DE3490215T

DE3490215T - Verfahren zur Herstellung von 1α,25-dihydroxyliertem Vitamin D↓2↓ und verwandten Verbindungen

Info

Publication number: DE3490215T
Application number: DE19843490215
Authority: DE
Inventors: Hector F. Deluca; Heinrich K. Madison Wis. Schnoes; Rafal R. Warschau/Warszawa Sicinski; Yoko Madison Wis. Tanaka
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1983-05-09
Filing date: 1984-05-09
Publication date: 1985-05-15
Also published as: DK8685A; DE3448412C2; JPH0610188B2; JPH02288829A; JPH0339505B2; DE3448360C2; DK8685D0; NL8420137A; AU568549B2; AU3011584A; CH665834A5; DK172567B1; NL193245B; DK184588D0; NL193245C; DK184588A; DE3490215C2; DK172733B1; WO1984004527A1; JPH02288873A

Description

3430215

PATENTANWÄLTE Dr. rer. nat. DIETER LOUlS Dlpl.-Phys. CLAUS POHLAU Dipl.-Ing. FRANZ LOHRENTZ Dipl.-Phys.WOLFGANG SEGETH KESSLERPLATZ 1

8500 NORNBERO 20

Wisconsin Alumni Research Foundation 614 North Walnut Street Madison, Wisconsin 53705 - USA

Verfahren zur Herstellung von 1^,25-

dihydroxyliertem Vitamin D₂ und verwandten Verbindungen

Beschreibung

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Herstellung von 1*,25-dihydroxylierten Verbindungen der Vitamin D -Serie.

Insbesondere betrifft die Verbindung die Herstellung von 1 o(, 25-Dihydroxyvitamin D„ und dessen ( 24R) -Epimer , der entsprechenden 5,6-trans-Isomeren und bestimmterC-25-Alkyl- oder Aryl-Analogverbindungen, wie auch der Acylderivate dieser Verbindungen.

Hintergrund

Die Bedeutung der hydroxylierten Formen von Vitamin D als Regulatoren des Calcium- und Phosphat-Metabolismus in Tieren und Menschen ist nunmehr aufgrund vieler Veröffentlichungen in der Patentliteratur und der allgemeinen

Literatur anerkannt, und als Folge daraus finden diese Hydroxyvitamin D-Derivate steigende klinische und veterinärmedizinische Verwendung als Medikamente zur Behandlung und zur Heilung von Erkrankungen dos Calciummetaboli sinus und damit zusammenhängender Knochenerkrankungen. Es ist bekannt, daß Vitamin D₃ in vivo zum 25-Hydroxyvitamin D₃ und dann zum 1¹*, 2 5-Dihydroxyvitamin D-, hydroxyliert wird, wobei das letztere allgemein als die aktive hormonale Form von Vitamin D-. akzeptiert wird. In ähnlicher Weise wird der sehr wirkungsfähige Vitamin D„-Metabolit, 1^,25-Dihydroxyvitamin D₂ (1o<,25-(OH)'D„) aus Vitamin D„ über 25-Hydroxyvitamin D₂ (25-OH-D₂) gebildet. Diese beiden hydroxylierten Vitamin D„-Verbindungen wurden isoliert und identifiziert (DeLuca et al, ÜS-PSen.3 585 221, 3 880 894); wenn sie von Vitamin D₂ abgeleitet sind, so sind diese Metaboliten durch die (S)-Stereochemie am Kohlenstoffatom 24 charakterisiert.

Beschreibung der Erfindung

Es wurde nun ein chemisches Verfahren zur Herstellung von λα,25-dihydroxylierten Verbindungen der Vitamin Dp-Serie entwickelt. Insbesondere schafft dieses Verfahren ein bequemes Mittel zur Herstellung von Verbindungen der unten dargestellten allgemeinen Strukturen A und B

worin R₁, R₃ und R₃ aus der Gruppe von Wasserstoff und Acyl ausgewählt sind, und worin X einen Alkyl- oder Arylrest bedeutet. In diesen Strukturen kann das asymmetrische

■■■■'-' ^η:· _ΨΗ ■";■. ■'■■'■ ""■ . 3Α9Ό21

Zentrum am Kohlenstoffatom 24 die (R)- oder (S)-Konfiguration aufweisen.

Spezielle Beispiele der nach dem erfindungsgemäßen Verfahreu zu erhaltenden Verbindungen umfassen 1X, 25-üihydroxyvitamin D₂, das entsprechende (24R) -Epimere, 1<x,25-Dihydroxy-24-epivitamin D₂, die entsprechenden 5,6-trans-lsomeren, d.h. 5, 6-trans-iix, 25-Dihydroxyvitamin D„ und 5,6-trans-1 <x, 25-Dihydroxy-24-epivitamin D„, wie auch die C-25-Alkyl- oder Arylhomologen dieser Verbindungen, d.h. die Verbindungen mit den oben dargestellten Formeln, worin X für Ethyl, Propyl, Isopropyl oder Phenyl steht.

In der folgenden Beschreibung bedeutet der Begriff "Acyl" einen aliphatischen Acylrest (Alkanoy!gruppe) mit 1 bis Kohlenstoffatomen in allen möglichen isomeren Formen, beispielsweise Formyl, Acetyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl, etc., oder einen aromatischen Acylrest (Aroylgruppe) wie Benzoyl oder die mit Methyl, Halogen oder Nitro substituierten Benzoylgruppen, oder einen Acylrest, der von einer Dicarbonsäure der allgemeinen Formeln ROOC (CH_?) CO- oder ROOCCHp-O-CH2CO- abgeleitet ist, worin η eine ganze Zahl mit den Werten von 0 bis einschließlich 4 ist und R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet. Repräsentativ für derartige Dicarbonsäure-Acylreste sind Oxalyl, Malonyl, Succinoyl, Glutaryl, Adipyl und Diglykolyl. Der Begriff "Alkyl" betrifft einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in allen isomeren Formen, beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, etc. Der Begriff "Aryl" betrifft einen aromatischen Rest, wie Phenyl, Benzyl oder die isomeren alkyl-substituierten Phenylreste.

Eine Ausführungsform des chemischen Verfahrens gemäß der Erfindung ist in dem angefügten Verfahrensschema I aufgezeichnet. In der folgenden Beschreibung dieses Verfahrens

-■ ' 3AS0215

* ¹P.

bezeichnen die Zahlen (z.B. 1, 2, 3, etc.) spezifische Produkte und beziehen sich auf die so bezeichneten Strukturen im Verfahrensschema I. Eine wellenförmige Linie am Substituenten (Methyl) am C-24 zeigt an, daß dieser Substituent sowohl R- als auch S-Konfiguration aufweisen kann.

Ein geeignetes Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist das Vitamin D-Ketalderivat der Struktur (1). Es ist allgemein zweckmäßig (z.B. in dem Falle, wenn beide C-24-Epimeren von 1tf,25-Dihydroxyvitamin D^-Verbindungen gewünscht sind) Verbindung (1) als ein Gemisch von 24R- und S-Epimeren zu verwenden, wobei die Trennung der individuellen 24R- und-S-Epimeren in einer späteren Stufe des Verfahrens durchgeführt wird. Jedoch ist das reine 24S- oder das reine 24R-Epimer von (1) in gleicher Weise als Ausgangsmaterialien geeignet, wobei die erstgenannte Verbindung nach der Verarbeitung über die angezeigten Syntheseschritte das (24S)-1 ex, 25-Dihydroxyprodukt zur Verfügung stellt, während die letztgenannte Verbindung bei analoger Behandlung das entsprechende (24R) -1o(, 25-dihydroxylierte Produkt liefert. .

Das Ausgangsmaberial (1) wird in die gewünschte ίχ-hydroxylierte Form über Cyclovitamin D-Derivate (DeLuca et al., US-PSen 4 195 027 und 4 260 549) überführt. So ergibt die Behandlung der Verbindung (1) mit Toluolsulfonylchlorid in herkömmlicher Weise das entsprechende C-3-Tosylat (2), welches in einem alkoholischen Medium solvolysiert wird, um das neue 3,5-Cyclovitamin D-Derivat (3) zu ergeben. Die Solvolyse in Methanol ergibt das Cyclovitamin der Struktur (3), worin Z gleich Methyl ist, während die Verwendung anderer Alkohole, z.B. Ethanol, 2-Propanol, Butanol, etc., in dieser Reaktion die analogen Cyclovitamin D-Verbindungen (3) ergibt, worin Z einen von dem Alkohol abgeleiteten Alkylrest darstellt, z.B. Ethyl, Isopropyl, Butyl, etc. Allyloxidation der Zwischenverbindung (3) mit Selendioxid und einem Hydroperoxid ergibt die liX-Hydroxy-Analogverbin-

dung der Struktur (4).Die anschließende Acetylierung der Verbindung (4) schafft das 1-Acetat der Struktur (5, R₁ = Acetyl). Wenn es gewünscht wird, werden andere 1-0-Acylate (Struktur 5, worin R-. = Acyl ist, z.B. das Formiat, Propionat, Butyrat, Benzoat, etc.) durch analoge herkömmliche Acyliefungsreaktionen hergestellt. Das 1-O-Acylderivat wird sodann einer säurekatalysierten Solvolyse unterworfen. Wenn diese Solvolyse in einem Lösungsmittelinedium durchgeführt wird, welches Wässer enthält, so wird die 5,6-cis-Vitamin D-Zwischenverbindung der Struktur (6, R₁ = Acyl, R₂ = H) und die entsprechende 5,6-trans-Verbindung (Struktur 7, R₁ = Acyl, R- = H) in einem Verhältnis von etwa 3 bis 4 : 1 erhalten. Diese 5,6-cis- und 5,6-trans-Isomeren können in dieser Stufe getrennt werden, z.B. durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Wenn es gewünscht wird, kann die C-1-O-Acylgruppe durch Basenhydrolyse entfernt werden, um Verbindungen (6) und (7) zu erhalten, worin R₁ und R„ = H ist. Ferner können gewünschtenfalls diese 1-0-Monoacylate weiter an den C-3-Hydroxylgrup-P^en acyliert werden, wobei herkömmliche Acylierungsbedingungen verwendet werden, um die entsprechenden 1,3-Di-O-acylate der Struktur (6) oder (7) zu erhalten, worin R₁ und R₂, die gleich oder unterschiedlich sein können, Acylgruppen darstellen. Alternativ dazu kann das Hydroxycyclovitamin der Struktur (4) einer säurekatalysierten Solvolyse in einem Medium unterworfen werden, welches eine organische Säure niederen Molekulargewichts enthält, um die 5,6-cis- und trans-Verbindungen der Strukturen (6) und (7) zu erhalten, worin R₁ = H und R_ = Acyl sind, wobei die Acylgruppe sich von der Säure ableitet, die in der Solvolysereaktion verwendet wird.

Die nächste Stufe des Verfahrens umfaßt die Entfernung der Ketal-Schutzgruppe zur Herstellung des entsprechenden 25-Ketons. Dieser Schritt ist kritisch, da die Umwandlung des Ketals zum Keton ohne begleitende Isomerisierung der 22(23)-Doppelbindung zu der konjugierten 23 (24)-Stellung,

die unter den sauren Bedingungen, die für die Ketalhydrolyse erforderlich sind, auftreten kann, durchgeführt werden muß. Ferner müssen die Bedingungen so ausgewählt werden, um eine Eliminierung der empfindlichen Allyl-C-1-Sauerstoffunktion zu vermeiden. Die Umwandlung wird erfolgreich durch vorsichtige Hydrolyse bei gemäßigten Temperaturen unter Verwendung organischer Säurekatalyse durchgeführt. So gibt die Behandlung der 5,6-cis-Verbindung (6) in wässrigem Alkohol mit p-Toluolsulfonsäure das entsprechende Keton (8). Um die unerwünschte Eliminierung der C-1-Sauerstoffunktion während dieser Reaktion zu vermeiden, ist es vorteilhaft, daß die C-1-Hydroxylgruppe in Verbindung (6) geschützt ist (z.B. R₁ = Acyl, R₂ = Wasserstoff oder Acyl).

Die nachfolgende Reaktion des Ketons (8) mit einem Methyl-Grignard-Reagens liefert dann die gewünschte Verbindung 1 ex, 25-Dihydroxyva tam.in D₇ der Struktur (^c)). Wenn das Λιι:;-gangsmaterial, die Verbindung (1), die in dem obigen Verfahren eingesetzt wird, ein Gemisch der beiden C-24-Epimeren ist, so wird die Verbindung (9) als ein Gemisch der 24S- und R-Epimeren (9a bzw. 9b) erhalten. Die Trennung dieses Epimerengemisches kann durch chromatographische Methoden erfolgen, um 1y,25-Dihydroxyvitamin D- (Struktur 9a, 24S-Stereochemie) und dessen 24R-Epimeres, 1^,25-Dihydroxy-24-epivitamin D₃ der Struktur 9b zu erhalten, die beide in reiner Form vorliegen. Eine derartige Trennung von Epimeren ist natürlich nicht erforderlich, wenn die Verbindungen zur Verwendung als ein Gemisch vorgesehen sind.

Die 5,6-trans-25-Ketal-Zwischenverbindung der Struktur (7), die in einer analogen Weise einer Ketalhydrolyse unterworfen wird, liefert die 5,6-trans-Ketonverbindung der Struktür (10), welche über eine Grignard-Reaktion mit Methylmagnesiumbromid oder einem analögen Reagens die 5,6-trans-1cx,25-Dihydroxyvitamin D₂-Verbindungen der Struktur (11)

_Ψ ρ ■ 3430215

als das 24S- oder 24R-Epimere oder als Gemisch beider Epi— nieren in Abhängigkeit von der Natur des Ausgangsrnaterials (1), welches in dem Verfahren verwendet wird, schafft. . Wenn die Epimeren als ein epimeres Gemisch erhalten werden, könrien sie durch Chromatographie getrennt werden, um 5,6-trans-1*,25-Dihydroxyvitamin D„ (11a) und dessen 24R-Epimer, 5 , 6-trans- W, 25-Dihydroxy-24-epivitarnin D~ der Struktur (11b) zu erhalten. Diese Reaktionsschritte unter Verwendung der 5,6-trans-Zwischenverbindung werden in einer Weise geführt, die derjenigen völlig analog ist, die auf die 5,6-cis-Verbindungen gemäß obiger Beschreibung angewandt werden.

Die neuen Seitenkettenketone der Strukturen (8) oder (10) sind sehr zweckmäßige und vielseitig"verwendbare Zw.i schenverbindungen, da sie zur Herstellung einer Vielzahl von 1«*., 25-Dihydroxyvitamin D_-Seitenkettenanalogverbindungen verwendet werden können. Speziell können diese Keto-Zwischenverbindungen zur Herstellung von 5,6-cis- oder 5,6-trans-1ai, 25-Dihydroxyvitamin D^-Analogverbindungen mit der allgemeinen Seitenkettenformel gemäß folgender Darstellung

•ort

ι ι

^ ^X

worin X einen Alkyl- oder Arylrest daryle] Jt, eingesetzt werden.

Beispielsweise ergibt die Behandlung von Keton (8) mit Ethylmagnesiunibromid die entsprechende llydroxyvitamin D_?- Analogverbindung mit der oben dargestellten Seitenkettenstruktur, worin X eine Ethylgruppe ist. In ähnlicher Weise ergibt die Behandlung von (8) mit Lsopropylnuigncsiumbromid oder Phenylmagnesiumbromid die Seitenketten-Analogverbindungen, worin X Isopropyl bzw. Phenyl ist. Analoge Behandlung der 5,6-trans-25-Keton-Zwischenverbindung der Struktur (10) mit Alkyl- oder Aryl-Grignard-Reagentien

ergibt die 5,6-trans-Vitamin D„-Analogverbindung mit der obigen Seitenkette, worin X der Alkyl- oder Arylrest ist, der durch das verwendete Grignard-Reagens eingeführt wird.

Es ist ebenfalls offensichtlich, daß die Reaktion der Keto-· Zwischenverbindungen (8) oder (10) mit einem isotopisch

3 14 markierten Grignard-Reagens (z.B. C H-MgBr, C H,MgBr,

2
C II MgBr, etc.) ein geeignetes Mittel zur Herstellung von 1¹X, 25-Dihydroxyvitamin D~ oder dessen trans-Isomer und den entsprechenden C-24-Epimeren in isotopisch markierter Form zur Verfügung stellt, d.h. als die Verbindungen mit

3 14 der oben dargestellten Seitenkette, worin XC H , C H^,

2 13 J j

C H , C H-. oder eine beliebige andere, mit Isotopen markierte ausgewählte Alkyl- oder Arylgruppe ist.

Die obigen Alkyl- oder Aryl-Homologen des 5,6-cis- oder trans-ίλ,25-Dihydroxy-vitamins D₉ sind wertvolle Ersatzverbindungen der Stammverbindungen in Situationen, in denen ein größeres Maß an Lipophilität gewünscht ist, während die oben erwähnten, mit Isotopen markierten Verbindungen als Reagentien in analytischen Anwendungen verwendet wer-

Wenn auch für therapeutische Anwendungen die freien Hydroxy!verbindungen, die durch die obigen Strukturen Λ und B dargestellt sind (worin R₁, R„ und R, = H gilt) allgemein verwendet werden, können für einige derartiger Anwendungsgebiete die entsprechenden Hydroxy-geschütztcn Derivate zweckmäßig oder bevorzugt sein. Derartige Hydroxygeschützten Derivate sind beispielsweise die acylierten Verbindungen, die durch die allgemeinen Formeln A und B oben angegeben sind, worin einer oder mehrere der Reste R^, R₉ und R-, einen Acylrest darstellen.

Derartige Acy] derivate .worden zwoekmäß i rjorwoiso aus den freien Hydroxyverbindungen durch herkömmliche Acylierungsverfahren hergestellt, d.h. durch Behandlung eines der

3430215

Hydroxyvitamin D^-Produkte mit einem Acylhalogenid oder Säureanhydrid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Pyridin oder einem Alkylpyridin. Durch geeignete Auswahl der Reaktionszeit, des Acylierungsmittels, der Temperatur und des Lösungsmittels, wie sie dem Fachmann bekannt sind, werden die teilweise oder vollständig acylierten Derivate, die durch die obigen Strukturen A oder B angegeben sind, erhalten. Beispielsweise ergibt die Behandlung von 1«\,25-Dihydroxyvitamin D„ (9a) in Pyridin-Lösungsmittel mit Essigsäureanhydrid bei Raumtemperatur das 1,3-Diacetat, während dieselbe Reaktion, durchgeführt bei erhöhter Temperatur, das entsprechende 1,3,25-Triacetat ergibt. Das 1,3-Diacetat kann weiter am C-25 mit einer unterschiedlichen Acylgruppe acyliert werden; beispielsweise wird durch Behandlung mit Benzoylchlorid oder Succinsäureanhydrid das 1,3-Diacetyl-25-benzoyl- bzw. das 1,3-Diacetyl-25-succinoylderivat erhalten. Ein 1,3,25-Triaeylderivat kann selektiv in einer milden Base hydrolysiert werden, um die 1,3-Dihydroxy-25-O-acylverbindung zu schaffen, wobei die freien Hydroxylgruppen davon erneut, wenn dies gewünscht wird, mit unterschiedlichen Acylgruppen acyliert werden können. In ähnlicher Weise kann ein 1 ,3-Diacylderivat: einer partiellen Acylhydrolyse unterworfen werden, um die 1-O-Acyl- und die 3-0-Acylverbindungen zu erhalten, die wiederum mit unterschiedlichen Acylgruppen reacyliert werden können. Ähnliche Behandlung irgendeines der anderen Hydroxyvitamin D„-Produkte (z.B. 9b, 11a/b oder deren entsprechende 25-Alkyl- oder Arylanalogenverbindungen) liefert die entsprechenden gewünschten Acylderivate, die durch die Strukturen A oder B angegeben sind, worin irgendeiner oder alle der Reste R.., R- und R-. Acylreste sind.

Wie der vorher bekannte Vitamin D„-Metabolit, 1.^,25-Dihydroxyvitamin D~ (9a), zeigen die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen ausgesprochene Vitamin D-ähnliche Aktivität

3430215

und stellen somit wünschenswerte Ersatzstoffe für die bekannten Vitamin D~- oder -D_.-Metaboliten in vielen therapeutischen oder veterinärmedizinischen. Anwendungsformen dar. Besonders bevorzugt in dieser Hinsicht sind die Produkte der Struktur 9b und 11a und 11b oder deren acylierte Derivate. Die neuen Verbindungen können zur Korrektur oder Verbesserung einer Vielzahl von Gleichgewichtsstörungen des Calcium- und Phosphathaushalts, die aus einer Vielzahl von Erkrankungen rühren, verwendet werden, wie beispielsweise bei gegenüber Vitamin D resistenter Rachitis, Knochenerweichung, Unterfunktion der Nebenschilddrüsen, Osteodystrophie, Pseudohypoparathyreoidismus, Osteoporose, Pagets-Erkrankung und ähnlichen Knochenerkrankungen und vom Mineralhaushalt herrührende Erkrankungen, die aus der medizinischen Praxis bekannt sind. Die Verbindungen können ebenfalls zur Behandlung bei gestörten Mineralgleichgewichten bei Tieren verwendet werden, wie beispielsweise bei Milchfieber, Geflügel-Boinschwächo (poultry leg weakness) oder zur Verbesserung der-Eischalenqualität von Geflügel.

Ihre Verwendung bei der Bekämpfung von Osteoporose ist besonders bemerkenswert.

Es ist bekannt, daß Frauen zur Zeit der Menopause einen merklichen Verlust an Knochenmasse erleiden, wodurch letztlich Anlaß zum Auftreten von Knochenerkrankungen (Osteopenia) gegeben wird, die ihrerseits Anlaß geben zu spontanen Zertrümmerungsbrüchen der Wirbelknochen (Vertebrae) und zu Frakturen der langen Knochen. Diese Erkrankung ist allgemein bekannt als Postmenopausen-Osteoporöse und stellt ein wesentlichen medizinisches Problem in den Vereinigten Staaten von Amerika und in den meisten anderen Ländern dar, in denen die Lebensspanne von Frauen mindestens 60 und 70 Jahre erreicht. Allgemein wird die Erkrankung, die häufig von Knochenschmerzen und eingeschränkter physischer Aktivität begleitet ist durch einen oder zwei vertebrale Zertrümmerungsfrakturen diagnostiziert, wobei Röntgenstrahlen Hinweis geben auf die ver-

"'■ ^3AS3215 minderte Knochenmasse. Es ist bekannt, daß diese Erkrankung begleitet ist von einer verminderten Fähigkeit zur Absorption von Calcium, verminderten Niveaus an Sexualhormonen, insbesondere Östrogen und Androgen, und einem negativen Calciumgleichgewicht.

Die Verfahren zur Behandlung der Erkrankung haben sich bemerkenswert verändert. Beispielsweise war die Calciumergärizung selbst nicht erfolgreich bei der Verhinderung oder Heilung der Erkrankung und die Injektion von Sexualhormonen, insbesondere östrogen, die als wirksam zur Verhinderung eines raschen Verlustes an Knochenmasse, der von Frauen in der Postmenopause erlitten wurde, berichtet wurde, wurde durch die Furcht vor der möglichen Karzinogenität des Hormons kompliziert. Andere Behandlungen, von denen wieder verschiedene Ergebnisse berichtet wurden, umschlossen eine Kombination von Vitamin D in großen Dosen, Calcium und Fluorid. Das primäre Problem bei diesem Ansatz besteht darin, daß Fluorid strukturell ungesunde Knochen induziert, die als gewirkte Knochen (woven bone) bezeichnet werden und zusätzlich eine Anzahl von Nebeneffekten hervorruft, wie ein gesteigertes Auftreten von Frakturen und gastrointestinaler Reaktion auf große Mengen an verabfolgtem Fluorid.

Ähnliche Symptome charakterisieren die Altersosteoporose und die durch steroid induzierte Osteoporose, wobei die letztere ein anerkanntes Ergebnis einer Langzeit-Glucocorticoid-Behandiung (Coritco-Steroid) für bestimmte Krankheitszustände ist.

Während verschiedene Metaboliten von Vitamin D_ die CaI-ciumabsorption und die Calciumretention innerhalb des Körpers von Säugetieren steigern und eine physiologische Tendenz besitzen oder einen Hinweis darauf liefern zum Verlust von Knochenmasse, sind sie ebenfalls charakterisiert durch die komplementären Vitamin D-ähnlichen Eigen-

. 3 A 9 O 2 1 5

ix Al·

schäften der Mobilisierung des Calciums im Knochen in Reaktion auf physiologische Bedürfnisse. Es wurde gefunden, daß die Epi-Verbindungen gemäß der Erfindung, insbesondere 24-Epi-1.X,25-dihydroxyvitamin D ( 24-Epi-1 , 25- (OH) ~- D₉) außerordentlich geeignet sind zur Verhinderung oder zur Behandlung von physiologischen Erkrankungen bei Säugetieren, die durch den Verlust an Knochenmasse charakterisiert sind, da sie, wenn sie auch einige der bekannten Vitamin D-ähnlichen Merkmale aufweisen, die den Calciummetabolismus beeinflußen, wie Steigerung des intestinalen Calciumtransports und Bewirkung der Knochen-Mineralisioruna, sie aber nicht die Seruin-Calciumniveaus, auch nicht bei hohen Dosierungen steigern. Dieses beobachtete Merkmal zeigt an, daß die Verbindungen nach der Verabfolgung nicht den Knochen mobiliseren. Diese Tatsache zusammen mit der Fähigkeit der Verbindungen, nach Verabfolgung Knochen zu mineralisieren, zeigt an, daß sie ideale Verbindungen zur Verhinderung oder zur Behandlung von häufigen Calciumerkrankungen sind, die durch den Verlust von Knochenniasse angezeigt werden, wie beispielsweise Postmenopausen-Osteoporose, Altersosteoporose und steroid-induzierte Osteoporose. Es ist offensichtlich, daß die Verbindungen rasche Anwendung finden werden zur Verhinderung oder zur Behandlung anderer Erkrankungen, in denen der Verlust an Knochonmasse eine Indikation ist, wie die Behandlung von Patienten, die einer Nierendialyse unterliegen, wobei ein Verlust an Knochenmasse als Folge der Dialyse auftritt.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Charakteristika von 24-Epi-1,25-(OH) ^p₂ , die zur außerordentlichen Geeignetheit zur Verhinderung oder zur Behandlung von Erkrankungen, die einen Verlust an Knochenmasse bewirken, beitragen.

^;-^v : ■■■ -^::- 34S0215 * AH

■ 1 ■ Beispiel · 1

Männliche Weanling-Ratten wurden auf cine Vitamin D-arme Diät gesetzt, wie sie von Suda et al., Journal of Nutrition 100, Seiten 1049-1052 (1970) beschrieben wird, die derart modifiziert ist, daß sie 0,02 % Calcium und 0,3 % Phosphor enthält. Nach 2 Wochen dieser Diät wurde den Tieren entweder 1,25-Dihydroxyvitamin D^ oder 24-Epi-1,25-dihydroxy- ^ vitamin D~ 13^i ich durch subkutane Injektion in 0,1 ml 5 %-igem Ethanol in Propandiol verabfolgt. 12 Stunden nach der letzten Dosis wurden die Tiere getötet und das Blut-, calcium und der intestinale Calciumtransport wurden gemessen. Die Ergebnisse dieser Messungen für die angezeigten Niveaus der verabfolgten Verbindungen sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt. Die Messungen des intestinalen CaI-ciumtransports, die in Figur 2 dargestellt sind, wurden nach dem Verfahren von Martin und DeLuca, American Journal of Physiology 216, Seiten 1351-1359 (1969), durchgeführt.

Beispiel 2

Männliche Weanling-Ratten wurden auf eine Diät mit hohem Calciumgehalt (1,2 £ Calcium) und niedrigem Phosphorgchalt (0,1 % Phosphor) gesetzt, wie sie von Suda et al (oben) beschrieben wurde. Die Ratten wurden mit dieser Diät für eine Zeit von 3 Wochen gefüttert, wonach sie in zwei Gruppen getrennt wurden. Einer Gruppe wurde T,25(OH)_?D verabfolgt,¹ während die anderen Gruppen 24-Epi-1,25(OH)₂D₂ ^er~ hielt, jeweils in 0,1 ml 5 %-igem Ethanol in Propandiol subkutan mit den Dosierungsniveaus der Verbindungen, die durch die Datenpunkte in Figur 3 gezeigt sind. Diese Dosen wurden täglich fortgesetzt für eine Zeit von 7 Tagen, worauf die Tiere getötet wurden und anorganischer Phosphor im Serum bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt.

Die Knochenasche wurde untersucht, indem die Oberschenkelknochen von den Ratten entfernt wurden. Die Oberschenkelknochen wurden von dem anhaftenden Bindegewebe befreit, 24 Stunden in absolutem Ethanol extrahiert und 24 Stunden in Diethylether extrahiert, wobei eine Soxhlet-Extrahiervorrichtung verwendet wurde. Die Knochen wurden bei 6 00⁰F für 24 Stunden verascht. Das Aschegewicht wurde durch Wiegen zu konstantem Gewicht ermittelt. Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt.

Die Ergebnisse der beiden Untersuchungen, die in den Beispielen 1.und 2 oben beschrieben wurden, zeigen an, daß 24-Epi-1 ,25-(OH) ₂D etwa gleich wirksam ist wie 1-X,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D-) hinsichtlich der Verursachung der Mineralisierung von Knochen und bezüglich der Stimulierung des intestinalen Calciumtransports. Kurz gesagt besteht keine wesentliche Differenz zwischen den beiden Gruppen in Figur 2 und Figur 4. Andererseits ist die Steigerung des anorganischen Phosphors im Serum, die aus der Knochenmobilisierung im Falle der Diät mit geringem Phosphorgehalt bewirkt wird, sehr deutlich durch 1,25-(OH)₂D₂ beeinflußt, jedoch kaum durch 24-Epi-1,25(OH) ₂ ^D ₂ stimuliert. In ähnlicher Weise hat bei der Mobilisierung von Calcium aus Knochen, wie durch die Serum-Calciumniveaus (Figur 1) sogar bei dem außerordentlich hohen Dosierungsniveau von etwa 750 pMol/Tag angezeigt ist, die 24-Epi-Verbindung keine Wirkung, während der Mobilisierungseffekt bei viel geringeren Dosierungen von 1,25-Dihydroxyvitamin D₂ deutlich ist. Da der Anstieg des Serumcalciums bei Ratten unter einer Diät mit niedrigem CaI-ciumgehalt die Fähigkeit zur Knochenmobilisierung mißt, und da die Steigerung des Blutphosphors bei Tieren unter einer Diät mit niedrigem Phosphorgehalt ebenfalls die Knochenmobilisierung mißt, zeigen diese Ergebnisse, daß 24-Epi-1,25-(OH)₂D eine unerwartete Eigenschaft zur Verfügung stellt, nämlich daß es von minimaler Wirksamkeit zur Mobilisierung von Knochencalcium ist, während es in

vollem Umfang fähig ist, den intestinalen Calciumtranspüri. und die Mineralisierung von neuem Knochen zu stimulieren, Eigenschaften, die diese Verbindung sehr geeignet machen für die Behandlung vqn Erkrankungen, die einen Knochenver-

lust bewirken. ^! :

Die einzigartigen Merkmale von 24-Epi-1 ,25- (011).„D , wie sie oben erwähnt wurden, bieten die seltene. Gelegenheit, die verschiedenen Ansprechprozesse auf Vitamin D (intestinale Calciumabsorptipn, Knochenmineralien-Mobilisierung ;..' und Knochenmineralisierung) in einer Weise und in einem Ausmaß, die bislang nicht durchführbar waren. Diese Möglichkeit erwächst aus der Tatsache, daß die 24-Epi-Verbindung gemäß der Erfindung dem Säugetier entweder allein (mit geeigneten und vertraglichen Trägern) oder in Kombination mit anderen Vitamin D-Derivaten, welche das volle / Spektrum der D-ähnlichen Aktivität zeigen, verabfolgt werden. Durch derartige Messungen ist es somit möglich, (zu welchem auch immer gewünschten Ausmaß) die Spezifität der Wirkungsweise des 24-Epi-Analogen mit der Allgemeinheit der Wirkung anderer Vitamin D-Metaboliten oder -Analogverbindungen zu kombinieren. Die Verabfolgung von 24-Epi-1,25-(OH)₂D₂ allein stimuliert, wie oben gezeigt wurde, den intestinalen Calciumtransport und die Knochenminefalisierung ohne oder unter minimaler ,Knöchcnmineral-Mobilisierung, jedoch kann die letztere Wirkung induziert werden durch Co-Verabfolgung eines oder mehrerer der bekannten Vitamin D-Derivate (z.B. 1,25-(OH)₂D₃, 1:χ , 25- (OH) ₂D , 10(-OH-D₃ und verwandte Analogverbindungen) . Durch Einregulierung der relativen Mengen der verabfolgten Verbindungen kann ein Maß der Kontrolle über die relativen Größen der intestinalen Calciumabsorption gegen die Knochenmineral-Mobilisierungsverfahren in einer Weise durchgeführt v/erden, die mit den bislang bekannten Vitamin D-Derivaten niqht möglich war. Die Co-Verabfolgung der 24-Epi-Verbindung und anderer Vitamin D-Verbindungen mit knochenmobilisierender Aktivität kann besonders vorteilhaft in der

*e /ff

Lage sein, in der ein gewisses Maß an Knochenmobilisieruny gewünscht ist. Beispielsweise wird angenommen,.daß unter bestimmten Umständen der Knochen zuerst mobilisiert werden muß, bevor neuer Knochen abgelagert werden kann. In derartigen Situationen induziert die Behandlung mit Vitamin D oder einem Vitamin D-Derivat die Knochenmobilisierung, z.B. Ί:<-Hydroxyvitamin D-. oder -D-, 1 <·Υ, 25-Dihydroxyvitamin D₃ oder -D₂, 25-Hydroxyvitamin D₃ oder -D₂, 24 ,24-Difluor-25-hydroxyvitamin D₃, 24 , 24-Dif luor-1 ^, 25-dihydroxyvitamin D₃, 24-Fluor-25-hydroxyvitamin D₃, 24-Fluor-1«,25-dihydroxyvitamin D₃, 2ß-Fluor-1o(-hydroxyvitamin D₃, 2ß-Fluor-25-hydroxyvitamin D₃, 2ß-Fluor-1o^, 25-dihydroxyvitamin D₃, 26,26,26, 27, 27, 27-Hexafluor-1o(,25-dihydroxyvitamin D₃, 26,26,26,27, 27,27-Hexafluor-25-hydroxyvitamin D₃, 24,25-Dihydroxyvitamin D₃, 1iy , 24 , 25-Trihydroxyvitamin D₃, 25,26-Dihydroxyvitamin D₃, 1«,25,26-Trihydroxyvitamin D₃ in Kombination mit 24-Epi-1,25(OH)₂D₂ erlaubt durch Einregelung der Verhältnisse der 24-Epi-Verbindung und der knochenmobilisierenden Vitamin D-Verbindung in der Behandlungsprobe die Einregelung der Geschwindigkeit der Mineralisation des Knochens, um die gewünschten medizinischen und physiologischen Ergebnisse zu erhalten. Geeignete und wirksame Gemische sind beispielsweise die Kombination von 1^,25-Dihydroxyvitamin D und 1 o(,25-Dihydroxy-24-epivitamin D₃ (9a und 9b), oder Gemische der entsprechenden 5,6-trans-Verbindurigen (11a und 11b) oder jegliche andere Kombination dieser vier Produkte als die freien Hydroxyverbindungen oder als deren acylierte Formen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren Kombinationen mit anderen Vitamin D-Derivaten oder anderen therapeutischen Mitteln können leicht als sterile parenterale Lösungen durch Injektion oder intravenös verabfolgt werden oder durch einen Ernährungskanal in der Form von oralen Dosierungen oder transdermal oder durch Suppositorien.

Vorteilhafterweise werden die Verbindungen in Dosierungsmengen von 0,1 bis 100 Mikrogramm pro Tag verabfolgt. Be-

züglich der Osteoporose: sind Dosen von etwa 0,5 bis etwa 25 Mikrogramm pro Tag allgemein wirksam. Die Verbindungen können entweder allein oder in Kombination mit anderen Vitamin D-Derivaten verabfolgt worden, wobei die Verhältnisse jeder der Verbindungen in der Kombination abhängig sind von dem speziellen Erkrankungszustand, der angesprochen wird, und von dem qewünschten Maß der Knochenmineralisierung und/oder Knochenmobilisierung. Bei der Behandlung von Osteoporose, wobei die bevorzugte Verbindung 24-Epi-1*,25-(OH)₂D₂ ist, ist die aktuelle Menge der eingesetzten 24-Epi-Verbindung nicht kritisch. In allen Fällen sollte eine hinreichende Menge der Verbindung verwendet werden, um Knochenmineralisierung zu induzieren. Mengen oberhalb von etwa 25 Mikrogramm pro Tag der 24-Epi-Verbindung oder der Kombination der Verbindung mit die Knochenmobilisierung" induzierenden Vitamin D-Derivaten sind allgemein erforderlich, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen, und mögen unter wirtschaftlichem Gesichtspunkt nicht praktisch erscheinen. In der Praxis v/erden höhere Dosen der Verbindungen verwendet, wo die therapeutische Behandlung eines Erkrankungszustandes das gewünschte Ziel ist, während die geringeren Dosen generell für prophylaktische eingesetzt werden, wobei zu verstehen ist, daß die spezielle verabfolgte Dosierung in jedem vorgegebenen Fall eingeregelt y?ird in Übereinstimmung mit den speziellen verwendeten Verbindungen, der zu behandelnden Krankheit, dem Zustarjd des Patienten und der anderen relevanten medizinischen Tatsachen, welche die Aktivität des Arzneimittels oder des Ansprechens des Patienten modifizieren mögen, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist.

Dosierungsformen der Verbindungen können durch Kombination dieser Verbindunge mit nicht toxischen pharmazeutisch verträglichen Trägern, !Wie' sie dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Derartige Träger können entweder fest oder flüssig sein, wie beispielsweise Maisstärke, Lactose Sucrose, Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl und Propylenglykol.

Wenn ein fester Träger verwendet wird, kann die Dosierungsform der Verbindungen Tabletten, Kapseln, Pulver, Pastillen (troches) oder Kautabletten (lozenges) sein. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird,; können die Dosierungsformen Weichgelatinekapseln, oder Sirup- oder Flüssigkeitssuspensionen, Emulsionen oder Losungen sein. Die Dosierungsform kann auch Zusatzmittel enthalten, wie Konservierungsstoffe, Stabilisierungsmittel, Benetzungsmittel oder Emulgiermittel, Lösungsförderer, etc. Sie können ebenfalls andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten, wie andere, Vitamine, Salze, Zucker, Proteine, Hormone oder andere medizinische Verbindungen;

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in größeren Einzelheiten in den folgenden Beispielen 3 bis 9 beschrieben. In diesen Beispielen beziehen sich die Bezeichnungen der spezifischen Produkte durch arabische Zahlen (z.B. Verbindungen 1, 2, 3, etc.) auf die in dem Verfahrensschema I so numerierten Strukturen.

Beispiel 3

1y-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D (4, Z = Methyl).

Eine Läsung der Verbindung (1) (50 mg) (als ein Gemisch der 24R- und-S-Epimeren) in wasserfreiem Pyridin (300 μΐ) wird mit 50 mg p-Toluolsulfonylchlorid bei 4⁰C für 30 Stunden behandelt. Das Gemisch wird unter Rühren über Eis/gesättigter NaHCO., ausgegossen und das Produkt wird mit Benzol extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen werden mit wässriger NaHCO₃, H-O, wässrigem CuSO₄ und Wasser gewaschen, über MgSO^ getrocknet und eingedampft.

Das rohe 3-Tosylderivat (2) wird direkt in wasserfreiem Methanol (10 ml) und NaHCO₃ (150 mg) solvolysiert durch Erhitzen auf 55⁰C für eine Zeit von 8,5 Stunden unter Rühren. Das Reaktionsgemisch wird sodann auf Raumtemperatur abgekühlt und unter vermindertem Druck auf ^r^2 ml einge-

engt. Benzol (80 ml) wird sodann zugesetzt und die organische Schicht wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das erhaltene Gyclovitamin (3, Z = Methyl), kann in der nachfolgenden Oxidation ohne weitere Reinigung eingesetzt werden.

Das rohe Produkt (3) in CELCl ' (4,5 ml) wird einer eisgekühlten Lösung von SeO₂ (5,05 mg) und tert.-BuOOH (16,5 \xl) in CHpCl₉ (8 ml), die wasserfreies Pyridin (50 μΐ) enthält,

IQ zugesetzt. Nach 15-minütigem Rühren bei 0⁰C wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt. Nach zusätzlichen 30 Minuten wird das Gemisch in einen Scheidetrichter überführt und mit 10 %-iger NaOH (30 ml) geschüttelt. Ether (150 ml) wurde zugesetzt und die abgetrennte organische Phase wurde mit 10 %-iger NaOH und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wurde über Silikagel-Dünnschichtplatten gereinigt (20 χ 20 cm große Platten, AcOEt/Hexan 4:6), um 20 g des V-Hydroxyderivats zu erhalten (4,Z= Methyl): Massenspektrum, m/e: 470 (M⁺, 5), 438 (20), 87 (100); NMR (CDCl₃)O 0,53 (3H, s, 18-H₃), 0,63 (1H, m, 3-H), 4,19 (1H, d, J=9,5 Hz, 6-H), 4,2 (1H, m, 1-H), 4,95 (1H, d, J=9,5 Hz, 7-H), 5,17 und 5,25 (2H, jeweils m, 19-H₃), 5,35 (2H, m, 22-H und 23-H).

Bei s;pie! 4 Acetylierung der Verbindung (4).

Eine Lösung von Cycloyitamin; (4, Z = Methyl) (18 mg) in Pyridin (1 ml) und Essigsäureanhydrid (0,33 ml) wird 2 Stunden auf 55°C erhitzt. Das Gemisch wird in eisgekühlte gesättigte NaHCOi eingegossen und ^Benzol und Ether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte werden mit Wasser, gesättigter CuSÖ.-Lösung und wässriger NaHCO₃-Losung gewaschen, getrocknet und eingedampft, um das 1-Acetoxyderivat zu ergeben (5, Z = Methyl, Acyl = Acetyl) (19 mg): Massenspektrum, m/e: 512 (M⁺, 5), 4 20 (5), 87 (100); NMR (CDCl₃) S 0,53 (3H, s, 18-H₀), 4,18 (1H, d,

J=9,5 Hz, 6-H) , 4,97 (2H, m, 7-II und 19-II), 5,24 (2JI, m, 1-H und 19-H), 5,35 (2H, m, 22-H und 23-H).

B e i s pie! 5

Solvolyse von 1„<-Acetoxy-3,5-cyclovitamin (5) (R₁ = Acetyl) . .. ^;: -

Eine Lösung von Cyclovitamin (5) (4,5 mg) in einem 3: 1-Gemisch von Dioxan/H₂0 (1,5 ml) wird auf 55°C erhitzt.

p-Toluolsulfonsäure (1 mg iil 20 μΐ H₂O) wird sodann zugesetzt und das Erhitzen wird 15 Minuten fortgesetzt. Das Gemisch wird in gesättigte NaHCO₃/Eis eingegossen und mit Benzol und Ether extrahiert; Die organischen Phasen werden mit NaHCO₃ und Wasser gewaschen und über MgSO- getrocknet.

Das Eindampfen der Lösungsmittel ergibt einen Rückstand, der die Verbindungen (6) (worin R- = Acetyl und R₂ = H sind) und (7) (worin R- = Acetyl und R„ = H ist), die durch Chromatographie über HPLC getrennt werden (6,2 mm χ 25 cm Zorbax-Sil), wobei 2 % 2-Propanol in Hexan als ein Eluationsmittel verwendet wird. Wenn es erforderlich ist, werden die Produkte weiter durch Rechromatographie gereinigt.

Beispiel 6

Ketalhydrolyse von Verbindung (6), um das Keton (8) zu erhalten.

Der Lösung des Ketals (6, R = Acetyl, R₃ = H) (1,35 mg) in Ethanol (1,5 ml) wird p-Toluolsulfonsäure (0,34 rag in 45 μΐ H₂O) zugesetzt und das Gemisch wird unter Rückfluß für eine Zeit von 30 Minuten erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird in verdünnte NaHCO₃ eingegossen und mit Benzol und Ether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte werden mit Wasser gewaschen, über MgSO. getrocknet und eingedampft. Die Anwendung der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographic auf das rohe Gemisch (4 % 2-Propanol/Hexan, 6,2 mm χ 25 cm Zorbax-Sil) liefert etwas nicht umgesetztes Ketal (6) (0,12 mg, gesammelt bei 48 ml) und das gewünschte Ke-

ton (8, R.. = Acetyl, R₂ ~ ^H) . (°#36 mg, gesammelt bei 52 ml), ""welches durch die folgenden Daten charakterisiert ist: Massenspektrum, m/e: 454 (M⁺, 9), 394 (17), 376 (10), (23), 43 (100); NMR (CDCl₃) 6 0,53 (3H, s, 18-H₃) ,'.^ 1 ,03 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-H₃), 1,13 (3H, d, J=7,0 Hz, 28-H₃) , 2,03 (3H₇ s, CH₃COO), 2,12 (3H, s, CH₃CO), 4,19 (1H, m, 3-H), 5,03 h.H, Ί, 19-H), 5,33 (3H, breit m, 19-H, 22-H und 23-H), 5,49 (1H, m, 1-H), 5,93 (1H, d, J=11 Hz, 7-H), 6,37 (1H, d, J=11 Hz, 6-H); UV (EtOH) ^ 266 nm, 250 nm,

ΪΠ 3. X

*_min 225 .nm,

Beispiel 7

Reaktion des Ketons (8) mit Methylmagnesiumbromid, um die Produkte (9a) und (9b) zu erhalten.

Das Keton (8, R₁ = Acetyl, R = H) in wasserfreiem Ether wird mit einem Überschuß an CH-MgBr (2,85 M-Lösung in Ether) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für eine Zeit von 30 Minuten gerührt, sodann mit wässriger NH₄Cl "abgeschreckt, mit Benzol, Ether und CH₂Cl₂ extrahiert,' Die organischen Phasen werden mit Verdünner NaHCO₃ gewaschen, über MgSO. getrocknet und eingedampft. Das so erhaltene Gemisch von (9a) und (9b) wird durch Hochleistungs-Flüssigke.itschromatographie getrennt (6 % 2-Propanol/Hexan, 4,6 mm χ 25 cm Zorbax-Sil), um in der Reihenfolge der Eluation die reinen Epimeren (9a) und (9b) zu erhalten. 1o(,25-Dihydr,oxyvitamin D₂ (9a): UV (EtOH)A_max 265,5 nm, λ . 227,5 rim; Massenspektrum, m/e: 428 (M⁺, 6), 410 (4), 352 (4), 287 (6), 269 (10), 251 (10), 152 (42), 134 (100), 59 (99); NMR (CDCl₃) S 0,56 (3H, s, 18-H₃), 1,Q1 (3H, d, J=6,5 Hz, -28-H,) , 1,04 (3H, d, J=6,5 Hz, 2I-H3) / 1,14 und 1,18 (:6H, jeweils s, 26-H₃ und 27-H₃), 4,24 (1H, m, 3-H), 4,43 (IH, m, 1-11), 5,01 (1H, m, 19-H), N5,34 (3H, breit m, 19-H, 22-H und 23-H), 6,02 (1H, d, J=11 Hz, 7-H), 6,39 (1H,d, J=11 Hz, 6-H).

ic(,25-Dihydroxy-24-epivitämin D₀ (9b): UV (EtOH /I 265,5 ,".., : / ■ ₊ max

nm_f λ . 227/5 nm; Massenspektrum, m/e: 428 (M , 13),

410 (9), 352 (7), 287 (11), 269 (15), 251 (13), 152 (52), 134 (100) , 59 (97) . ;

Beispiel 8 Umwandlung der Verbindung (7) in Sjö vitamin D~-Verbindungen (11a) und (11b).

Die Hydrolyse der Ketal-Zwischenverbindung (7, R₁ = Acetyl, R₂ = H) unter den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen schafft das entsprechende 5,6-trans-25-Keton der Struktur (10, R₁ = Acetyl> R₂ = H) und die anschließende Reaktion dieses Ketons mit Methylmagnesiumbromid unter Anwendung von Bedingungen, die: denjenigen des Beispiels 5 analog sind, ergibt ein Gemisch der Epimeren (11a) und (11b), die durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt werden, um in reiner Form 1o<, 25-Dihydroxy-5 , 6-trans-vitamin D„ (11a) und 1c*, 25-Dihydroxy-5 ,6-trans-24-epivitamin D„ (11b) zu erhalten. Wenn es erforderlich ist, kann die Strukturbestimmung durch Isomerisierung ^zu den entsprechenden 5,6-cis-Verbindungen (9a, 9b) nach bekannten Verfahren bestätigt werden.

5,6-trans-1<y,25-Dihydroxyvitamin D₂ (11a): UV (EtOH)

/\ 273,5 nm, ] . 230 nut; Massenspektrum, m/e: 4 28 (M

ITl el X ΙΠ1Π

8), 410 (3), 287.(3), 269 (7), 251 (7), 152 (34), 134 (100), 59 (78).

5,6-trans-1d,25-Dihydroxy-24-epivitamin D- (11b): UV (EtOH) λ _av 273,5 nm, I . 230 nm; Massenspektrum, m/e:

Iu el X ΓΠΙΠ.

428 (M , 10) , 410 (4) , 352 (4), 287 (5) , 269 (9), 251 (8) , 152 (37), 134 (100) , 59 (82).

Beispiel 9

Herstellung von Alkyl- und Aryl-Analogverbindungen von 1.y,25-Dihydroxyvitamin D₂-Verbindungen.

Durch Umsetzung der Keton-Zwischenverbindung (8) (R₁ -

15

3A3Ü215

Acetyl, R„ = H) mit jeweils entsprechend

(a) Ethylmagnesiumbromid,

(b) Propylmagnesiumbromid,

(c) Isopropylmagnesiumbromid,

(d) Butylmagnesiumbromid oder

(e) Phenylmagnesiumbromid

unter Bedingungen, die den in Beispiel 7 beschriebenen Bedingungen analog sind, werden die entsprechenden Hydroxyvitamin D„-Produkte der nachstehend angegebenen Formel erhalten

worin X jeweils
(a) Ethyl,

(b) Propyl,

(c) Isopropyl,

(d) Butyl oder
(β) Phenyl

darstellt.

Durch ähnliche Behandlung der 5,6-trans-Keton-Zwischenverbindung (10) (R₁ = Acetyl, R„ = H) mit den oben aufgeführten Grignard-Reagentien werden die entsprechenden 5,6-trans-Hydroxyvitamin D^-Produkte erhalten, welche die folgende Formel aufweisen:;

35

ΌΗ

worin X jeweils entsprechend

(a) Ethyl,

(b) Propyl, V

(c) Isopropyl,

(d) Butyl oder
(e) Phenyl

ist.

Ein geeignetes Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist das Vitamin D-Ketalderivat der Struktur (1), welches nach den folgenden Verfahrensschemata II und III erhalten werden kann, wie beschrieben ist in der GB-PS 2 127 023 oder der US-PS 4 448 721. Es ist im allgemeinen zweckmäßig (z.B. wenn beide C-24-Epimeren gewünscht werden) die Verbindung (1) als ein Gemisch von 24R- und 24S-Epimeren zu verwenden, wobei die Trennung der individuellen 24R- und 24S-Epimeren später durchgeführt wird. Jedoch sind das reine 24S- oder das reine 24R-Epimere von (1) in gleicher Weise geeignet, wobei das erstere das 24S-1u<,25-Dihydroxy-Produkt und das letztere das entsprechende 24R-Produkt zur Verfügung stellt.

VERFAHRENSSCHEMA I

: 24R

VERFAHRENSSCHEMA II

3A90215

,cHO

349021

VERFAHRENSSCHEMA III

HO

σ L—i

SuIfon A

Claims

34S0215

PATENTANWÄLTE Dr. rer. not. DIETER LOUIS Dlpl-Phys. CLAUS PÖHLAU Dlpl.-Ing. FRANZ LOHRENTZ Dipl.-Phys.WOLFGANG SEGETH KESSLERPLATZ

NÜRNBERG

Wisconsin Alumni Research Foundation North Walnut Street Madison, Wisconsin 53705 - USA

Verfahren zur Herstellung von 1^,25-dihydroxyliertem Vitamin D₉ und verwandten Verbindungen

Pa tent a n sprüch e Verbindung aus der Gruppe, die aus

der Reste R.,

~ und R., ,

besteht, worin jeder die gleich oder unterschiedlich sein können,aus der Gruppe von Wasserstoff und Acyl ausgewählt ist, und X einen Alkyl- oder Arylrest oder einen isotopisch markierten Alkyl- oder Arylrest darstellt, mit der Maßaabe, daß sofern der C-24-Methvlsubstituent in der

34SÜ215

5,6-cis-Verbindung die S-Konfiguration besitzt und X gleich Methyl ist, R-, / R-, und R^ nicht alle Wasserstoff sein können.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, worin X für Methyl steht.

3. Verbindungen nach Anspruch 1, worin das asymmetrische Zentrum am C-24-Atom die (R)-Konfiguration aufweist.

4. Verbindungen nach Anspruch 1, worin das asymmetrische Zentrum am C-24-Atom die (S)-Konfiguration aufweist.

5. 1oi,25-Dihydroxy-24-epivitamin D„. 6. 1,y, 25-Dihydroxy-5 , 6-trans-vitamin D₉.

7. 1j( , 25-Dihydroxy-5 ,-6—trans-24-epivitamin D₀.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung ^q nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einon pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, die 1 ,*', 25-Dihydroxy-5 , 6-trans-vitamin D~ und/oder 1 ■$., 25-Dihydroxy-5 ,6-trans-24-epivitamin D„ enthält.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, die 1·/,25-Dihydroxy-5 ,6-trans-vitamin D₉ und 1 ■·/, 25-Dihydroxyvitamin D₇ enthält.

. ■:.'. ,

11. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, die 1o<,25-Di-

hydroxy-5 ,6-trans-vitamin D_ und 1 ■_*, 25-Dihydroxy-5 ,6-trans-24-epi-vitamin D„ enthält.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, die 1'/,25-Dihydroxyvitamin D₉, 1-x, 25-Dihydroxy-24-opivi Lara in Dy,

/ Q Π ?

η J ¹J Z

1 a, 25-Dihydroxy-5 , 6-trans-vitamin D₉ und l..X,25-Dihydroxy-5,6-trans-24-epivitamin D₉ enthält.

13· Zusammensetzung nach Anspruch 8, die 1 .y,25-Dihydroxyvitamin D₉ und 1o<, 25-Dihydroxy-24-epivitamin D₉ ent-

Ct *—

hält. ;

14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die 1 Y, 25-D.i hydroxy-

5 , 6-trans-vitamin D2 und entweder 1 ■/, 25-Dihydroxy-5 , 6-trans-25-epivitamin Dp öder 1«,25-Dihydroxy-24-epivitamin D₉ enthält.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 14, dadurch gekennzeich η e t , daß sie mindestens eine die Knochenmobilisierung induzierende Verbindung enthält.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die die Knochenmobilisierung induzierende Verbindung ein Vitamin D-Derivat ist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von 25-Hydroxyvitamin D₃, 25-IIydroxy vitamin D₉, 1·_<Hydroxyvitamin D₃, Ι.χ-Hydroxyvitamin D₉, 1.x,25-D.ihydroxyvitamin D₃, 1 c/, 25-Dihydroxyvitamin D₉, 24,24-Difluor-25-hydroxyvitamin D₃, 24,24-Difluor-1 *, 25-dihydroxyvitamin D₃, 24-Fluor-25-hydroxyvitamin D-, 24-Fluor-1,i(,25-dihydroxyvitaniin D₃, 26,26,26,27,27,27-Hexafluor-1^,25-dihydroxyvitamin D₃, 26,26,26,27,27,27-Hexafluor-25-hydroxyvitamin D₃, 2ß-Fluor-1 yf-hydroxyvitamin D₃, 2ß-Fluor-25-hydroxyvitamin D^., 24,25-Dihydroxyvitamin D₃, 1 c<, 24 , 25-Trihydroxyvitamin D₃, 25, 26-Dihydroxyvitamin D₃, 1 ;/, 25 , 26-Trihydroxyvitamin D₃. .

17. Verbindungen der Formel
35

3 4 9 Ü 2 1 5

worin Y für Wasserstoff, Hydroxyl oder Ό-Acyl steht und Z eirißn Alkylrest bedeutet.
■ . -

'18. Verbindungen nach Anspruch 1, worin Y ein Wasserstoffatom darstellt.

19. Verbindungen nach Anspruch 1, worin Y eine Hydroxylgruppe oder eine O-Acetylgruppe ist.

20. Verbindung nach Anspruch 2, worin Z eine Methylgruppc ist.

_;21, Verbindung nach Anspruch 3, worin Z eine Methylgruppe ist. ■ '

22. Verbindung aus der Gruppe, die aus

besteht, worin K ein Sauerstoffatom oder eine Ethylendioxygruppe ist, und worin R₁ und R₂, die gleich oder unterschiedlieh sein können, ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest darstellen.

23. Verbindungen nach Anspruch 5, worin K ein Sauerstoffatom ist.

24. Verbindungen nach Anspruch 5, worin K eine Ethylendioxygruppe ist.

25. 1 ^-Hydroxy-^S-oxo-^V-norvitainin D₂ und dessen Acetat.

26. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einer O Formel gemäß der Definition in Anspruch 1, worin jeder

der Reste R₁, R₂ und IL·., die gleich oder unterschiedlich sein können, ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest darstellt und X einen Alkyl- oder Ärylrest oder
einen isotopisch markierten Alkyl- oder Ärylrest dar- § stellt, dadurch gekennzeichnet , daß
ein Ketal der Formel

OR,

oder

worin R. und R₂ der vorstehend genannten Definition
entsprechen einer Hydrolyse bei einer Temperatur von
50 bis 100⁰F (10 bis 38°C) unter sauren Bedingungen
unterworfen wird und das erhaltene Keton mit einem

Grignard-Reagens umgesetzt wird. 30

27. Verfahren nach Anspruch 26, worin die Hydrolyse unter Verwendung von p-Toluolsulfonsäure durchgeführt wird.

28. Verfahren zur Verhinderung oder zur Behandlung physiologischer Erkrankungen bei Säugetieren, wobei die

Erkrankungen durch das Erfordernis charakterisiert

' ο / G η 7 1 R

g -ZU ^ö ' ^{J ü Z} '

werden, Knochenmasse zu regenerieren oder deren Verlust zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, daß den Säugetieren eine therapeutisch v/irksame Menge 1S, 25-Dihydroxy-24»"epivitamin D~ allein oder in Kombination mit mindestens einer Vitamin D-Verbindung, die durch ihre Fähigkeit gur Mobilisierung des Knochens in vivo charakterisiert ist, verabfolgt wird.

29. Verfahren nach Anspruch 1r worin die Erkrankung Postmenopausen-Osteoporose ist,

30. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Erkrankung Altorsosteoporose ist.

3.1. Verfahren nach Anspruch 1, worin d.ie Erkrankung steroid-induzierte Osteoporose ist,

32. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Verbindung Krauen während und im Anschluß an die Menopause verabfolgt wird.

33. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Verbindung an Frauen vor dem Beginn der Menopause verabfolgt wird.

34. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Verbindung in einer Menge von etwa0,5 Mikrogramm bis etwa 25 Mikrogramm pro Tag verabfolgt wird.

35. Verfahren nash Anspruch 1, worin die Verbindung in Lösung in einem flüssigen Träger, der durch die genannten Säugetiere unverdaulich und diesen gegenüber nicht toxisch ist, oral in eingekapselter Form verabfolgt wird.

36. Verfahren nach Anspruch 1, worin 1 ,*, 25-D.ihydroxy-24-epivitamin D« die allein verabfolgte Verbindung ist.

1 37. Verfahren nach Anspruch 1, worin 1 -<, 25-Dihydroxy-24 epivitamin D~ in Kombination mit mindestens einer Vitamin D-Verbindung, die durch die Fähigkeit zur Knochenmobilisierung in vivo gekennzeichnet ist, verab-

5 folgt wird.

38. 1x-Hydroxy-25-oxo-27-nor~24-epivitarnin D