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DE3444746A1 - Proteolytischer wundverband und seine herstellung - Google Patents

Proteolytischer wundverband und seine herstellung

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DE3444746A1
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DE
Germany
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chitin
carrier
proteolytic
wound dressing
wound
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DE19843444746
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Jirí Dipl.-Ing. Prag/Praha Stamberg
Jaroslava Dipl.-Ing. Ceský Brod Turková
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Czech Academy of Sciences CAS
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Description

Ceskoslovenskä akademie ved Prag, CSSR
Proteolytischer Wundverband und seine
Herstellung
Die Erfindung betrifft einen proteolytischen Wundverband und ein Verfahren zu seiner Herstellung, bei dem an Teilchen auf der Basis von Polysacchariden nach Aktivierung ein Enzym aus der Gruppe der Proteasen gebunden wird. Dieser biopolymere Wundverband liegt in Form eines Streupulvers oder eines fließfähigen Trockenpuders vor, das sich insbesondere zur Abdeckung und Behandlung von eitrigen und nekrotischen Wunden eignet.
Neben den klassischen Streupulvern mit zwei Bestandteilen, die als Basis zB Talk oder Stärke und als Wirkstoff zB ein Sulfonamid, ein Antibiotikum oder ein Antimykotikum enthalten, werden derzeit verschiedene biopolymere Wundverbände in Form eines Streupulvers angewandt. Diese neueren Präparate beruhen hauptsächlich auf einer Adsorptionswirkung oder einer proteolytischen Wirkung und gegebenenfalls auf der Kombination beider Wirkungen.
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Die Adsorptionswirkung liegt im Absaugen der flüssigen Bestandteile des Eiters aus Wunden, die proteolytische Wirkung in der enzymatischen Zersetzung unerwünschter Eiweißstoffe im Exsudat bzw Wundsekret. Biopolymere Wundverbände dieses Typs sind zB von B. S. Jacobson et al., Scand. J. Plast. Reconstr. Surg K> (1976) 65-72 sowie in den CS-Patentanmeldungen PV 4129-82 und PV 7138-83 beschrieben.
Eine wichtige Gruppe biopolymerer Streupulver sind Mittel auf der Basis von hydrophilen Biopolymerisaten. Zu ihren Vorteilen gehört die Wasserunlöslichkeit, die eine Kontamination der Wunde durch fremde Bestandteile verhindert. Biopolymere hydrophile unlösliche Streupulver werden vom Organismus gut toleriert, da sie keine Nebenwirkungen aufweisen. Ihr Effekt liegt in der Wechselwirkung zwischen der festen und der flüssigen Phase, dh zwischen den Streupulverteilchen und den flüssigen Bestandteilen der Wunde. Die Wechselwirkung ist auf das Kontaktgebiet beschränkt und tritt entsprechend an anderen Stellen im Organismus nicht auf. Je nach der Art der Wechselwirkung werden adsorptiv wirksame und proteolytische biopolymere Wundverbände unterschieden. Bei den absorptiv wirksamen Wundverbänden liegt entsprechend eine physikalische, bei den proteolytischen Wundverbänden eine chemische Wirkung vor.
Absorptiv wirksame Wundverbände sind zB aus sphärischem vernetzten Dextran herstellbar, das kommerziell erhältlich ist (zB DEBRISAN ® , Pharmacia, Uppsala, Schweden, vgl auch B.S. Jacobson et al., Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. U) (1976) 65).
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Ein proteolytischer, durch Lyophilisierung getrockneter Wundverband auf der Basis von sphärischer Cellulose mit kovalent gebundenen Proteasen und seine Anwendung in der medizinischen Praxis ist Gegenstand der CS-Patentanmeldung PV 7138-83.
Beide Typen von biopolymeren Wundverbänden haben ihre Vorteile gegenüber den bisher verwendeten klassischen Streupulvern, weisen aber auch Nachteile auf. Der angeführte adsorptiv wirksame Wundverband aus Dextran wirkt lediglich physikalisch, dh durch Absaugen von Wasser und wässerigen Lösungen, gegebenenfalls durch Aufnahme in Hohlräumen poröser Teilchen sowie in den Zwischenräumen der Streupulverschicht. Proteolytische Wundverbände aus Cellulose wirken andererseits vor allem enzymatisch. Es ist jedoch sehr wünschenswert, daß gleichzeitig auch flüssige Bestandteile aus der Wunde abgesaugt werden, dh auch eine Adsorptions- bzw Absorptionswirkung erzielt wird. Die kann aber nur erreicht werden, wenn spezielle Maßnahmen bei der Herstellung des Celluloseträgers und des eigenen Wundverbands ergriffen werden, die kompliziert und kostspielig sind.
Cellulose zeigt bei Trocknung eine natürliche Neigung zur Kristallisation und zur Bildung von gering porösen Strukturen. Wenn daher Wundverbände mit hoher Adsorptionswirksamkeit bzw hoher Porosität hergestellt werden sollen, müssen spezielle Trockenverfahren in allen Herstellungsphasen angewandt werden.
Ein weiterer wichtiger Typ von biopolymeren Streupulvern sind Präparate auf der Basis von
Chitin (DE-OSen 1 906 155 und 1 906 159, GB-PS 1 252 373, US-PSen 3 632 754 und 3 914 413). Streupulver aus Chitin wirken nach einem gänzlich anderen Prinzip als die oben angeführten biopolymeren Verbandmaterialien; ihre Wirkung kann als Regenerationswirkung bezeichnet werden. Chitin wird in der Wunde sehr langsam depolymerisiert, wobei die entstehenden monomeren Bestandteile in den in der verletzten Stelle ablaufenden Stoffwechsel eingreifen. Auf diese Weise tragen Streupulver aus Chitin zur Erneuerung von verwundeten Hautgeweben bei.
Eine Einschränkung liegt bei den Chitinstreupulvern in ihrer spezifischen Wirkung, dh im Vorliegen der Regenerationswirkung als einzigem Wirkprinzip. Chitin weist eine hohe Kristallinität und dementsprechend niedrige Porosität auf, so daß Streupulver auf dieser Basis nur geringe Adsorptionswirkung zeigen. Eine proteolytische Wundreinigungswirkung liegt be,i den bisherigen Chitinverbänden nicht vor.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung der Nachteile der herkömmlichen hydrophilen unlöslichen biopolymeren und chitinischen Verbandmaterialien einen Wundverband sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben, der neben proteolytischer Wirksamkeit auch hohes Adsorptions- bzw Absorptionsvermögen bei hoher Porosität besitzt.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
Der erfindungsgemäße Wundverband besteht aus
Teilchen eines Trägers auf der Basis von Polysacchariden, an denen ein Enzym aus der Gruppe der Proteasen gebunden ist; er ist gekennzeichnet durch einen Träger auf der Basis eines unter vernetztem Dextran, Chitin und Chitosan ausgewählten Polysaccharids.
Der erfindungsgemäße Wundverband besteht vorteilhaft aus sphärischen Teilchen auf der Basis von vernetztem Dextran mit einem Durchmesser von 0,05 bis 0,5 mm.
Der Wundverband nach der Erfindung kann ferner vorteilhaft aus Teilchen auf der Basis von Chitin und Chitosan mit einem Durchmesser von 0,01 bis 0,3 mm bestehen.
Wichtiges Kennzeichen der Wundverbände auf Dextranbasis ist die Anwendung eines vernetzten Dextrans als biopolymeren Träger für die Immobilisierung von Proteasen. Vernetzte Dextrane weisen im Unterschied zu Cellulose ohne spezielle Maßnahmen eine hohe Porosität auf, wobei die poröse Struktur des Dextranträgers in einem weiten Bereich durch den Vernetzungsgrad des Ausgangspolymerisats einstellbar ist. Bei Trocknung des vernetzten, in Wasser gequollenen Dextrans verschwindet im Gegensatz zu Cellulose die Porosität nicht; nach üblichen Trocknungsverfahren sind ferner Produkte zu gewinnen, die in Wasser wieder auf einen hohen Wassergehalt aufquellen. Derartige erfindungsgemäße Wundverbände auf der Basis von Dextranen weisen neben der proteolytischen Wirkung ohne Anwendung spezieller Maßnahmen eine hohe Adsorptionswirksamkeit auf.
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Zur Herstellung dieses erfindungsgemäßen Wundverbands verwendet man sphärische vernetzte Dextrane mit einer Teilchengröße von 0,05 bis 0,5 mm, die in Wasser auf einen Gehalt von 2 bis 10 g Wasser/g Trockenmasse aufquellen. Unter dem Wassergehalt wird hierbei die nach Abzentrifugieren auf einer Glasfritte in den aufgequollenen Teilchen verbleibende Wassermenge verstanden. Diesen Anforderungen werden die kommerziellen Produkte DEBRISAN ^ und entsprechende SEPHADEX ^-Typen bzw ihnen entsprechende andere handelsübliche Materialien gerecht.
Poröse vernetzte Dextrane weisen gute chemische Reaktivität zur Bindung der Enzyme auf. Zur Immobilisierung der Proteasen können bekannte, gegebenenfalls modifizierte Verfahren angewandt werden (vgl zB Handbook of Enzyme Biotechnology, Alan Wiseman, Editor, E. Horwood, London 1975). Man wählt solche Verfahren, die Produkte mit fest gebundenen Enzymen liefern, die bei der Anwendung nicht freigesetzt werden. Zur Trocknung des Produkts wird mit Vorteil die Gefriertrocknung angewandt.
Bei den erfindungsgemäßen Wundverbänden auf der Basis von Chitin und Chitosan wird mit Vorteil das Chitinpulver, das durch Mahlen und Klassierung von Chitin tierischen Ursprungs oder aus Pilzen gewonnen wird, vor der Immobilisierung alkalisch aufbereitet, was zur partiellen Desacetylierung von Struktureinheiten des N-Acetylglucosamins und zur Freisetzung ionogener Aminogruppen führt. Auf diese Weise werden in der Chitinstruktur Chitosanstruktureinheiten erzeugt. Das Vorliegen von primären Aminogruppen in der Polymerstruktur erhöht
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die chemische Reaktivität des Biopolymerisats zur Bindung von Proteasen beträchtlich. Zur Immobilisierung selbst können wiederum bekannte Verfahren angewandt werden (vgl z.B. W.L. Standley et al., Biotechnol. Bioeng. J_7 (1975), 315, US-PS 3 090 sowie R.A.A. Muzarelli et al., Chitin, PergamonPress, Oxford 1977, S. 199).
Die Regenerationswirkung, die den Chitinstreupulvern eigen ist, liegt auch bei den entsprechenden erfindungsgemäßen biopolymeren Wundverbänden vor. Der relativ niedrige Substitutionsgrad von Struktureinheiten, der zur Immobilisierung von Proteasen notwendig ist, und die Erzielung der erwünschten enzymatischen Aktivität bedeuten, daß in der Struktur des Biopolymers ein großer Teil unveränderter Struktureinheiten verbleibt, die durch langsame enzymatische Depolymerisation freigesetzt werden und zur Regenerierung von Hautgeweben beitragen können. In heilenden frischen und alten Wunden liegen große Mengen Lysozym vor, das die Chitinstruktur enzymatisch abbaut. Die freigesetzten Monomereinheiten greifen in den Metabolismus der Hexosamine ein und orientieren und vernetzen Kollagen. Es ist ferner bekannt, daß Uridindiphospho-N-acetylglucosamin die Schlüsselverbindung bei der Biosynthese von Chondroitinsulfaten, Hyaluronsäure und Glycoproteinen darstellt. Diese Prozesse begleiten die Regeneration von Hautgeweben.
Hinsichtlich dieses Mechanismus können vorteilhaft auch feine Streupulverteilchen mit einer Teilchengröße bis hinunter zu 0,01 mm verwendet werden,
ohne daß ihr Eindringen in den Blutkreislauf zu befürchten ist.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Wundverbands
in der medizinischen Praxis erfolgt ähnlich wie in
ν
der CS-Patentanmeldung PV 7138.83 beschrieben.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung des erfindungsgemäßen Wundverbands.
Beispiel 1
Herstellung eines Wundverbands mit gebundenem Chymotrypsin
Als Träger wurde ein handelsübliches vernetztes Dextran (SEPHADEX ® G-100, Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit sphärischen Teilchen von 0,05 bis 0,5 mm Durchmesser verwendet. Zur Aktivierung wurde 2-Amino-4.6-dichlor-s-triazin eingesetzt. Das vernetzte Dextran wurde in Wasser gequollen und für die Umsetzung in der Menge angewandt, die 7,5 g Trockenmasse entsprach. Das Aktivierungsreagens wurde bei 50 0C in 750 ml Aceton aufgelöst. Bei derselben Temperatur wurde zu der Lösung die gleiche Menge Wasser zugegeben. Das vernetzte Dextran wurde dann 5 min mit der Aktivierungslösung (300 ml) bei 50 0C gemischt. Danach wurde eine Lösung aus 15 g Natriumcarbonat in 100 ml Wasser und 0,6 Volumteilen 1 M Salzsäure in einer Menge von 120 ml (50 0C) zu dem Aktivierungsgemisch zugegeben. Durch Zugabe der konzentrierten Salzsäure wurde der pH-Wert des Aktivierungsgemischs schnell unter 7 erniedrigt.
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Anschließend wurde das aktivierte Produkt abfiltriert, mit wässerigem Aceton (50 %) sowie mit Wasser gewaschen und in 0,1 M Phosphatpuffer (2 0C) bei pH 6,6 aufbewahrt.
An dem so aktivierten Träger wurde Chymotrypsin aus einer 1,5-%igen Lösung in 0,2 M Boratpuffer von pH 8,75 bei 24 0C gebunden. Nach 12 h waren 195 mg Enzym/g Träger immobilisiert. Das vernetzte Dextran mit dem daran gebundenen Chymotrypsin wurde abwechselnd mit 0,1 M Boratpuffer, der 1 M NaCl (pH 9) enthielt, und mit 0,1 M Acetatpuffer, der 1 M NaCl (pH 4,5) enthielt, bis zum Ausbleiben proteolytischer Aktivität im Eluat gewaschen. A schließend wurde die Probe mit 0,25 M Boratpuffer (pH 8) gewaschen und lyophilisiert.
Beispiel 2
Herstellung eines Wundverbands mit gebundenem Papain
Als Träger wurde ein handelsübliches vernetztes Dextran (DEBRISAN ^ Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit sphärischen Teilchen von 0,05 bis 0,5 mm Durchmesser verwendet, das durch Einführung von Imidocarbonatgruppen aktiviert wurde.
Das vernetzte Dextran (1 g) wurde nach Aktivierung 6 min mit Bromcyan (40 ml) bei 24 0C und pH 11 in Kontakt gebracht. Danach wurde das Produkt 7 min mit einer kalten 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung (500 ml) Wasser und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,6) gewaschen.
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Das Papain wurde während 16 h auf dem aktivierten Träger aus 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,6) bei der Raumtemperatur gebunden.
Das Produkt wurde dann auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet, dh durch Pufferwechsel gewaschen, bis das Eluat keine proteolytische Aktivität zeigte, und danach lyophilisiert.
Beispiel 3
Herstellung eines Wundverbands mit gebundenem Trypsin
Als Träger wurde ein handelsübliches vernetztes Dextran (SEPHADEX ^ G 50 Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit sphärischen Teilchen von 0,05 bis 0,5 mm Durchmesser verwendet, das durch Einführung von Isothiocyanatgruppen mit Thiophosgen aktiviert wurde.
Das vernetzte Dextran (20 g) wurde dann mit 4-Nitrophenylglycidylether (4 g) in 20 ml Toluol gerührt und mit einer Lösung von Natriumhydroxid (80 ml) versetzt. Die Suspension wurde anschließend 18 h auf 70 0C erhitzt. Nach dem Waschen wurde der Träger in Wasser (100 ml) gequollen; danach wurden 40 ml 5 M NaOH und 2 g Natriumdithionit zugefügt und das Reaktionsgemisch 1 h auf 65 0C gehalten. Das Produkt wurde gewaschen, in 3,5 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gequollen, mit einer 10-Hgen Lösung von Thiophosgen in CCl. umgesetzt, gewaschen und getrocknet.
An dem so aktivierten Träger wurde Trypsin aus einer 1,8-ligen Lösung in 0,05 M Boratpuffer
(pH 8,6) in Stickstoffatmosphäre bei 5 0C gebunden. Nach 15 h waren 200 mg Enzym/g Träger immobilisiert.
Das Produkt wurde ähnlich wie in Beispiel 1 abwechselnd mit Puffern bis zum Ausbleiben proteolytischer Aktivität im Eluat gewaschen, mit demselben Boratpuffer versetzt und lyophilisiert.
Beispiel 4
Herstellung eines Wundverbands aus tierischem Chitin
Aus Krabbenpanzern isoliertes und durch Mahlen und Klassieren auf eine Teilchengröße von 0,05 bis 0,15 mm gebrachtes Chitin (100 g) wurde mit 2 1 40 2-iger Natronlauge 16 h bei 115 0C in Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann abgekühlt, das Produkt abfiltriert und mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Unter diesen Bedingungen kam es zu einer etwa 70-ligen Desacetylierung des Chitins.
Das hydrolysierte Produkt wurde in einer Menge, die 15g Trockenmasse entsprach, in eine Säule eingefüllt und mit Boratpuffer (pH 8,5) gewaschen, bis der pH-Wert des Eluats den pH-Wert des zufließenden Puffers erreichte. Auf die Säule wurde dann eine gemischte Lösung aus 15 ml des verwendeten Puffers, 15 ml Chymotrypsinlösung (0,1 g) und 15 ml 4-Siger Glutaraldehydlösung aufgegeben und langsam durch die Schicht hindurchfließen gelassen. Das System wurde anschließend 1 h ruhig stehengelassen. Nach Beendigung der Immobilisierung wurde die Schicht
- 14 - 34U746
mit 500 ml des verwendeten Puffers gewaschen. Das Waschen wurde dann abwechselnd mit einem alkalischen und einem sauren Puffer (0,1 M Boratpuffer mit 1 M NaCl (pH 9) und Acetatpuffer mit 1 M NaCl (pH 4,5) fortgesetzt, bis das nicht gebundene Enzym vollständig ausgewaschen war. Das Waschen wurde bis zum Ausbleiben proteolytischer Aktivität im Eluat fortgesetzt. Abschließend wurde das Produkt mit 0,25 M Boratpuffer (pH 8) gewaschen und in Suspension mit diesem Puffer lyophilisiert.
Beispiel 5
Herstellung eines Wundverbands aus fungalem Chitin
Zur Herstellung des Wundverbands wurde das bei der Herstellung von Penicillin anfallende Pilzgeflecht von Penicillium chrysogenum verwendet. Die Mycelmasse wurde sterilisiert und durch Extraktion mit Chloroform bei Raumtemperatur von Lipidbestandteilen, besonders von Fetten, befreit. Das gewonnene Produkt wurde 18 h mit 1 N NaOH bei Raumtemperatur umgesetzt und nach Ansäuern mit HCl durch Dialyse gereinigt. Durch Naßvermahlung wurde das Chitinmaterial auf eine Teilchengröße von 0,05 bis 0,2 mm aufbereitet. Hydrolyse, Immobilisierung und abschließende Weiterverarbeitung wurden wie in Beispiel 4 durchgeführt.
Der erfindungsgemäße Wundverband zeichnet sich durch proteolytische Wirksamkeit und gleichzeitige Absorptions- und Regenerationswirkung aus und ist daher vorteilhaft pharmazeutisch anwendbar.
Der Wundverband führt entsprechend zu einer raschen Reinigung der Wunden von nekrotischen Defekten und einer beschleunigten Ausbildung von reinen Granulationen und damit zu einer schnellen Wundheilung.

Claims (6)

Ansprüche
1. Proteolytischer Wundverband aus Teilchen eines Trägers auf der Basis von Polysacchariden, an denen ein Enzym aus der Gruppe der Proteasen gebunden ist,
gekennzeichnet
durch
einen Träger auf der Basis eines unter vernetzten Dextranen, Chitin und Chitosan ausgewählten
Polysaccharids.
2. Wundverband nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch sphärische Teilchen auf der Basis von vernetztem
Dextran einer Teilchengröße von 0,05 bis 0,5 mm
als Träger.
3. Wundverband nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Teilchen auf der Basis von Chitin und/oder
Chitosan einer Teilchengröße von 0,01 bis
0,3 mm als Träger.
4. Verfahren zur Herstellung des proteolytischen Wundverbands nach einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Aktivierung eines polymeren Trägers auf der Basis von Polysacchariden und Bindung eines proteolytischen Enzyms daran, gekennzeichnet durch Verwendung
eines Trägers auf der Basis eines unter vernetzten
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Dextranen, Chitin und Chitosan ausgewählten PoIysaccharids.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Verwendung von sphärischen Teilchen auf der Basis von vernetztem Dextran mit einer Teilchengröße von 0,05 bis 0,5 mm als Träger.
6. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Verwendung von Teilchen auf der Basis von Chitin oder Chitosan mit einer Teilchengröße von 0,01 bis 0,3 mm als Träger.
DE19843444746 1983-12-08 1984-12-07 Proteolytischer wundverband und seine herstellung Withdrawn DE3444746A1 (de)

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