DE3546312A1 - METHOD FOR IDENTIFYING NUCLEIC ACIDS - Google Patents
METHOD FOR IDENTIFYING NUCLEIC ACIDSInfo
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Description
Verfahren zur Identifizierung von NucleinsäurenMethods for identifying nucleic acids
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren mit Hilfe in Lösung erfolgender Hybridisierung. Kennzeichnend für das erfindungsgemässe Verfahren ist, dass bei der Hybridisierungsreaktion mit wenigstens zwei Sonden gearbeitet wird. Die Detektorsonde ist mit einem Indikator markiert, während an die Einfangsonde eine Komponente gebunden ist, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag, wobei das bei der Hybridisierung gebildete Einfangsonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid von den übrigen in der Hybridisierungsmischung vorliegenden Komponenten mit Hilfe des anderen Partners des Affinitätspaares getrennt werden kann. The invention relates to a method for the identification of nucleic acids with the aid of those carried out in solution Hybridization. Characteristic for the inventive The method is that in the hybridization reaction with at least two probes are worked. The detector probe is marked with an indicator while attached to the capture probe a component is bound that is able to function as a partner in an affinity pair, this being the case during hybridization capture probe formed: sample: detector probe hybrid of the rest present in the hybridization mixture Components can be separated with the help of the other partner of the affinity pair.
Zur Identifizierung von Nucleinsäuren hat man sich verschiedenartiger Hybridisierungsverfahren bedient. Als Beispiele seien die direkten Hybridisierungsverfahren und die Sandwich-Hybridisierungsverfahren genannt. Bei den direkten Hybridisierungsverfahren liegt die Nucleinsäureprobe entweder in Lösung oder an einen festen Trägerstoff gebunden vor. Die zu identifizierende Nucleinsäure wird unter Verwendung einer einzigen markierten Sonde nachgewiesen. Bei den Sandwich-Hybridisierungsverfahren (US 4486539) arbeitet man mit zwei verschiedenen Sonden, mit denen die zu identifizierende Nucleinsäure in der Probelösung nachgewiesen wird. Die Detektorsonde ist dabei mit einem Indikatorstoff markiert, während die Trennsonde an einen festen Träger gebunden ist.The identification of nucleic acids has become more diverse Hybridization process served. Examples are the direct hybridization processes and the sandwich hybridization processes called. In the direct hybridization method, the nucleic acid sample is either in solution or bound to a solid carrier. The nucleic acid to be identified is using detected with a single labeled probe. In the sandwich hybridization process (US 4486539) works one with two different probes with which the nucleic acid to be identified is detected in the sample solution will. The detector probe is marked with an indicator substance, while the separation probe is attached to a solid support is bound.
Erfindungsgemäss wurde ein neues Hybridisierungsverfahren entwickelt, bei dem man mit zwei verschiedenen Sonden arbeitet, wobei beide Sonden in der gleichen Lösungsphase enthalten sind. Da die an der Hybridisierung teilnehmende Probenucleinsäure und beide Sonden sich in der gleichen Lösungsphase befinden, erfolgt die Hybridisierungsreaktion beträchtlich schneller als bei jener Sandwich-Hybridisierung, beiAccording to the invention, a new hybridization process developed, in which one works with two different probes, both probes contain in the same solution phase are. Since the sample nucleic acid participating in the hybridization and both probes are in the same solution phase are located, the hybridization reaction takes place considerably faster than in the case of that sandwich hybridization
der die Trennsonde an einen festen Träger gebunden ist» v Beim erfindungsgemässen Verfahren ist eine einstündigeof the separation probe is bound to a solid support "v According to the inventive method is a one-hour
Inkubationszeit ausreichend. Bei der einstufigen Sandwich-Hybridisierung (US 4486539) sind für eine ausreichende Hybridisierung 12 Stunden erforderlich. Bei der zweistufigen Sandwich-Hybridisierung (Dun und Hasseil, Cell. Vol. 12 S. 23-36, 1977) benötigt man eine Hybridisierungszeit von wenigstens 24 Stunden.Sufficient incubation time. In the one-step sandwich hybridization (US 4486539) 12 hours are required for sufficient hybridization. With the two-stage Sandwich hybridization (Dun and Hasseil, Cell. Vol. 12 pp. 23-36, 1977) requires a hybridization time of at least 24 hours.
Beim erfindungsgemässen Verfahren arbeitet man vorzugsweise mit wenigstens zwei Sonden. Diese Sonden sind zur zu identifizierenden Nuclein.säure ausreichend homologe Nucleinsäuren fragmente. Es ist von Vorteil, wenngleich nicht erforderlich, wenn die Sonden homolog zu relativ nahe beieinander liegenden Stellen in der zu identifizierenden Nucleinsäure sind. Die Sonden dürfen nicht homolog zueinander sein.The process according to the invention is preferably used with at least two probes. These probes are sufficiently homologous to the nucleic acid to be identified fragments. It is advantageous, although not necessary, for the probes to be homologous too relatively close to one another are located in the nucleic acid to be identified. The probes must not be homologous to one another.
Die Sonden können synthetisch, halbsynthetisch, mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechnik oder aus direkt aus der Natur isolierten Nucleinsäuren gewonnen werden. Derartige Sonden sind auch im Handel erhältlich. Die Sonde kann an einen \, geeigneten Vektor gebunden sein; sie kann Vektorteile enthalten oder völlig frei von Vektorteilen sein.The probes can be synthetic, semi-synthetic, using recombinant DNA technology, or made directly from nature isolated nucleic acids are obtained. Such probes are also commercially available. The probe can be attached to a \, appropriate vector bound; it can contain vector parts or be completely free of vector parts.
Die Detektorsonde ist durch passende Indikatoren markiert. Als Indikatoren eignen sich verschiedenartige radioaktive Isotope oder radioaktiv markierte Verbindungen. Der Indikator kann auch fluoreszierend, lumineszierend, lichtemittierend oder enzymatisch bzw. immunologisch nachweisbar sein usw. Als Beispiele seien die auf der Affinität von Biotin und Avidin oder Streptavidin basierenden Indikatorstoffe, die Lanthanidchelate, die Ferritin- und Hämv.erbindungen und die immunologisch nachweisbaren Haptene, wie die Acetoxyacetylfluorenderivate (WO 8302286), genannt. Auch eine Identifizierung über Proteine ist möglich. Das erfindungsgemässe Verfahren ist unabhängig vom verwendeten Indikator. Im Zusammenhang mit dem Verfahren können alle bekannten und zukünftig zu entwickelnden, für die Nucleinsäurehybridisierung geeigneten Indikatorstoffe frei eingesetzt werden.The detector probe is marked with suitable indicators. Various types of radioactive are suitable as indicators Isotopes or radiolabelled compounds. The indicator can also be fluorescent, luminescent, light-emitting or be enzymatically or immunologically detectable, etc. Examples are those on the affinity of biotin and avidin or streptavidin based indicator substances, the lanthanide chelates, the ferritin and heme compounds and the immunologically detectable haptens, such as the acetoxyacetyl fluorene derivatives (WO 8302286), called. Identification via proteins is also possible. The inventive The method is independent of the indicator used. In connection with the method, all known and indicator substances suitable for nucleic acid hybridization to be developed in the future can be freely used.
An die als Einfangsonde dienende Sonde ist eine Komponente gebunden, die als Partner in einem Affinitätspaar zu fungieren vermag. Derartige Affinitätspaare sind beispielsweise Biotin - Avidin, Biotin - Streptavidin, Schwermetallderivat - Thiogruppe und die verschiedenen Homopolynucleotide, wie Poly dG - Poly dC, Poly dA - Poly dT oder Poly dA Poly U. Es können jedoch auch andere Affinitätspaare eingesetzt werden, sofern ihre Komponenten nur eine genügend starke Affinität zueinander haben. Unter den bei immunologischen Verfahren eingesetzten Liganden und Konjugaten finden sich geeignete Affinitätspaare.A component that acts as a partner in an affinity pair is bound to the probe serving as a capture probe able. Such affinity pairs are, for example Biotin - avidin, biotin - streptavidin, heavy metal derivative - thio group and the various homopolynucleotides, such as Poly dG - Poly dC, Poly dA - Poly dT or Poly dA Poly U. However, other affinity pairs can also be used as long as their components only have a sufficiently strong affinity to one another. Among the immunological The ligands and conjugates used in the method are suitable affinity pairs.
Vor der Hybridisierungsreaktion wird die Probe so behandelt, dass die Nucleinsäuren in einsträngiger Form in die
Hybridisierungslösung freigesetzt werden. Die Hybridisierung erfolgt in einer Hybridisierungsmischung, in der die Nucleinsäuren,
die markierte Detektorsonde und die Einfangsonde nötigenfalls in einsträngige Form überführt sind. Als Hybridisierungslösung
können verschiedenartige für diesen Zweck geeignete Puffer verwendet werden. Die Hybridisierung erfolgt
im Temperaturbereich 0 - 800C, jedoch wird vorzugsweise
mit einer Temperatur von 65°C gearbeitet. Enthält die
H-ybridisierungslösung Formamid (40 - 55 %), so kann eine Temperatur von 37 C ange'
zeit genügt eine Stunde.Before the hybridization reaction, the sample is treated in such a way that the nucleic acids are released into the hybridization solution in single-stranded form. The hybridization takes place in a hybridization mixture in which the nucleic acids, the labeled detector probe and the capture probe are converted into single-stranded form, if necessary. Various buffers suitable for this purpose can be used as the hybridization solution. The hybridization is carried out in the temperature range 0 - 80 0C, but is preferably carried out at a temperature of 65 ° C. If the hybridization solution contains formamide (40 - 55%), a temperature of 37 C can be
one hour is enough.
Temperatur von 370C angewendet werden. Als Hybridisierungs-Temperature of 37 0 C can be applied. As a hybridization
Nach erfolgter Hybridisierung wird die Lösung nötigenfalls so verdünnt, dass sich für das Affinitätspaar günstige Verhältnisse ergeben. Danach bringt man das Gemisch mit dem anderen Partner des Affinitätspaares in Kontakt, der an einen festen Träger gebunden ist, z.B. an eine Affinitätschromatographie-Säule, ein Filter oder eine Plastikbzw. Glasfläche, und isoliert das Einfangsonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid. After hybridization has taken place, the solution is diluted if necessary in such a way that it is favorable for the affinity pair Relationships result. Then the mixture is brought into contact with the other partner of the affinity pair, the is bound to a solid support, e.g. to an affinity chromatography column, a filter or a plastic or Glass surface, and isolates the capture probe: sample: detector probe hybrid.
Als Affinitätssäulen-Trägermaterial kann zum Beispiel Cellulose, Latex, Polyacrylamid, Dextran oder Agarose dienen. Diese Materialien können auch als Suspensionen im Reagenz- *'For example, cellulose, Latex, polyacrylamide, dextran or agarose are used. These materials can also be used as suspensions in the reagent * '
ι glas eingesetzt werden. Vorteilhaft ist auch,ι glass can be used. It is also advantageous
mit Reagenzgläsern zu arbeiten, an deren Innenfläche die eine Komponente des Affinitätspaares angelagert ist. Voraussetzung bei der Wahl des Materials ist, dass daran eine Komponente gebunden werden kann, welche Affinität zu der an die Einfangsonde gebundenen Komponenten hat.to work with test tubes, on the inner surface of which one component of the affinity pair is attached. pre-condition when choosing the material is that a component can be bound to it, which has an affinity for the has components bound to the capture probe.
Falls die Probe zu identifizierende Nucleinsäure enthält, entsteht bei der Hybridisierung ein Einfangsonde:Probe:Detektorsonde-Hybrid. Dieses Hybrid haftet sich bei der Fraktionierung an den Träger. Die Markierung der sich an den Träger gehafteten Fraktion kann nach herkömmlichen Verfahren direkt am Träger oder nach vorheriger Elution am Eluat gemessen werden.If the sample contains nucleic acid to be identified, a capture probe is created during hybridization: sample: detector probe hybrid. This hybrid adheres to the carrier during fractionation. The marking of the The fraction adhering to the carrier can be applied directly to the carrier by conventional methods or after prior elution on the eluate be measured.
Bei der Fraktionierung können anstelle von Affinitätschromatographie auch andere Systeme, beispielsweise Phasenextraktion oder Magnetfeld, zur Anwendung gebracht werden.In the case of fractionation, affinity chromatography can be used instead other systems, for example phase extraction or magnetic fields, can also be used.
In den folgenden Anwendungsbeispielen wird das erfindungsgemässe Verfahren im einzelnen beschrieben. Das erfindungsgemässe Verfahren ist nicht an die in den Beispielen verwendeten Nucleinsäurefragmente gebunden. Dem Fachmann ist bekannt, wie sich entsprechende Nucleinsäurefragmente gewinnen lassen.In the following application examples, the inventive Process described in detail. The inventive The method is not bound to the nucleic acid fragments used in the examples. It is known to the person skilled in the art how corresponding nucleic acid fragments can be obtained.
125 Als Detektorsonde dient der mit I markierte rekombinante Phage mKTH 1206, ein BgI II-Fragment des Adenovirus (Typ 2) aus der Adenovirus-Genkarten-Position 42 - 45,3 %. Der besagte rekombinante Phage ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter Nr. 2827 deponiert. Seine spezifische Aktivität beträgt 7 χ 10 cpm/pg DNA. Eine nähere Beschreibung dieser Sonde findet sich in der Schrift Ranki et al. 1983, Gene 21, 77 - 85.125 The I-marked recombinant phage mKTH 1206, a BgI II fragment of the adenovirus (type 2) from the adenovirus gene map position 42 - 45.3%. The said recombinant phage is in the German collection of microorganisms deposited under No. 2827. Its specific activity is 7 × 10 cpm / pg DNA. A closer one A description of this probe can be found in the publication Ranki et al. 1983, Gene 21, 77-85.
Als Einfangsonde dient das rekombinante Plasmid pKTH 1202, das in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unterThe recombinant plasmid pKTH 1202, which is available in the German Collection of Microorganisms under
der Nummer DSM 2824 deponiert ist und aus einem BamHI D-Fragment des Adenovirus (Kartenposition 29 - 42 %), cloniert auf das Plasmid pBR322, besteht. Das rekombinante Plasraid pkTH 1202 (DSM 2824) wurde mit Restriktionsenzym Hae HI gespaltet, und an die 3' Enden der Fragmente wurde mit Hilfe von Terminaltransferase ein Poly-A-Schwanz gefügt. Diethe number DSM 2824 is deposited and from a BamHI D fragment of the adenovirus (map position 29-42%), cloned on the plasmid pBR322. The recombinant Plasraid pkTH 1202 (DSM 2824) was digested with restriction enzyme Hae HI, and the 3 'ends of the fragments were cleaved with the aid of a poly-A tail was added by terminal transferase. the
3
Schwanzlänge wurde durch H-A-Inkorporation gemessen. Die Länge betrug im Durchschnitt etwa 70 Α-Reste. Vor Gebrauch
wurde die Einfangsonde durch Kochen denaturiert. Als Probe dienten Adenovirus-infizierte A-549-Zellen. Die infizierten
Zellen wurden 21 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden gesammeil;
und mit einprozentiger Natriumdodezylsulfatlösung aufgebrochen. Die Lösung enthielt ca. 10 Zellen/ml. Die
Viskosität wurde durch Ultraschallbehandlung gesenkt. Als Kontrolle dienten nichtinfizierte A-549-Zellen, die identisch
behandelt wurden. Vor der Hybridisierung wurde die Probe 5 min in 0,02 M NaOH gekocht, auf O0C abgekühlt und
mit Essigsäure neutralisiert.3
Tail length was measured by HA incorporation. The length averaged about 70 Α residues. The capture probe was denatured by boiling before use. Adenovirus-infected A-549 cells were used as samples. The infected cells were incubated for 21 hours. The cells were collected; and broken up with one percent sodium dodecyl sulfate solution. The solution contained approx. 10 cells / ml. The viscosity was lowered by ultrasonic treatment. Uninfected A-549 cells, which were treated identically, served as controls. Before the hybridization, the sample was boiled for 5 min in 0.02 M NaOH, cooled to 0 ° C. and neutralized with acetic acid.
Für den Test wurden im Reagenzglas 500.000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 μΐ Probe zusammengebracht. Das Volumen wurde auf 50 μΐ eingestellt, und als Pufferlösung dienten 0,6 M Natriumchlorid, 0,06 M Natriumzitrat, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5 % Natriumdodezylsulfat. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 65 C inkubiert·For the test, 500,000 cpm detector probe, 50 ng capture probe DNA and 10 μΐ sample were brought together in the test tube. The volume was adjusted to 50 μΐ, and the buffer solution used was 0.6 M sodium chloride, 0.06 M sodium citrate, 0.02 M sodium phosphate (pH 7.6) and 0.5% sodium dodecyl sulfate. The mixture was incubated for one hour at 65 ° C.
Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung auf +20 C abgekühlt und langsam durch eine Chromatographiesäule geschleust, die 1 ml Oligo-dT-Cellulose enthielt. Der Durchlauf wurde aufgefangen und erneut durch die Säule geschickt. Danach wurde die Säule mit 20 ml Lösung gewaschen, welche 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumphosphat (pH 7,6) und 0,5 % Natriumdodezylsulfat enthielt. Die angelagerte DNA wurde zum Schluss rait I ml 0,02 M NaOH abgelöst. Diese Lösung wurde aufgefangen, und ihre Radioaktivität wurde bestimmt.After hybridization, the solution was heated to +20 ° C cooled and slowly passed through a chromatography column containing 1 ml of oligo-dT cellulose. The run was collected and sent back through the column. The column was then washed with 20 ml of solution, which Contained 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium phosphate (pH 7.6) and 0.5% sodium dodecyl sulfate. The attached Finally, DNA was detached from 1 ml of 0.02 M NaOH. These Solution was collected and its radioactivity determined.
125
Ergebnis: !-Aktivität (cpm)125
Result :! Activity (cpm)
Probe: infizierte Zellen Kontrollzellen 5230 325 Sample: infected cells control cells 5230 325
Identifizierung der DNA von Chlamydia trachomatis unter Verwendung von Biotin - StreptavidinIdentification of the DNA of Chlamydia trachomatis under Use of biotin - streptavidin
125 Als Detektorsonde diente der mit I markierte rekombinante Phage mKTH 1245, welcher zwei Bamlll - Sail DNA-Fragmente des Clons pKTH 1220 enthält, die zusammen an den Vector M13mp8 gebunden sind. Der Clon pKTH 1220 ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2825 deponiert und in der Publikation Palva et al., FEMS Microbiology Letters 23 S. 83-89 (1984) beschrieben.125 The I-marked recombinant phage mKTH 1245, which contains two BamIII - Sail DNA fragments, served as the detector probe of the clone pKTH 1220, which are linked together to the vector M13mp8. The clone pKTH 1220 is in German Collection of microorganisms deposited under the number DSM 2825 and in the publication Palva et al., FEMS Microbiology Letters 23 pp. 83-89 (1984).
Als Einfangsonde diente das rekombinante Plasmid pkTH 1250. Dieses Plasmid besteht aus einem 2,9 kb Sail - CIaI Fragment des Plasmids ρ KTH 1220 (DSM 2825) und dem Vector pAT 153. An die DNA des ρ KTH 1250 wurden unter Anwendung des bekannten Nick-Translationsverfahrens (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, S. 237-251, 1977) und mit Biotin-11-ϋΤΡ als Substrat (Bethesda Research Laboratories) Biotinmoleküle kovalent gebunden. Die Einfangsonden-DNA wurde vor Gebrauch 5 min in dem Puffer 10 mM Tris-Cl pH 7,6, 1 mM EDTA gekocht.The recombinant plasmid pkTH 1250 served as the capture probe. This plasmid consists of a 2.9 kb Sail-CIaI fragment of the plasmid ρ KTH 1220 (DSM 2825) and the vector pAT 153. The DNA of the ρ KTH 1250 were using the known Nick translation method (Rigby et al., J. Mol. Biol. 113, pp. 237-251, 1977) and with biotin-11-ϋΤΡ as Substrate (Bethesda Research Laboratories) Biotin molecules covalently bound. The capture probe DNA was prior to use Boiled for 5 min in the buffer 10 mM Tris-Cl pH 7.6, 1 mM EDTA.
Als Probe diente das rekombinante Plasmid pkTH 1220 (DSM 2825). Dieses Plasmid enthält etwa 10 kb für Chlamydia trachomatis typische DNA, gebunden an den Vector pBR322. Das Plasmid fungiert als Modell-DNA und repräsentiert Genom-DNA des Bakteriums. Vor Gebrauch wurde das Plasmid 5 min in 0,02 M NaOH gekocht und sodann die Lösung mit Essigsäure neutralisiert.The recombinant plasmid pkTH 1220 (DSM 2825) served as the sample. This plasmid contains about 10 kb of DNA typical of Chlamydia trachomatis , bound to the vector pBR322. The plasmid acts as a model DNA and represents genomic DNA of the bacterium. Before use, the plasmid was boiled in 0.02 M NaOH for 5 minutes and then the solution was neutralized with acetic acid.
Das als Affinitatsmaterial verwendete Streptavidin wurde an CNBr-aktivierte Sepharose gebunden (Axen et al., Nature 214, S. 1302-1304, 1967).The streptavidin used as the affinity material was bound to CNBr-activated Sepharose (Axen et al., Nature 214, pp. 1302-1304, 1967).
Für den Test wurden im Reagenzglas 500,000 cpm Detektorsonde, 50 ng Einfangsonden-DNA und 10 ng Proben-DNA zusammengebracht. Das Volumen wurde auf 20 ul eingestellt, und die Pufferlösung war die gleiche wie im Beispiel 1. Als Kontroll-DNA diente Kalbsthymus-DNA.For the test, 500,000 cpm detector probe, 50 ng capture probe DNA and 10 ng sample DNA combined. The volume was adjusted to 20 µl and the buffer solution was the same as in Example 1. As control DNA served calf thymus DNA.
Das Gemisch wurde bei 65 C 60 min inkubiert. Danach wurden 500 jil Pufferlösung folgender Zusammensetzung zugesetzt: 0,1 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2, 0,05 % Triton x-100. Die Lösung wurde zum Schluss in einer 0,2 ml Streptavidin-Sepharose-Säule fraktioniert. Die Säule wurde mit 10 ml der o.g. Pufferlösung und mit 0,015 M Natriumchlorid-, 0,015 M Natriumphosphat- (pH 7,6), 0,5 % Natriumdodezylsulfatlösung (50 C), Volumen 10 ml, gewaschen. Dabei haftete sich die biqtinylierte DNA ans Streptavidin, während die übrige DNA die Säule passierte. Die radioaktive Sonde haftete sich nur als Folge der Hybridbildung an. Die angehaftete Radioaktivität wurde durch Einbringen der gesamten Säule in das Zählrohr eines Gammazählers bestimmt.The mixture was incubated at 65 ° C. for 60 minutes. 500 μl of buffer solution of the following composition were then added: 0.1 M Tris-Cl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 mM MgCl 2 , 0.05% Triton x-100. The solution was finally fractionated in a 0.2 ml streptavidin-Sepharose column. The column was washed with 10 ml of the above-mentioned buffer solution and with 0.015 M sodium chloride, 0.015 M sodium phosphate (pH 7.6), 0.5% sodium dodecyl sulfate solution (50 ° C.), volume 10 ml. The biqtinylated DNA adhered to the streptavidin while the rest of the DNA passed through the column. The radioactive probe only adhered as a result of the hybrid formation. The attached radioactivity was determined by placing the entire column in the counter tube of a gamma counter.
Identifizierung von Plasmid-pBR322-DNA unter Vervendung eines Antigen-Antikörper-PaaresIdentify plasmid pBR322 DNA using an antigen-antibody pair
Als Detektorsonde diente ein Plasmid-pBR322-Derivat (kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich), aus dem das Fragment Pstl-Sall (3613-651) entfernt worden war. Das Plasmid war nach einem bekannten Verfahren (Forster et al., Nucleic Acids Res. 13, S.745-761, 1985) und unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien (Bresa, Adelaide, Australien) mit Photobiotin markiert worden.A plasmid pBR322 derivative (commercially available available from various sources) from which the fragment Pstl-Sall (3613-651) had been removed. That Plasmid was by a known method (Forster et al., Nucleic Acids Res. 13, pp.745-761, 1985) and below Using commercially available reagents (Bresa, Adelaide, Australia) has been labeled with photobiotin.
Als Einfangsonde diente DNA des rekombinanten Phagen M13mpll, an welche das Plasmidfragment Pstl-Sall gefügt worden war. Die DNA war nach einem bekannten Verfahren (Orgenics Ltd. Yavne, Israel) sulfoniert worden.DNA from the recombinant phage M13mpll, to which the plasmid fragment Pstl-SalI was added, served as the capture probe had been. The DNA was sulfonated by a known method (Orgenics Ltd. Yavne, Israel).
Als Probe diente E. CoIi HBlOl, an welches das Plasmid pBR322 gefügt war. Die Plasmid-pBR322-Menge wurde durch Chloramphenikol-Amplifikation erhöht (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die Bakterienzellen wurden mit Lysozym aufgebrochen und in NaOH gekocht wie in der Publikation Palva, J. Clin. Microbiol. 18, S. 92-100, 1983, beschrieben ist. E. Coli HB101, to which the plasmid pBR322 was attached, served as the sample. The amount of plasmid pBR322 was increased by chloramphenicol amplification (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). The bacterial cells were disrupted with lysozyme and boiled in NaOH as described in the publication Palva, J. Clin. Microbiol. 18, pp. 92-100, 1983.
Die Antisulfon-monoklonalen Antikörper wurden nach Standardverfahren (McKearn, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980) in den Vertiefungen der aus Polystyrol hergestellten Mikrotiter befestigt.The antisulfone monoclonal antibodies were prepared using standard procedures (McKearn, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980) in the wells of the microtiter made of polystyrene.
Für den Test wurden 5 χ 10 aufgebrochene E. coli-Zellen (sowohl ans Plasmid pBR322 gefügt als auch ohne dieses), 100 ng Einfangsonden-DNA und 100 ng Detektorsonden-DNA zu einer Hybridierungslösung vereint, deren Volumen man auf 50 ul einstellte. Die Hybridisierungsverhältnisse waren die gleichen wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme, dass 5 % Polyethylenglykol (PEG 6000) zugesetzt wurden und der Natriumdodezylsulfatgehalt 0,1 % betrug.For the test, 5 × 10 disrupted E. coli cells (both attached to plasmid pBR322 and without it), 100 ng capture probe DNA and 100 ng detector probe DNA were combined to form a hybridization solution, the volume of which was adjusted to 50 μl. The hybridization ratios were the same as in Example 1 with the exception that 5% polyethylene glycol (PEG 6000) was added and the sodium dodecyl sulfate content was 0.1 % .
Nach erfolgter Hybridisierung wurde die Lösung mit 0j02 M Natriumphosphat (pH 7,6) auf 250 μΐ verdünnt; danach wurde die Lösung in die Mikrotiter-Vertiefungen gebracht, in denen die Antikörper befestigt waren. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei 370C. Danach wurden die Mikrotiter mit einer aus 0,15 M Natriumchlorid, 0,02 M Natriumphosphat und 0,05 % Triton-X-100 bestehenden Lösung gewaschen.After hybridization, the solution was diluted to 250 μl with 0.02 M sodium phosphate (pH 7.6); then the solution was transferred to the microtiter wells in which the antibodies were attached. This was followed by a two-hour incubation at 37 ° C. The microtiters were then washed with a solution consisting of 0.15 M sodium chloride, 0.02 M sodium phosphate and 0.05% Triton-X-100.
Die Beobachtung der Detektorsonde erfolgte durch Zugabe von Streptavidin (Bethesda Research Laboraties, BRL), Waschen, Zugabe von biotinylierter alkalischer Phosphatase (BRL) und Waschen wie in der Publikation Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, S. 4045-4049, 1983, beschrieben ist. Zum Schluss wurden 250 ul Paranitrophenylphosphatlösung (35 mg/ml, Sigma) im Diethanolaminpuffer (pH 10) zugesetzt. Nach 60 Minuten wurde die Reaktion gestoppt und die Absorption bei 410 nm gemessen.The detector probe was observed by adding of streptavidin (Bethesda Research Laboraties, BRL), washing, addition of biotinylated alkaline phosphatase (BRL) and washing as in the publication Leary et al., Proc. Natl. Acad. May be. USA 80, pp. 4045-4049, 1983 is. Finally, 250 μl of paranitrophenyl phosphate solution (35 mg / ml, Sigma) in diethanolamine buffer (pH 10) added. After 60 minutes, the reaction was stopped and the absorbance at 410 nm was measured.
Ergebnis: A 410 nmResult: A 410 nm
Probe: Zellen, an die KontrollzellenSample: cells, to the control cells
pBR322 gefügt war (ohne pBR322) > 2 0,15pBR322 was attached (without pBR322)> 2 0.15
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