DE3525719C2

DE3525719C2 -

Info

Publication number: DE3525719C2
Application number: DE19853525719
Authority: DE
Inventors: Toshimitsu Machida Tokio/Tokyo Jp Musha; Isao Tachikawa Tokio/Tokyo Jp Karube; Hideaki Kawasaki Kanagawa Jp Matsuoka
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1984-07-18
Filing date: 1985-07-18
Publication date: 1989-01-05
Also published as: DE3525719A1; JPS6128866A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung immunologischer Reaktion gemäß den Oberbegriffen des Patentanspruches 1 bzw. 16.The invention relates to a method and an apparatus for Measurement of immunological response according to the generic terms of the Claims 1 and 16 respectively.

Es sind immunologische Analysen zur Messung von immunologischen Substanzen, Hormonen, Arzneimitteln und verschiedenen Komponenten wie Immunregulatoren, die in geringen Mengen in lebenden Körpern vorhanden sind unter Anwendung spezieller immunologischer Reaktionen bekannt. Die immunologischen Analysen können grob eingeteilt werden in solche, bei denen Markierungssubstanzen wie Enzyme und Isotope als Indikatorsubstanzen verwendet werden und solche, bei denen die Antigen-Antikörper-Komplexe direkt, ohne daß Markierungssubstanzen vorhanden sind, gemessen werden.They are immunological analyzes for measuring immunological ones Substances, hormones, medicines and various Components such as immune regulators that are found in low levels Amounts present in living bodies are in use special immunological reactions known. The immunological Analyzes can be roughly divided into those where labeling substances such as enzymes and isotopes as Indicator substances are used and those in which the antigen-antibody complexes directly, without any labeling substances are present to be measured.

Bei der zuerst genannten Gruppe der mit Markierungssubstanzen arbeitenden immunologischen Analysen sind allgemein bekannt der Radio-Immuno-Assay (RIA), der Enzym-Immuno- Assay (EIA) und der Fluoreszenz-Immuno-Assay (FIA). Diese Assays bzw. Untersuchungen haben den Vorteil, daß eine hohe Empfindlichkeit erzielt werden kann, aber auch den Nachteil, daß die Handhabung von Isotopen und verbrauchten Flüssigkeiten schwierig ist, die Meßzeiten lang sind und die Markierungsreagentien teuer sind, so daß die Untersuchungskosten pro Probe, d. h. die laufenden Kosten, leicht zu hoch werden.In the former group of those with labeling substances working immunological analyzes are general known the radio immunoassay (RIA), the enzyme immuno Assay (EIA) and the fluorescence immunoassay (FIA). These Assays or examinations have the advantage that a high Sensitivity can be achieved, but also the disadvantage that handling isotopes and used fluids is difficult, the measuring times are long and the labeling reagents are expensive, so the investigation costs per sample, d. H. the running costs, easily get too high.

Für die zuletzt genannte immunologische Analyse ohne Markierung wurden die Immuno-Elektrophorese, Immuno-Diffusion und -Sedimentation entwickelt. Diese Verfahren sind ziemlich einfach, jedoch nicht ausreichend empfindlich, quantitativ und reproduzierbar, wie es für genaue Messungen erforderlich ist.For the latter immunological analysis without labeling were immuno-electrophoresis, immuno-diffusion and sedimentation developed. These procedures are pretty simple, but not sufficiently sensitive, quantitative and reproducible as required for accurate measurements is.

In "Immuno chemistry", Bd. 12, Nr. 4 (1975), S. 349 bis 351, ist eine immunologische Analyse beschrieben, bei der Antigene oder Antikörper, die an die Oberfläche kleiner Teilchen gebunden sind, mit Antikörpern oder Antigenen in einer Testflüssigkeit reagieren und die mittlere Diffusionskonstante, die ein Zeichen für die Brown'sche Bewegung der Aggregate aus agglutinierten Teilchen ist, wird aus einer Variation in der spektralen Breite von Laserlicht gemessen, das von einer Lösung von Teilchen gestreut wird. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, daß keinerlei Reagens verwendet wird. Da jedoch die Breite (Verbreiterung) des Spektrums, die auf dem Dopplereffekt aufgrund der Brown'schen Bewegung der Aggregate beruht, mit Hilfe eines Spektrometers nachgewiesen wird, ist die Vorrichtung ziemlich groß und teuer. Darüber hinaus kann es zu Fehlern führen, wenn das Spektrometer mechanisch angetrieben wird, so daß die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit schlecht werden. Darüber hinaus wird bei diesen bekannten Verfahren die mittlere Diffusionskonstante aus der spektralen Breite gemessen, wodurch nur eine beschränkte Information über die Antigen-Antikörper-Reaktion zur Verfügung steht.In "Immuno chemistry", Vol. 12, No. 4 (1975), pp. 349 to 351, an immunological analysis is described in which antigens or antibodies attached to the surface of small particles are bound with antibodies or antigens in one Test liquid react and the mean diffusion constant, which is a sign of the Brownian movement of the Aggregates made up of agglutinated particles is made up of one Variation in the spectral width measured by laser light, that is scattered by a solution of particles. This method has the advantage that no reagent is used becomes. However, since the width (broadening) of the spectrum, that on the Doppler effect due to Brownian motion the aggregate is based, detected with the help of a spectrometer the device is quite large and expensive. In addition, it can lead to errors if the spectrometer is mechanically driven so that accuracy and reproducibility become poor. Beyond that the mean diffusion constant in these known methods measured from the spectral width, whereby only a limited Information about the antigen-antibody reaction to Available.

Aus der DE-OS 24 40 376 ist ein Verfahren zum Messen von Teilchengrößen bekannt, bei dem ebenfalls ein Spektrometer erforderlich ist, wobei zu jedem Streuwinkel das Frequenzspektrum des Streulichtes gemessen und die Halbwertsbreite des durch den Dopplereffekt verbreiterten Frequenzspektrums ermittelt wird.DE-OS 24 40 376 describes a method for measuring particle sizes known in which also a spectrometer is required, with the frequency spectrum for each scattering angle of the scattered light and the half-width of the frequency spectrum broadened by the Doppler effect is determined.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Messung einer Antigen-Antikörper-Reaktion zu entwickeln, bei dem es nicht erforderlich ist, teure Reagentien und teure und große Spektrometer zu verwenden und bei dem die Messung mit großer Genauigkeit reproduzierbar durchgeführt werden kann. Die Messung soll automatisch innerhalb kurzer Zeit durchführbar sein und es sollen kleine Mengen bzw. Konzentrationen an Antigen oder Antikörper in einer Testprobe genau meßbar sein.The object of the invention is a method to develop an antigen-antibody response, which does not require expensive reagents and to use expensive and large spectrometers and at which the measurement is carried out reproducibly with great accuracy can be. The measurement should automatically take place within a short time Time should be feasible and there should be small amounts or concentrations of antigen or antibody in a test sample be precisely measurable.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 gekennzeichnet, während eine entsprechende Vorrichtung im Patentanspruch 16 beschrieben ist. The inventive method for solving this problem is in Claim 1 characterized while a corresponding Device is described in claim 16.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den folgenden Tatsachen. Die Intensität von Licht, das gestreut wird durch die Aggregate der bei der Antigen-Antikörper-Reaktion entstehenden Teilchen verändert sich bzw. schwankt aufgrund der Interferenz des Lichtes und ein Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung hängt ab von der Form und Größe der Aggregate oder Teilchen. Daher ist es durch Nachweis bzw. Untersuchung des Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen möglich, viele nützliche Informationen über immunologische Reaktionen zu erhalten, wie das Auftreten einer Antigen-Antikörper-Reaktion, eine quantitative Information über den Antigen- bzw. Antikörpergehalt und den Agglutinationszustand der Aggregate von Teilchen (Durchmesser der Aggregate) aufgrund der Antigen-Antikörper- Reaktion. Da die Veränderung der Intensität des gestreuten Lichtes einfach durch Nachweis des gestreuten Lichtes mit Hilfe eines Fotodetektors gemessen werden kann, ist es erfindungsgemäß nicht mehr erfordelrich, irgendein teures Reagens zu verwenden. Da keine Analyse des Spektrums des gestreuten Lichtes durchgeführt wird, ist es auch nicht erforderlich, ein großes und teures Spektrometer zu verwenden.The present invention is based on the following facts. The intensity of light that is scattered by the aggregates of the resulting in the antigen-antibody reaction Particle changes or fluctuates due to the interference of light and a density spectrum of the Fluctuations in the intensity of the scattered radiation depend on the shape and size of the aggregates or particles. Therefore it is through detection or examination of the density spectrum of fluctuations in intensity possible, lots of useful information to get about immunological reactions like the occurrence of an antigen-antibody reaction, a quantitative one Information about the antigen or antibody content and the agglutination state of the aggregates of particles (Diameter of the aggregates) due to the antigen-antibody Reaction. As the change in the intensity of the scattered Light simply by demonstrating the scattered Light can be measured with the help of a photo detector, according to the invention, it is no longer required, either to use expensive reagent. Because no analysis of the spectrum of the scattered light is not carried out required to use a large and expensive spectrometer.

Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird das gestreute Licht homodyn gemessen und das Verhältnis der Kippfrequenzen (relaxation frequencies) des Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung vor und nach der Antigen-Antikörper-Reaktion wird aufgezeichnet, um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu messen. Dies beruht auf der Tatsache, daß die Kippfrequenz unmittelbar zusammenhängt mit der Größe der Aggregate agglutinierter Teilchen.In a preferred mode of operation, the scattered light homodyne measured and the ratio of the tilt frequencies (relaxation frequencies) of the density spectrum of the intensity fluctuations the scattered radiation before and after the Antigen-antibody response is recorded to determine the Measure antigen-antibody response. This is due to the The fact that the sweep frequency is directly related with the size of the aggregates of agglutinated particles.

Bei einer anderen bevorzugten Arbeitsweise nach der Erfindung wird das Verhältnis der integrierten Werte des Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen in einem niedrigeren Frequenzbereich vor und nach der Antigen-Antikörper- Reaktion gemessen. Das beruht auf der Tatsache, daß der integrierte Wert des Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes im niedrigeren Frequenzbereich dicht zusammenhängt mit der Größe der Teilchenaggregate.In another preferred mode of operation according to the invention the ratio of the integrated values of the Density spectrum of intensity fluctuations in a lower one Frequency range before and after the antigen-antibody Response measured. This is due to the fact that the integrated value of the density spectrum of the intensity fluctuations of the scattered light in the lower frequency range closely related to the size of the particle aggregates.

Erfindungsgemäß wird die Schwankung der Intensität des von agglutinierten Teilchen gestreuten Lichtes gemessen auf der Basis des Dichtespektrums und daher ist es nicht mehr erforderlich, teure Reagentien und Spektromneter zu verwenden, und es können viele wertvolle Informationen über die Antigen-Antikörper-Reaktion in sehr kurzer Zeit mit sehr großer Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit erhalten werden, selbst wenn die Antigen- bzw. Antikörperkonzentration, die gemessen werden soll, sehr klein ist.According to the invention, the fluctuation in the intensity of the agglutinated particles of scattered light measured on the Basis of the density spectrum and therefore it is no longer necessary to use expensive reagents and spectrometers, and there can be a lot of valuable information about that Antigen-antibody reaction in a very short time with very large Sensitivity and reproducibility are obtained, even if the antigen or antibody concentration, that is to be measured is very small.

Die Erfindung wird an Hand der Zeichnungen näher erläutert.The invention is illustrated in the drawings explained in more detail.

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht, die eine Ausführungsform der immunologischen Meßvorrichtung nach der Erfindung zeigt. Fig. 1 is a schematic view showing an embodiment of the immunological measuring device according to the invention.

Fig. 2 ist eine schematische Ansicht, die den Aufbau eines in Fig. 1 gezeigten Kollimators darstellt. FIG. 2 is a schematic view showing the construction of a collimator shown in FIG. 1.

Fig. 3 ist eine schematische Ansicht, die die Hauptteile einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen immunologischen Meßvorrichtung zeigt. Fig. 3 is a schematic view showing the main parts of another embodiment of an immunological measuring device according to the invention.

Fig. 4 und 5 sind graphische Darstellungen, die Kurven für das Dichtespektrum für Teilchen mit Durchmessern von 0,188 µm bzw. 0,305 µm zeigen. FIGS. 4 and 5 are graphical representations, the curves of the density spectrum for particles having diameters of 0.188 microns and are show 0.305 microns.

Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen dem Teilchendurchmesser und der Kippfrequenz des Dichtespektrums zeigt. Fig. 6 is a graph showing the relationship between the particle diameter and the tilt frequency of the density spectrum.

Fig. 7 und 8 sind graphische Darstellungen, die Kurven des Dichtespektrums für Teilchenkonzentrationen von 0,1 Gew.-% bzw. 0,09 Gew.-% zeigen. FIGS. 7 and 8 are graphs showing the curves of the density spectrum for particle concentrations of 0.1 wt .-% and 0.09 wt .-% Show.

Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Teilchenkonzentration und der Kippfrequenz angibt. Fig. 9 is a graph showing the relationship between the particle concentration and the sweep frequency.

Fig. 10 und 11 sind graphische Darstellungen, die Kurven für das Dichtespektrum vor und nach der Antigen- Antikörper-Reaktion für Antigenkonzentration von 10^-4 g/ml bzw. 10^-9 g/ml angeben. FIGS. 10 and 11 are graphs showing the curves of the density spectrum before and after the antigen-antibody reaction for the antigen concentration of 10 ^-4 g / ml and 10 ^-9 g / ml specify.

Fig. 12 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Antigenkonzentration und dem Verhältnis der Kippfrequenzen angibt, und Fig. 12 is a graph showing the relationship between the antigen concentration and the ratio of the tilt frequencies, and

Fig. 13 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Antigenkonzentration und dem Verhältnis der relativen Schwankungen angibt. Fig. 13 is a graph showing the relationship between the antigen concentration and the ratio of the relative fluctuations.

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht, die eine Ausführungsform einer Vorrichtung zur Messung immunologischer Reaktionen nach der Erfindung zeigt. Bei dieser Ausführungsform ist eine Lichtquelle vorgesehen, die kohärentes Licht aussendet, und zwar ein He-Ne-Gaslaser 1, der einen Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 632,8 nm aussendet. Die Lichtquelle kann auch ein Feststofflaser, wie ein Halbleiterlaser, sein. Ein Laserlichtstrahl 2, der von der Lichtquelle 1 ausgesandt wird, wird durch einen halbdurchlässigen Spiegel 3 in die Lichtstrahlen 4 und 5 aufgetrennt. Der Lichtstrahl 4 wird durch eine Sammellinse 6 gesammelt und trifft auf die Zelle 7 auf. Die Zelle 7 besteht aus durchsichtigem Quarz. Der Lichtstrahl 5 trifft auf einen Fotodetektor 8 wie eine Silicium-Fotodiode auf. Dann erzeugt der Fotodetektor 8 ein Monitorsignal, das eine Veränderung der Intensität des von der Lichtquelle 1 ausgesandten Lichtes anzeigt. Fig. 1 is a schematic view showing an embodiment of an apparatus for measuring immunological reactions according to the invention. In this embodiment, a light source is provided that emits coherent light, namely a He-Ne gas laser 1 that emits a laser beam with a wavelength of 632.8 nm. The light source can also be a solid-state laser, such as a semiconductor laser. A laser light beam 2 , which is emitted by the light source 1 , is separated into the light beams 4 and 5 by a semi-transparent mirror 3 . The light beam 4 is collected by a converging lens 6 and strikes the cell 7 . The cell 7 consists of transparent quartz. The light beam 5 strikes a photodetector 8 like a silicon photodiode. The photodetector 8 then generates a monitor signal which indicates a change in the intensity of the light emitted by the light source 1 .

In der Zelle 7 ist eine Testflüssigkeit für eine Antigen- Antikörper-Reaktion enthalten, die ein Gemisch ist aus einer Pufferlösung, in der feine Teilchen 9 suspendiert sind, und einer Testprobe, enthaltend das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper. Auf der Außenseite der Teilchen 9 sind Antikörper bzw. Antigene gebunden, die spezifisch mit dem Antigen oder Antikörper in der Testprobe reagieren. Daher tritt in der Zelle 7 eine Antigen- Antikörper-Reaktion ein und es treten Anziehungskräfte zwischen den Teilchen auf. Wenn die Teilchen miteinander unter Bildung von Aggregaten agglutiniert sind, ändert sich die Brown'sche Bewegung je nach der Größe und Form der Aggregate. Lichtstrahlen, die durch die Teilchen 9 in der Zelle 7 gestreut werden, treffen auf einen Fotodetektor 11 über einen Kollimator 10 auf, der zwei (gegenüberliegende) Löcher aufweist. Der Fotodetektor 11 besteht aus einem Fotomultiplier mit hoher Empfindlichkeit. Das Austritts-(Monitor-)signal des Fotodetektors 8 wird über einen Verstärker mit geringem Rauschen in eine Datenverarbeitungsvorrichtung 14 geleitet, in die auch das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 über einen Verstärker 15 mit geringem Rauschen und einen Tiefpaßfilter 16 geführt. Die Datenverarbeitungsvorrichtung 14 umfaßt eine Analog-Digital-Umwandlereinheit 17, eine schnelle Fourier- Transformator-(FFT-)Einheit 18 und eine Recheneinheit 19 und verarbeitet die Signale, wie später näher erläutert wird, um Meßergebnisse für die Antigen-Antikörper-Reaktion zu erhalten. Die Meßergebnisse werden in einer Display- bzw. Aufzeichnungsvorrichtung 20 angezeigt.The cell 7 contains a test liquid for an antigen-antibody reaction, which is a mixture of a buffer solution in which fine particles 9 are suspended and a test sample containing the antigen or the antibody to be determined. Antibodies or antigens are bound on the outside of the particles 9 , which react specifically with the antigen or antibody in the test sample. Therefore, an antigen-antibody reaction occurs in cell 7 and attractive forces occur between the particles. When the particles are agglutinated with each other to form aggregates, Brownian motion changes depending on the size and shape of the aggregates. Light rays that are scattered by the particles 9 in the cell 7 strike a photodetector 11 via a collimator 10 that has two (opposite) holes. The photodetector 11 consists of a photomultiplier with high sensitivity. The exit (monitor) signal of the photodetector 8 is passed via an amplifier with low noise into a data processing device 14 , into which the exit signal from the photodetector 11 is also led via an amplifier 15 with low noise and a low-pass filter 16 . The data processing device 14 comprises an analog-to-digital converter unit 17 , a fast Fourier transformer (FFT) unit 18 and a computing unit 19 and processes the signals, as will be explained in more detail later, in order to obtain measurement results for the antigen-antibody reaction . The measurement results are displayed in a display or recording device 20 .

Das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 zeigt die Intensität des gestreuten Lichtes an, das aus der Meßzelle 7 austritt und wird normiert durch das Monitorsignal, das von dem Fotodetektor 8 geliefert wird und über einen kurzen Zeitraum gemittelt. Dadurch kann eine etwaige Variation der Intensität des Laserlichtstrahls 2 aus der Lichtquelle 1 ausgeschaltet werden. Anschließend wird ein Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes nachgewiesen und der Agglutinationszustand der Teilchen 9 in der Zelle 7 und damit das Fortschreiten der Antigen-Antikörper- Reaktion gemessen.The exit signal from the photodetector 11 indicates the intensity of the scattered light which emerges from the measuring cell 7 and is normalized by the monitor signal supplied by the photodetector 8 and averaged over a short period of time. Any variation in the intensity of the laser light beam 2 from the light source 1 can thereby be eliminated. Then a density spectrum of the intensity fluctuations of the scattered light is detected and the agglutination state of the particles 9 in the cell 7 and thus the progression of the antigen-antibody reaction are measured.

Fig. 2 ist eine schematische Ansicht, die die Konstruktion des Kolimators 10 der Fig. 1 im einzelnen zeigt. Der Kollimator 10 umfaßt ein Rohr 10 a aus einem opaken, d. h. nicht durchscheinenden Material, um den Einfluß von äußerem Licht zu vermeiden. Darüber hinaus ist die innere Wand des Rohres 10 a mit einer nicht-reflektierenden Schicht überzogen. An beiden Enden des Rohrs 10 a sind optische lÖcher 10 b und 10 c vorgesehen. Wenn die Radien der optischen Löcher 10 b und 10 c a₁ bzw. a₂ sind, und der Abstand zwischen den Löchern L, der Brechungsindex des Mediums innerhalb des Rohres 10 a n und die Wellenlänge des Lichtes λ ist, folgt der Kollimator 10 der folgenden Gleichung (1) FIG. 2 is a schematic view showing the construction of the colimator 10 of FIG. 1 in detail. The collimator 10 comprises a tube 10 a made of an opaque, ie non-translucent material to avoid the influence of external light. In addition, the inner wall of the tube 10 a is covered with a non-reflective layer. At both ends of the tube 10 a optical holes 10 b and 10 c are provided. If the radii of the optical holes 10 b and 10 c a ₁ and A ₂ are, and the distance between the holes L, the refractive index of the medium within the tube 10 a n and the wavelength λ of the light, the collimator 10 follows the following equation (1)

Erfindungsgemäß wird das Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes nachgewiesen. Das Dichtespektrum kann angegeben werden durch einen Term der Schwankung aufgrund der Interferenz des Lichtes, die durch die Teilchen hervorgerufen wird, die über einen Abstand dispergiert sind, der im wesentlichen gleich ist der Wellenlänge, und einen Term der Schwankung der Anzahl der Teilchen, die in das streuende Volumen eintreten und daraus austreten. Der erste Fluktuations-Term, der auf der Interferenz beruht, wird als räumliche Schwankung eines Punktmusters beobachtet. Wenn diese räumliche Schwankung von einem Fotodetektor mit einem breiten lichtempfangenden Bereich aufgenommen wird, wird das räumliche Mittel über die lichtaufnehmende Fläche gebildet und daher kann nur eine geringe Schwankung nachgewiesen werden. Bei der erfindungsgemäßen Arbeitsweise ist das Blickfeld des Fotodetektors 11 durch den Kollimator 10 mit den optischen Löchern begrenzt, so daß die Fluktuation mit sehr hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann. Die oben angegebene Gleichung (1) kann erfüllt werden durch Verwendung eines Kollimators 10 mit Löchern mit einem Durchmesser von 0,3 mm im Abstand von 30 cm, wenn das Medium im Inneren des Kollimators Luft mit einem Brechungsindex n=1 ist. According to the invention, the density spectrum of the intensity fluctuations of the scattered light is detected. The density spectrum can be given by a term of fluctuation due to the interference of light caused by the particles dispersed over a distance substantially equal to the wavelength, and a term of fluctuation in the number of particles in the scattering volume enter and exit. The first fluctuation term, which is based on the interference, is observed as a spatial fluctuation of a point pattern. If this spatial fluctuation is recorded by a photodetector with a wide light-receiving area, the spatial average is formed over the light-receiving area and therefore only a slight fluctuation can be detected. In the mode of operation according to the invention, the field of view of the photodetector 11 is limited by the collimator 10 with the optical holes, so that the fluctuation can be detected with very high sensitivity. Equation (1) given above can be satisfied by using a collimator 10 with holes with a diameter of 0.3 mm at a distance of 30 cm if the medium inside the collimator is air with a refractive index n = 1.

Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform ist der Lichtstrahl 4, der auf die Zelle 7 auftrifft, senkrecht zu der optischen Achse des Kollimators 10, so daß der auftreffende Lichtstrahl nicht direkt in den Fotodetektor 11 gelangt. Das wird als homodyne Methode bezeichnet. Erfindungsgemäß ist es jedoch auch möglich, die heterodyne Methode anzuwenden, bei der ein Teil des auftreffenden Lichtstrahls in den Fotodetektor 11 gelangt. Fig. 3 zeigt eine solche heterodyne Anordnung. Erfindungsgemäß kann ein Neigungswinkel R zwischen dem einfallenden Lichtstrahl 4 und der optischen Achse des Kollimators 10 beliebig bestimmt werden. Bei der homodynen Anordnung, die in Fig. 1 gezeigt ist, ist das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 proportional dem Mittelwert des Quadrats , wobei E _s die Intensität des elektrischen Felds des gestreuten Lichtes ist. Bei der heterodynen Anordnung, die in Fig. 3 gezeigt ist, wird das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 folgendermaßen angegebenIn the embodiment shown in FIG. 1, the light beam 4 , which strikes the cell 7 , is perpendicular to the optical axis of the collimator 10 , so that the incident light beam does not get directly into the photodetector 11 . This is called the homodyne method. According to the invention, however, it is also possible to use the heterodyne method in which part of the incident light beam reaches the photodetector 11 . Fig. 3 shows such a heterodyne arrangement. According to the invention, an angle of inclination R between the incident light beam 4 and the optical axis of the collimator 10 can be determined as desired. In the homodyne arrangement shown in Fig. 1, the exit signal from the photodetector 11 is proportional to the mean value of the square, where E _{s is} the intensity of the electric field of the scattered light. In the heterodyne arrangement shown in FIG. 3, the exit signal from the photodetector 11 is given as follows

wobei E _e die Intensität des elektrischen Felds des direkt auftreffenden Lichtes ist. Da E _e gar nicht oder nur gering schwankt, verglichen mit der Schwankung des gestreuten Lichtes, ist die Variable des Austrittssignals aus dem Fotodetektor 11 im wesentlichen gleich dem zweiten Term 2 E _e · . Das heißt selbst bei der heterodynen Methode ist es möglich, ein Austrittssignal zu erhalten, das im wesentlichen proportional ist der Intensität des elektrischen Felds des gestreuten Lichtes. Ferner ist zu bemerken, daß der Kollimator 10 nicht auf die oben beschriebene Ausführungsform beschränkt ist, sondern verschiedene Formen besitzen kann, sofern das Blickfeld des Fotodetektors 11 kleiner gehalten werden kann als ein Punktmuster. where E _{e is} the intensity of the electric field of the directly incident light. Since E _e does not fluctuate at all or only slightly, compared to the fluctuation of the scattered light, the variable of the exit signal from the photodetector 11 is essentially the same as the second term 2 E _e ·. That is, even with the heterodyne method, it is possible to obtain an exit signal that is substantially proportional to the intensity of the electric field of the scattered light. It should also be noted that the collimator 10 is not limited to the embodiment described above, but can have various shapes, provided that the field of view of the photodetector 11 can be kept smaller than a dot pattern.

Im folgenden wird die Verarbeitung des Signals erläutert. Das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 wird in die datenverarbeitende Vorrichtung 14 über den Tiefpaßfilter 16 eingegeben und dort zusammen mit dem Austrittsmonitorsignal aus dem Fotodetektor 8 verarbeitet, um das Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes zu erhalten. Die Dichte des Intensitätsspektrums S(f) eines stationären stochastischen Prozesses x(t) kann folgendermaßen ausgedrückt werden.The processing of the signal is explained below. The exit signal from the photodetector 11 is input into the data processing device 14 via the low-pass filter 16 and processed there together with the exit monitor signal from the photodetector 8 in order to obtain the density spectrum of the intensity fluctuations of the scattered light. The density of the intensity spectrum S (f) of a stationary stochastic process x (t) can be expressed as follows.

Auf der Basis dieser Gleichung (2) wird die Fourier-Transformation durchgeführt, um die Dichte des Intensitätsspektrums zu messen. Das Austrittssignal aus dem Fotodetektor 11 wird durch den Verstärker 15 mit geringem Rauschen so verstärkt, daß Signalwerte einen großen Bereich von Analog-Digital-Umwandlungspegelstufen abdecken können und so gequantelte Daten mit Hilfe eines Mikroprozessors berechnet werden, um die Dichte des Intensitätsspektrums zu messen. Aus der Dichte des Intensitätsspektrums wird der Zustand der immunologischen Reaktion gemessen bzw. berechnet, wie später näher erläutert wird, und numerisch auf der Displayeinheit 20 angezeigt.Based on this equation (2), the Fourier transform is performed to measure the density of the intensity spectrum. The exit signal from the photodetector 11 is amplified by the low noise amplifier 15 so that signal values can cover a wide range of analog-to-digital conversion level levels and so quantized data is calculated using a microprocessor to measure the density of the intensity spectrum. The state of the immunological reaction is measured or calculated from the density of the intensity spectrum, as will be explained in more detail later, and displayed numerically on the display unit 20 .

Die Fig. 4 und 5 sind graphische Darstellungen, die Kurven des Dichtespektrum zeigen, die erhalten werden, wenn Testflüssigkeiten mit dispergierten Polystyrol-Latexteilchen mit Durchmessern von 0,188 µm bzw. 0,305 µm in die in Fig. 1 gezeigte Zelle 7 eingebracht werden. Man erhält Kurven des Dichtespektrums vom Lorentz-Typ. Das zeigt die Interferenz-Komponente des Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes. Aus diesen Kurven kann man erkennen, daß die Kippfrequenz des Dichtespektrums umgekehrt proportional ist dem Teilchendurchmesser. Wie oben erklärt, ist die Schwankung in der Intensität des gestreuten Lichtes eine Summe der Komponente, die auf der Interferenz von kohärentem Licht beruht, und der Komponente, die auf der Veränderung der Anzahl der Teilchen innerhalb des streuenden Volumens beruht. Bei der erfindungsgemäßen Arbeitsweise wird hauptsächlich die Komponente, die auf der Interferenz beruht, nachgewiesen. Dann ist die Kippfrequenz des Dichtespektrums, die definiert ist durch die Frequenz an der Schulter der Dichtespektrums- Kurve, gleich dem Kehrwert der Zeit, innerhalb derer sich die Aggregate über eine Distanz, die gleich ist der Wellenlänge, bewegen. Wenn der Durchmesser der Teilchenaggregate zunimmt, wird die für die Bewegung erforderliche Zeit länger und damit die Kippfrequenz niedriger. FIGS. 4 and 5 are graphical representations, the curves of the density range show, which are obtained are introduced when the test liquid with dispersed polystyrene latex particles having diameters of 0.188 microns and 0.305 microns to the position shown in Fig. 1 cell 7. One obtains curves of the density spectrum of the Lorentz type. This shows the interference component of the density spectrum of the intensity fluctuations of the scattered light. It can be seen from these curves that the tilt frequency of the density spectrum is inversely proportional to the particle diameter. As explained above, the variation in the intensity of the scattered light is a sum of the component based on the interference of coherent light and the component based on the change in the number of particles within the scattering volume. In the procedure according to the invention, mainly the component based on the interference is detected. Then the tilt frequency of the density spectrum, which is defined by the frequency at the shoulder of the density spectrum curve, is equal to the reciprocal of the time within which the aggregates move over a distance that is equal to the wavelength. As the diameter of the particle aggregates increases, the time required for the movement becomes longer and thus the tilting frequency decreases.

Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Teilchengröße, die auf der Abszisse aufgetragen ist, und der Kippfrequenz, die auf der Ordinate aufgetragen ist, zeigt. Beide Koordinaten sind im logarithmischen Maßstab. Für Teilchen mit einem Durchmesser von 0,0915 µm wird eine Kippfrequenz von etwa 400 Hz beobachtet, für Teilchen mit einem Durchmesser von 0,188 µm eine Kippfrequenz von etwa 200 Hz und für Teilchen mit einem Durchmesser von 0,305 µm eine Kippfrequenz von etwa 100 Hz. Wie aus der Fig. 6 deutlich hervorgeht, ist die Kippfrequenz umgekehrt proportional dem Teilchendurchmesser und daher ist es durch Nachweis der Änderung der Kippfrequenz während der immunologischen Reaktion möglich, das Vorliegen von Agglutination der Teilchen aufgrund der Antigen-Antikörper- Reaktion und den Grad der Agglutination zu messen. Das heißt, wenn die Antigen-Antikörper-Reaktion in der Zelle 7 stattfindet, werden feine Teilchen miteinander agglutiniert unter Bildung größerer Aggregate und dadurch wird die Kippfrequenz niedriger. Fig. 6 is a graph showing the relationship between the particle size plotted on the abscissa and the sweep frequency plotted on the ordinate. Both coordinates are on a logarithmic scale. For particles with a diameter of 0.0915 µm, a tipping frequency of approximately 400 Hz is observed, for particles with a diameter of 0.188 µm a tipping frequency of approximately 200 Hz and for particles with a diameter of 0.305 µm a tipping frequency of approximately 100 Hz from FIG. 6 clearly shows, the sweep frequency is inversely proportional to the particle diameter and therefore it is possible by detecting the change of the sweep frequency during the immunological reaction, the presence of agglutination of the particles due to the antigen-antibody reaction and the degree of agglutination to measure up. That is, when the antigen-antibody reaction takes place in the cell 7 , fine particles are agglutinated with each other to form larger aggregates, and thereby the tilting frequency is lower.

Die Fig. 7 und 8 zeigen Dichtespektrums-Kurven, die erhalten worden sind mit Hilfe von Polystyrol-Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,3 µm, suspendiert in einer Pufferlösung in Konzentrationen von 0,1 bzw. 0,09 Gew.-%. Beide Kurven sind vom Lorentz-Typ. Wie oben erläutert ist die Schwankung der Intensität des gestreuten Lichtes die Summe aus der Interferenz-Komponente aufgrund der Brown'schen Bewegung der Teilchen und einer Nicht-Interferenz-Komponente aufgrund einer Veränderung der Anzahl von Teilchen in dem streuenden Volumen. Wenn die Anzahl der Teilchen in dem streuenden Volumen klein ist, wird die Interferenz- Komponente kleiner und vergleichbar mit der Nicht-Interferenz- Komponente. Dann können andere Komponenten als die Schwankung in der Intensität des gestreuten Lichtes aufgrund der Brown'schen Bewegung der Teilchen nachgewiesen werden und die Antigen-Antikörper-Reaktion kann nicht mehr genau gemessen werden. Daher sollte die Konzentration der Teilchen so bestimmt werden, daß das einfallende Licht in dem streuenden Volumen ausreichend stark ist und die Interferenz- Komponente größer wird als die Nicht-Interferenz- Komponente. FIGS. 7 and 8 show spectral density curves obtained microns using polystyrene latex particles with a diameter of 0.3, suspended in a buffer solution at concentrations of 0.1 and 0.09 wt .-%. Both curves are of the Lorentz type. As explained above, the variation in the intensity of the scattered light is the sum of the interference component due to Brownian motion of the particles and a non-interference component due to a change in the number of particles in the scattering volume. If the number of particles in the scattering volume is small, the interference component becomes smaller and comparable to the non-interference component. Then, components other than the fluctuation in the intensity of the scattered light due to Brownian motion of the particles can be detected, and the antigen-antibody response can no longer be measured accurately. Therefore, the concentration of the particles should be determined so that the incident light in the scattering volume is sufficiently strong and the interference component becomes larger than the non-interference component.

Fig. 9 zeigt die Beziehung zwischen der Anzahl der Teilchen in einem mm³ und der relativen Schwankung Wenn der Durchmesser eines streuenden Körpers konstant ist, wird die relative Streuung auch über einen verhältnismäßig weiten Bereich der Teilchenkonzentration konstant. Dies wird experimentell durch die in Fig. 9 gezeigte Kurve bestätigt. Fig. 9 shows the relationship between the number of particles in a mm³ and the relative fluctuation. When the diameter of a scattering body is constant, the relative scatter also becomes constant over a relatively wide range of the particle concentration. This is confirmed experimentally by the curve shown in FIG. 9.

Die Fig. 10 und 11 zeigen Dichtespektrums-Kurven vor und nach (15 min) der Antigen-Antikörper-Reaktion. Diese Kurven wurden erhalten durch Dispergieren von Polystyrol- Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,3 µm, an deren Oberfläche Antiimmunglobulin G (anti-IgG) gebunden war in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7, die mit Tris- HCl eingestellt worden war, und Zugabe von Immunoglobulin-G zu der Suspension in einer Konzentration von 10^-4 g/ml bzw. 10^-9 g/ml. Wie aus Fig. 10 hervorgeht, war im Falle einer Antigen-Konzentration von 10^-4 g/ml vor der Reaktion die Kippfrequenz etwa 50 Hz und nach 15 min war sie auf 10 Hz gesunken. Im Gegensatz dazu betrug die Kippfrequenz bei einer Antigen-Konzentration von 10^-9 g/ml vor der Reaktion etwa 95 Hz und sank nach der Reaktion auf etwa 40 Hz. Daher erhält man für das Verhältnis F der Kippfrequenz vor und nach der Reaktion die folgenden Werte. FIGS. 10 and 11 show spectral density curves before and after (15 min) of the antigen-antibody reaction. These curves were obtained by dispersing 0.3 µm diameter polystyrene latex particles to the surface of which antiimmunoglobulin G (anti-IgG) was bound in a pH 7 buffer solution adjusted with Tris-HCl , and adding immunoglobulin-G to the suspension in a concentration of 10 ^-4 g / ml and 10 ^-9 g / ml, respectively. As is apparent from Fig. 10, in the case of an antigen concentration of 10 ^-4 g / ml before the reaction, the sweep frequency was about 50 Hz and after 15 minutes it had dropped to 10 Hz. In contrast, at an antigen concentration of 10 ^-9 g / ml, the flip frequency was about 95 Hz before the reaction and decreased to about 40 Hz after the reaction. Therefore, for the ratio F of the flip frequency before and after the reaction, the following are obtained Values.

Die Beziehung zwischen dem Verhältnis F und der Antigen- Konzentration wird angegeben durch die in Fig. 12 gezeigte Kurve. In Fig. 12 ist auf der Abszisse die Konzentration an Antigen und auf der Ordinate das Verhältnis F der Kippfrequenzen angegeben. Auf diese Weise kann erfindungsgemäß die Antigen-Konzentration gemessen werden durch Bildung des Verhältnisses F der Kippfrequenz vor und nach der Reaktion.The relationship between the ratio F and the antigen concentration is indicated by the curve shown in FIG . In Fig. 12, the concentration of antigen and on the ordinate the ratio F is shown on the abscissa of the tilting frequencies. In this way, according to the invention, the antigen concentration can be measured by forming the ratio F of the tilt frequency before and after the reaction.

Aus den in den Fig. 10 und 11 gezeigten Kurven ist ferner zu erkennen, daß das Verhältnis R der relativen Schwankungen vor und nach der Antigen-Reaktion zusammenhängt mit der Antigen-Konzentration. Dies wird im folgenden näher erläutert. In Fig. 1 wird das elektrische Ausgangssignal aus dem Fotodetektor 11, der das gestreute Licht aufnimmt, durch ein Tiefpaßfilter mit der folgenden Durchlaßfunktion H(f) geleitet,From the curves shown in FIGS. 10 and 11 it can also be seen that the ratio R of the relative fluctuations before and after the antigen reaction is related to the antigen concentration. This is explained in more detail below. In Fig. 1, the electrical output signal from the photodetector 11 , which receives the scattered light, is passed through a low-pass filter with the following pass function H (f) ,

wobei f _c die Grenzfrequenz des Tiefpaßfilters ist, die ausreichend niedriger ist als die Kippfrequenz f _r. Dann kann eine Veränderung der Schwankung des elektrischen Ausgangsstroms I aus dem Tiefpaßfilter folgendermaßen ausgedrückt werdenwhere f _{c is} the cut-off frequency of the low-pass filter, which is sufficiently lower than the sweep frequency f _r . Then, a change in the fluctuation of the electrical output current I from the low-pass filter can be expressed as follows

⟨w I²⟩ = K² ⟨N⟩ + K² ⟨N⟩² f _c/f _r (4) ⟨W I ²⟩ = K ² ⟨⟩ N + K ² ⟨N ⟩² f _c / f _r (4)

wobei K eine Konstante ist und N die mittlere Anzahl von Teilchen in dem streuenden Volumen. Daher kann eine relative Schwankung in dem aus dem Tiefpaßfilter austretenden Strom angegeben werden durch die folgende Gleichung (5)where K is a constant and N is the average number of particles in the scattering volume. Therefore, a relative variation in the current exiting the low-pass filter can be given by the following equation (5)

wobei γ eine Proportionalitätskonstante ist. Da angenommen werden kann, daß die Anzahl der Teilchen in dem streuenden Volumen ausreichend groß ist, kann die Gleichung (5) folgendermaßen geschrieben werden. where γ is a proportionality constant. Since it can be assumed that the number of particles in the scattering volume is sufficiently large, equation (5) can be written as follows.

Diese Gleichung zeigt, daß die relative Schwankung berechnet werden kann durch Berechnung der Kippfrequenz f _r aus der Dichtespektrums-Kurve. Dann kann das Verhältnis der relativen Schwankung angegeben werden durch die folgende Gleichung (7).This equation shows that the relative fluctuation can be calculated by calculating the sweep frequency f _r from the density spectrum curve. Then the ratio of the relative fluctuation can be given by the following equation (7).

Fig. 13 zeigt die Beziehung zwischen dem Verhältnis R der relativen Schwankung und der Antigen-Konzentration. Aus dieser Figur geht deutlich hervor, daß die unbekannte Konzentration eines Antigens berechnet werden kann durch Bildung des Verhältnisses R der relativen Schwankung vor und nach der Antigen-Antikörper-Reaktion. Das heißt vor der tatsächlichen Messung wird das Verhältnis R der relativen Schwankung bestimmt durch Verwendung von Standardproben mit bekannten Antigen-Konzentrationen zur Erstellung einer Eichkurve, die ähnlich der in Fig. 13 gezeigten Kurve ist. Dann wird das Verhältnis der relativen Schwankung für die Probe festgestellt und die zu bestimmende Antigen-Konzentration aus der Eichkurve abgelesen. Fig. 13 shows the relationship between the ratio R of the relative fluctuation and the antigen concentration. It is clear from this figure that the unknown concentration of an antigen can be calculated by forming the ratio R of the relative fluctuation before and after the antigen-antibody reaction. That is, before the actual measurement, the ratio R of the relative fluctuation is determined by using standard samples with known antigen concentrations to prepare a calibration curve that is similar to the curve shown in FIG. 13. Then the ratio of the relative fluctuation for the sample is determined and the antigen concentration to be determined is read from the calibration curve.

Das Verhältnis R der relativen Schwankung, wie es durch Gleichung (7) angegeben wird, kann berechnet werden als Verhältnis der integrierten Werte der Dichtespektrums- Kurve in einem niedrigeren Frequenzbereich. Das heißt, das Verhältnis R der relativen Schwankung kann auch entsprechend der folgenden Gleichung berechnet werden.The ratio R of the relative fluctuation as given by equation (7) can be calculated as the ratio of the integrated values of the density spectrum curve in a lower frequency range. That is, the ratio R of the relative fluctuation can also be calculated according to the following equation.

Wie aus den Fig. 10 und 11 hervorgeht, werden die integrierten Werte A und B des Dichtespektrums vor und nach der Reaktion erhalten durch Integration des Dichtespektrums von 10^-1 Hz bis 10¹ Hz. Daher ist der Tiefpaßfilter so zusammengesetzt, daß er diesen Frequenzbereich durchläßt.As shown in Figs. 10 and 11, the integrated values A and B of the density spectrum before and after the reaction are obtained by integrating the density spectrum from 10 ^-1 Hz to 10¹ Hz. Therefore, the low-pass filter is composed to pass this frequency range .

In den Fig. 10 und 11 ist das Verhältnis R der relativen Schwankung angegeben als Verhältnis der integrierten Werte A und B des Dichtespektrums im niedrigeren Frequenzbereich. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, das Verhältnis R der realtiven Schwankung bei einer bestimmten Frequenz im niedrigen Frequenzbereich, z. B. 10⁰ Hz, zu messen. In einem solchen Falle kann ein Digitalfilter anstelle des schnellen Fourier-Transformators angewandt werden und die gesamte Konstruktion kann sehr einfach werden und die Bearbeitungszeit sehr kurz.In Figs. 10 and 11, the ratio R is given to the relative variation as the ratio of the integrated values A and B of the density spectrum in the lower frequency range. According to the invention it is also possible to use the ratio R of the realistic fluctuation at a specific frequency in the low frequency range, e.g. B. 10⁰ Hz to measure. In such a case, a digital filter can be used in place of the fast Fourier transformer, and the whole construction can be very simple and the processing time can be very short.

Wenn die Größe der Teilchenaggregate verhältnismäßig gleichförmig ist, wird das Dichtespektrum vom Lorentz-Typ und nimmt ab umgekehrt proportional zum Quadrat der Frequenz jenseits der Kippfrequenz. Wenn die Aggregatgröße jedoch unterschiedlich ist, kann eine Überlagerung einer Vielzahl von Dichtespektrums-Kurven vom Lorentz-Typ mit unterschiedlichen Kippfrequenzen beobachtet werden und daher nimmt die Dichte des Spektrums nicht mehr umgekehrt proportional zu der Frequenz ab. Das bedeutet, daß eine Verteilung der Aggregatgröße aus einer Konfiguration der Dichtespektrums-Kurve im höheren Frequenzbereich deutlich werden kann. Solche Daten konnten nach bekannten Analyseverfahren nicht erhalten werden und sie sind sehr wertvoll zur Analyse der Antigen-Antikörper-Reaktion.If the size of the particle aggregates is relatively uniform, the density spectrum of the Lorentz type and decreases inversely proportional to the square of the frequency beyond the sweep frequency. If the aggregate size is different, however Superposition of a variety of density spectrum curves from Lorentz type observed with different tilt frequencies and therefore the density of the spectrum no longer increases inversely proportional to the frequency. That means, that a distribution of the aggregate size from a configuration the density spectrum curve clearly in the higher frequency range can be. Such data could be obtained using known analysis methods not be preserved and they are very valuable for analysis of the antigen-antibody reaction.

Bei der oben beschriebenen Arbeitsweise wurde Immunoglobulin G (IgG) als zu bestimmendes Antigen verwendet, es können jedoch auch beliebige andere Substanzen wie Immunoglobulin A (IgA), IgM, IgD, IgE, Australia-Antigen und Insulin, die zur Agglutination über eine Antigen-Antikörper- Reaktion führen, verwendet werden. Ferner wurde bei der oben beschriebenen Arbeitsweise Antikörper an die Oberfläche der Teilchen gebunden und Antigen in der Probe bestimmt. Es kann jedoch auch ein Antikörper in einer Probe bestimmt werden unter Verwendung von Teilchen, an die Antigen gebunden ist. Ferner wurden bei der oben beschriebenen Ausführungsform Polystyrol-Latexteilchen verwendet. Es können jedoch auch beliebige andere organische und anorganische Teilchen wie Glasperlen u. ä. verwendet werden. Darüber hinaus ist es möglich, teilchenförmige Substanzen zu verwenden, die direkt durch Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet werden. Wenn z. B. menschliches Villus Gonadotropin (HCG) als Antigen und anti-Human-Villus-Gonadotropin (Anti-HCG) als Antikörper verwendet wird, kann der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion gebildete Komplex direkt als Teilchen verwendet werden. Ferner kann ein Antigen selbst als Teilchen verwendet werden. Ein Beispiel für eine derartige Antigen-Antikörper- Reaktion ist die Reaktion, bei der Candida albicans (Hefe) als Antigen und Anti-Candida albicans als Antikörper verwendet wird. Darüber hinaus können Blutkörperchen, Zellen und Mikroorganismen als Teilchen verwendet werden.In the procedure described above, immunoglobulin G (IgG) used as the antigen to be determined however, can also use any other substances such as immunoglobulin A (IgA), IgM, IgD, IgE, Australia antigen and Insulin, which is used for agglutination via an antigen-antibody Cause reaction to be used. Furthermore, the above working method described antibodies to the surface of the particles bound and antigen determined in the sample. However, an antibody can also be determined in a sample are bound to the antigen using particles is. Furthermore, in the embodiment described above Polystyrene latex particles used. However, it can also any other organic and inorganic particles like glass beads u. Ä. are used. Beyond that it is possible to use particulate substances directly can be formed by antigen-antibody reaction. If e.g. B. human villus gonadotropin (HCG) as an antigen and anti-human villus gonadotropin (anti-HCG) as an antibody can be used by the antigen-antibody reaction formed complex can be used directly as particles. Furthermore, an antigen itself can be used as a particle will. An example of such an antigen-antibody Reaction is the reaction in which Candida albicans (yeast) used as an antigen and anti-Candida albicans as an antibody becomes. In addition, blood cells, cells and microorganisms can be used as particles.

Außerdem wird bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform die Messung ansatzweise durchgeführt, wobei die zu untersuchenden Lösungen nacheinander in die Zelle gegeben werden. Es kann jedoch auch kontinuierlich gearbeitet werden, wobei die Antigen-Antikörper-Reaktionsflüssigkeit kontinuierlich durch die Zelle strömt. Außerdem kann anstelle der beschriebenen Lichtquelle, die einen Laser mit kohärenten Licht aussendet, irgendeine beliebige Lichtquelle verwendet werden, die nicht kohärentes Licht aussendet. In addition, in the embodiment shown in FIG. 1, the measurement is carried out batchwise, the solutions to be examined being introduced into the cell one after the other. However, it is also possible to work continuously, with the antigen-antibody reaction liquid flowing continuously through the cell. In addition, any light source that emits non-coherent light can be used instead of the described light source that emits a laser with coherent light.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das beschriebene Verfahren und die dafür verwendete Vorrichtung zu den folgenden Vorteilen führen:In summary, it can be said that the described Method and the device used therefor lead to the following advantages:

1) Since it does not require reagents like enzymes and radioisotopes to use, which are expensive and difficult to use the analysis can be economical and easy be performed.
2) Because the accuracy and reproducibility of the invention Procedure is higher than other immunological Analyzes that work without marking, like that Immuno-electrophoresis, immunodiffusion and sedimentation it is possible to get reliable measurement results with high accuracy to obtain.
3) Since the measurement is carried out by proof of Fluctuations in intensity of the scattered light due to the Brownian motion of the particles makes it possible to be precise Perform measurements in a short time, even if the amount the sample to be examined is extremely small.
4) In contrast to the known method in which the mean diffusion constant from the change in the spectral Width of the scattered light is detected no spectrometer required according to the invention. Therefore the entire measuring device is kept small and cheap, and it is also possible to be very accurate and reliable To achieve measurement results.
5) Since the measurement on the density spectrum of the intensity fluctuations the scattered radiation, it is possible a lot of valuable information about the antigen-antibody Get response.

Der vorstehend verwendete Ausdruck "Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung" bedeutet das Dichtespektrum eines durch einen Fotodetektor, der durch Teilchen gestreutes Licht empfängt, erzeugten Stromes. Aufgrund der Brown'schen Bewegung der Teilchen schwankt dieser Austrittsstrom. Erfindungsgemäß wird das Dichtespektrum dieser Intensitätsschwankungen erzeugt.The expression "density spectrum of the Intensity fluctuations of the scattered radiation "means the density spectrum of a through a photodetector Receives scattered light, generated electricity. Due to Brownian motion of the particles fluctuates this exit stream. According to the density spectrum this produces fluctuations in intensity.

Das Dichtespektrum ist allgemein definiert durch die folgende GleichungThe density spectrum is generally defined by the following equation

in der ψ²×(f, Δ f) ein mittleres Quadrat in einer Zeitspannung zwischen f und f+Δ f ist und dieses mittlere Quadrat angegeben wird durchin which ψ ² × ( f, Δ f ) is a mean square in a time voltage between f and f + Δ f and this mean square is given by

Daher kann das Dichtespektrum beschrieben werden durch die Gleichung (2). Das Dichtespektrum ist daher ein Maß für die Intensität zwischen f und f+Δ f und hat daher die Dimension (Amplitude)²/Frequenz, d. h. Ampere²/Hertz. Um die von der Lichtquelle herrührende Schwankung auszuschalten, wurde das Dichtespektrum mit Ampere² normiert. Das ergibt die in den Figuren angewandte Einheit 1/Hertz.Therefore, the density spectrum can be described by equation (2). The density spectrum is therefore a measure of the intensity between f and f + Δ f and therefore has the dimension (amplitude) ² / frequency, ie Ampere² / Hertz. In order to eliminate the fluctuation resulting from the light source, the density spectrum was standardized with Ampere². This results in the unit 1 / Hertz used in the figures.

Claims

1. A method for measuring immunological reactions, in which radiation is impinged on a reaction liquid which contains at least antigen and antibody, and which measures radiation scattered by particulate substances in the reaction liquid, characterized in that the density spectrum of the intensity fluctuations of the scattered radiation is determined and receives the antigen-antibody response based on this density spectrum.

2. The method according to claim 1, characterized, that the antigen-antibody response is in accordance with a change in the tilt frequency of the density spectrum is measured becomes.

3. The method according to claim 2, characterized, that the antigen-antibody response is measured by formation the ratio of the flip frequency before and after the antigen-antibody Reaction.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized, that the antigen-antibody response is measured by measurement a change in the density spectrum in a low frequency range.

5. The method according to claim 4, characterized in that the low frequency range is in the range of 10 ^-1 Hz to 10¹ Hz.

6. The method according to claim 4, characterized in that measured the antigen-antibody response is built by forming the ratio of the Value of the density spectrum in the low frequency range before and after the antigen-antibody reaction.

7. The method according to claim 4, characterized in that measured the antigen-antibody response is determined by forming the ratio of the relative Fluctuation of the density spectrum in the low frequency range before and after the antigen-antibody reaction.

8. The method according to claim 4, characterized in that measured the antigen-antibody response is determined by forming the ratio of the relative Fluctuation of the density spectrum at a frequency in the lower Frequency range.

9. The method according to claim 1, characterized in that measured the antigen-antibody response will change according to the Density spectrum in the higher frequency range.

10. The method according to claim 1 to 9, characterized in that the scattered light is measured homodyne becomes.

11. The method according to claim 1 to 9, characterized in that the scattered light is measured heterodyne becomes.

12. The method according to claim 1 to 11, characterized, that the particulate substances have been formed from Particles that are initially introduced into the reaction liquid have been bound to the surface and antigen or antibody is.

13. The method according to claim 12, characterized, that the particles are made of polystyrene latex.

14. The method according to claim 1 to 11, characterized, that the particulate substances are formed from particles, that arise during the antigen-antibody reaction itself.

15. The method according to claim 1 to 14, characterized, that the radiation is coherent laser light.

16. Device for measuring immunological reactions for carrying out the method according to one of the preceding claims
a light source that emits a beam of light,
a cell that contains an antigen-antibody reaction liquid,
optical devices for projecting the light emitted by the light source into the cell,
Photodetectors for recording the light scattered by the particulate substance in the antigen-antibody reaction liquid to produce an electrical output signal,
marked by
Means for receiving the electrical output signal from the photodetector and for generating a density spectrum of the intensity fluctuations of the scattered radiation and
Means for measuring the antigen-antibody response based on the density spectrum.

17. The apparatus according to claim 16, characterized in that the light source has a coherent Includes light emitting laser.

18. The apparatus according to claim 16, characterized in that they have additional means of limitation the field of view of the photodetector over a smaller area as a dot pattern.

19. The apparatus of claim 18, wherein the limiting means a collimator with a tubular part of the field of vision and two arranged at both ends of the tubular part optical holes.

20. The apparatus of claim 19, wherein the collimator is constructed to correspond to the following equation in which L indicates the distance between the two holes, a ₁ and a ₂ are the radii of the holes and n indicates the refractive index of the medium contained in the tubular part and λ indicates the wavelength of the light emitted by the light source.

21. The apparatus according to claim 16 to 20, characterized in that that the cell is made of transparent or transparent quartz.

22. The apparatus according to claim 16, characterized in that the means for generating the density spectrum an analog-to-digital converter and a fast one Includes Fourier transformer.

23. The method according to claim 2, characterized, that the antigen-antibody reaction based on the Measurement of the relative signal fluctuation resulting in the breakover frequency becomes.

24. The method according to claim 23, characterized, that the antigen-antibody response is measured by: the ratio of the relative fluctuations before and after the Antigen-antibody response is determined.