DE3587720T2

DE3587720T2 - Testverfahren.

Info

Publication number: DE3587720T2
Application number: DE3587720T
Authority: DE
Inventors: Gordon Coulter Forrest; Hugh Allen Oliver Hill; Simon John Rattle; Grenville Arthur Robinson
Original assignee: Serono Diagnostics Ltd
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1985-05-13
Publication date: 1994-06-01
Anticipated expiration: 2005-05-14
Also published as: EP0167248A2; CA1268520A; AU597562B2; IL75174A0; ATE100203T1; AU4241185A; US4945045A; GB8417301D0; EP0167248B1; EP0167248A3; IL75174A; DE3587720D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Assay eines oder von einem Paar spezifischer Bindungspartner(s) und Reagenzausrüstungen zur Durchführung dieser Verfahren.
Es besteht gegenwärtig eine große Notwendigkeit für schnelle und genaue Verfahren zum Testen biologisch aktiver Substanzen (die in geringer Konzentration vorliegen können), insbesondere in Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel oder Urin. Eine breite Vielfalt medizinischer Zustände, wie Schwangerschaft, Arzneimittelüberdosierung, metabolische Geburtsdefekte, hormonelle Erkrankungen und Diabetes können unter Verwendung derartiger Assaytechniken diagnostiziert werden.
Viele Assay(Test)verfahren beruhen auf der Bildung eines Komplexes zwischen den zu untersuchenden Spezies (nachfolgend als "Ligand" bezeichnet) und einem anderen Spezies, an das sich der Ligand spezifisch bindet (nachfolgend als "spezifischer Bindungspartner" bezeichnet.) Der Umfang der Komplexbildung ist eine Funktion der Menge des vorhandenen Liganden.
Die Assay des Liganden wird bestimmt durch Beobachtung des Umfanges der Komplexbildung, zum Beispiel durch Verwendung von chemischen oder biochemischen Markern. Es sind verschiedene Verfahren zur Markierung angewandt worden, zum Beispiel die Radioisotop- oder Enzym-Markierung, Spin-Markierung oder die Markierung unter Verwendung fluoreszierender oder biolumineszenter Spezies.
Die Verwendung von Radioisotop-Markern ist besonders weit verbreitet wegen des hohen Grades der zu erhaltenen Empfindlichkeit und Spezifik. Es gibt allerdings verschiedene Nachteile bei der Verwendung radioaktiver Marker. Radioaktive Marker sind hinsichtlich der Lagerfähigkeit infolge des spontanen Zerfalls beschränkt, erfordern eine häufige Nacheichung der Ausrüstung, und ihre Verwendung erfordert die Befolgung strenger Sicherheitsbestimmungen und ist Gegenstand gesetzlicher Bestimmungen. Diese Nachteile führen unvermeidlich zu höheren Kosten und zur Notwendigkeit für hohe Standards ausgereifter Ausrüstung, Laborausstattungen und Personal.
Die EP-A-125139 und die EP-A-149339 sind Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ.
Es wurde nunmehr gefunden, daß Elektronentransfervermittler, die zur Stützung des Transfers von Elektronen von einer Elektronenquelle zu einer Elektrode (oder des Transfers von Elektronen von der Elektrode zu einem Elektronenakzeptor) als Marker angewandt werden können, um das Problem zu überwinden, das mit den oben erörterten bekannten Markern verbunden ist, und um eine empfindliche, spezifische und bequeme Assaymethode bereitzustellen.
Es wird somit als ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Assay eines Liganden in einer Probe bereitgestellt unter Verwendung einer elektrochemischen Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch das Kontaktieren der Probe mit Komponenten, die umfassen:
(a) eine Elektronenquelle oder einen Elektronenakzeptor,
(b) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und
(c) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter den Ligandenanalogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden,
wobei die Komponente (b) oder wenigstens eine der Komponenten (b) und (c) mit einem Elektronentransfervermittler markiert ist, der den Transfer der Elektronen von der Elektronenquelle zur Arbeitselektrode oder von der Arbeitselektrode zum Elektronenakzeptor unterstützt;
und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade der Elektronentransfer gestört ist durch (i) Komplexbildung oder (ii) einen gesteuerten äußeren Einfluß, was zu einer Störung des Elektronentransfers als eine Funktion des gebildeten Komplexes zwischen den Liganden und wenigstens einem spezifischen Bindungspartner führt, mit der einen oder der anderen der nachstehenden Maßgaben.
In dem Vertragsstaat AT besteht die Maßgabe, daß wo kein gesteuerter äußerer Einfluß angewandt wird, keine Komponente (c) vorhanden ist und der Ligand ein Polynucleotidstrang ist, wobei die Komponente (a) ein nicht-enzymatisches Reagenz ist. In den restlichen Vertragsstaaten (wie aus den Ansprüchen ersichtlich) besteht die Maßgabe darin, daß die Komponente (a) ein nicht-enzymatisches Reagenz ist, worin (I) keine Komponente (c) angewandt wird oder ein Vermittler-markiertes Ligandenanaloges als Komponente (c) angewandt wird, in beiden Fällen ohne Störung des Elektronentransfer durch gesteuerten äußeren Einfluß, oder worin (11) die Komponente (c) ein Vermittlermarkierter spezifischer Bindungspartner ist und ein gesteuerter äußerer Einfluß angewandt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Ausrüstung zur Durchführung eines Assayverfahrens, wie es oben definiert wurde, umfassend:
(i) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden oder einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter Ligandenanlogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, der Komponente (i) oder wenigstens einer der Komponenten (i), die mit einem Elektronentransfervermittler markiert sind; und
(ii) eine Nicht-Enzym-Elektronenquelle, die zur Abgabe von Elektronen fähig ist an den Elektronentransfervermittler oder einen Nicht-Enzym-Elektronenakzeptor, der zur Aufnahme von Elektronen von dem Elektronentransfervermittler fähig ist.
In dem Falle, wo das Verfahren eine heterogene Vergleichsassay ist, umfaßt die Ausrüstung zur Durchführung der Assay:
(i) einen nicht-markierten spezifischen Bindungspartner für den Liganden, gebunden an einen festen Träger, der ausgewählt ist unter einer Arbeitselektrode oder einer Nicht-Elektroden- Festphase,
(ii) ein Elektronentransfervermittler-markiertes Ligandenanaloges und
(iii) ein Oxidoreduktase-Enzym, das in Gegenwart eines Substrates dafür als Komponente (a) geeignet ist, oder eine Nicht-Enzym-Elektronenquelle oder ein für diese Komponente geeigneter Elektronenakzeptor.
In dem Falle, wo die Assay eine Vergleichs-Sandwich-Assay ist, umfaßt die Ausrüstung zur Durchführung der Assay:
(i) einen nicht-markierten spezifischen Bindungspartner für den Liganden,
(ii) ein nicht-markiertes Ligandenanloges, gebunden an einen festen Träger, der ausgewählt ist unter einer Arbeitselektrode oder einer Nicht-Elektroden-Festphase,
(iii) ein Elektronentransfervermittler-markiertes Ligandenanaloges und
(iv) ein Oxidoreduktase-Enzym, das in Gegenwart des Substrates dafür als Komponente (a) geeignet ist, oder eine Nicht-Enzym- Elektronenquelle oder ein Elektronenakzeptor, geeignet für diese Komponente.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in einem elektrochemischen Verfahren zur Assay eines Liganden in einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt:
(i) Kontaktieren der Probe mit Komponenten, die umfassen
(a) eine Elektronenquelle oder einen Elektronenakzeptor,
(b) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der an einen festen Träger immobilisiert ist, ausgewählt unter der Arbeitselektrode und Festphasenpartikeln oder -kügelchen,
(c) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der mit einem Elektronentransfervermittler markiert ist, der zur Unterstützung des Elektronentransfers von der Elektronenquelle zur Arbeitselektrode oder von der Arbeitselektrode zum Elektronenakzeptor in der Lage ist;
(ii) Ersatz des festen Trägers in Bezug auf die ungebundene Vermittler-markierte Komponente (c); und
(iii) Bestimmung, ob eine Störung vorliegt und gewünschtenfalls, in welchem Umfang der Transfer der Elektronen gestört ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann sowohl für qualitative als auch quantitative Assays verwendet werden, wobei die Assay vervollständigt wird durch Vergleich der ermittelten Störung mit Eichdaten.
Der Begriff "Ligandenanaloges", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Spezies, die zur Komplexierung mit dem gleichen spezifischen Bindungspartner wie der zu testende Ligand in der Lage ist und schießt unter anderem in seinem Umfang eine bekannte Menge des zu testenden Liganden mit ein.
Elektronenquellen oder -akzeptoren, die die Komponente (a) umfassen, können einzelne Spezies oder zwei oder mehrere miteinander kooperierende Spezies sein. Somit kann zum Beispiel Ascorbat.
die Funktion als Elektronenquelle übernehmen, Apomorphin, substituierte Catechole (wie 1-Amino-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethan oder 1-Amino-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)ethan) oder Aminophenole (wie p-Aminophenol oder 1-Amino-2-(2-amino-4,5-dihydroxyphenyl)ethan) werden geeigneterweise als Marker für die Komponenten (b) und falls vorhanden (c) angewandt, oder Dihydronicotinamid-adenosinphosphat (NADH) kann als Elektronenquelle wirken, mit Chinonen (z. B. o-Chinone, wie die oxydierten Formen von Dopamin (3-Hydroxytyramin) und 3,4-Dihydroxybenzylamin) als Marker.
Alternativ dazu können Enzyme im Zusammenwirken mit ihren Substraten angewandt werden. Zu besonders geeigneten Enzymen gehören die sogenannten Oxidoreduktasen, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, Flavo- und Chino-proteinenzyme, z. B. Glucoseoxydase, Glucosedehydrogenase oder Methanoldehydrogenase. Der hier verwendete Begriff "Enzym" schließt wirkliche Enzyme ein, z. B. von den zuvor genannten Arten, sowie Apoenzyme, die in Gegenwart eines Co-Faktors aktiviert werden können. Als Apoenzym kann zum Beispiel Apoglucoseoxidase verwendet werden.
Andere Elektronenquellen und -akzeptoren und geeignete Vermittler dafür sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Die bevorzugten Elektronenquellen sind Oxidoreduktase- Enzyme (z. B. jene oben genannten). Somit stellt die vorliegende Erfindung nach einem bevorzugten Merkmal ein Verfahren zur Assay eines Liganden in einer Probe, wie zuvor definiert, bereit, worin die Komponente (a) ein Oxidoreduktase-Enzym im Zusammenwirken mit einem Substrat dafür ist.
Geeignete Marker für die Komponenten (b) und (c) zur Verwendung in einem solchen bevorzugten Verfahren können zum Beispiel zur Aufnahme von Elektronen von dem Enzym und Abgabe dieser an die Elektrode (während der Substratoxidation) in der Lage sein, oder sie können zur Aufnahme von Elektronen von der Elektrode und zur Abgabe dieser an das Enzym (während der Substratreduktion) in der Lage sein. Derartige Marker können zum Beispiel ausgewählt werden unter dem folgenden:
(i) einem Polyviologen wie zum Beispiel einer Verbindung der Formel
und Derivaten davon, z. B. Seitenkettenalkylderivaten, deren Herstellung in Polymer Letters 9, S. 289-295 (1971) beschrieben ist,
(ii) einer Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, ausgewählt unter Chloranilen, Fluoranilen und Bromanilen (z. B. o- Chloranil),
(iii) Ferrocen (Bis-n&sup5;-cyclopentadienyl-Eisen(II)) oder einem Derivat davon (einschließlich z. B. funktionalisierter Derivate wie Ferrocen-monocarbonsäure (FMCA), polymere Formen ("Polyferrocene") wie (Ferrocen)&sub4; oder Polyvinyl-ferrocen und "Bortetraferrocen" (B(ferrocen)&sub4;)),
(iv) Verbindungen biologischen Ursprungs, die eine geeignete Enzymkompatibilität haben, z. B. Vitamin K,
(v) N,N,N',N'-Tetramethyl-4-phenylendiamin,
(vi) Derivate von Phenazinmethosulfat oder Phenazinethosulfat, und
(vii) wenn das verwendete Enzym ein Apoenzym ist, ein Co-Faktor des Apoenzyms; wobei der Co-Faktor im allgemeinen mit dem Apoenzym auf normalen Wege wechselwirken wird.
Vermittler können mit dem Enzym an einer Stelle wechselwirken, die entfernt von oder nahe an der aktiven Stelle für die Substratreaktion liegt.
Von den zuvor genannten Elektronentransfervermittlern sind die bevorzugten Ferrocen und funktionalisierte Derivate davon. Diese Verbindungen sind für diesen Zweck erwünscht, da sie relativ billig sind, stabil, wasserlöslich, nicht-toxisch und ein elektrochemisch leicht reversibles System darstellen, das in einem reduzierten FeII-Zustand nicht gegen Oxidation durch Sauerstoff an der Luft anfällig ist.
Eine Funktionalisierung kann erforderlich sein z. B. um eine Anfügung des Markers an das Reagenzmolekül zu gestatten. Das Redoxpotential von Ferrocen beträgt + 422 mV gegen NHG. Durch Einführung funktioneller Gruppen an das Ringsystem kann diese Zahl zwischen + 300 und + 650 mV variiert werden. Darüber hinaus ist die Wasserlöslichkeit der Carboxy-substituierten Ferrocene größer als die der Elternverbindung (siehe z. B. Szentrimay, R., 1977, Amer. Chem. Soc. Symposium Series, 38, 154).
Somit kann es zum Beispiel im Falle des Ferrocens erforderlich sein, den Ferrocenkomplex zu modifizieren, indem eine oder beide Cyclopentadienyl-Gruppen mit einer oder mehreren Seitenketten versehen werden, z. B. der Formel
-CHO, (CH&sub2;)nCOOH oder -(CH&sub2;)mNHR¹R²
worin n und m beispielsweise 0 bis 6 sein können, und R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen (z. B. Methyl). Zusätzliche funktionelle Gruppen können in die Seitenketten eingeführt werden, normalerweise solche Gruppen, wie sie bei der chemischen Modifizierung von Proteinen verwendet werden, zum Beispiel Quecksilberchlorid, Vorläufer von Nitrenen und Carbenen, Diazo- oder Iodid-Gruppen. Eine ähnliche Funktionalisierung kann wünschenswert sein, wenn andere Vermittler als Ferrocen verwendet werden.
Die Wechselwirkung zwischen dem Vermittler-Marker und dem Enzym kann somit die Form einer chemischen Bindung annehmen, oder sie kann die Form einer nichtchemischen Bindung oder einer Nicht-Bindungs-Wechselwirkung annehmen.
Die Arbeitselektrode, von der die elektrochemischen Meßwerte aufgenommen werden, ist vorzugsweise fest und hat eine elektrisch leitfähige Arbeitsoberfläche aus z. B. Kohlenstoff (vorzugsweise Graphit, z. B. pyrolytischer Graphit) oder Metall, z. B. Silber, Gold oder Platin. Wenn die Elektrode aus Kohlenstoff ist, kann sie als vorgeformter Stab oder als eine Elektrodenform vorhanden sein, die aus einer Paste aus Kohlenstoffteilchen hergestellt wird. Die Art der Oberfläche der Elektrode ist üblicherweise wichtig. Falls aus Metall, kann die Oberfläche aufgerauht oder chemisch modifiziert werden, falls aus festem Kohlenstoff, kann die Oberfläche vorher in einem Ofen mit einem Sauerstoffüberschuß wärmebehandelt werden oder elektrochemisch oxidiert werden. Somit kann zum Beispiel, wenn Ascorbat als Elektronenquelle verwendet wird, vorteilhaft eine Kohlenstoffpastenelektrode aus polierten "Glaskohlenstoff"-Blättchen angewandt werden.
Zusätzlich zu der Arbeitselektrode, von der die elektrochemischen Meßwerte abgenommen werden, kann die Vorrichtung eine Hilfs(Gegen-)elektrode umfassen und gegebenenfalls eine Referenzelektrode, wobei die Elektroden in Verbindung mit einem Potentiostaten und einem empfindlichen Stromzähler verwendet werden. Die Vorrichtung enthält vorzugsweise ein wäßriges Assaymedium, bestehend unter anderem aus pH-Puffer. Es können Einrichtungen vorgesehen sein zur Inkubierung des Assaymediums bei einer gewünschten Temperatur. Eine geeignete elektrochemische Vorrichtung ist im senkrechten Schnitt in Fig. 1 (a) der dazugehörigen Zeichnungen erläutert. Die Arbeitselektrode 1 besteht aus einem länglichen Kern 2 aus Stahl, an der Spitze mit einer Arbeitsoberfläche 3 aus pyrolytischem Graphit und hat einen Überzug 4 aus Epoxidharz. Die Hilfs(Gegen-)elektrode 5 besteht aus Platin. Eine Kalomel- Referenzelektrode 6 ist gezeigt, verbunden mit der Zelle über eine Lugginsche Kapillare 7. Die Zelle und die Referenzelektrode sind durch einen Wassermantel 8 umschlossen.
Zur Messung der elektrochemischen Merkmale der Komponenten kann eine Vielzahl elektrochemischer Methoden angewandt werden, die zwei der drei Parameter Potential (E), Strom (i) und Zeit (t) auswerten. Zum Beispiel kann die elektrochemische Messung erfolgen unter Verwendung der Differenzimpuls-Voltammetrie, der zyklischen Voltammetrie oder der Rechteckwellen- Voltammetrie. Wenn die zyklische Voltammetrie verwendet wird, kann ein Stromkreis, wie zum Beispiel der schematisch in Fig. 1(b) der dazugehörigen Zeichnungen gezeigte, angewandt werden. In dieser Figur stellt C die Hilfs(Gegen-)elektrode dar, W ist die Arbeitselektrode und R die Referenzelektrode. Dieser Stromkreis kann üblicherweise in Verbindung mit einer Vorrichtung des in Fig. 1(a) gezeigten Typs verwendet werden, wobei der elektrochemische Strom i unter Einsatz eines Potentiostaten gemessen wird.
In homogenen Assaysystemen kann die Bildung des Komplexes zwischen dem Liganden und dem spezifischen Bindungspartner oder im Falle der Vergleichsassay zwischen dem Ligandenanlogen und dem spezifischen Bindungspartner eine Änderung (z. B. ein Abfall) hervorrufen in der Fähigkeit der Elektronen z. B. von dem Enzym zur Elektrode zu fließen und umgekehrt über den Vermittler. Dies kann zum Beispiel das Ergebnis sein von:
1. der Blockierung des Austauschs zwischen dem Vermittler und dem Enzym durch die Bildung des Komplexes, wodurch ein Elektronentransfer verhindert wird;
2. der Blockierung des Austauschs zwischen dem Vermittler und der Elektrode durch die Bildung des Komplexes, wodurch der Elektronentransfer verhindert wird;
3. der Änderung der Angleichung des Vermittlers durch die Bildung des Komplexes, so daß die freie Passage der Elektronen zwischen dem Enzym und dem Vermittler gehemmt wird; oder
4. der Änderung der Angleichung des Vermittlers durch die Bildung des Komplexes, so daß die freie Passage der Elektronen zwischen dem Vermittler und der Elektrode gehemmt wird.
In einer typischen homogenen Assay stört daher die Bildung des Komplexes eine elektrochemische Charakterisierung der Komponenten der Lösung. Für ein vollständiges Voltammogramm ist es nicht erforderlich, durch Messung der elektrochemischen Merkmale bestimmt zu werden; es kann ausreichend sein, zum Beispiel für ein entsprechend ausgewogenes Potential, ausgewählt zu werden und Meßwerte des Stromes an diesem Punkt zu nehmen. Der Grad der Störung kann dann in Bezug gebracht werden zu der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden aus Eichdaten, die mit einem ähnlichen System unter Verwendung bekannter Mengen des Liganden erhalten wurden.
Obgleich die Reihenfolge der Einführung der Probe und der Komponente(n) in die Vorrichtung nicht kritisch ist, wird vorgezogen, daß ein Komplex nach Einführung der letzten der Probenkomponente(n) gebildet wird, jedoch nicht davor. Es ist allerdings auch möglich, für jene als Komplex vorzuliegen bevor die letzte dieser Komponenten wieder hinzugegeben wird, wobei in einem solchen Falle die Endkomponente komplexiert wird, indem sie eine Komponente des Komplexes ersetzt. Es kann erforderlich sein, diese Komponenten für einen gewissen Zeitraum zu inkubieren, um die Komplexierungsreaktion zur Erreichung des Gleichgewichtes zu ermöglichen, bevor die Komponente (a) hinzugegeben wird. Die Zugabe der Komponente (a) sollte die Komplexierungsreaktion nicht bewirken, jedoch müssen diese Komponenten vorhanden sein, bevor die Messungen an der Arbeitselektrode vorgenommen werden können.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist anwendbar bei z. B. "Direkt"-Assays (bei denen die Komponente (c) abwesend ist), "Ersatz"-Assays oder "Vergleichs"-Assays (bei denen ein Ligandenanaloges in der Komponente (c) vorhanden ist). Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei der sogenannten "Sandwich"-Technik angewandt werden unter Verwendung eines Festphasen-Bindungspartners. In Abhängigkeit von der Reihenfolge der komplexierenden Reaktionen sind nach der vorliegenden Erfindung die Vorwärts-, schnelle Vorwärts-, Umkehr- und Simultan-Variation möglich. Die Festphase kann die Elektrodenoberfläche umfassen, oder sie kann die Form von Partikeln, Kügelchen usw. haben. Der Festphasen-Bindungspartner kann durch ein beliebiges einer Vielzahl üblicher Verfahren zur Immobilisierung von Reagenzien auf festen Trägern hergestellt werden.
In einem Verfahren der Erfindung, bei der die Zeit (t) als Parameter benutzt wird, kann die Geschwindigkeit der Störung des elektrochemischen Merkmals als Ergebnis der Komplexbildung bestimmt werden. Zweckmäßig wird die Anfangsgeschwindigkeit der Störung gemessen. Ein solches Verfahren ist zum Beispiel anwendbar bei einer Vergleichsassay, bei der der Ligand und das markierte Ligandenanaloge mit dem spezifischen Bindungspartner für die Komplexierung konkurrieren. Somit ist die Anfangsgeschwindigkeit der Störung auf die Konzentration des vorhandenen Liganden bezogen, und aus einer Eichkurve der Anfangsgeschwindigkeit der Störung gegen die Konzentration des vorhandenen Liganden kann die Liganden-Assay leicht bestimmt werden.
Das Verfahren zur Assay, das eine Bestimmung der Geschwindigkeit der Störung zum Inhalt hat, ist auch auf nichtvergleichende Assays anwendbar, wo das markierte Ligandenanaloge abwesend ist und ein ausreichend markierter spezifischer Bindungspartner angewandt wird, um den gesamten eingeführten Liganden komplexieren zu können.
Die Messung von beispielsweise des absoluten elektrochemischen Stromes, der nach einer Standard-Inkubationszeit erzeugt wird, kann die Leichtigkeit und Empfindlichkeit der Assay verstärken.
In einer typischen heterogenen Assay ruft die Bildung des Komplexes keine (oder nur eine geringe) Störung in einem elektrochemischen Merkmal der Komponenten hervor. In dem Falle wird es im allgemeinen erforderlich sein, künftig eine Störung durch kontrollierte äußere Einflüsse zu erzeugen oder zu verstärken. Obgleich die Größe des äußeren Einflusses einigen Einfluß haben kann auf die hervorgerufene Veränderung und daher übereinstimmen muß mit irgend einem dieser Einflüsse, der bei den Eichversuchen angewandt wird, besteht der Gedanke darin, daß eine beliebige Veränderung, die in der Störung hervorgerufen wird, eine Funktion des Ligand/spezifischer Bindungspartner-Komplexes bleibt. [Künstliche Erzeugung oder Verstärkung einer Störung kann auch in homogenen Assays wünschenswert sein].
Die künstliche Erzeugung oder Verstärkung der Störung wird vorzugsweise durchgeführt mittels Ersetzen des Komplexes in Bezug auf die ungebundene markierte Komponente, zum Beispiel indem die Komponente (b) in einer unlöslichen Form, gekoppelt (z. B. in üblicher Weise) an einen festen Träger, vorgesehen wird. Alternativ dazu kann der Komplex weiterhin komplexiert werden mit einer Spezies, die spezifisch an den Komplex anbindet, gekoppelt an einen festen Träger, mit anschließendem Ersatz des Trägers und der angekoppelten Moleküle. In extremen Fällen kann der Ersatz in der vollständigen Entfernung des Komplexes von der Vorrichtung bestehen, im allgemeinen wird der Komplex jedoch innerhalb der Vorrichtung ersetzt.
Der feste Träger kann zum Beispiel die Elektrodenoberfläche umfassen oder kann die Form üblicher Festphasenpartikel, Kügelchen usw. annehmen. Der feste Träger kann magnetisch sein oder magnetisierbar, um den Ersatz oder die Trennung zu erleichtern. Somit können zum Beispiel magnetische Träger (z. B. in Form von Partikeln oder Kügelchen) aus ferromagnetischen oder paramagnetischen Materialien bestehen, wie Metallen (z.
B. Eisen, Nickel oder Kobalt), Metallegierungen (z. B. magnetische Legierungen von Aluminium, Nickel, Kobalt und Kupfer), Metalloxiden (z. B. Fe&sub3;O&sub4;, γ-Fe&sub2;O&sub3;, C rO&sub2;, CoO, NiO oder Mn&sub2;O&sub3;, Magnetoplumbite oder feste Lösungen (z. B. feste Lösungen von Magnetit mit Eisen(III)-oxid). Das bevorzugte Material für magnetische Träger ist Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) oder Haematit (&sim;-Fe&sub2;O&sub3;). Die Teilchen können nicht-kolloidal oder kolloidal sein.
Der Ersatz des festen Trägers kann zum Beispiel durch Drängen des Trägers in die Nähe der Elektrode bewirkt werden. Somit kann zum Beispiel eine magnetische Elektrode (z. B. bestehend aus einem Permanentmagneten oder einem Elektromagneten) verwendet werden, oder es kann eine nichtmagnetische Elektrode verwendet werden, in welchem Falle magnetische Träger in Form von Partikeln in die Nähe der Elektrode durch Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes gedrängt und dort gehalten werden.
Die Komponente (b) kann direkt auf dem magnetischen Träger immobilisiert werden, oder sie kann über eine oder mehrere andere "Spacer"-Moleküle immobilisiert werden einschließlich der Partner in spezifischen Bindungs-Wechselwirkungen. Die Immobilisierung der Reagenzien kann im allgemeinen durch übliche Techniken erreicht werden, zum Beispiel durch Adsorption, kovalente Bindung oder Vernetzung oder eine Kombination dieser Techniken, z. B. Adsorption einer chemischen Verbindung mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen gefolgt von einer kovalenten Bindung oder Vernetzung dieses Reagenz. Alternativ dazu können im wesentlichen nicht-chemische Mittel angewandt werden. Geeignete Immobilisierungtechniken sind aus dem Stand der Techniken bekannt.
Zu anderen Verfahren zur künstlichen Erzeugung oder Verstärkung der Störung gehören zum Beispiel die Entfernung von überschüssigem unkomplexiertem markiertem Reagenz, z. B. durch Abzug aus der Vorrichtung oder durch Kupplung an einen geeigneten festen Träger und Entfernung des festen Trägers aus der Vorrichtung.
Alle die oben für homogene Assays (einschließlich direkter, vergleichender, Sandwich- und Ersatztechnik und Verfahren, in denen die Geschwindigkeit der Störung im Gegensatz zur absoluten Störung gemessen wird) beschriebenen Variationen sind gleichermaßen auf heterogene Assays anwendbar.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind im allgemeinen einfacher als die bekannten Verfahren, da sie die Notwendigkeit zur Trennung von unkomplexierten und komplexierten Phasen vor der Assaystufe eliminieren können. Allerdings schließt die Erfindung, wie sie oben ausgeführt wurde, in ihren Schutzumfang auch Verfahren mit ein, bei denen Reagenzien angewandt werden, die auf einer festen Oberfläche immobilisiert sind, wobei es bei diesen Verfahren erforderlich oder wünschenswert sein kann, die feste (komplexierte) und die unkomplexierte Phase vor der Assaystufe zu trennen. Eine derartige Trennung kann die Form einer vollständigen Entfernung der festen Phase aus dem Assaymedium annehmen, oder sie kann zum Beispiel die Form einer Sedimentierung oder Aufkonzentrierung der festen Phase in einem Bereich des Assaymediums annehmen.
Wenn Elektroden-immobilisierte Komponenten angewandt werden, kann die Notwendigkeit zur separaten Zugabe der Komponente zu der elektrochemischen Vorrichtung eliminiert werden. Zusätzlich kann die direkte Wechselwirkung zwischen der Elektrode und den Elektrode-immobilisierten Spezies zu einer Verbesserung bei der Empfindlichkeit der Störungsmessungen führen.
Nach einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung sind daher Verfahren zur Assay eines Liganden in einer Probe, wie vorher definiert, vorgesehen, bei denen eine oder mehrere der Komponenten (b) und falls vorhanden (c) auf der Arbeitselektrode oder einer geeigneten festen Oberfläche immobilisiert ist/sind. Die immobilisierte(n) Komponente(n) kann an der Arbeitsoberfläche der Arbeitselektrode gebunden sein oder an einen Teil der Arbeitselektrode, der nicht die Arbeitsoberfläche darstellt.
Die immobilisierte Komponente ist vorzugsweise jene Komponente, die markiert ist. Die genannte Komponente kann über den Marker immobilisiert sein, solange die Fähigkeit des Markers zur Vermittlung des Elektronentransfers nicht beeinträchtigt ist.
Somit kann zum Beispiel ein Polyviologen-Marker kovalent an eine Metallelektrode gebunden werden. Das große Polyviologen-Molekül ragt aus der Elektrodenoberfläche heraus, und dies erleichtert vermutlich die Wechselwirkung mit dem Enzym. Alternativ dazu kann Chloranil und/oder Fluoranil überall in einer Elektrode, bestehend aus teilchenförmigen Kohlenstoff, verstreut werden. Als weitere Alternative kann ein Co-Faktor eines Apoenzyms auf einer Kohlenstoffelektrode immobilisiert werden, zum Beispiel durch direkte Bindung oder durch Modifizierung des Co-Faktors und/oder der Elektrode. Zum Beispiel wird ein Verfahren zur Kupplung von Flavin-Co-Faktoren an Kohlenstoffelektroden durch eine Reaktion vom Wittig-Typ in Biotechnology and Bioengineering Symposium Nr. 8 (1978) 483- 487 beschrieben.
Nach einem Gegenstand besteht das System aus einer Elektrode, z. B. einer Kohlenstoffelektrode (zum Beispiel einer pyrolytischen Graphitelektrode) oder einer geeigneten festen Oberfläche, die eine immobilisierte Schicht einer Ferrocendicarbonsäure, 1,1'-Dimethylferrocen (DMF) oder Polyvinylferrocen trägt (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 16000), wobei deren Moleküle auch an das Reagenz (b) oder falls vorhanden (c) als Marker davon gekoppelt sind.
Der Kohlenstoffelektrodenkern oder die geeignete feste Oberfläche kann ein ganzes Stück oder eine steife Paste aus Partikeln sein. Normalerweise präsentiert eine beliebige angewandte feste Oberfläche eine poröse Oberfläche für das Ferrocen oder Ferrocenderivat, das auf eine Vielzahl von Wegen daran angeheftet werden kann, zum Beispiel:
(a) für monomeres Ferrocen oder ein monomeres Ferrocen-Derivat durch Ablagerung aus einer Lösung in einer leicht verdampfbaren Flüssigkeit, z. B. einem organischen Lösungsmittel wie Toluol;
(b) für ein polymeres Ferrocen-Derivat, z. B. Polyvinyl-Ferrocen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 16000 (für ein Syntheseverfahren siehe J. Polymer Sci. 1976, 14, 2433), Ablagerung aus einem leicht verdampfbaren organischen Lösungsmittel für das Polymere wie Chloroform;
(c) für ein polymerisierbares Monomeres vom Ferrocen-Typ durch elektrochemisch induzierte Polymerisation in situ, z. B. durch Lösen von Vinylferrocen in einem organischen Elektrolyten, der tertiäres Butylammoniumperchlorat in einer Konzentration von etwa 1 M enthält, und Ablagerung bei einem Potential von -700 mV, um eine Ablagerung von Vinylferrocen-Radikalen als Polymeres in situ hervorzurufen; oder
(d) durch kovalente Modifikation der festen Oberfläche z. B. durch Carbodiimid-Vernetzung des Ferrocens oder Ferrocen-Derivates auf der Oberfläche (z. B. einer Kohlenstoffelektrode).
Alternativ dazu kann die Komponente direkt auf der festen Oberfläche durch ein beliebiges der konventionellen Verfahren, wie sie für die Kupplung von Reagenzien an feste Träger angewandt werden, immobilisiert werden.
Falls gewünscht, kann die Elektroden-immobilisierte Komponente an einen Teil der Elektrode gebunden werden, der nicht die Arbeitsoberfläche ist. Die Elektrode kann unter diesen Umständen so gebaut sein, daß gesichert ist, daß die immobilisierte Komponente ausreichend dicht an der Arbeitsoberfläche bleibt, um die Assay effektiv durchführen zu können. Eine solche Elektrode wird im senkrechten Schnitt in Fig. 2 der dazugehörigen Zeichnungen erläutert. Sie ist besonders geeignet für "Sandwich"-Immunoassays, in denen die immobilisierte Komponente ein nichtmarkierter spezifischer Bindungspartner ist (z. B. ein Einfang-Antikörper). Die Elektrode in Fig. 2 umfaßt eine nach oben gerichtete Graphit-Arbeitsoberfläche 1 am Boden einer Zelle, wobei die Wand von dieser durch einen aus dem Körper der Elektrode vorstehenden Teil 2 aus Polystyrol gebildet wird. Auf dieser Wand ist es, wo ein geeigneter spezifischer Bindungspartner immobilisiert sein kann (z. B. durch Adsorption). Die elektrische Verbindung ist über einen isolierten Draht 3 vorgesehen, der am Boden der Arbeitsoberfläche durch Silber-beladenes Epoxidharz 4 gesichert ist, wobei die Anordnung in Epoxidharz 5 eingebettet und mit Polypropylen 6 versiegelt ist.
Es wird eingeschätzt, daß wenn die Komponente (b) elektroden-immobilisiert ist, es nicht möglich ist, künstlich eine Störung durch Ersatz des erhaltenen Komplexes zu erzeugen oder zu verstärken. Allerdings kann eine Störung noch künstlich erzeugt oder hervorgerufen werden zum Beispiel durch Komplexieren einer beliebigen unkomplexierten markierten Komponente, die in Lösung bleibt, mit einer Spezies, die spezifisch diese Komponente komplexiert, gekoppelt an einen festen Träger, mit nachfolgendem Ersatz des Trägers und der angekoppelten Moleküle. Nach einem weiteren Gegenstand betrifft die vorliegende Erfindung Ausrüstungen von Reagenzien und oder Vorrichtungen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Assays. Geeignete Ausrüstungen können aus einer elektrochemischen Vorrichtung bestehen, die eine Arbeitselektrode, eine Hilfselektrode und gegebenenfalls eine Referenzelektrode enthalten sowie ein wäßriges Assaymedium mit geeigneten vorhandenen Komponenten (entweder in Lösung oder immobilisiert). Andere Komponenten (z. B. weitere Reagenzien usw.) und die zu untersuchende Probe können bequem über eine in der Vorrichtung vorgesehene Eintrittsöffnung eingebracht werden.
Die Vorrichtung kann automatisiert sein, so daß die Komponenten in einer vorher bestimmten Abfolge hinzugegeben werden, und die Inkubationstemperatur kann gesteuert werden. Vorteilhaft kann die Vorrichtung vorgeeicht sein und mit einer Skala versehen, wodurch die Störungen bei den elektrochemischen Eigenschaften der Komponente direkt als Menge des Liganden in der Probe abgelesen werden können.
Beispiele von Liganden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden können, sind in Tabelle 1 unten aufgeführt zusammen mit einem Hinweis auf einen geeigneten spezifischen Bindungspartner für jeden Fall.

Tabelle I

Ligand spezifischer Bindungspartner
Antigen spezifischer Antikörper
Antikörper Antigen
Hormon Hormon-Rezeptor
Hormon-Rezeptor Hormon
Polynucleotidstrang komplementärer Polynucleotidstrang
Avidin Biotin
Biotin Avidin
Protein A Immunglobulin
Immunglobulin Protein A
Enzym Enzym-Co-Faktor (Substrat)
Enzym-Co-Faktor ( Substrat) Enzym
Lectine spezifisches Carbohydrat
spezifisches Carbohydrat von Lectinen Lectine
Das erfindungsgemäße Verfahren hat eine sehr breite Anwendbarkeit, jedoch kann es insbesondere zum Test verwendet werden für: Hormone, einschließlich Peptidhormone (z. B. Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), Human-Choriongonadotropin (HCG), luteinisierendes Hormon (LH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin) oder Nicht-Peptidhormone (z. B. Steroidhormone wie Cortisol, Estradiol, Progesteron und Testosteron und Thyroidhormone wie Thyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteine (z. B. carcinoembryontisches Antigen (CEA) und Alphafetoprotein (AFP)), Arzneimittel (z. B. Digoxin), Zucker, Toxine oder Vitamine.
Die Erfindung wird im einzelnen nachfolgend unter Bezug auf einen Antikörper oder ein Antigen als Liganden beschrieben. Allerdings ist die Erfindung nicht auf Assays von Antikörpern oder Antigenen beschränkt.
Es wird davon ausgegangen, daß der Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet wird, in seinem Umfang einschließt
a) eine beliebige der verschiedenen Klassen oder Unterklassen von Immunglobulin, z. B. IgG, IgM, abgeleitet von einem beliebigen der üblicherweise dazu verwendeten Tiere, z. B. Schaf, Kaninchen, Ziegen oder Mäuse,
b) monoklonale Antikörper
c) intakte Moleküle oder "Fragmente" von Antikörpern, monoklonal oder polyklonal, wobei die Fragmente, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, z. B. Fragmente ohne den Fc- Abschnitt (z. B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) sind oder die sogenannten "Halbmolekül"fragmente, erhalten durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die Schwere Kette-Komponenten in dem intakten Antikörper verbinden.
Das Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von Antikörpern ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und wird hier nicht beschrieben.
Der hier verwendete Begriff "Antigen" wird so verstanden, daß er sowohl permanent antigene Spezies einschließt (zum Beispiel Proteine, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) sowie Haptene, die unter bestimmten Bedingungen antigen gemacht werden können.
Der Einschluß von zum Beispiel einem Ferrocen-Marker in die Molekülstruktur eines Antikörpers kann zum Beispiel erreicht werden durch eine der folgenden Methoden:
(i) Bereitstellung eines Markers mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die zu Bindungswechselwirkungen mit der Molekülstruktur des Antikörpers in der Lage sind;
(ii) Verwendung von Vernetzungsgruppen;
(iii) Verwendung des Avidin-Biotin-Bindungssystems (d. h. Avidin-markierter Antikörper, der mit Biotin-markierten Ferrocenmolekülen bindet, oder Biotin-markierter Antikörper, der mit Avidin-markiertem Ferrocen bindet).
Ähnliche Verfahren können gewünschtenfalls für die Markierung eines Antigenmoleküls angewandt werden. Geeignete Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden im Detail hier nicht erörtert. So ist zum Beispiel der Einschluß von Ferrocen in bestimmte Steroide beschrieben in Journal of Organometallic Chemistry, 160 (1978) S. 223-230.
Verfahren zur Reinigung des markierten Antikörpers oder Antigens sind ebenfalls bekannt, und dazu gehören zum Beispiel die Dialyse, die Ultrazentrifugierung nach Dichtegradienten, die Gelfiltration und die Ionenaustausch-Chromatografie.
Das Anfügen des Markers an den Antikörper oder das Antigen kann über einen beliebigen Teil der Molekülstruktur des Antikörpers oder Antigens erfolgen, solange die immunologische Aktivität dessen beibehalten wird.
Die Immobilisierung eines Antikörper- oder Antigenmoleküls auf der Elektrode oder einer anderen geeigneten festen Oberfläche kann nach verschiedenen Verfahren bewirkt werden. Die Anfügung des Antikörpers oder Antigens an die Elektrode oder die feste Oberfläche kann über einen beliebigen Teil der Molekülstruktur bewirkt werden, solange die spezifische immunologische Aktivität an der Antikörper- oder Antigen-Bindungsstelle beibehalten wird.
Somit kann zum Beispiel die Elektrodenimmobilisierung von unmarkiertem Antikörper- oder Antigenreagenz erreicht werden durch Bindungswechselwirkungen zwischen funktionellen Gruppen des Antikörper- oder Antigenmoleküls und der Elektrode oder durch Vernetzung oder Absorption auf der Oberfläche der Elektrode. Die Bindung von Reagenzien an die Elektrode kann durch Verfahren bewirkt werden, die bekannten Verfahren für die Bindung derartiger Reagenzien an feste Träger (z. B. Teilchen und Kügelchen) analog sind, zum Beispiel durch solche, die in der EP-A-0105714 beschrieben sind.
Die Elektrodenimmobilisierung des markierten Reagenz kann zum Beispiel erreicht werden durch eine der folgenden Methoden:
(i) Einschluß eines Markermoleküls in die molekulare Struktur von freiem Reagenz und nachfolgende Immobilisierung des Reagenz auf einer Elektrode an einer Stelle, die von dem Marker entfernt ist, in gleicher Weise wie oben für unmodifizierte Reagenzien beschrieben;
(ii) Einschluß eines Markermoleküls in die molekulare Struktur eines vorimmobilisierten Reagenz;
(iii) Einschluß eines bifunktionellen Markers in die Molekülstruktur von freiem Antikörper oder Antigen, so daß eine Funktion in der Lage ist mit der Elektrode wechselzuwirken; oder (iv) Einschluß eines bifunktionellen Markers auf der Elektrode, so daß eine Funktion in der Lage ist mit der molekularen Struktur des freien Antikörpers oder Antigens wechselzuwirken.
Der bevorzugte Marker zur Verwendung mit einer Enzym/Substrat-Elektronenquelle oder Elektronenakzeptor ist Ferrocenmonocarbonsäure.
Wenn Ascorbat als Elektronenquelle verwendet wird und ein Catechol oder Aminophenol als Marker, wird die Elektrodenimmobilisierung des markierten Reagenz vorzugsweise durch Adsorption oder chemische Reaktion über den Marker auf einer entsprechend modifizierten Kohlenstoffelektrode bewirkt. Eine Diskussion von Verfahren zur Anfügung derartiger Spezies an Kohlenstoffelektroden ist in Analytical Chemistry, Bd. 55, 9, (1983) S. 1576 beschrieben.
Allein zur Erläuterung als Beispiel schließt die Erfindung unter anderem die folgenden Ausführungsformen ein:
= Antikörper = Antigen M = Vermittlermarker E = Elektronenquelle oder -akzeptor (z. B. Enzym + Substrat) = Elektrodenoberfläche
O = Festphase (Nicht-Elektrode); ? zeigt den zu testenden Liganden an.

1. Direkte Antikörper-Assay

a) löslich Zugabe
b) immobilisiert auf der Elektrode Zugabe
In beiden dieser Assays verringert die Bildung des Immunkomplexes die Wirksamkeit des Vermittlers, wobei die Veränderung beim Signal ein Maß für die Antikörperkonzentration ist.

2. Direkte Antigen-Assay

a) löslich Zugabe
Die Immunreaktion ändert die Fähigkeit des Vermittlers/- Antikörperkomplexes, Elektronen zur oder von der Elektrode zu transportieren. Daher ändert sich das Signal.
b) immobilisiert Zugabe

3. Vergleichs-Antigen-Assay

a) löslich Zugabe
Der Vergleich zwischen dem Vermittler-markierten Antigen und dem zu testenden Antigen für die Verfügbarkeit von Antikörper führt dazu, daß ein Teil des Vermittlers gestört ist, das Signal bezieht sich auf die Konzentration des zu testenden Antigens.
b) immobilisiert
Das immobilisierte System kann zwei Formen annehmen:
(i) auf der Elektrodenoberfläche Zugabe
Nach Trennung hängt das gemessene Signal von dem Verhältnis des zu testenden Antigens zum Vermittler-markierten Antigen ab. Die Elektrode liefert Mittel zur leichten Trennung.
(ii) Auf der Festphase (z. B. magnetische Teilchen) Zugabe abtrennen ASSAY
Die Sedimentierung des Immunkomplexes reduziert die Menge des Vermittlers in Lösung, folglich stört sie das Signal. 4. Ersatz-Antigen-Assay Zugabe
Der Ersatz des Vermittler/Antigen-Komplexes vom Antikörper durch das zu testende Antigen führt zu einer Erhöhung des Signals.

5. Sandwich-Antigen-Assay

a) Auf der Elektrode Zugabe abtrennen
Die Bindung des Vermittler-markierten Antikörpers an die Elektrode über das Antigen ergibt ein Maß für die Antigenkonzentration.
b) auf der Festphase Zugabe abtrennen und überstehendes zurückhalten ASSAY
Dies geht nur, wenn der freie Vermittler getestet wird, ergibt jedoch noch ein Maß der Antigenkonzentration.

6. Vergleichs-Sandwich-Antikörper-Assay

a) auf der Elektrode Zugabe abtrennen
Der Vergleich zwischen Vermittler-markiertem Antikörper und den zu testenden Antikörper führt zu einem Signal, das sich auf die Konzentration des zu testenden Antikörpers bezieht.
b) auf der Festphase Zugabe abtrennen und überstehendes zurückhalten ASSAY
Der Wirkungsmechanismus ist der gleiche wie beim Elektroden-immobilisierten System, jedoch wird der freie Vermittler dazu verwendet, ein Signal zu geben.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung vollständiger.

Beispiel 1

Bewertung eines Konjugates von Thyroxin (T4) und Ferrocenmonocarbonsäure (FMCA) (T4-FMCA) als Vermittler für Glucoseoxidase

Herstellung der Ausgangsmaterialien

(i) Ferrocen-modifiziertes Thyroxin(T4)-hormon (Hapten)

Zu gerührtem gekühltem (-10ºC) Dimethylformamid (3 ml) wurde Ferrocen-monocarbonsäure (FMCA) (1 mMol) zugegeben und anschließend Triethylamin (1,0 mMol). Das Gemisch wurde anschließend weiterhin auf -15ºC gekühlt und für 30 Minuten gerührt. Danach ließ man es sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührte eine weitere Stunde. Das erhaltene Carboxycarbonsäureanhydrid von Ferrocen wurde tropfenweise zu einer Lösung von T4 in Natriumhydroxid/Ethanol gegeben und für 24 Stunden gerührt, wonach die Probe abfiltriert und anschließend durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert wurde. Der erhaltene Niederschlag wurde in Tetrachlorkohlenstoff gewaschen, anschließend in Ethylacetat mehrere Male und das unlösliche Ferrocen-monocarbonsäure-T4-Konjugat (T4-FMCA) anschließend aus der Ethylacetatlösung abfiltriert.

(ii) Reinigung von Ferrocen-modifiziertem Thyroxin-Konjugat (T4-FMCA)

Das T4-FMCA-Konjugat wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatografie unter Verwendung einer C18-Umkehrphasensäule gereinigt. Nach der Reinigung wurden die T4- und die Ferrocen- Konzentrationen in dem Konjugat durch Radioimmunoassay bzw. Elektrochemie gemessen.

(iii) Merkmale des T4-FMCA-Konjugates

Die Inkubierung von T4-FMCA mit einem Überschuß von Anti- T4-Antikörper zeigte, daß 73,4% des T4-FMCA an den Antikörper gebunden war.
Die Elektrochemie des Konjugates wurde ebenfalls mit der von T4 und FMCA verglichen. Das Konjugat zeigte zwei Peaks auf der Vorwärtswelle des cyclischen Voltammogramms an einer pyrolytischen Graphitelektrode (spannungsgeregelte Geschwindigkeit = 20 mVs&supmin;¹), wobei der erste bei + 310 mV gegen eine Standard-Kalomelelektrode (S.C.E.) war (der Ferrocen-Peak), der zweite bei + 410 mV gegen S.C.E. (T4), siehe Fig. 3. Bei der Rückwelle wurde nur 1 Peak bei einem Potential von + 255 mV gegen S.C.E. beobachtet. Die cyclische Voltammetrie bei pyrolytischen Graphitelektroden (spannungsgeregelte Geschwindigkeit = 5 mVs&supmin;¹) der unmodifizierten Komponenten des Konjugates zeigte, daß FMCA [0,2 mM FMCA in Tris (50 mM; pH 7,4)) Peaks bei + 320 mV und + 260 mV gegen S.C.E. für die Vorwärtsbzw. Rückwärtswellen hatte (Fig. 4 a), während T4 einen einzigen Peak bei + 420 mV gegen S.C.E. auf der Vorwärtswelle hatte (Fig. 4 b).

(iv) Anti-T4-Antikörper

Der Anti-T4-Antikörper war ein übliches polyklonales Antiserum, erhalten durch Immunisierung des Schafes mit T4, konjugiert an Protein mit hohem Molekulargewicht [Schlüsselloch-Schnecken-Haemocyanin (keyhole limpet haemocyanin)).

(v) Standardlösungen von T4

T4 (Natriumsalz) wurde von Sigma London Chemical Company, England, erhalten. Standardlösungen wurden hergestellt durch Auflösung des T4 in Natriumhydroxid (0,1 M) und anschließender Verdünnung mit Tris-HCl-Puffer (50 mM; pH 7,4) auf die gewünschte Konzentration.

(vi) Zur Elektrochemie von T4/FMCA verwendete Vorrichtung

Die cyclische Voltammetrie wurde durchgeführt unter Verwendung einer elektrochemischen 3-Elektroden-Zelle mit einer pyrolytischen Graphit-Arbeitselektrode, wie in Fig. 1(a) gezeigt.
Bewertung der Leistungsfähigkeit des T4-FMCA-Konjugates als Elektronentransfervermittler für Glucoseoxydase 40 ul einer Lösung von T4-FMCA (3 · 10&supmin;&sup7; molar, in Natriumpropionat-Puffer, 200 mM/l, pH 6,0) wurden in die elektrochemische Zelle gegeben zusammen mit 40 ul Glucose (eine molare Lösung, enthaltend 100 mM/l Magnesiumchlorid) und 320 ul Tris/HCl-Puffer (10 mM/l, pH 7,4). Nach Messung des elektrochemischen Stromes wurde das obige Experiment wiederholt mit 20 ul einer Lösung von Glucose-oxydase (1 mg Enzym pro ml in Wasser), die hinzugegeben wurde, jedoch nur 300 ul Puffer. Der elektrochemische Strom wurde wiederum gemessen.
In einer dritten Serien von Experimenten wurden 20 ul des Anti-T4-Antiserums zu 40 ul des T4-FMCA-Konjugates und 280 ul des Puffers gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten wurden 20 ul Glucoseoxydase-Lösung und 40 ul Glucoselösung hinzugegeben und der elektrochemische Strom wieder gemessen.
In einer vierten Serie von Experimenten wurden 20 ul einer Lösung von T4 (0,5 mM pro Liter in Tris/HCl-Puffer, 10 mM/l, pH 7,5), 20 ul des Anti-T4-Antiserums, 40 ul des T4- FMCA-Konjugates und 260 ul Tris/HCl-Puffer vermischt und für 20 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 20 ul der Lösung von Glucoseoxydase und 40 ul der Glucoselösung, wurde der elektrochemische Strom gemessen.
In allen Fällen wurde der elektrochemische Strom bei einer Temperatur von 37 + 0,5ºC und bei einer spannungsgeregelten Geschwindigkeit von 5 mV/s gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, daß T4-FMCA als ein Elektronentransfervermittler für Glucoseoxydase wirkt, wobei dessen Fähigkeit zur Vermittlung gestört wird nach Bindung mit Anti- T4-Antikörper.

Tabelle 1

Experiment elektrochemischer Strom (uA)
T4-FMCA + Glucose + Puffer 0,58
T4-FMCA + Glucose + Puffer + Glucoseoxydase 1,58 ± 0,04
T4-FMCA + Glucose + Puffer + Glucoseoxydase + Anti-T4-Antikörper 1,35 ± 0,01
T4-FMCA + Glucose + Puffer + Glucoseoxydase + Anti-T4-Antikörper + T4-Standard 1,53 ± 0,05

Beispiel 2

Ferrocen-modifizierter IgG-Antikörper

Zu einer gerührten gekühlten (-8ºC) Lösung von Ferrocen-monocarbonsäure (1 mMol) in Tetrahydrofuran (getrocknet) wurde Isobutylchloroformiat (1 mMol) und Triethylamin (1 mMol) unter Rühren hinzugegeben. Das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt. Anschließend ließ man es sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührte eine weitere Stunde. Das erhaltene Carboxycarbonsäureanhydrid von Ferrocen wurde tropfenweise zu einer gekühlten (2ºC) Lösung von IgG (500 mg) in 50 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 4ºC für 24 Stunden gerührt und anschließend erschöpfend gegen Boratpuffer pH 8,5 dialysiert. Es wurde herumgewirbelt und Gel-filtriert über S-200-Gel. Der Eisengehalt wurde durch Atomabsorption bestimmt.

Claims

1. Elektrochemisches Verfahren zur Assay eines Liganden in einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode, wobei das Verfahren umfaßt das Kontaktieren der Probe mit Komponenten, die umfassen:

(a) eine Elektronenquelle oder einen Elektronenakzeptor,

(b) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und

(c) gewünschtenfalls wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter den Ligandenanalogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden,

wobei die Komponente (b) oder wenigstens eine der Komponenten (b) und (c) mit einem Elektronentransfervermittler markiert ist, der den Transfer der Elektronen von der Elektronenquelle zur Arbeitselektrode oder von der Arbeitselektrode zum Elektronenakzeptor unterstützt;

und Bestimmung ob und gewünschtenfalls bis zu welchem Grade der Elektronentransfer gestört ist durch (i) Komplexbildung oder (ii) einen gesteuerten äußeren Einfluß, was zu einer Störung- des Elektronentransfers als Funktion des gebildeten Komplexes zwischen dem Liganden und wenigstens einem spezifischem Bindungspartner führt;

mit der Maßgabe, daß die Komponente (a) ein nicht-enzymatisches Reagenz ist, worin (I) keine Komponente (c) angewandt wird oder ein Vermittler-markiertes Ligandenanaloges als Komponente (c) angewandt wird, in jedem Falle ohne Störung des Elektronentransfers mittels eines gesteuerten äußeren Einflusses, oder worin (II) die Komponente (c) ein Vermittler-markierter spezifischer Bindungspartner ist und ein gesteuerter äußerer Einfluß angewandt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Komponente (a) ein Oxidoreduktase-Enzym im Zusammenwirken mit einem Substrat dafür ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Komponente (a) eine Nicht-Enzym-Elektronenquelle ist, ausgewählt unter Ascorbat und NADH.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das die Stufe des Ersetzens des gebildeten Vermittler-markierten Komplexes in Bezug auf die ungebundene Vermittler-markierte Komponente umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, das eine heterogene Verdrängungsassay darstellt, worin die Probe kontaktiert wird mit (i) einem nicht-markierten spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der an einen festen Träger immobilisiert ist, ausgewählt unter der Arbeitselektrode oder einer Nicht-Elektroden- Festphase, und (ii) einem Elektronentransfervermittler-markierten Ligandenanalogen, gefolgt von dem Ersetzen des festen Trägers in Bezug auf die ungebundene markierte Komponente.

6. Verfahren nach Anspruch 4, das eine Sandwich-Verdrängungsassay ist, worin die Probe kontaktiert wird mit (i) einem nicht-markierten spezifischen Bindungspartner für den Liganden, (ii) einem nicht-markierten Ligandenanalogen, immobilisiert an einen festen Träger, ausgewählt unter der Arbeitselektrode oder einer Nicht-Elektroden-Festphase und (iii) einem Elektronentransfervermittler-markierten Ligandenanalogen, gefolgt von einem Ersatz des festen Trägers in Bezug auf die ungebundene markierte Komponente.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, worin der feste Träger in Form von Festphasenpartikeln oder -kügelchen vorliegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Ligand, die Komponente (b) und falls vorhanden die Komponente (c) unter Antigenen und Antikörpern ausgewählt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Elektronentransfervermittler Ferrocen oder ein Derivat davon umfaßt.

10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Störung beim Transfer der Elektronen bestimmt wird aus einer Störung beim Spitzenstrom, der unter Anwendung eines vorgewählten Potentials über die Komponenten beobachtet wird.

11. Ausrüstung zur Durchführung eines Assayverfahrens nach Anspruch 1, umfassend:

(i) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden oder einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden und wenigstens ein weiteres Reagenz, ausgewählt unter Ligandenanalogen und spezifischen Bindungspartnern für den Liganden, der Komponente (i) oder wenigstens einer der Komponenten (i), die mit einem Elektronentransfervermittler markiert sind; und

(ii) eine Nicht-Enzym-Elektronenquelle, die zur Abgabe von Elektronen fähig ist an den Elektronentransfervermittler oder einen Nicht-Enzym Elektronenakzeptor, der zur Aufnahme von Elektronen von dem Elektronentransfervermittler fähig ist.

12. Ausrüstung zur Durchführung eines Assayverfahrens nach Anspruch 5, umfassen:

(i) einen nicht-markierten spezifischen Bindungspartner für den Liganden, gebunden an einen festen Träger, der ausgewählt ist unter einer Arbeitselektrode oder einer Nicht-Elektroden- Festphase,

(ii) ein Elektronentransfervermittler-markiertes Ligandenanaloges und

(iii) ein Oxidoreduktase-Enzym, das in Gegenwart eines Substrates dafür geeignet ist als Komponente (a), oder eine Nicht-Enzym-Elektronenquelle oder ein Elektronenakzeptor, geeignet für diese Komponente.

13. Ausrüstung zur Durchführung eines Assayverfahrens nach Anspruch 6, umfassend:

(i) einen nicht-markierten spezifischen Bindungspartner für den Liganden,

(ii) ein nicht-markiertes Ligandenanaloges, gebunden an einen festen Träger, der ausgewählt ist unter einer Arbeitselektrode oder einer Nicht-Elektroden-Festphase,

(iii) ein Elektronentransfervermittler-markiertes Ligandenanaloges und

(iv) ein Oxidoreduktase-Enzym, das in Gegenwart des Substrates dafür als Komponente (a) geeignet ist, oder eine Nicht-Enzym Elektronenquelle oder einen Elektronenakzeptor, geeignet für diese Komponente.

14. Elektrochemisches Verfahren zur Assay eines Liganden in einer Probe unter Verwendung einer elektrochemischen Vorrichtung mit einer Arbeitselektrode und einer Hilfselektrode, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(i) Kontaktieren der Probe mit Komponenten, die umfassen

(a) eine Elektronenquelle oder einen Elektronenakzeptor,

(b) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der an einen festen Träger immobilisiert ist, ausgewählt unter der Arbeitselektrode und Festphasenpartikeln oder -kügelchen,

(c) einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, der mit einem Elektronentransfervermittler markiert ist, der zur Unterstützung des Elektronentransfers von der Elektronenquelle zur Arbeitselektrode oder von der Arbeitselektrode zum Elektronenakzeptor in der Lage ist;

(ii) Ersatz des festen Trägers in Bezug auf die ungebundene Vermittler-markierte Komponente (c); und

(iii) Bestimmung, ob eine Störung vorliegt und gewünschtenfalls des Umfanges der Störung für den Transfer der Elektronen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Komponente (a) ein Oxidoreduktase-Enzym im Zusammenwirken mit einem Substrat dafür ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Komponente (a) eine Nicht-Enzymelektronenquelle ist, ausgewählt unter Ascorbat und NADH.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin der Ligand und die spezifischen Bindungspartner ausgewählt werden unter Antigenen und Antikörpern.

18. Ausrüstung zur Durchführung eines Assayverfahrens nach Anspruch 14, umfassend die Komponenten (b) und (c) und ein Oxidoreduktase-Enzym, das in Gegenwart eines Substrates dafür vorliegt, das als Komponente (a) geeignet ist, oder einer Nicht-Enzymelektronenquelle oder eines Elektronenakzeptors, geeignet für diese Komponente.