch Absorptionsmessungen bei 415 nm; die Ergebnisse sind in Fig. 7 angegeben. Die beiden Peaks wurden als Hämoglobin A. (Retentionszeit 3,36 min) bzw. Hämoglobin A_Q (4,40 min) identifiziert.

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Trennmediums bei der quantitativen Analyse.

Es wurde eine Probe mit 60% Hämoglobin A und 40% Hämoglobin C hergestellt, die dann seriell verdünnt wurde, wobei eine Reihe von Lösungen erhalten wurde, in denen die Konzentration dieser beiden Proteine differierte. Ein festgelegtes Volumen (20μ1) jeder Lösung wurde dann mehrmals in Säulen eingeführt, die denen von Beispiel 2 (Einzelsäule) entsprachen. Die aus den Säulen eluierten Peaks wurden anhand der spezifischen Absorption bei 415 nm nachgewiesen, und die Flächen der Peaks wurden durch elektronische Integration des Detektorausganges bestimmt.

Die Fig. 8a und 8b zeigen die durch den Integrator erzeugten Peakflachen, aufgetragen gegen die einzelnen Proteinmengen von Hämoglobin A und Hämoglobin C, wobei jede Figur eine getrennte Verdünnungsreihe darstellt. Die Linearität der Ergebnisse zeigt, daß die Gewinnung dieser Proteine in quantitativen Peaks über den gesamten untersuchten Bereich (2 bis 100 \i<3 eingesetztes Protein) ausgezeichnet ist.

Die vorstehende Beschreibung dient nur zur Erläuterung. Es können zahlreiche Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden, ohne daß der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

Claims

Patentansprüche

1. Chromatographisches Trennmedium, gekennzeichnet durch einen festen, im wesentlichen nichtporösen inerten Träger, an dessen Oberfläche polymere Ketten kovalent gebunden sind, wobei jede dieser Ketten mehrere Bindungsstellen enthält.

2. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstellen anionische, kationische und/oder hydrophobe Stellen sind.

3. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die freie Oberfläche des Trägers hydrophil ist.

4. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Poly-(hydroxypropylmethacrylat), Poly-(hydroxyethylmethacrylat), Poly-(glycidylmethacrylat) bzw. deren Derivate, einschließlich Vernetzungsmittel aus der Gruppe Diethylenglykoldimethacrylat und Ethylenglykoldimethacrylat,

umfaßt.

5. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus im wesentlichen sphärischen Perlen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,5 bis etwa 30 um zusammengesetzt ist.

6. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus im wesentlichen sphärischen Perlen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 1,0 bis etwa 10 um zusammengesetzt ist.

7. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durchschnittliche Molekulargewicht der polymeren Ketten etwa 100 bis etwa 100 000 beträgt.

8. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durchschnittliche Molekulargewicht der polymeren Ketten etwa 250 bis etwa 5000 beträgt.

9. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Ketten im wesentlichen verzweigt sind und daß jede ihrer Einheiten etwa eine Bindungsstelle enthält.

10. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstellen Anionenaustauschsteilen sind und die polymeren Ketten ein Chloridbindungsvermögen von etwa 10 bis etwa 1000 uVal/ml, bezogen auf das gesamte chromatographische Trennmedium, haben.

11. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstellen Anionenaustauschstellen sind und die polymeren Ketten ein Chloridbindungsvermögen von etwa 30 bis etwa 350 uVal/ml, bezogen auf das gesamte chromatographische Trennmedium, haben.

12. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstellen Anionenaustauschstellen sind und daß die polymeren Ketten ein Chloridbindungsvermögen von etwa 70 bis etwa 130 uVal/ml, bezogen auf das gesamte chromatographische Trennmedium, haben.

13. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Ketten aus Polyethylenimin, Polylysin, Polymeren von Asparaginsäure und deren Derivaten bestehen.

14. Chromatographisches Trennmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Ketten aus Polyethylenimin sowie aus Polyethylenimin, dessen aktive Stellen zu Carboxy-, SuIfonat- und guaternären Ammoniumgruppen umgewandelt sind, bestehen.

15. Chromatographisches Trennmedium, dadurch gekennzeichnet, daß der feste, im wesentlichen nichtporöse inerte Träger aus vernetztem Poly-(hydroxypropylmethacrylat) und vernetztem PoIy-(glycidylmethacrylat) bestehen, an dessen Oberfläche Polyethyleniminketten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht je Kette von etwa 250 bis etwa 5000 gekoppelt sind, und zwar in einer Menge, die ausreicht, um dem Medium ein Chloridbindungsvermögen von etwa 70 bis etwa 130 uVal/ml zu verleihen, wobei der Träger in Form von im wesentlichen sphärischen Perlen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 1 bis 10 um vorliegt.

16. Chromatographische Trennsäule, enthaltend ein gepacktes Bett aus dem chromatographischen Trennmedium nach Anspruch 1 mit einer Länge von maximal etwa 20 cm.

17. Chromatographische Trennsäule, enthaltend ein gepacktes Bett aus chromatographischem Trennmedium nach Anspruch 1, mit einer Länge von etwa 1,0 bis etwa 10 cm.

18. Chromatographische Trennsäule, enthaltend ein gepacktes Bett eines chromatographischen Trennmediums nach Anspruch 1, mit einer Länge von etwa 2,0 bis etwa 7,5 cm.

19. Chromatographische Trennsäule, enthaltend ein gepacktes Bett mit einem festen, im wesentlichen nichtporösen inerten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger vernetztes Poly-(hydroxypropylmethacrylat) oder vernetztes Poly-(glycidylmethacrylat) darstellt, an dessen Oberfläche Polyethyleniminketten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht je Kette von etwa 250 bis etwa 5000 gekoppelt sind, und zwar in einer Menge, die ausreicht, um dem Medium ein Chloridbindungsvermögen von etwa 70 bis etwa 130 uVal/ml zu verleihen, wobei die Unterlage in Form von im wesentlichen sphärischen Perlen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 1 bis etwa 10 um vorliegt und die Säule eine Länge von etwa 2,0 bis etwa 5,0 cm hat.

20. Verfahren zum Nachweis einer Species in einem Gemisch, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) das Gemisch durch ein gepacktes Bett aus einem festen, im wesentlichen nichtporösen inerten Träger leitet, an dessen Oberfläche polymere Ketten gebunden sind, von denen jede Kette mehrere Bindungsstellen enthält, um die Species in im wesentlichen diskrete Banden zu trennen; und

(b) diese Banden nachweist, wenn sie aus dem Bett austreten.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das gepackte Bett eine Säule mit einem Volumen von etwa 0,1 bis etwa 2,0 cm darstellt, das Gemisch weniger als etwa 500 ug wiegt und die Species aus Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren ausgewählt sind.

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das gepackte Bett eine Säule mit einem Volumen von etwa 0,2 bis etwa 1,5 cm darstellt, das Gemisch weniger als etwa 200 ug

wiegt und die Species aus Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren ausgewählt sind.

23. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das gepackte Bett eine Säule mit einer Länge von maximal etwa 20 cm darstellt und das Gemisch weniger als etwa 500 ug wiegt.

24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das gepackte Bett eine Säule von etwa 1,0 bis etwa 10 cm Länge darstellt und das Gemisch weniger als etwa 500 ug wiegt.

25. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das gepackte Bett eine Säule von etwa 2,0 bis etwa 7,5 cm Länge darstellt und das Gemisch weniger als etwa 200 ug wiegt.

26. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe (a) eine inerte Trägerflüssigkeit mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 0,5 bis etwa 10 ml/min durch das Bett laufen läßt.

27. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe (a) eine inerte Trägerflüssigkeit mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1,0 bis etwa 5 ml/min durch das Bett laufen läßt.

28. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Parameter der Trägerflüssigkeit, nämlich Salzkonzentration, Salzzusammensetzung und pH-Wert während der Stufe (a) kontinuierlich variiert werden.

29. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit ein darin gelöstes Salz mit einer Konzentration enthält, die kontinuierlich im Verlauf der Stufe (a) zunimmt, wobei eine Nettozunahme der Molarität von etwa 0,03 auf etwa 1,0 erfolgt.

30. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerflüssigkeit ein darin gelöstes Salz mit einer" Konzentration enthält, die kontinuierlich im Verlauf der Stufe (a) zunimmt, wobei eine Nettozunahme der Molarität von etwa 0,05 auf etwa 0,5 erfolgt.

31. Verfahren zum Nachweis von Proteinen in einem Proteingemisch mit einer Probengröße von etwa 200 ug oder weniger, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) das Gemisch durch ein gepacktes Bett mit einem Volumen von etwa 0,2 bis etwa 1,5 cm und einer Länge von etwa 1,0 bis etwa 10 cm hindurchleitet, wobei das Bett aus einem festen, im wesentlichen nichtporösen inerten Träger zusammengesetzt ist, an dessen Oberfläche polymere Ketten gebunden sind, von denen jede mehrere Bindungsstellen enthält, daß man durch das gepackte Bett eine inerte Trägerflüssigkeit mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1 bis etwa 5 ml/min laufen läßt, wobei die Trägerflüssigkeit ein Salz in einer Konzentration gelöst enthält, die mit einer Nettozunahme der Molarität von etwa 0,1 auf etwa 0,5 kontinuierlich über einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 5 min zunimmt, um die Proteine in im wesentlichen diskrete Banden zu trennen; und daß man

(b) die Banden beim Austritt aus dem Bett nachweist.

32. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der inerte Träger aus im wesentlichen sphärischen Perlen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 5 bis etwa 50 um zusammengesetzt ist.

33. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Ketten Polyethyleniminketten oder Polyethyleniminketten darstellen, deren aktive Stellen in Carboxylgruppen, Sulfonatgruppen oder quaternäre Ammoniumgruppen umgewandelt sind.

34. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die

-ir-

Bindungsstellen Anionenaustauschstellen sind und die polymeren Ketten ein Chloridbindungsvermögen von etwa 10 bis etwa 1000 UVal/ml, bezogen auf das gesamte chromatographische Trennmedium, haben.

35. Verfahren zu Nachweis von Proteinen in einem Proteingemisch mit einer Probengröße von etwa 200 ug oder weniger, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) das Gemisch durch ein gepacktes Bett mit einem Volumen von etwa 0,2 bis etwa 1,5 cm und einer Länge von etwa 2,0 bis etwa 7,5 cm hindurchleitet, das aus einem festen, im wesentlichen nichtporösen inerten Träger in Form von im wesentlichen sphärischen Perlen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 1,0 bis etwa 10 um zusammengesetzt ist, an dessen Oberfläche Polyethyleniminketten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht je Kette von etwa 250 bis etwa 5000 in einer solchen Menge gekoppelt sind, daß das Medium ein Chloridbindungsvermögen von etwa 70 bis etwa 130 uVal/ml hat, daß durch das gepackte Bett eine inerte Trägerflüssigkeit mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1,0 bis etwa 5 ml/min geleitet wird, welche ein gelöstes Salz mit einer kontinuierlich zunehmenden Konzentration enthält, wobei eine Nettozunahme der Molarität von etwa 0,05 bis etwa 0,5 über einen Zeitraum von etwa 1 bis 5 min erfolgt, um die Proteine in diskrete Banden zu trennen; und daß man

(b) die Banden beim Austritt aus dem Bett nachweist.