DE3440423A1

DE3440423A1 - Antibiotisches polypeptid, verfahren zu seiner herstellung, dieses polypeptid erzeugender stamm von staphylococcus epidermidis, dieses polypeptid enthaltende zubereitungsformen und seine verwendung zur bekaempfung infektioeser erkrankungen

Info

Publication number: DE3440423A1
Application number: DE19843440423
Authority: DE
Inventors: Hermann Dipl.-Chem. 7410 Ludwigsburg Allgaier; Günther Prof. Dr. 7400 Tübingen Jung; Ursula 7255 Rutesheim Schneider; Rolf-Günther Dipl.-Mikrobiol. Dr. 7950 Biberach Werner; Hans Prof. Dr. Zähner
Original assignee: Dr Karl Thomae GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1984-11-06
Filing date: 1984-11-06
Publication date: 1986-05-07
Also published as: ZA858446B; AU4941385A; AU596082B2

Description

Antibiotisches Polypeptid, Verfahren zu seiner
Herstellung, dieses Polypeptid erzeugender Stamm vom Staphylococcus epidermidis, dieses Polypeptid enthaltende Zubereitungsformen und seine Verwendung zur Bekämpfung infektiöser Erkrankungen Die Erfindung betrifft ein antibiotisch wirkendes Polypeptid, in der Folge Epidermin genannt, ein Verfahren zu seiner Herstellung, mittels eines gegen diese Substanz resistenten neuen Stammes von Staphylococcus epidermidis, den neuen resistenten Stamm, den Wirkstoff Epidermin enthaltende antibiotische Zubereitungsformen und die Verwendung des Wirkstoffes zur Bekämpfung von infektiösen Erkrankungen.
Durch die EP-A-0 027 710 ist es bekannt, daß ein besonderer Stamm des Staphylococcus epidermidis, nämlich Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 (hinterlegt bei der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen) ein niedermolekulares, antibiotisch wirkendes Polypeptid mit einer breiten Wirkung auf grampositive Keime erzeugt, welches Bakterienzellen lysiert.
Es ist ferner bekannt, daß der Stamm Staphylococcus epidermidis MF 205 (S.M. Tylor et al. Int. J.Mass Spectrom. and Ion Physics 48, 161-164, 1983) ebenfalls ein Oligopeptid mit Wirkung gegen grampositive Bakterien produziert. Aus der Veröffentlichung ist es nicht ersichtlich, ob dieser Stamm mit dem oben erwähnten Stamm NCIB 11536 identisch ist.
Es wurde nun gefunden, daß eine resistente Mutante des Staphylococcus epidermidis, die am 26.10.1984 bei der "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" unter der Nummer DSM 3095, hinterlegt wurde und die mit dem obenerwähnten Stamm NCIB 11536 verwandt ist, nach einem modifizierten Herstellungs- und Aufarbeitungsverfahren das ähnliche antibiotisch, vorzugsweise auf grampositive Keime, wirkende Polypeptid Epidermin erzeugt, welches beim Vergleich mit den Produkten aus Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 und MF 205 unter anderem folgende Unterschiede in der Aminosäureanalyse aufweist: Verglich der Aminosäureanalysen: Epidermin Produkte von Staph.epidermidis MF 205 NCIB 11536 Asx 1 2 1 Glx - 3 -1 Pro 1 1 -1 Gly 2 2 2 Ala 2 2 1 Ile 2 2 1 Phe 2 2 1 Lys 2 -2 1 Lan 2 ß-Me-Lan 1 Dhb 1-Tyr 1 1 X 1 1-2 X ist eine noch nicht völlig in ihrer Struktur aufgek-lärte Aminosäure, welche bei saurer Totalhydrolyse zerstört wird.
Dhb entspricht der a,ß-Dehydroaminobuttersäure, Asx und Glx bedeuten Asn/Asp bzw. Gln/Glu.
Nach Totalhydrolyse von Epidermin mittels 6N Salzsäure (18 Stunden bei 1100C) lieferte die quantitative Aminosäurenanalyse durch Ionenaustauscherchromatographie (Standardprogramm mit dem Gerät Biotronik LC 6000 E) folgende a-Aminosäuren-Zusammensetzung: Asx (1,00), Pro (0,95), Gly (2,09), Ala (2,03), Ile (2,03), Tyr (0,30), Phe (2,02) und Lys (2,00) (vgl. auch Abb. 1).
Durch Zugabe von Thioglykolsäure erhöhte sich der Tyrosingehalt des Totalhydrolysats auf den weitgehend stöchiometrischen Wert von 0,93.
Die Konfiguration der Proteinaminosäuren wurde durch Gaschromatographie der Pentafluoropropionyl-aminosäure-n-propylester aus dem Totalhydrolysat ermittelt. Die Trennung erfolgte an der chiralen stationären Phase L-Valin-tert.-butylamid-polysiloxan (Chirasil-Val). Durch Vergleich mit einer Testmischung von Aminosäuren bekannter Konfiguration konnte den oben angeführten Bausteinen die L-Konfiguration zugeordnet werden (vgl. Abb. 2).
Zu diesen Proteinaminosäuren kommen noch folgende Nichtproteinaminosäuren: Lanthionin (2), ß-Methyllanthionin (1) und a,ß-Dehydroaminobuttersäure (1); hierbei besitzt Lanthionin die meso- und ß-Methyllanthionin die 2S,3S,6R-Konfiguration.
Die neue Verbindung Epidermin kann durch folgende Angaben charakterisert werden: 1. Natur: farbloses Pulver 2. Molmasse: im Bereich von 2160 3. Ultraviolettabsorptionsspektrum: In wässriger Lösung langwelliges Maximum bei 267 nm (Abb. 3).
4. Infrarotabsorptionsspektrum: IR-Spektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette: siehe Abb. 4.
5. Löslichkeit: Sehr gut löslich in Mischungen aus Wasser/Eisessig bzw. Methanol/Eisessig, löslich in niederen Alkoholen, unlöslich in Chloroform, Aceton, Diethylether, Petrolether.
6. Farbreaktion auf Kieselgelplatten: Ninhydrin, Chlor/TDM (TDM=4,4' -Bis-(dimethylamino)diphenylmethan), Orcin/Schwefelsäure, Anisaldehyd/Schwefelsäure, Zerstörungsfreier Nachweis im W-Licht bei 254 nm und durch Sprühen mit Wasser.
7. Stabilität: Stabil von pH=2 bis pH=7, bei höheren pH-Werten tritt starker Aktivitätsabfall ein.
8. Kernmagnetische Resonanzspektren Abb. 5 ¹H-NMR Spektrum, Abb. 6 13C-NMR-Spektrum 9. Dünnschichtchromatographie: Es wurden Kieselgelfertigplatten 60 F254 (Merck) verwendet System A: Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniak (2/2/1), RF = 0,73 System B: Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniak (70/35/10) RF = 0,30 System C: n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/1/1) RF = 0,05 10. HPLC : siehe Abb. 7.
Die Sequenzierung des Epidermins erfolgte durch tryptische Spaltung. Die Umsetzung mit Trypsin führte in- kurzer- Zeit zum Verlust der antibiotischen Aktivität. Makroskopisch beobachtete man bei der tryptischen Spaltung einen~gallertartigen weißen Niederschlag, welcher durch Zentrifugation abgetrennt werden konnte. Der Überstand wurde lyophilisiert und an Sephadex G-25 (Dextrangel der Firma Pharmacia) in 1%iger Essigsäure gelchromatographiert.
Die mit Ninhydrin, Chlor/TDM und Wasser anfärbbare chemisch einheitliche Fraktion (im folgenden als P1 bezeichnet)~erwies sich als N-terminales Bruchstück der tryptischen Spaltung von Epidermin (siehe unten).
Der extrem hydrophobe gallertartige Niederschlag bestand aus mehreren chemischen Komponenten, welche bei der tryptischen Spaltung aus dem C-terminalen Bruchstück des Gesamtmoleküls entstanden. Ein chemisch einheitliches Produkt (im folgenden P2 bezeichnet) erhielt man durch Auflösen des Niederschlags in Dimethylformamid und anschließender Gelchromatographie an Sephadex LH-20 (Dextrangel, durch Hydroxypropylierung aus Sephadex G 25 hergestellt, Firma Pharmacia) mit Dimethylformamid als Fließmittel. P2 ließ sich mit Wasser, Chlor/TDM und unter W-Licht detektieren. Die Ninhydrinreaktion an P2 verlief negativ.
Die Aminosäurenanalyse des Fragments P1 ergab folgende Zusammensetzung: Pro (1), Lan (1), ß-Me-Lan (1), Gly (1), Ala (2), Ile (2), Phe (1), Lys (2). Da durch Dansylierung des Gesamtmoleküls Isoleucin als N-terminale Aminosäure bestimmt wurde und das Fragment P2 kein Isoleucin enthält, muß das Fragment P1 das N-terminale Spaltprodukt des Gesamtmoleküls sein. Die C-terminale Aminosäure von Fragment P1 muß auf Grund der tryptischen Spaltung Lysin sein.
Zur weiteren Strukturaufklärung von P1 wurde die C-terminale Aminosäure Lysin enzymatisch mittels Carboxypeptidase B (Firma Boehringer Mannheim) entfernt. Das daraus entstandene Fragment P12 konnte durch Gelchromatographie an Sephadex G-25 (1% Essigsäure) in reiner Form isoliert werden. P12 besteht aus folgenden Aminosäuren: Pro (1), Lan (1), ß-Me-Lan (1), Gly (1), Ala (2), Ile (2), Phe (1), Lys (1).
Die Schwefelbrücken der Thioetheraminosäuren Lanthionin und ß-Methyllanthionin verhindern eine Sequenzanalyse nach Edman. Durch Umsetzung von P12 mit Raney-Ni W2 erhielt man ein schwefelfreies Dodekapeptid. Dabei wird meso-Lan in D- und L-Alanin überführt und ß-Methyllanthionin in D-Aminobuttersäure und L-Alanin. Die Dodekapeptidsequenz wurde durch Edman-Abbau und FAB-Spektrometrie aufgeklärt und sieht wie folgt aus: Ile¹-Ala²-Ala³-Lys4-Phe5-Ile6-Ala7-Abu8-Pro9 -Gly10-Ala11-Ala12.
Verschiedene Untersuchungen für die Zuordnung der Schwefelbrücken beim Fragment P12 ergaben folgende Struktur: Das durch tryptische Spaltung -erhaltene C-terminale Bruchstück P2 ließ sich wie folgt charakterisieren: Asx (-1-), Lan (1), Gly (1), Phe (1), Tyr (1), X (1) und α-Ketobuttersäure.
Die a-Ketobuttersäure stammt aus der Dehydroaminobuttersäure, welche in der Sequenz des Gesam-tmoleküls direkt auf Lysin13 folgt. Die tryptische Spaltung setzt die Aminogruppe der Dehydroaminobuttersäure frei; da Dehydroaminosäuren mit freier Aminogruppe instabil sind, lagern sie sich unter anderem in a-Ketosäuren um.
P2 ist N-terminal mit der -Ketobuttersäure blockiert (Ninhydrinreaktion an P2 verläuft negativ)-. Neben den durch Totalhydrolyse und Aminosäurenanalyse identifizierten Aminosäuren Lanthionin, Glycin, Phenylalanin, Tyrosin und Asparaginsäure besitzt P2 einen weiteren Baustein X, -der durch saure Totalhydrolyse zerstört wird. Dieser ließ sich an Hand 13 seiner Signale in den C-Kernresonanzspektren von Epidermin (Abb. 6) und im Fragment P2 (Abb. 8) charakterisieren.
Einen Hinweis auf die chemische Natur von X erhielt man durch Umsetzung von P2 mit Raney-Ni W2, bei der zwei Hauptprodukte entstanden. Bei beiden durch präparative HPLC isolierten Produkten-zeigte sich nach Totalhydrolyse ein zusätzlicher Alaninrest im Aminosäurenchromatogramm, der durch diese Umsetzung aus X entstand.
Gegenstand der Erfindung ist also ein einheitliches und damit als rein anzusehendes Produkt, Epidermin genannt, desweiteren Verfahren zu seiner Herstellung, Isolierung und Reinigung.
Die Zucht des Produzenten Staphylococcus epidermidis DSM 3095 erfolgt aerohisch bei-37"C in einem Komplex- medium der Zusammensetzung 2 bis 4% Fleischextrakt, 1 bis 3% Malzextrakt und 0,25 bis 1% CaCO3 oder 0,25 bis 0,5% Ca(OH)2. (Bei den Prozentangaben handelt es sich hier und im folgenden immer, sofern nichts anderes angegeben wird, um Gewichtsprozente.) Das Maximum an antibiotischer Aktivität wird nach 18-23 Stunden erreicht.
Versuche zur Anreicherung des Antibiotikums wurden beispielsweise am Kultur filtrat von 10 l-Fermentern vorgenommen, wobei die Effektivität einzelner Schritte durch den Plattendiffusionstest überprüft wurde. Die aktive Komponente konnte durch Extraktion des von Zellen und Kalk befreiten Kulturfiltrats mit n-Butanol angereichert werden. Die Extraktion mit n-Butanol gelang aber nur beim natürlichen End-pH des Kulturfiltrats von 8,0. Eine weitere Reinigung konnte durch die Abtrennung lipidischer Begleitstoffe durch Etherfällung erreicht werden. Dazu wurde der Butanolextrakt evaporiert, der Rückstand in Methanol gelöst und in die fünffache Menge kalten Diethylether eingerührt. Die Aktivität blieb dabei vollständig im Niederschlag zurück (Schema Abb. 9).
Ein besonders geeignetes Verfahren zur Anreicherung ist auch die Adsorption des zentrifugierten Kulturfiltrats an Amberlite XAD-8, einem Polymeren auf Acrylesterbasis (Firma Serva). Die Anheftung von Epidermin erfolgt dabei nicht durch einfache Adsorption, sondern durch die Kationenaustauschwirkung freier Acrylsäuregruppierungen am Harz. Dafür spricht die Tatsache, daß die aktive Komponente nur durch Elution mit Methanol/konz. HC1 (99:1) vom Harz gelöst werden konnte. Das stark saure Eluat muß vor dem Einengen am Vakuum mit Ammoniak neutralisiert werden. Auf ein anschließendes Umfällen aus Methanol/Ether konnte nach dieser-Aufarbeitung mittels Adsorption an Amberlite XAD-8 verzichtet werden.
Stabilitätstests und chromatographische Untersuchungen wurden am lyophylisierten Butanolextrakt durchgeführt. Die Inkubation des Extraktes mit wässrigen Lösungen verschiedener pH-Werte ergab ab pH 10 eine starke Abnahme der Aktivi-tät, im Bereich von pH 2-7 ist das Antibiotikum jedoch stabil.
In den Dünnschichtchromatogrammen des eingeengten Butanolextraktes fanden sich eine Vielzahl mit verschiedenen Sprühreagentien anfärbbarer Verbindungen. Parallel dazu durchgeführte Bioautogramme ergaben wichtige Hinweise auf die Natur der unbekannten Aktivität. In sauren und fast allen neutralen Systemen bleibt das Antibiotikum bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel 60 am Start sitzen, während. die Chromatographie mit alkalischen Laufmitteln RF-Werte z-wischen 0,3 und 0,75 ergab. Die Kombination der Bioautographie mit der Dünnschichtchromatographie in alkalischen Systemen zeigte eine Korrelation mit einer Verbindung, welche durch Ninhydrin anfärbbar war.
Als Ergebnis dieser Vorversuche konnte festgehalten werden, daß es sich bei der unbekannten Aktivität um ein stark basisches Peptid handelt, welches sich einer weitern Aufreinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 entzog, da es mit sauren oder neutralen Systemen nicht von der Säule eluiert weiden konnte.
Die Chromatographie des Amerlite XAD-Eluats- bzw. des von Lipiden befreiten Butanolextrakts an Sephadex LH-2Q mit Methanol/Essigsäure (95:5) trennte eine große Zahl von kleinen Peptiden, Aminosäuren und Salzen aus dem Medium vom Antibiotikum ab (Schema Abb. 9).
Bei der sich anschließenden multiplikativen Gegenstromverteilung nach Craig konnten die bei der Extraktion des Antibiotikums aus dem Kultur filtrat gemachten Erfahrungen herangezogen werden. In einer ersten Flüssig-Flüssig-VerteiluUg mit dem System n-Butanol/Essigester/0,l N Essigsäure (3:1:3) blieb das Antibiotikum am Start sitzen. Bei der zweiten Craig-Verteilung mit dem neutralen System 2-Butanol/0,05 N Ammoniumacetat (1:1) fand man das Antibiotikum in der Mitte der Apparatur. Ammoniumacetat konnte durch Lyophilisation am Hochvakuum wieder entfernt werden.
Epidermin fiel nach Gefriertrocknung als ein in allen verwendeten Dünnschichtsystemen einheitliches Pulver an.
Während die Reinigung gemäß der Verfahrensweise der Europäischen Patentanmeldung 0 027 710 durch Gefrier-Auftau-Extraktion, Verdampfung der Extraktionsmittel, Ultrafiltration, Fällung durch Ammoniumsulfat, Ionen-Austausch-Chromatographie und Gelfiltration an Sephadex G 50 oder G 25 oder G 15 oder an Biogel P2 erfolgte, führt die erfindungsgemäße Reinigung zu einem einheitlichen Reinprodukt durch die Adsorption des zentrifugierten Kulturfiltrates an Amberlite XAD-8, gefolgt von einer Gelchromatographie an Sephadex LH 20, und anschließender zweifacher Gegenstromverteilung nach Craig. Die Isolierung und Reinigung gemäß dem Verfahren der vorstehend genannten Europäischen Patentanmeldung und dem erfindungsgemäßen Verfahren erweist sich somit als völlig unterschiedlich.
Weitere Unterschiede gegenüber dem bekannten Verfahren gemäß der obengenannten EP-A-0.027.710 bestehen in der Wahl der komplexen Nährlösung. Während die bekannte Nährlösung Brain Heart Infusion (37 g BHI/1) nur eine sehr geringe Antibiotika-Ausbeute erbrachte, zeigt eine erfindungsgemäße Nährlösung, bestehend aus 2 bis 4 % Fleischextrakt, 1 bis 3 % Zucker bzw. Zuckeralkohole, wie Malzextrakt, Maltose, Galaktose, Laktose, Mannit, Glucose, Glycerin und 0,25 bis 1 Calciumcarbonat oder 0,25 bis 0,5% Calciumhydroxid sehr gute Ergebnisse. Die beste Produktion wurde bei einer Nährlösung folgender Zusammensetzung erhalten: 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt und 0,37 % Calciumhydroxid. Von allen C-Quellen zeigte Maltose nach Malzextrakt die beste Produktion. Glucose sollte nur in Verbindung mit anderen C-Quellen eingesetzt werden. Auch die Kombination von Laktose und Maltose bzw.
Galaktose und Maltose lieferten gute Ergebnisse. Alle anderen üblichen C-Quellen zeigten keine oder nur eine geringe Produktion. Die Zugabe aller 20 Aminosäuren als N-Quelle in Konzentrationen von jeweils 2 g/l brachte die gleichen Ergebnisse wie der Fleischextrakt. Casaminoacid (Firma Difco) eignet sich als N-Quelle nur bei Zugabe von Tryptohphan (1-2 mM) und Vitaminen. Als Vitamine eignen sich (bevorzugte Konzentrationen in Klammer): Biotin (0,006 mg/l), Nicotinsäure (2,3 mg/l), Thiamin (1,0 mg/l), Pyridoxin.HCl (12,0 mg/l), Calciumpantothenat (1,2 mg/l).
Die Fermentation erfolgt unter guter Belüftung bei Temperaturen zwischen 34 und 370C. Den besten Produktionsverlauf erhält man, wenn der pH-Wert vor der Fermentation bei 6,0 bis 7,0 liegt. Bei Fehlen von Carbonaten oder Hydroxiden zweiwertiger Kationen, wie Calciumkarbonat oder Calciumhydroxid, findet keine Produktion statt. Nach der Zugabe von beispielsweise Calciumcarbonat zeigt der pH-Wert einen charakteristischen Verlauf mit Abfall in den sauren Bereich, dabei fand keine Produktion statt. Beim anschließendem Anstieg des pH-Wertes in den alkalischen Bereich setzte die Produktion ein. Anstelle von Calciumcarbonat kann auch Magnesiumcarbonat verwendet werden, Calciumhydroxid lieferte bessere Ergebnisse als Calciumcarbonat. Mit 50 mM Calciumhydroxid konnte die Produktion gegenüber 25 mM Calciumcarbonat noch etwas gesteigert werden. Bei der Verwertung von C-Quellen (Zucker) durch den Stamm kommt es zur Bildung organischer Säuren, die durch zweiwertige Kationen komplexiert werden, gleichzeitig erfolgt eine Abpufferung des Mediums.
In Abbildung 10 sind die Ergebnisse anhand des Verlaufs der Lebendkeimzahl und der Antibiotikum-Produktion, ausgedrückt in mm Hemmhof gegen Micrococcus luteus ATCC 9341, der erfindungsgemäßen Medien im Vergleich zu Brain Heart Infusion Medium (Firma Difco) gemäß der oben zitierten Europäischen Patentschrift angegeben.
Mittels einer Eichgeraden ergaben sich im Plattendiffusionstest nachstehend aufgeführte Aktivitätssteigerungen zum Zeitpunkt des Produktionsmaximums.
Die Aktivität in Nährlösung Brain Heart Infusion wurde gleich 100% gesetzt.
a) Brain Heart Infusion Agar 100 % b) 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt, 25 mM Calciumcarbonat 200 % c) 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt, 50 mM Calciumhydroxid 320 % Diese Angaben stellen keine absoluten Produktionswerte dar.
Ein Vergleich der mit Hilfe des Plattendiffusionstests gewonnenen Werte zeigt aber eindeutig, daß gegenüber der bekannten Arbeitsweise bei Einhaltung der erfindungsgemäßen Arbeitsweise eine signifikante Steigerung der Ausbeuten erzielt wurde.
Der zur Herstellung von Epidermin verwendete Stamm wird nach Schleifer & Kloos (Int. J. Syst. Bact. 25, 50-61 (1975)) wie folgt charakterisiert: Gramfärbung : positiv Zellgröße : Durchmesser 0,5-0,8 um Koloniengröße : ca. 1 mm Durchmesser Aussehen der Kolonien : glatt, glänzend, in der Mitte leicht erhöht Kolonienfarbe : gräulich - weiß Zellen in Kultur : oft Einzelzellen oder Zweier-Pakete, selten größere Haufen Hämolyse : auf Blutplatten ausgestrichene Kulturen zeigten starke Hämolyse Anaerobes Wachstum : der Stamm wächst auch unter anaeroben Bedingungen Lysozymempfindlichkeit: : die Zellen sind bis 2 mg/ml resistent gegen Lysozym Lysostaphinempfindlichkeit : die Zellen sind schon bei 20 Rg/ml sensitiv für Lysostaphin Epidermin-Resistenz : bis 1 mg/ml nachgewiesen Sonstige Resistenzen : in Flüssigkultur zeigt der Stamm eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Streptomycin (bis 1 mg/ml) und Spectinomycin (0,5 mg/ml) Erhöhter NaCl-Gehalt : Der Stamm wächst noch gut bis 15% Gew.-% Natriumchlorid.
Kolonien oder ausgestrichene Kulturen sind sehr klebrig.
Die Verwertung von verschiedenen C-Quellen unter Säurebildung und andere Enzymreaktionen wurden mit Hilfe des Api-Staph-Systems (Firma Biomerieux, Nürtingen) bestimmt.
Dieses System beruht auf einer Kombination von 20 biochemischen Reaktionen, die auf die Klassifizierung von KLOOS & SCHLEIFER (J.Clin.Microbiol. 1, 82-88 (1975)) zurückzuführen sind.
Tabelle 1: C-Quellenverwertung und andere Enzymreaktionen C-Quelle bzw. Enzym Pro- Staph. epid. Staph.epid.
duzent Kloos&Schleifer Api - Staph Kontrolle D-Glucose + k.A. + D-Fructose + + + D-Mannose (+) (+) + Maltose + + + Laktose (+) (+) + D-Trehalose D-Mannitol Xylitol D-Melibiose k .A.
Raffinose k .A.
D-Xylose Saccharose + + + a- Methylglucoside - k.A.
N-Acetylglucosamine - k.A. + Nitratreduktion + + + Phosphatase + + + Bildung von Acetylmethyl- + k.A. + carbinol (Voges-Proskauer Reaktion) Arginindehydrolase - k.A. + Urease + k.A. + + positive Reaktion - negative Reaktion (+) eindeutig positive Reaktion tritt erst etwas später auf + variable Eigenschaft k.A. keine Angaben Der Stamm Staphylococcus epidermidis DSM 3095 wurde auf Schrägröhrchen mit einem Medium der Zusammensetzung Pepton 10 g Dinatriumhydrogenphosphat 2 g, Fleischextrakt 8 g Glucose 10 g (separat autoklaviert) Kochsalz 3 g pH 7,2 g überimpft, über Nacht bei 370C inkubiert und anschließend bei -200C eingefroren. Für neue Versuchsansätze wurde jeweils ein frisches Röhrchen aufgetaut, da bei längerer Lagerung bei 40C Aktivitätsverluste beobachtet wurden.
Im folgenden wird eine genauere Beschreibung zur Herstellung des Antibiotikums Epidermin gegeben: Die Fermentation läßt sich in dazu geeigneten Schüttelkolben durchführen, zur Herstellung größerer Substanzmengen können auch Fermenter von 200 Liter und mehr verwendet werden.
Für Kolbenversuche wurden 500 ml Erlenmeyerkolben mit einem seitlichen Einstich verwendet. Die Kolben wurden mit 100 ml Nährlösung gefüllt und 20 Minuten bei 1210C autoklaviert.
Als Impfmaterial diente 1% einer 4 Stunden alten Vorkultur.
Die Inkubation erfolgte bei 370C auf der rotierenden Schüttelmaschine bei 140 rpm.
Für die Fermentation im 10-Liter-Maßstab wurden Fermenter mit 10 1 Nutzinhalt (Modell MF-14 New Brunswick, Scientific Co., New Brunswick, USA) mit 9,9 1 Nährlösung gefüllt und 30 Minuten bei 1340C autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde mit 100 ml einer 4 Stunden alten Vor kultur beimpft und bei 370C, 0,6 vvm und 240 rpm des Blattrührers fermentiert. Der relativ starken Schaumbildung wurde durch wiederholte Zugabe von sterilem Polyol begegnet.
Für die Fermentation im 25 1 Maßstab wurde ein 25 1 Fermenter (Typ b 25, Braun/Melsungen mit Umwurfsystem) mit 25 1 Nährlösung unter Zusatz von 3 ml Polyol beschichtet und in situ bei 1210C 30 Minuten sterilisiert. Als Impfmaterial dienten 300 ml einer 4 Stunden alten Vorkultur. Die Fermentation erfolgte bei 370C, 0,6 vvm und 1000 rpm.
Der Verlauf einer Fermentation im 10 1 Maßstab in einer Nährlösung, enthaltend 30 g Fleischextrakt, 20 g Malzextrakt und 5 g Calciumcarbonat in 1 Liter, ist in Abbildung 11 dargestellt. Intensives Wachstum verbunden mit der Verwertung der angebotenen C-Quelle unter Säurebildung kann am Abfall des pH-Wertes erkannt werden. Mit Beginn der Alkalisierung kann das Antibiotikum im Kultur filtrat nachgewiesen werden. Die Produktion erreicht nach 12 bis 18 Stunden ihr Maximum.
Zur Kontrolle des Fermentationsverlaufes wurden zu verschiedenen Zeiten während der Fermentation steril Proben entnommen.Die Proben wurden folgendermaßen ausgewertet: a.) pH-Wert: Messung mit einem Labor-pH-Meter (Knick pH-mV-Meter) b) Wachs tumsver lauf: Das Wachstum konnte anhand der Zunahme der Lebendkeimzahl verfolgt werden.
Hierzu wurden 0,5 ml steril entnommene Kultur in Saline verdünnt und davon 0,1 ml auf Platten (Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz 3 g, Dinatriumhydrogenphosphat 2 g, Glucose 10 g auf 1 1.) ausplattiert.
Nach 18 Stunden Inkubation bei 370C konnten die Einzelkolonien ausgezählt werden.
c.) Antibiotikumkonzentration: Die Proben wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge 3200 2 Minuten abzentrifugiert und 20 ijl des Überstandes im Plattendiffusionstest getestet.
Parallel wurde eine Eichkurve mit bekannten Konzentrationen erstellt.
Nach Erreichen des Produktionsmaximums wurde die Kulturflüssigkeit mittels kontinuierlicher Zentrifugation (Zentrifuge: Typ LA 71b-4, Loher & Söhne, Ruhstorf/Rott) mit 1380 rpm abzentrifugiert. Für eine optimale Abtrennung der Zellen mußte die Durchflußrate sehr niedrig gehalten werden. Eine erste Anreicherung der aktiven Komponenten wurde mittels der auf Seite 7 erwähnten Adsorption an Amberlite XAD-8, gemäß nachfolgendem Beispiel 1 erreicht: Beispiel 1 80 Liter Kulturfiltrat wurden über ca. 8 Liter Amberlite XAD-8 gegeben. Im Durchlauf konnte keine Aktivität festgestellt werden. Beim anschließenden Waschen mit Wasser wurde ebenfalls keine Aktivität eluiert. Anschließend wurde mit 13 Liter 100% Methanol gewaschen. Im Waschwasser wurde keine Aktivität detektiert. Die Elution erfolgte mit Methanol/ Salzsäure 99:1, wobei folgende Fraktionen erhalten wurden: Fraktion 1: 0,8 1 aktiv Fraktion 2: 4,5 1 Hauptaktiv Fraktion 3: 2 1 aktiv Fraktion 4: 2 1 keine Aktivität Fraktion 5: 1 1 keine Aktivität Die Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch auf ihren Gehalt an Epidermin getestet, anschließend wurden die aktiven Fraktionen vereinigt und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt (81,2 g). Der Rückstand wurde in Methanol/Essigsäure (95/5) aufgenommen (400 ml), von unlöslichen Bestandteilen abzentrifugiert und in Portionen von je 50 ml an Sephadex LH 20 (Säule 100x5 cm, Fließmittel Methanol/ Essigsäure 95:5) gelchromatographiert. Positive Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft (14,8 g).
Für die multiplikative Verteilung nach Craig kamen Apparaturen der Firma Labortec (Basel) zum Einsatz. Eine erste Trennung wurde mit einer 50 ml-Apparatur im System n-Butanol/Essigester/0,l M Essigsäure (3/1/3) durchgeführt. Die in der Unterphase (100 ml) gelöste Probe (5 g) wurde folgenden Trennbedingungen unterworfen: Stufenzahl: 160 Schüttelbewegungen/Stufe: 70 Schüttelintensität: 45 Trennzeit: 20 Min.
Zur Endreinigung wurde das erhaltene Rohprodukt (4,2 g) in Portionen von je 2 g in der Unterphase des Systems sec.-Butanol/0,05 N Ammoniumacetat (50 ml) gelöst und in einer 10 ml-Apparatur mit 440 Elementen aufgereinigt.
Stufenzahl: 440 Schüttelbewegungen/Stufe: 50 Schüttelintensität: 50 Trennzeit: 10 Min.
Die Epidermin enthaltenden Elemente wurden vereinigt, eingeengt, mit Wasser aufgenommen und mehrmals am Hochvakuum lyophylisiert. Das Antibiotikum (2,6 g) erwies sich bei allen vorgenommenen Untersuchungen als einheitlich.
Während der Herstellung und Isolierung des Epidermins wurde zur biologischen Charakterisierung der Plattendiffusionstest angewandt; nämlich zur Aufnahme des Wirkungsspektrums sowie zur Kontrolle von Produktion, Aufarbeitung und Anreicherung.
Der Test wurde, wie bei Zähner und Maas, Biology of antibiotics <Springe Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1972) beschrieben, in Petrischalen der Firma Greiner, Nürtingen mit Filterrondellen von 6 mm Durchmesser (Macherey & Nagel, Düren) durchgeführt. Die Filterrondellen wurden mit 20 ul der betreffenden Testflüssigkeit benetzt, bei Raumtemperatur auf einer Glasplatte getrocknet und auf die Testplatten aufgelegt. Die Testplatten wurden bei 370C inkubiert und nach ca. 16 Stunden die Wachstumshemmung ausgewertet.
Als Routinetestkeim diente Streptococcus pyogenes ATCC 8668 und, aufgrund seiner problemloseren Handhabung, Micrococcus luteus ATCC 9341.
Testplatten mit Streptococcus pyogenes ATCC 8668: Der Testkeim mußte vor Herstellung der Testplatten auf Blutplatten mit Mucin [Medium: 500 ml Agar pH 7,4, 160 ml Mucinlösung (10 Gewichtsprozent), 3,5 ml Glucoselösung (50 Gewichtsprozent), 70 ml Hammelblut] frisch überimpft werden.
Nach 15-18 Stunden Inkubation bei 370C wurde eine Salinesuspension (E578 0,5) hergestellt und 1 ml dieser Suspension zu 100 ml Nährboden (Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz 3 g, Na2HPO4 2 g, Glucose 10 g auf 1 1, pH 7,2) pipettiert. Die zu 10 ml Portionen gegossenen Platten waren einige Tage bei 40C haltbar.
Testplatten mit Micrococcus luteus ATCC 9341: Eine Übernachtkultur (Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz 3 g, Na2HPO4 2 g, Glucose 10 g auf 1 1, pH 7,2) wurde auf eine Extinktion von 1,0 bei 578 nm verdünnt. Mit 0,25 ml dieser Suspension wurden 100 ml Agar angeimpft und Platten zu 10 ml gegossen. Die Testplatten konnten mehrere Tage bei 40C aufbewahrt werden.
Testpatten für das Wirkungsspektrum: Testplatten mit Bakterien: a.) Aerob lebende Bakterien: Übernachtkulturen wurden in den jeweiligen Testmedien angezogen und die Platten wie bei Micrococcus luteus ATCC 9341 beschrieben hergestellt.
ß.) Anaerob lebende Bakterien: Die Vorkulturen für Clostridium pasteurianum ATCC 6013 und Propionibacterium acnes DSM 1897 wurden in Reagenzgläsern gezogen, die zur Verdrängung des Sauerstoffes bis zum Wattestopfen mit Nährlösung aufgefüllt wurden.
Mit 3 ml Vorkultur wurden 100 ml Agar beimpft und Platten in 10 ml Portionen gegossen.
Die Inkubation erfolgte im Anaerobier-Topf (BBL-Gas Pak 100, Becton, Dickinson GmbH, Heidelberg) bei der jeweils optimalen Temperatur.
Testplatten mit hefeartig wachsenden Pilzen: In Schüttelkultur wurden die Zellen im jeweiligen Testmedium 18-20 Stunden angezogen. Nach Auszählen in der Thoma-Zählkammer wurden die Testplatten zu einer Dichte von 10 Organismen/ml Agar angeimpft.
Testplatten mit Pilzen und Streptomyceten: Die Testorganismen wurden auf Schrägröhrchen (Medium: Hefeextrakt 4 g, Malzextrakt 10 g, Glucose 4 g auf 1 1) bei den entsprechenden Temperaturen bis zur Sporulation angezogen.
Die Sporen wurden mit 3 ml Saline-Tween 80 (1 Tropfen Tween 80 auf 100 ml Saline) abgeschwemmt und in Testplatten eingegossen.
Die Substanz Epidermin besitzt eine sehr gute antibakterielle Wirksamkeit; sie wirkt besonders gut gegen eine ganze Reihe grampositiver Bakterien. Die antibakterielle Wirkung von Epidermin wurde vergleichend mit der von Nisin (Nisin vgl. u.a. DE-A-2 000 818 bzw. GB-B-1 182 156) untersucht; bei einigen wichtigen, klinisch relevanten Keimen wurde auch Fusidinsäure in den Vergleich miteinbezogen. Die Wirksamkeit wurde mit Hilfe des Plattendiffuisionstests und durch die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen ermittelt.
a.) Plattendiffusionstest: Im Plattendiffusionstest wurde die Empfindlichkeit verschiedener Mikroorganismen gegen Epidermin und Nisin getestet.
Tabelle 2 zeigt, daß beide Antibiotika fast ausschließlich auf grampositive Bakterien wirken. Verwendet wurde Nisin mit einer Aktivität von 40000 units.
Tabelle 2: Empfindlichkeit gegen Epidermin und Nisin Angabe in mm Hemmhof, Konzentrationen 1 mg/ml und 0,5 mg/ml.
Mikroorganismen Kulturbed. Epidermin Nisin Temp. Medium 1 0,5 1 0,5 Bakterien Eubacteriales, grampositiv Arthrobacter aurescens 270C 5 8 Sp 9 8 Arthrobacter crystallopoietes 270C 5 16 15 16 15 Arthrobacter globiformis 270C 5 14 12 14 13 Arthrobacter oxydans 270C 5 12 11 11 10 Arthrobacter pascens 27QC 5 13 12 14 13 Bacillus cereus 370C 3 8 Sp Bacillus pumilus 370C 4 14 12 12 10 Bacillus subtilis ATCC 6051 370C 4 12 11 9 8 Bacillus subtilis ATCC 6051 370C 6 17 16 14 12 Bacillus subtilis ATCC 6633 370C 4 14 11 9 8 Bacillus subtilis F 24-2 370C 4 13 11 8 Sp Bacillus subtilis A 14 370C 4 12 10 9 Sp Brevibacterium flavum 370C 4 11 10 8 7 Clostridium pasteurianum 300C 7 17 15 14 13 Clostridium sporogenes 370C 8 10 9 8 Sp Corynebacterium spec. 270C 4 15 13 9 8 Corynebacterium insidiosum 270C 4 19 17 10 8 Corynebacterium rathayi 270C 4 14 12 10 9 Micrococcus luteus ATCC 381 270C 5 10 9 - -Micrococcus luteus ATCC 9341 270C 2 21 20 17 16 Propionibacterium acnes 370C 8 22 19 21 18 Sarcina lutea 370C 5 15 14 15 14 Staphylococcus aureus Tü 202 370C 4 13 10 10 9 Staphylococcus aureus DSM 683 370C 4 11 9 Sp -Staphylococcus aureus Pen.res 370C 4 12 11 9 8 Staphylococcus cohnii 370C 2 14 12 9 -Streptococcus pyogenes 370C 2 22 20 18 17 Eubacteriales, gramnegativ: Proteus mirabilis 370C 4 11 9 9 7 Proteus vulgaris 370C 5 9 8 8 Sp Actinomycetales: Streptomyces glaucescens 270C 3 10 8 10 9 Streptomyces violaceoruber 370C 3 9 8 -Streptomyces virido- 370C 3 11 10 9 8 chromogenes (-) bedeutet, daß keine Wirkung eintrat; Sp = Spuren b.) Minimale Hemmkonzentration: Die minimale Hemmkonzentration für klinisch relevante Keime, angegeben in pg/ml, wurde in Mikrotiterplatten in folgendem Medium geprüft: 5 ml Na-Lactat, 5 g Na2SO4, 0,5 g KH2PO4, 0,1 g MgCl2, 5 g NH4C1, 10 g Glucose, 50 jig Calciumpantothenat, 50 jig Thiamin, 0,25 jig Folsäure, 50 µg Niacin, 25 µg p-Aminobenzoesäure, 50 µg Pyridcxin-Hydrochlorid, 25 jig Riboflavin in 1000 ml Aqua dest.
In Tabelle 3 sind die minimalen Hemmkonzentrationen (µg/ml) von Epidermin, Nisin und Fusidinsäure im Vergleich dargestellt.- Das hierbei verwendete Nisin besaß eine Aktivität von 2500 units.
Tabelle 3: Minimale Hemmkonzentration in pg/ml: Epidermin Fusidinsäure Nisin St. epidermidis WG 99 2 4 128 Sc. pyogenes ATCC 8668 0,125 1 4 Sc. pneumoniae ATCC 6302 2 16 32 Mc. luteus ATCC 15957 0,25 0,5 16 Mc. luteus ATCC 9341 S 0,06 0,5 8 Cb. xerosis NCTC 9755 0,125 0,125 16 E. coli ATCC 11775 128 >128 >128 E. coli ATCC 9637 128 >128 >128 Propionib. acnes PC 904 0,06 0,5 32 Propionib. acnes ATCC 25746 0,25 1 64 Die in der Tabelle 2 genannten Medien werden nachfolgend beschrieben. Die Medien wurden nach Einstellen des pH-Wertes 20 Minuten bei 12100 autoklaviert.
Die Mengenangaben beziehen sich jeweils auf 1 1 Wasser. Bei chemisch definierten Medien wurde entionisiertes Wasser verwendet.
Medium: (2) Glucose-Agar--Medium: Pepton 10 g Fleischextrakt 8 g NaCl 3g Na2HPO4 2g Glucose 10 g (getrennt autoklaviert) Agar 20 g pH 7,2 (3) Hefe-Malz-Medium: Hefeextrakt 4 g Malzextrakt 10 g Glucose 4g Agar 20 g pH 7,3 (4) Oxoid-Medium für Bakterien: Fleischextrakt 10 g Pepton 10 g NaCl 5g Agar 20 g pH 7,2 (5) Nutrient broth 8 g (Firma Difco) Agar 20 g pH 7,2 (6) Minimalmedium für Bakterien (HÜTTER et al., 1966): D-Glucose 8 g di-Ammoniumtartrat 4 g NaCl 5 g K2HPO4 2 g MgSO4 x 7 H2O 1 g CaCl2 0,2 g MnSO4 x H2O 0,01 g Ferrioxamin B 0,02 g Agar 20 g pH 7,2 (7) Medium für Clostridium pasteurianum: Fleischextrakt 3 g Hefe Extrakt 3 g Malz Extrakt 3 g Pepton 20 g D-Glucose 5 g Ascorbinsäure 0,2 g Agar 20 g pH 7,0 (8) Brewer Thioglycolatmedium für Propionibacterium acnes: Thioglycolatmedium 40,5 g Agar 20 g pH 7,2 Epidermin ist sehr gut verträglich, bei topischer Anwendung, wurden keine toxischen Wirkungen festgestellt..
Von sehr großem Vorteil ist es. daß die resistente Mutante Staphylococcus epidermidis DSM 3095 gegenüber dem von ihm produzierten Epidermin resistent ist. Der Stamm NCIB 11536 besitzt keine derartige Resistenz gegen das von ihm produzierte niedermolekulare Antibiotikum.
Der neue Klon DSM 3095 wurde wie folgt gewonnen: Die Adoption wurde in 100 ml Erlenmeyerkölbchen mit einem seitlichen Einstich und 10 ml Nährlösung (Brain Heart Infusion) durchgeführt. Die Startkultur wurde mit 0,5 ml einer 12 Stunden alten Kultur angeimpft. Für die Kölbchen, die steigende Epidermin-Konzentrationen enthielten, dienten 0,5 ml der jeweils vorangegangenen, gutgewachsenen Kultur als Impfmaterial. Die Beurteilung des Wachstums erfolgte photometrisch bei 578 nm. Die Kultur, die bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml Epidermin in Flüssigkultur noch gut gewachsen war, wurde in Saline verdünnt und auf einer Platte, in die 0,5 mg/ml Epidermin eingegossen waren, ausplattiert.
Als Vergleichswert wurde eine unverdünnte 12 Stunden alte Kultur des literaturbekannten Vergleichsstammes NCIB 11536 ausplattiert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 370C zeigten sich bei der auf 10 verdünnten adaptierten Kultur 94 Einzelkolonien. Der unverdünnt auf 0,15 mg/ml Epidermin enthaltende Platten ausplattierte Vergleichsstamm wuchs auch nach 48 Stunden Inkubation nicht. Die resistenten Kolonien wurden selektioniert und auf Platten Medium 2 im Raster ausgestrichen. Nach einem Vortest auf Produktion durch Ausstechen von Stückchen mit 5 mm Durchmesser und Aktivitätstest auf Micrococcus luteus ATCC 9341 wurden produzierende Klone im Flüssigmedium getestet.
Vergleich des resistenten Stammes mit dem literaturbekannten Stamm: a.) Minimale Hemmkonzentration im Plattendiffusionstest: Auf Testplatten mit den beiden Stämmen ergaben sich die in Tabelle 4 aufgeführten minimalen Hemmkonzentrationen.
Tabelle 4: Minimale Hemmkonzentrationen von Epidermin im Plattendiffusionstest bei NCIB 11536 und DSM: 3095.

Stamm llg/ml

NCIB 11536 10

DSM 3095 > 1000

b.) Wachstum und Produktion: Wachstum- und Produktionsverlauf der beiden Stämme wurden in Nährlösung (3% Fleischextrakt, 2% Malzextrakt, 0,379c Ca (OH)2) verglichen. Siehe Abbildung 12.
Wachstumsverlauf: Lebendkeimzahlbestimmung Produktionsverlauf: Aktivität gegen Micrococcus luteus ATCC 9341 im Plattendiffusionstest.
Beim resistenten Stamm wird eine bessere Produktion beobachtet.
c.) Empfindlichkeit gegen Epidermin in verschiedenen Wachstumsphasen: Die Versuche zur Eigenhemmung des Produzentenstammes durch das Antibiotikum und die Untersuchung auf Resistenz der selektionierten Klone wurden im Biophotometer (Eppendorf-Photometer mit Umlaufautomat) durchgeführt.
Diese Versuche können z.B. im einzelnen wie folgt durchgeführt werden: Jeweils 0,5 ml einer 12 Stunden Kultur von Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 bzw. des selektionierten resistenten Stammes DMS 3095 wurden auf frisches Medium überimpft.
Diese Kulturen ließ man bis zu einer Extinktion von 0,043 bei 578 nm hochwachsen (Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm) und verteilte sie dann in Portionen zu 7,5 ml in die Küvetten des Biophotometers (Schichtdicke 2 cm).
Die Dichte der Zellsuspension wurde im Biophotometer auf eine Transmission von 90% eingestellt. Die Inkubation erfolgte bei 370C und maximaler Belüftung. Epidermin wurde als wässrige Lösung in unterschiedlichen Wachstumsphasen zugegeben.
Bei beiden Stämmen wurden zu Beginn und in der Mitte der logarithmischen Phase unterschiedliche Epidermin-Konzentrationen zugegeben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 13 und 14 dargestellt.
Mit den bis jetzt getesteten Konzentrationen konnte beim resistenten Stamm keine Lyse beobachtet werden.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum Epidermin übt, genauso wie die Kulturbrühe, aus der es isoliert wurde, eine bakterizide Wirkung aus, die zur Lysis der Zellen führt.
Angesichts der bakteriziden Wirkung und des breiten Wirkungsspektrums gegen grampositive Bakterien ist das erfindungsgemäße Polypeptid-Antibiotikum Epidermin besonders wirksam bei der Behandlung von Infektionen, die durch grampositive Bakterien verursacht wurden. Epidermin ist besonders wertvoll für die Bekämpfung von Hautinfektionen, wie Ekzeme, Impetigo, Cellulitis und insbesonders Akne. Die sehr gute Wirksamkeit gegen einige wichtige Propionibakteriumacnes-Stämme wurde in den Tabellen 2 und 3 gezeigt. Es kann gesagt werden, daß Epidermin, welches normalerweise von Organismen, die die menschliche Haut besiedeln, erzeugt wird, bessere Aktivitäten zum Schutze der Haut ausübt als sonstige übliche Antibiotika.
Die eingangs erwähnten pharmazeutischen Zubereitungsformen, die das erfindungsgemäße Antibiotikum zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen und Trägerstoffen enthalten, können der oralen, parenteralen, enteralen oder topischen Applikation dienen. Solche Zubereitungsformen, insbesondere aber topische Zubereitungsformen können als Lösungen, Emulsionen, Gele, Lotionen, Salben, Cremes oder Puder vorliegen.
Die folgenden Beispiele zeigen die Herstellung solcher pharmazeutischer Anwendungsformen: Beispiel 2 Tinktur In 100 g Tinktur sind enthalten: Epidermin 1,0 g Ethanol (94,5 Vol.-%) 56,0 g 1,2-Propylenglykol 40,0 g Wasser demineralisiert 3,0 g Herstellung: Epidermin wird in dem Gemisch Ethanol/l,2-Propylenglykol/Wasser gelöst, die Lösung anschließend sterilfiltriert.
Beispiel 3 Lotio In 100 g Lotio sind enthalten: Epidermin 1,00 g 1,2-Propylenglykol 7,00 g Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (Benzalkon A )) 0,15 g Sorbitanmonopalmitat (Span 40 (R)) 0,40 g Sorbimacrogolpalmitat (Tween 40 (R)) 1,20 g Ölsäuredecylester (Cetiol V(R) 2,40 g Gemisch aus Cetyl- und Stearylalkohol (Lanette O(R) 1,60 g Cetylpalmitat 0,80 g demineralisiertes Wasser ad 100 g Herstellung: Die vorgenannten Mengen an Alkyldimethylbenzylammonuimchlorid, Sorbitanmonopalmitat, Sorbimacrozolpamitat, Ölsäuredecylester, Cetyl- und Stearylalkohol und Cetylpalmitat werden in 75 ml Wasser eingerührt, die gefilterte Lösung von Epidermin in 1,2-Propylenglykol und dem restlichen Wasser wird dazugerührt und die Ti..nk.tur -..homogenisiert.
Beispiel 4 Gel 100 g Gel enthalten , Epidermin 1,0 g Polyethylenglykolether des Laurylalkohols (Brij 35 (R)) 1,0 g 1,2-Propylenglykol 5,0 g Acrylsäurepolymerisat (Carbopol 934 (R)) 1,2 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester 1,6 g p-Hydroxybenzoesäurepropylester 0,4 g Parfüm q.-s.
Natronlauge ad pH 6,5.
demineralisiertes Wasser ad 100 Herstellung: Die vorgegebenen Mengen an Hilfsmitteln werden in 75 ml. Wasser eingerührt; das Epidermin wird in dem Gemisch aus 1,2-Propylenglykol und dem restlichen Wasser gelöst und diese Lösung ebenfalls eingerührt; das .fertige Gel wird nochmals homogenisiert.
Legende zu den Abbildungen: Abb. 1: Aminosäurenchromatogramm des sauren Totalhydrolysats von Epidermin; Ninhydrin-Färbung, 2L = 570 nm.
Abb. 2: Gaschromatogramm der N-Pentafluorpropionyl-aminosäure-n-propylester des sauren Totalhydrolysats von Epidermin an Chiralsil-Val. Temperaturprogramm 3 Min. 850C isotherm, dann 40C/Min. bis 2000C; Trägergas H2 (0,92 bar).
Abb. 3: UV-Spektrum von Epidermin in Wasser, pH 3 (C=0,15 mg/ml).
Abb. 4: Infrarot-Spektrum von Epidermin in einer Kaliumbromidtablette.
Abb. 5: 1H-Kernresonanzspektrum von Epidermin t20 mg/0,5 ml D7-Dimethylformamid, 400,16 MHz).
Abb. 6: 13C-Kernresonanzspektrum von Epidermin (40 mg/0,5 ml 12C. ²H-Dimethylformamid, 100,6 MHz, 45360 Pulse).
Abb. 7: HPLC-Chromatogramm von Epidermin an µ Bondapak C18 (300x3,9 mm). Mobile Phase: A=Acetonitril/ 0,01 M KH2PO4 (10/90), B=Acetonitril/ 0,01 KH2PO4 (70/30); linearer Gradient von 10% B auf 10096 B in 30 Min., Fließgeschwindigkeit 2 ml/min.
13 Abb. 8: C-Kernresonanzspektrum des Fragments P2 (12 mg/0,5 ml 12C, 2H-Dimethylformamid, 100,6 MHz, 38300 Pulse).
Abb. 9: Isolierung von Epidermin.
Abb. 10: Vergleich der Medien anhand Lebendkeimzahl (durchgezogene Linien) und Aktivität gegen Micrococcus luteus (gestrichelte Linien) Brain Heart Infusion o 3% Fleischextrakt 2% Malzextrakt 0,25% CaCO3 # 3% Fleischextrakt 2% Malzextrakt 0m37% Ca(OH)2 Abb. 11: Verlauf einer Fermentation im 10 Maßstab pH-Verlauf # Lebendkeimzahl o Aktivität gegen Streptococcus pyogenes ATCC 8668 Abb. 12: Vergleich von literaturbekanntem Stamm und resistentem Klon DSM 3095 anhand Lebendkeimzahl (durchgezogene Linien) und Aktivität gegen Micrococcus luteus ATCC 9341 (gestrichelte Linien).
o literaturbekannter Stamm # resistenter Klon Abb. 13: Epiderminzugabe in verschiedenen Wachstumsphasen bei Staphylococcus epidermidis NCIB 11536: Kurve 1: normaler Wachstumsverlauf Kurve 2: Zugabe von 10 Wg/ml Epidermin zu Beginn der logarithmischen Phase führt zur Lyse.
Kurve 3: Zugabe von 10 SLg/ml Epidermin in der Mitte der logarithmischen Phase führt ebenfalls zur Lyse.
Kurve 4: Zugabe von 2,5 ,ug/ml Epidermin in der Mitte der logarithmischen Phase führt zur Wachstumsverzögerung.
Abb. 14: Epiderminzugabe in verschiedenen Wachstumsphasen beim resistenten Klon DSM 3095 Kurve 1: normaler Wachstumsverlauf, identisch mit dem Stamm NCIB 11536.
Kurve 2: Zugabe von 120 llg/ml Epidermin zu Beginn der lagrithmischen Phase ergibt nur eine geringfügige Wachstumsverzögerung Kurve 3: Zugabe von 360 llg/ml Epidermin in der Mitte der logarithmischen Phase führt auch hier nur zu einer Wachstumsverzögerung.

Claims

Patentansprüche 1. Antibiotisch wirksames Polypeptid, genannt Epidermin, gekennzeichnet durch folgende Aminosäurenzusammensetzung: Asx (1), Pro (1), Gly (2), Ala (2), Ile (2), Phe (2), Lys (2), Lan (2), ß-Me-Lan (1), Dhb (1), Tyr (1), X (1), worin X eine strukturell nicht aufgeklärte Aminosäure ist, Dhb die a,ß-Dehydroaminobuttersäure und Asx das Fragment Asn/Asp bedeuten, und durch eine chemisch einheitliche Fraktion P1 als N-terminales Bruchstück der tryptischen Spaltung und durch eine nach der tryptischen Spaltung isolierte chemisch einheitliche Fraktion P2, die aus dem C-terminalen Bruchstück des Gesamtmoleküls entsteht, wobei die Fraktion P1 nach Entfernung der C-terminalen Aminosäure Lysin als Fraktion P12 aus folgenden Aminosäuren besteht: Pro (1), Lan (1), ß-Me-Lan (1), Gly (1), Ala (2), Ile (2), Phe (1), Lys (1) und nach Überführung von meso-Lanthionin in D- und L-Alanin und von ß-Methyllanthionin in D-Aminobuttersäure und L-Alanin und nach Zuordnung der Schwefelbrücken folgende Struktur besitzt und das C-terminale Fragment P2 aus folgenden Aminosäuren besteht: Asx (1), Lan (1), Gly (1), Phe (1), Tyr (1), X (1) und a-Ketobuttersäure.
2. Epidermin gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende weitere Parameter: 1. Natur: farbloses Pulver 2. Molmasse: im Bereich von 2160
3. Ultraviolettabsorptionsspektrum: In methanolischer Lösung langwelliges Maximum bei 267 nm (Abb. 3),
4. Infrarotabsorptionsspektrum: IR-Spektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette: siehe Abb. 4.
5. Löslichkeit: sehr gut löslich in Mischungen aus Wasser/-Eisessig bzw. Methanol/Eisessig, löslich in niederen Alkoholen, unlöslich in Chloroform, Aceton, Diethylether, Petrolether, 6. Farbreaktion auf Kieselgelplatten: Ninhydrin, Chlor/ 4,4'-Bis-(dimethylamino)diphenylmethan, Orcin/Schwefel-Säure, Anisaldehyd/Schwefelsäure, zerstörungsfreier Nachweis im W-Licht bei 254 nm und durch Sprühen mit Wasser, 7. Stabilität: Stabil von pH=2 bis pH=7, bei höheren pH-Werten tritt starker Aktivitätsabfall ein, 8. Kernmangnetische Resonanzspektren Abb. 5 ¹H-NMR Spektrum, Abb. 6 13C-NMR-Spektrum 9. Dünnschichtchromatographie: Kieselgelfertigplatten 60 F254 (Merck) System A: Chloroform/Methanol 17% Ammoniak (2/2/1), RF = 0,73 System B: Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniak (70/35/10) RF = 0,30 System C: n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/1/1) RF = 0,05 10. HPLC : siehe Abb. 7.

3. Verfahran zur Herstellung, Isolierung und Reinigung des Antibiotikums Epidermin, gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Staphylococcus epidermidis DSM 3095 aerobisch bei 34 bis 370C in einer komplexen Nährlösung, bestehend aus 2 bis 4% einer Stickstoffquelle wie Fleischextrakt, 1 bis 3% eines Zuckers bzw. Zuckeralkohols als Kohlenstoffquelle und 0,25 bis 1% eines Carbonats und/oder 0,25 bis 0,5% eines Hydroxids eines Erdalkalimetalls, gezüchtet wird, die Kulturbrühe anschließend nach Entfernung der,Zellen und anorganischer Salze zur Isolierung des gebildeten Wirkstoffes entweder mit n-Butanol bei pH 8 extrahierts, der Butanolextrakt evaporiert, der Rückstand in Methanol gelöst und die Lösung durch Etherfällung von den lipidischen Begleitstoffen befreit oder mit Polymeren auf Acrylesterbasis, wie Amberlite XAD-8, behandelt wird, wobei das adsorbierte Epidermin mit Methanol/konzentrierte Salzsäure (99:1) vom Harz gelöst, die Lösung anschließend mit Ammoniak neutralisiert und am Vakuum eingeengt wird, und die so gewonnenen Medien zur Abtrennung von weiteren niedermolekularen Peptiden, Aminosäuren und Salzen gelchromatographiert (Sephadex LH-20 mit Methanol/Essigsäure (95:5)) und anschließend einer multiplikativen Gegenstromverteilung nach Craig, bei welcher zuerst eine Flüssig-Flüssig-Verteilung mit dem System n-Butanol/Essigester/0,l N Essigsäure (3:1:3) vorgenommen wird, bei der Epidermin am Start sitzen bleibt, und anschließend bei einer zweiten Verteilung mit dem neutralen System 2-Butanol/0,05 N Ammoniumacetat (1:1) die Eliminierung des reinen Epidermins erreicht wird, unterworfen werden und aus dem Eluat durch Gefriertrocknung das Epidermin als farbloses Pulver eliminiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Stickstoffquellen 2 bis 4 Gew.-% eines Fleischextraktes, eines Gemisches aus allen 20 Aminosäuren in Aminosäure-Konzentrationen von jeweils 2 g/l, oder 2 bis 4 % von Casaminoacid in Gegenwart von Tryptophan, als Kohlenstoffquellen 1 bis 3 Gew.-% Malzextrakt, Maltose, Galaktose, Laktose, Mannit, Glucose, Glycerin oder Kombinationen von Laktose mit Maltose, Galaktose mit Maltose, desweiteren 0,25 bis 1 Gew.-% Calciumcarbonat oder 0,25 bis 0,5 Gew.-% Calciumhydroxid in das Fermentationsmedium eingebracht und gegebenenfalls noch Vitamine wie Biotin, Nicotinsäure, Thiamin, Pyridoxin.HCL und Calciumpantothenat zugefügt werden, der pH-Wert vor der Fermentation auf 6,0 bis 7,0 eingestellt wird und der Produktionsverlauf durch laufende Probenahmen überprüft wird.

5. Epidermin erhalten nach dem Verfahren des Anspruchs 3.
6. Als neuer Epidermin-erzeugender und gegen Epidermin resistenter Stamm Staphylococcus epidermidis DSM 3095.
7. Staphylococcus epidermidids DSM 3095 mit folgender Charakterisierung Gramfärbung : positiv Zellgröße : Durchmesser 0,5-0,8 Wm Koloniengröße : ca. 1 mm Durchmesser Aussehen der Kolonien : glatt, glänzend, in der Mitte leicht erhöht Kolonienfarbe : gräulich - weiß Zellen in Kultur : oft Einzelzellen oder Zweier-Pakete, selten größere Haufen Hämolyse : auf Blutplatten ausgestrichene Kulturen zeigten starke Hämolyse Anaerobes Wachstum : der Stamm wächst auch unter anaeroben Bedingungen Lysozymempfindlichkeit: : die Zellen sind bis 2 mg/ml resistent gegen Lysozym Lysostaphinempfindlichkeit : die Zellen sind schon bei 20 Wg/ml sensitiv für Lysos taph in Epidermin-Resistenz : bis 1 mg/ml nachgewiesen Sonstige Resistenzen : in Flüssigkultur zeigt der Stamm eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Streptomycin (bis 1 mg/ml) und Spectinomycin (0,5 mg/ml) Erhöhter NaCl-Gehalt : Der Stamm wächst noch gut bis 15% Gew.-% Natriumchlorid, wobei die Kolonien oder ausgestrichenen Kulturen klebrig sind.
8. Antibakterielle Arzneimittelzubereitungen gekennzeichnet durch einen Gehalt an Epidermin gemäß Anspruch 1 und 2 neben üblichen Träger und/oder Hilfsstoffen.
9. Verwendung von Epidermin gemäß Anspruch 1 und 2 zur Bekämpfung von Bakterien.