DE3228060A1

DE3228060A1 - Verfahren zum behandeln von wuchernden hautkrankheiten

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Publication number: DE3228060A1
Application number: DE19823228060
Authority: DE
Inventors: Jon Philip 94404 Foster City Calif. Miller; Wesley Ward 94538 Fremont Calif. Zmolek
Original assignee: SRI International Inc; Stanford Research Institute
Current assignee: SRI International Inc
Priority date: 1981-08-05
Filing date: 1982-07-27
Publication date: 1983-02-24
Also published as: FR2510889B1; JPS5826818A; CA1198678A; US4369181B1; GB2103086A; SE8204561D0; SE8204561L; FR2510889A1; US4369181A

Description

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* t * t t

Verfahren zum Behandeln von wuchernden Hautkrankheiten

Die Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von wuchernden Hautkrankheiten mit bestimmten 6,8-substituierten Ribofuranosylpurin-3',5'-Cyclophosphaten.

Psoriasis (Schuppenflechte) ist vielleicht die am häufigsten auftretende wuchernde Hautkrankheit. Eine Übersicht "Research Needs in 11 Major Areas in Dermatology" in J. Invest. Derm., 73, S. 402-413 (1979) berichtet von Schätzungen, denen zufolge bis zu 4 % der Bevölkerung der Vereinigten Staaten von Amerika an Psoriasis leiden. Man nimmt an, daß Psoriasis eine durch eine Vielzahl von Faktoren hervorgerufene genetische Krankheit ist. Personen, die für Psoriasis erblich veranlagt sind, entwickeln die Krankheit entweder spontan oder in einem verletzten Hautbereich. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch unkontrolliertes gutartiges Wachstum der Epidermis, und psoriatische Epidermis zeigt (1) eine

deutliche Wucherungszunahme und (2) eine verminderte Enddifferenzierung. Infolgedessen hat sich ein großer Teil der Untersuchungen hinsichtlich der Krankheitsursachen und der Behandlung von Psoriasis auf die Paktoren, die das Wachstum und die Differenzierung der Epidermis steuern, sowie auf die pharmakologische Modulation eines oder mehrerer dieser Faktoren konzentriert.

Derzeit wird eine Vielzahl von Therapien zur Behandlung von Psoriasis angewandt, unter anderem Dialyse, Fotochemotherapie, allgemeine Chemotherapie sowie lokale Chemotherapie. Dabei wird die lokale Chemotherapie wahrscheinlich am häufigsten angewandt. Teer, Retinoide, Anthralin, Kortikosteroide und Antimetabolite sind einige der heute zur Behandlung von Psoriasis angewandten Mittel. Zyklisches Adenosinmonophosphat (zAMP) ist einer der Faktoren, von denen angenommen wird, daß sie kritische Regulatoren der Zellenphysiologie sind, und in Übereinstimmung damit hängt die Störung des epiderinisehen zAMP-Systems mit der Psoriase zusammen. Infolgedessen werden zAMP und viele seiner Derivate als gegen Psoriasis wirkende Mittel angesehen. In den US-PS'en 4 007 268 und 4 207 315 wird vorgeschlagen, bestimmte 9-ß-D-Ribofuranosyladenin-3',5'-Cyclophosphate für die Behandlung von wuchernden Hautkrankheiten wie Psoriase einzusetzen. Diese Verbindungen sind Analoga der zyklischen Nukleotide, die nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Vergleichsversuche zwischen einigen dieser Analoga und den Nukleotiden nach der Erfindung zeigen, daß letztere gegenüber den untersuchten Analoga eine unerwartete bessere antipsoriatische Wirksamkeit aufweisen.

AO

Die US-PS 4 058 659 beschreibt eine Gattung von 6,8-substituierten 9-ß-D-Ribofuranosylpurin-3',S'-Cyclophosphaten, die einige, jedoch nicht alle, der bei der Erfindung zur Anwendung kommenden zyklischen Nukleotide umfassen. Die Verbindungen der Gattung sind Analoga der natürlich auftretenden Purin-Nukleotide, und sie sind angeblich beständiger gegenüber einem Phosphodiesterase-Angriff als die natürlichen Verbindungen. Von den Verbindungen wird gesagt, daß sie u. a. folgende Eigenschaften aufweisen: sie sind phosphodiesterase-hemmend, sie aktivieren Proteinkinase und wirken adenylatcyclase-hemmend. In dieser Beziehung werden die beiden erstgenannten Aktivitäten - Hemmung von Phosphodiesterase und Aktivierung von Proteinkinase - allgemein als charakteristisch für Verbindungen angesehen, die zur Behandlung von Psoriase einsetzbar sind. Die vorliegend angestellten Untersuchungen zeigen jedoch, daß eine lokale antipsoriatische Wirksamkeit aus diesen Aktivitäten nicht abgeleitet werden kann, da sämtliche Verbindungen, die diese Aktivitäten aufweisen, keine praktischen Wirkstoffe gegen Psoriasis sind. Die dritte Aktivität - Hemmung von Adenylatcyclase ist nicht charakteristisch für solche Verbindungen, sondern ist im Gegenteil eher charakteristisch für Verbindungen, die wuchernde Hautkrankheiten fördern.

Wie nachstehend im einzelnen erläutert wird, zeigen die durchgeführten Untersuchungen ferner unzweideutig, daß die Wirksamkeit eines bestimmten zAMP-Analogons als lokaler Wirkstoff gegen Psoriasis nicht aus der chemischen Struktur des Analogons vorausgesagt werden kann.

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Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß eine ausgewählte Gruppe von zAMP-Analoga eine unerwartete Wirksamkeit als Mittel gegen Psoriasis aufweist, wenn sie lokal angewandt werden.

Die beigefügte Grafik zeigt die antipsoriatische Wirksamkeit eines der Nukleotide nach der Formel (1).

Das Verfahren nach der Erfindung zum Behandeln von wuchernden Hautkrankheiten ist gekennzeichnet durch Aufbringen auf eine befallene Stelle der Haut eines Patienten einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der folgenden Formel:

OH

in der

R₆ ist:

(i) -NR₁ R₂, wobei R·] und R₂ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-5 Kohlenstoffatomen oder Cyclopentyl sind oder zusammen mit dem Stickstoffatom verbunden sind unter Bildung einer heterocyclischen Gruppe mit 4 bis einschließlich 5 ringförmigen Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß die Gesamtanzahl Kohlenstoffatome in der -NR. R₂~Gruppe 4 oder 5 ist, oder

(ii) -XR, wobei X ein Chalkogenatom mit der Ordnungszahl 8 oder 16 und R ein Alkyl mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen ist;

R₈ ist:

(i) -X-(CH₂) R₃, wobei X wie vorher definiert ist, η eine ganze Zahl von 1-3 einschließlich ist, R^ Wasserstoff, Alkyl mit 1-7 Kohlenstoffatomen oder 0-bis einschließlich 1-substituiertes Phenyl, Stickstoff, Halogen mit der Ordnungszahl von 9 bis 35 einschließlich, methoxylhaltig, hydroxylhaltig oder Methyl ist, oder

(ii) -NR. R,-, wobei R, und R,- unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-8 Kohlenstoffatomen oder Phenalkyl mit 7-9 Kohlenstoffatomen sind mit der Maßgabe, daß nur entweder R₄ oder R₅ Wasserstoff ist und daß die Gesamtzahl Kohlenstoffatome in der -NR₄ Rc-Gruppe im Bereich von 1 bis einschließlich 9 liegt; und

Z ist:

Wasserstoff, ein Alkalimetall-Kation oder Ammonium.

Die lokal anwendbare Formulierung nach der Erfindung zum Behandeln eines Patienten mit einer wuchernden Hautkrankheit ist gekennzeichnet durch eine therapeutisch wirksame Menge mindestens einer Verbindung der folgenden Formel:

O=. P — O OH

e ο

in der

Rg ist:

(i) -NR^ R2, wobei R^ und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-5 Kohlenstoffatomen oder Cyclopentyl sind oder zusammen mit dem Stickstoffatom verbunden sind unter Bildung einer heterocyclischen Gruppe mit 4 bis einschließlich 5 ringförmigen Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß die Gesamtanzahl Kohlenstoffatome in der -NR₁ R^-Gruppe 4 oder

I —

5 ist, oder

Rg ist:

(ii) -NR₄ R₅, wobei R₄ und R₅ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-8 Kohlenstoffatomen oder Phenalkyl mit 7-9 Kohlenstoffatomen sind mit der Maßgabe, daß nur entweder R- oder R,- Wasserstoff ist und daß die Gesamtzahl Kohlenstoffatome in der -NR₄ Rc-Gruppe im Bereich von 1 bis einschließlich 9 liegt; und

_ ι 5 —

a ist:

Wasserstoff, ein Alkalimetall-Kation oder Ammonium;

die mit einem pharmazeutisch anerkannten lokalen Vehikel vermischt ist.

Die Bezeichnung "wuchernde Hautkrankheiten" bezieht sich im vorliegenden Fall auf gutartige Zustände der Haut, die durch epidermische Zellenwucherung oder unvollständige Zellendifferenzierung gekennzeichnet sind. Diese Zustände können entweder spontan auftreten oder durch außerhalb des Körpers liegende Ursachen, z. B. durch Einwirkung von Strahlung oder Chemikalien, hervorgerufen werden. Diese Krankheiten umfassen Psoriasis, allergische Dermatitis, unspezifische Dermatitis, durch Reizkontakt hervorgerufene primäre Dermatitis, allergische Kontaktdermatitis, Ichthyosis, epidermolytische Hyperkeratose, durch Sonneneinwirkung hervorgerufene vorkanzeröse Keratose, gutartige Keratose sowie seborrhoische Dermatitis. Sie umfassen ferner Krankheiten wie Räude, die für Tiere spezifisch sind. Das Verfahren kann zur Behandlung von Menschen und anderen Säugetieren, z. B. Haustieren, kleinen Haustieren (Hunde, Katzen) und beim Sport eingesetzten Tieren, angewandt werden.

Wuchernde Hautkrankheiten werden gemäß der Erfindung behandelt, indem eines oder mehrere der zyklischen Nukleotide gemäß Formel (1) in einer therapeutisch wirksamen Dosis auf die befallene Stelle lokal aufgebracht wird. Normalerweise wird das Nukleotid auf die befallene Hautstelle in konventioneller Formulierung etwa als Salbe, Creme, Gel, Paste, Lotion, Schampoo oder Spray aufgebracht. Eine solche Formu-

lierung enthält das Nukleotid, das mit einem oder mehreren pharmazeutisch zulässigen Vehikeln wie Rohvaseline, PoIyglykol, Gelatine, Isopropylmyristat, Polyvinylalkohol u. dgl. angesetzt ist. Die Formulierung kann ferner Additive wie Erweichungsmittel, Stabilisatoren, Tenside, das Eindringen in die Haut ändernde Mittel sowie Pigmente enthalten. Wenn eine kontrollierte kontinuierliche Abgabe des Nukleotids auf die befallene Stelle erwünscht ist, wenn etwa das Nukleotid eine kurze Halbwertszeit in vivo hat, kann das Nukleotid in bekannte Formulierungen mit kontrollierter Abgabe eingebracht werden, die die Abgaberate des Medikaments an die Haut durch Diffusion, Osmose, Auflösung, j Iontophorese oder Erosion steuern. Die Nukleotide gemäß Formel (1) sind bei pH-Werten im Bereich von ca. 3-9 im allgemeinen stabil, so daß die sie enthaltende Formulierung einen pH-Wert innerhalb dieses Bereichs haben sollte. Bevorzugt ist der pH-Wert der Formulierung ungefähr neutral, so daß die Haut im wesentlichen nicht gereizt wird. Bei Aufbringung in Form eines konventionellen Medikaments, in dem das Nukleotid im Vehikel gelöst ist, hängt die Höchstkonzentration des Nukleotids selbstverständlich von seiner Löslichkeit im Vehikel ab. In dieser Beziehung ist zu sagen, daß die Nukleotide im wesentlichen wasserlöslich sind und daß der Einsatz von Vehikeln auf Wasserbasis in der Formulierung den Einsatz eines weiten Bereichs von Nukleotidkonzentrationen erlaubt. Charakteristisch liegt die Konzentration des Nukleotids bei konventionellen Medikamenten zur örtlichen Anwendung im Bereich von 0,0001-1 Gew.-%, üblicherweise 0,001-0,1 Gew.-%, bezogen auf die Dosis.

Die bei der Anwendung der Nukleotide gemäß Formel (1) auf den Patienten anzuwendende Dosierungsvorschrift hängt von dem jeweiligen Nukleotid ab. Modellversuche an Tieren haben gezeigt, daß die antipsoriatische Wirksamkeit mindestens einiger der Nukleotide über einen begrenzten Dosierungsbereich auftritt. Dies geht vermutlich auf die dosisabhängige bevorzugte Aktivierung entweder der Proteinkinase vom Typ I oder vom Typ II zurück. Die bevorzugte Aktivierung von Proteinkinase vom Typ II geht mit verminderter epidemischer Wucherung einher, wogegen die bevorzugte Aktivierung von Proteinkinase vom Typ I den Zustand sogar verschlimmern kann. Funktionsmäßig ist eine therapeutische Dosis alsoj eine Dosis, die bevorzugt und signifikant Proteinkinase vom Typ II in dem behandelten Patienten aktiviert. Der therapeutische Dosisbereich eines bestimmten Nukleotids kann empirisch bestimmt werden unter Anwendung des in den Beispielen beschriebenen Tiermodells. Therapeutische Dosisbereiche für andere Tiergattungen sind denjenigen des Modells angenähert, da der Verabreichungsmodus lokal und nicht allgemein und somit im wesentlichen unabhängig vom einzelnen Körpergewicht oder Serumvolumen ist. Tiermodellversuche zeigen, daß der therapeutische Dosisbereich für die Nukleotide normalerweise zwischen ca. 0,01 und 10 jug/cm² behandelte Fläche, bevorzugt ca. 0,1-1 jag/cm^, behandelte Fläche liegt. Konventionelle Formulierungen, die das Nukleotid nicht mit kontrollierter Rate über einen längeren Zeitraum an die Haut abgeben, werden normalerweise zweimal täglich in den angegebenen Mengen auf die befallene Stelle aufgetragen. Formulierungen mit kontrollierter Abgabe sind so hergestellt, daß das Nukleotid in solcher Menge abgegeben wird, daß die Nukleotidkonzentration in der Epidermis auf einem therapeu-

• 1> * f »

tischen Wert gehalten wird. Auf der Grundlage der Nukleotidkonzentration, die bevorzugt Proteinkinase vom Typ II aktiviert, wird diese Konzentration als im Bereich von ca. 0,0025-0,25 /jg/cm³ Haut liegend geschätzt.

Wie vorstehend angegeben, kann der Substituent an der 6. Position der Puringruppe des Nukleotids, der in der Formel (1) mit Rg bezeichnet ist, eine bestimmte alkylsubstituierte Aminogruppe, ein n-heterozyklischer Rest, eine Alkylthio- oder eine Alkoxygruppe sein. Die Aminogruppe kann mono- oder dialkylsubstituiert sein, wenn die Gesamtanzahl Kohlenstoffatome in der Aminogruppe 4 oder 5 ist. Bevorzugt ist das bzw. sind die Alkyle geradkettig (mit Ausnahme von Zyklopentyl). Beispiele für solche Gruppen sind n-Butyl-, n-Pentyl-, Isobutyl-, Isopentyl-, Zyklopentyl-, Methylpropyl-, Methylisopropyl-, Diäthyl-, Äthylpropyl- und Äthylisopropylaminogruppen. Die durch Rg repräsentierten n-heterozyklischen Gruppen sind gesättigt. Beispiele für solche Gruppen sind n-Piperidyl und n-Pyrrolidyl. Die Alkylgruppen der Alkylthio- oder Alkoxygruppen, die durch R, repräsentiert sind, können verzweigt- oder geradkettig sein. Bevorzugt ist die Alkylgruppe dieser Radikalen geradkettig. Beispiele für solche Gruppen sind n-Butylthio-, Isobutylthio-, n-Pentylthio-, Isopentylthio-, n-Butoxy-, Isobutoxy-, n-Pentoxy- und Isopentoxy-Gruppen. R_g ist bevorzugt ein n-Butylaminorest.

Der in der Formel (1) mit R_Q bezeichnete Substituent in der 8. Position der Puringruppe des Nukleotids bezeichnet bestimmte Alkylthio-, Phenylalkylthio-, Alkoxy-, Phenylalkoxy-, Mono- oder Dialkylamino- oder Phenalkylaminogrup-

pen. Die Alkylgruppen in diesen Radikalen sind bevorzugt geradkettig. Beispiele dafür sind Methylthio-, Äthylthio-, n-Hexylthio-, 3-Methylhexylthio-, n-Decylthio--, Methoxy-, Propoxy-, n-Heptoxy-, n-Nonoxy-, Benzylthio-, p-Chlorobenzylthio-, m-Fluorobenzylthio-, p-Nitrobenzylthio-, o-Chlorobenzylthio-, p-Methoxybenzylthio-_f p-Methylbenzylthio-, Phenäthylthio-, Phenpropylthio-, Benzoxy-, Phenpropoxy-, Methylamino-, Dimethylamino-, Äthylamino-, Diäthylamino-, n-Propylamino-, Di-n-propylamino-, Hexylamino-, Oxtylamino-, Benzylamino-, Phenäthylamino- und Phenpropylaminogruppen. Bevorzugt ist R_g ein Benzylthiorest.

Gemäß der Formel (1) können die Nukleotide in Form einer freien Base oder eines Alkalimetalls oder als Ammoniumsalz vorliegen. Im vorliegenden Zusammenhang umfaßt die Bezeichnung "Ammoniumsalze" primäre, sekundäre und tertiäre Ammoniumsalze. Ein bevorzugtes Salz ist Natriumsalz.

Die zyklischen Nukleotide der Formel (1) können mit Hilfe der Reaktionsschemata nach der US-PS 4 058 659 erhalten werden. Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und beschreiben Verfahren zur synthetischen Herstellung dieser Nukleotide. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind in den Beispielen die Prozentsätze in Gew.-% angegeben.

Beispiel 1

Herstellung von 8-(Benzylthio)-6-(n-butylamino)-9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-3',5'-Cyclophosphat

Methode A:

Eine Lösung von 2'-O — Azetyl-8(benzylthio)6-chloro-9(ß"-D-ribofuranosyl)purin-3',5'-Cyclophosphat-Natriumsalz (3,5 g, 5,25 mMol) in 50 ml H₂O und 10 ml n-Butylamin wurde Übernacht bei Raumtemperatur bewegt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Äther zerrieben, in H₂O gelöst und mit 1 N HCl auf einen pH-Wert 1 angesäuert. Der Rohfeststoff wurde filtriert und in Äthylen-OH gelöst. Fünf Volumina Äther wurden dem Äthylen-OH zugeführt, und der ausgefällte Feststoff wurde aufgefangen: Rekristallisation aus EtOH-H₂O (1:1); Ausbeute 1,68 g (61 %) von 26; UV Xmax, pH-Wert 1,288 nm ( ε 22 300), pH-Wert 11,291 nm (d 8 100). Errechnete Analyse für

^C21^H26^N5^OPS*^H2^{O: C 47}'⁹⁹' ^{H 5}f32; N 13,32; S 6,10. Ermittelt: C 47,77; H 5,48; N 13,24; S 6,30.

Methode B:

In einem Dreihalskolben, der mit einem Thermometer, einem Trockenrohr und einem Rückflußkühler ausgerüstet war, wurde eine Suspension von Adenosin-3',5'-Cyclophosphat (230 g, 0,70 Mol) und 1,5-Diazabicyclo[5.4.0]undez-5-en (115 g,

0,75 Mol) in 600 ml Dimethylformamid (DMF) bei 60 ⁰C (Innentemperatur) gerührt, bis eine Lösung erhalten wurde.

Es wurde tropfenweise 2,6-Lutidin (37,4 g, 240 ml) zugefügt, gefolgt von langsamer Zugabe von Crotylbromid (135 g, 1 Mol). Das Reaktionsgemisch wurde während weiterer 5 h bei

60 ⁰C gerührt. Das Produkt, das langsam aus der Lösung auskristallisiert war, wurde filtriert, mit einer geringen Menge DMP und MeOH gewaschen und getrocknet; es wurde eine Ausbeute von 146 g N¹-Crotyl-zAMP erhalten.

N¹-Crotyl-ζAMP (140 g, 0,365 Mol) wurde in 800 ml von 1 N NaOH gelöst und während 2 h auf 75 ⁰C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, und es wurden 24 ml Eisessig zugefügt. Nach der Zugabe von 4,0 g 5 %em Pt auf Kohlenstoff wurde das Reaktionsgemisch unter H₂ (2,8 kp/cm während 5 h) geschüttelt, bis 39,4 kg H₂ (theoretisch 41,2 kg) aufgenommen waren. Der Katalysator wurde filtriert und mit 200 ml heißem H₂O gewaschen. Der Kombination aus Filtrat und Waschwasser (1 1) wurde Br₂ (61 g, 0,38 Mol) in zwei Teilmengen in 30-min-Intervallen zugegeben. Es wurden 40 g NaOAc zugefügt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 4 h wurden weitere 10 ml Br₂ zugefügt, und das Rühren wurde über einen Zeitraum von 3 Tagen fortgesetzt.

Die Lösung wurde mit N₂ für 2 h entlüftet, wonach NaBH. zugefügt wurde, bis die Lösung einen negativen KI-Stärketest ergab. Der pH-Wert wurde mit 30 % NaOH auf 12 eingestellt, und es wurden 40 ml Benzylmerkaptan zugefügt. Die resultierende Lösung wurde während 1 h auf 70 ⁰C erwärmt und dann mit konzentriertem HCl auf einen pH-Wert 1,8 angesäuert. Die saure Lösung wurde gerührt und langsam abgekühlt. Das Rohprodukt wurde filtriert und mit H₂O und anschließend Äthylen-OH gewaschen. Das Rohmaterial wurde durch Zugabe von Triäthylamin in CHCl₃ gelöst. Die CHC1₃-Lösung wurde einer Säule aus 200 g trockenem Kieselsäuregel zugefügt. Die

Säule wurde mit CHCl^ gewaschen, und das Produkt wurde mit 4 % Äthylen-OH in CHCl₃ eluiert. Die entsprechenden Säulenfraktionen wurden gesammelt und verdampft. Das Tr iäthylammoniumsalz wurde in 100 ml warmem 2 N NH.OH gelöst, es wurden 500 ml MeOH zugegeben, und die Lösung wurde mit konzentriertem HCl auf einen pH-Wert 2 angesäuert. Nachdem die Lösung abgekühlt war, wurde der resultierende Feststoff filtriert, mit H_o und Äthylen-OH gewaschen und getrocknet; die Ausbeute betrug 101 g 8-(Benzylthio)-6(n-butylamino)9-(ß-D-ribofuranosyl)purin-3',5'-Cyclophosphat, das mit demjenigen nach der Methode A identisch war.

Beispiel

Herstellung von 8-(Benzylthio)-6-piperidin-9-(ß-D-Ribofuranosyl)purin-3',5'-Cyclophosphat

Eine Lösung von 2'-o-Azety1-8-(benzylthio)-6-chloro-9-(ß-D-ribofuranosyl)purin-3',5'-Cyclophosphat-Natriumsalz (1,3 g) in 20 ml Wasser und 10 ml Piperidin wurde übernacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Äther zerrieben. Der Endrückstand wurde in Wasser gelöst und auf eine Dowex-50-Säule (H⁺, 0,15-0,074 mm Maschenweite) von 2,5 χ 10 cm gegeben, die mit Methanol-Wasser (1:1) vorgewaschen worden war. Die Säule wurde mit Wasser, gefolgt von 100 ml Methanol-Wasser (1:4), 100 ml Methanol-Wasser (1:1) und schließlich Methanol-Wasser (3:1) gewaschen, bis das gesamte Produkt eluiert war. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, kombiniert und bis zur Trockenheit ver-

dampft. Der Rückstand wurde in siedendem Äthanol gelöst, es wurden 5 Volumina Wasser zugefügt, und die Lösung wurde auf 1/5 des Volumens konzentriert. Nach der Abkühlung wurden aus der wäßrigen Lösung 700 mg (59 %) weiße Kristalle von 8-(Benzylthio)-6-piperidin-9-(ß-D-ribofuranosy1)purin-3',5'-Cyclophosphat abgeschieden. Die errechnete Analyse für C₂₂H₂₆N₅O₆PS war: C 51,01; H 5,11; N 13,52; S

Beispiel 3

Herstellung von 8-(Benzylthio)6-pyrrolidin-9-(ß-D-ribofuranosyl)purin-3',5'-Cyclophosphat

Eine Losung von 2'-o-Azetyl-8(benzylthio)6-chloro-9(ß-D-ribofuranosyl)purin-3',5'Cyclophosphat (2 g) in 20 ml H₂O, das 5 ml Pyrrolidin enthielt, wurde wie für die Synthese der Verbindung nach Beispiel 2 behandelt. Wasser wurde dem Rückstand aus der Säule zugefügt, und die resultierenden Kristalle wurden filtriert und getrocknet; es ergaben sich 947 mg (51 %) 8-(Benzylthio)6-(pyrrolidin)-9-(ß-D-ribofuranosyl)purin-3¹,5'-Cyclophosphat. Die rechnerische Analyse für C₂₁H₂₄N₅O₆PS.1,5H₂O war: C 47,36; H 5,11; N 13,15. Tatsächliche Analyse: C 47,05; H 5,26; N 12,94.

Beispiele 4-7

Unter Anwendung der Methoden entsprechend den in den Beispielen 1-3 erläuterten wurden ferner die folgenden Nukleotide der Gleichung (1) hergestellt, isoliert und gereinigt.

4. 6-(n-Butylamino)-8(methylthio)-9(ß-D-ribofuranosyl)-purin-3',5'Cyclophosphat: UV λ.max pH 1,289 nm (e 19_w 600); ph 11, 290 nm {£ 17 800), rechnerische Elementaranalyse für ^C ₁₅H22^N5^O6^{PS: c 41}·⁷³/' ^{H 5}r1⁵? ^N 16,24; tatsächliche Analyse: C 41.37; H 5,23; N 15,81.

5. 6-(Diäthylamino)-8(diäthylamino)-9(ß-D-ribofuranosyl)-purin-3' ,5'-Cyclophosphat: UV Xmax pH 1, 289 nm (£ 18 900); ph 11, 286 nm (£20 000), rechnerische Elementaranalyse für C₁₈H₃₉NgO₆P: C 47,34; H 6,42; N 18,42; tatsächliche Analyse: C 47,09; H 6,30; N 18,33.

6. 8-(Benzylthio)-6(n-pentylamino)-9(ß-D-ribofuranosyl)-purin-3¹ ,5'-Cyclophosphat; UV Xmax pH 1, 288 nm (6 21 900); pH 11, 291 nm (e 17 900), rechnerische Elementaranalyse für C₂₂H₃SN₅OPS: C 50,53; H 5,42; N 13,44; tatsächliche Analyse: C 50,89; H 5,17; N 13,55.

7. 6-(n-Butylmethylamino)-8(benzylthio)-9(ß-D-ribofuranosyl)purin-3',5',Cyclophosphat: UV ^max pH 1, 288 nm («5 21 500); pH 11, 290 nm (£18 700); rechnerische Elementaranalyse für C₂₂H₂QNcOPS: C 50,53; H 5,42; N 13,44; tatsächliche Analyse: C 51,02; H 5,61; N 13,63.

Die Nukleotide nach den Beispielen 1 und 3-7 wurden zusammen mit verschiedenen homologen Verbindungen und ähnlichen bekannten Nukleotiden, von denen berichtet worden war, daß sie antipsoriatisch wirken, auf antipsoriatische Wirksamkeit untersucht, wobei das Tiermodell und das Verfahren angewandt wurden, die in British Journal of Dermatology 94, I, S. 1-6 (1976) beschrieben sind. Kurz gesagt, wird bei diesem Versuch die haarlose Maus eingesetzt, und das Kriterium für die Wirksamkeit ist die Inhibition der epidermalen DNS-Synthese (was ein Anzeichen für Wucherungs-Inhibition ist), nachgewiesen durch eine Abnahme des Einbaus von tritiummarkiertem Thymidin in die DNS der epidermalen Zellen. Bei diesen Versuchen wird eine 7 cm große Fläche am Rücken der Maus einer bestimmten UV-Strahlendosis ausgesetzt. Es wurde nachgewiesen, daß diese Bestrahlung eine erhebliche übermäßige Wucherung in der Epidermis (nachgewiesen durch gesteigerte DNS-Synthese) 48 h nach der Bestrahlung hervorruft. Das Versuchs-Nukleotid wird auf die exponierte Haut in der erwünschten Dosierung 1, 18, 24 und 47 h nach der UV-Bestrahlung aufgebracht. Die Mäuse werden nach 47 h mit tritiummarkiertem Thymidin gespritzt und nach 48 h getötet. Die behandelte Epidermis wird von dem Kadaver entfernt und aufgelöst. DNS wird aus dem Produkt der epidermalen Zellauflösung mit Hydroxylapatit extrahiert. Der Einbau von tritiummarkiertem Thymidin in die DNS wird mit einem Strahlungs-Szintillationszähler gemessen. Kontrolltiere, die nur mit Nukleotid behandelt werden, Kontrolltiere, die nur mit Vehikel (Wasser-Polyvinylalkohol) behandelt werden, und Kontrolltiere, die mit UV-Strahlung bestrahlt, jedoch mit Vehikel ohne das Nukleotid behandelt werden, werden zu

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Vergleichszwecken gleichzeitig mit den UV-bestrahlten und nukleotid-behandelten Tieren untersucht. Die Nukleotide wurden als eine Wasser-Polyvinylalkohol-Formulierung (0,000001 Gew.-% Nukleotid) aufgebracht.

Das Nukleotid nach Beispiel 1 wurde entsprechend dem vorgenannten Verfahren mit unterschiedlichen Gesamtdosen untersucht. Die beigefügte Zeichnung zeigt die Eregbnisse dieser Untersuchung grafisch. Der schraffierte Teil am unteren Ende der Grafik gibt die Resultate für die mit Vehikel behandelten Kontrolltiere wieder; der schraffierte Teil am oberen Ende der Grafik gibt die Resultate für die UV-bestrahlten und mit Vehikel behandelten Kontrolltiere wieder; die Kreise bezeichnen die Ergebnisse für die UV-behandelten und mit Nukleotid behandelten Tiere; und die Dreiecke bezeichnen die Resultate für die nur mit Nukleotid behandelten Kontrolltiere. Das Nukleotid war über einen Gesamtdosisbereich von ca. 0,1-15 Mg (flächenmäßig normiert ca. 0,01-1,5 jug/cm ) wirksam, wobei die maximale Wirksamkeit bei einer Dosis von ca. 2-3 /ag (flachenmäßig normiert ca. 0,15-0,25 jug/cm ) erzielt wurde. Der zyklische Charakter der Kurve in der Zeichnung wird der Stimulation von Proteinkinase vom Typ I durch das Nukleotid bei einer oberhalb von ca. 2-3 jag liegenden Gesamtdosis zugeschrieben. Die in der Grafik berichteten Ergebnisse repräsentieren Daten von mindestens 15 Tieren mit jeder Versuchsdosis.

Im Hinblick auf die praktische Wirksamkeit ist es höchst erwünscht, ja sogar unbedingt erforderlich, daß ein gegen Wucherungen wirkendes Mittel als Therapie für einen sehr hohen Prozentsatz, möglichst sämtliche, der behandelten

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Tiere wirksam ist. Daher wurde die antipsoriatische Wirksamkeit der Verbindungen unter Bezugnahme auf ihre Fähigkeit, 100 % der behandelten Tiere zu heilen (mindestens 5 Tiere je Dosis), mit jeder Dosis wie folgt bestimmt.

Die Rate der DNS-Synthese für jede Gruppe von Tieren ((keine UV-Strahlung (Vehikel), UV-Strahlung (Vehikel), UV-Strahlung (Präparat)) wurde zuerst als mittlerer +Standardfehler ausgedrückt. Das Ausmaß der Inhibition der DNS-Synthese wurde errechnet durch Subraktion der mittleren Rate für die nicht-UV-behandelten, vehikel-behandelten Kontrolltiere von (1) den UV- und vehikel-behandelten Kontrolltieren und (2) den UV- und medikament-behandelten Tieren. Die Differenz zwischen dem Nettowert für (1) und dem Nettowert für (2) wurde in % des Nettowerts von (1) ausgedrückt. Der jedem %-Inhibitionswert anhaftende Fehler wurde als größerer der Standardfehler, die entweder (1) oder (2) anhaften (Bruttowerte) angenommen und in % umgewandelt.

Die nachstehende Tabelle berichtet über die Ergebnisse dieser Bestimmungen und die Standardfehler für die Verbindungen der Beispiele 1 und 3-7 sowie Analoga, die nicht in den Bereich der Gleichung (1) fallen. (Fälle, bei denen der Standardfehler die Bestimmung überschritt (d. h. < 100 % Therapie) werden mit Null angegeben.) Die mit R- und R₈ überschriebenen Spalten bezeichnen die Substituenten an der Position 6 und der Position 8 des Nukleotids. Sämtliche aufgeführten Verbindungen wurden als freie Basen untersucht.

Inhibition der epidermalen DNS-Synthese {%) Gesamtdosis (ng)

0,002 0,02 0,2 2 20

aufgebrachte Konzentration (mg/ml)

Nukleotide der Gleichung (1)

-SCH₂C₆H₅

-NHnC₄H₉
-NHnC₅H₁₁ -SCH₂C₆H₅

J₄] -SCH₂C₆H₅ -N(CH₃)JiC₄H₉ -SCH₂C₆H₅ -NHnC₄H₉

-SCH-

-N(C₂H₅J₂ -N(C₂H₅J₂

0 0 0 0 0 0

89±27 70±32 0 0 0 0 0

0 0 0

32±10 0

70±34 95118 35±20

60*25

Analoga

-NH₂	-SCH₂C₆H₅	O	O	O	O	O	O
-NHJiC₄H₉	-H	O	O	O	O	O	O
-NHCH₂CH₃	-SCH₂CgH₅	O	O	O	O	O	O
-NHJlC₃H₇	-SCH₂C₆H₅	O	O	O	O	O	O
-N(JlC₃H₇J₂	-SCH₂C₆H₅	O	O	O	O	O	O
-NHJiC₆H₁₃	-SCH₂CgH₅ .	O	O	O	O	O	O

Die Daten in der vorstehenden Tabelle weisen auf verschiedene Faktoren in bezug auf die lokale antipsoriatische Wirksamkeit von 6,8-substituierten Ribofuranosylpurin-3',S'-Cyclophosphaten hin. Erstens ergibt sich aus dem zweiten aufgeführten Analogon (R_ß = n-Butylamino_r R_g = H), daß der Substituent an der Position 8 der Puringruppe unabdingbar ist. Dies wurde durch Versuche mit verschiedenen anderen 8-substituierten Analoga nachgewiesen, die sämtlich eine antipsoriatische Wirksamkeit Null zeigten. Zweitens ergibt sich aus dem ersten aufgeführten Analogon (R, = NH«, Rg = Benzylthio), daß der an die Position 6 der Puringruppe gebundene Stickstoff substituiert werden muß. Die übrigen untersuchten Analoga zeigen, daß in der Substituentenposition 6 die Anzahl Kohlenstoffatome 4 oder sein muß. Ferner fällt das erste aufgeführte Analogon in die in den US-PS'en 4 007 268 und 4 207 315 angegebene Gattung, und die Daten zeigen, daß die Verbindungen der Formel (1) im Vergleich mit diesem Analogon eine bessere lokale antipsoriatische Wirksamkeit haben.

-So-

Leerseite

Claims

3228050

Patentanwalt· DlpL-Ing. Hane-Jflrgen Mfiller DipL-Chem. Dr.Geriiard Schupfner DipL-Ing. Han·-Peter Gauger

Ludte-SrahR-Str.SI - D8000 MOnchin N

SRI International (P 1595!

HJM/sw

Patentansprüche

1. V/erwendung einer Verbindung der folgenden Formel:

- 2 —

NACHGETREIOHT

in der
R, ist:

(i) -NR. R₂, wobei R₁ und Rp unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-5 Kohlenstoffatomen oder Cyclopentyl sind oder zusammen mit dem Stickstoffatom verbunden sind unter Bildung einer heterocyclischen Gruppe mit 4 bis einschließlich 5 ringförmigen Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß die Gesamtanzahl Kohlenstoffatome in der -NR₁ Rp-Gruppe 4 oder 5 ist, oder

(ii) -XR, wobei X ein Chalkogenatom mit der Ordnungszahl 8 oder 16 und R ein Alkyl mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen ist;

R₀ ist:
ο

(i) -X-(CH₂J_nR₃, wobei X wie vorher definiert ist, η eine ganze Zahl von 1-3 einschließlich ist, R₃ Wasserstoff, Alkyl mit 1-7 Kohlenstoffatomen oder O-bis einschließlich 1-substituiertes Phenyl, Stickstoff, Halogen mit der Ordnungszahl von 9 bis 35 einschließlich, methoxylhaltig, hydroxylhaltig oder Methyl ist, oder

(ii) -NR, R₅, wobei R^ und R₅ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-8 Kohlenstoffatomen oder Phenalkyl mit 7-9 Kohlenstoffatomen sind mit der Maßgabe, daß nur entweder R, oder R₅ Wasserstoff ist und daß die Gesamtzahl Kohlenstoffatome in der -NR, Rc-Gruppe im Bereich von 1 bis einschließlich 9 liegt; und

2 ist:

Wasserstoff," ein· Alkalimetall-Kation oder Ammonium, zur Behandlung bzw. Bekämpfung von wuchernden Hautkrankheiten,

2. Verwendung einer Verbindung von Anspruch 1 zur Behandlung bzw. Bekämpfung von Psoriasis (Schuppenflechte).

3. Verwendung einer Verbindung von Anspruch 1 zur bevorzugten und signifikanten Aktivierung von Proteinkinase Typ II.

4. Verwendung einer Verbindung von Anspruch T, bei der

R_ß n-Butylamino, n-Pentylamino, n-Butylmethylamino oder Pyrrolidyl, RgBenzylthio und Z Wasserstoff ist, zu dem in einem oder mehreren der Ansprüche 1-3 genannten Zweck,

5. Verwendung einer Verbindung von Anspruch 1, bei der R₆ n-Butylamino, R_g Methylthio und Z Wasserstoff ist, zu dem in einem oder mehreren der Ansprüche 1-3 genannten Zweck.

6. Verwendung einer Verbindung von Anspruch 1, bei der R₆ Diäthylamino, Rg Diäthylamino und Z Wasserstoff ist, zu dem in einem oder mehreren der Ansprüche 1-3 genannten Zweck.

7. Verwendung einer Verbindung von Anspruch 1, bei der Rg n-Butylamino, R_g Benzylthio und Z Wasserstoff ist, zu dem in einem oder mehreren der Ansprüche 1-3 genannten Zweck.

-A-

8. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 4-7 in einer Menge im Bereich von ca. 0,01 bis ca.

2
10 ug/cm behandelte Haut zu dem in der Ansprüche 1 -3 genannten Zweck.

10 ug/cm behandelte Haut zu dem in einem oder mehreren

9. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 7 in einer

ρ Menge im Bereich von 0,1-1 ug/cm behandelte Haut zu dem in einem oder mehreren der Ansprüche 1-3 genannten Zweck.

10. Lokal anwendbare Formulierung zum Behandeln eines Patienten mit einer wuchernden Hautkrankheit, gekennzeichnet durch eine therapeutisch wirksame Menge mindestens einer Verbindung der folgenden Formel:

O=P O OH

i B O

in der

Rg ist:

(i) -NR₁ R₀, wobei R₁ und R, unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-5 Kohlenstoffatomen oder Cyclopentyl sind oder zusammen mit dem Stickstoffatom verbunden sind unter Bildung einer heterocyclischen Gruppe mit 4 bis einschließlich 5 ringförmigen Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, daß die Gesamtan-

zahl Kohlenstoffatome in der -NR 5 ist, oder

4 oder

(ii) -XR, wobei X ein Chalkogenatom mit der Ordnungszahl 8 oder 16 und R ein Alkyl mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen ist;

Rg ist:

(i) -X-(CI^)_n Rj, wobei X wie vorher definiert ist, η eine ganze Zahl von 1-3 einschließlich ist, R-Wasserstoff, Alkyl mit 1-7 Kohlenstoffatomen oder 0-bis einschließlich 1-substituiertes Phenyl, Stickstoff, Halogen mit der Ordnungszahl von 9 bis 35 einschließlich, methoxylhaltig, hydroxylhaltig oder Methyl ist, oder

(ii) -NR₄ R₅, wobei R₄ und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1-8 Kohlenstoffatomen oder Phenalkyl mit 7-9 Kohlenstoffatomen sind mit der Maßgabe, daß nur entweder R₄ oder R₅ Wasserstoff ist und daß die Gesamtzahl Kohlenstoffatome in der -NR₄ Rc-Gruppe im Bereich von 1 bis einschließlich 9 liegt; und

B ist:

Wasserstoff, ein Alkalimetall-Kation oder Ammonium;

die mit einem pharmazeutisch anerkannten lokalen Vehikel vermischt ist.

Formulierung nach Anspruch 1©#
dadurch gekennzeichnet,

daß Rg n-Butylamino, η-PentyIamino, n-Butylmethylamino oder Pyrrolidyl, R_Q ßenzylthio und Z Wasserstoff ist.

12. Formulierung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Rg η-Butylamino, Rg Methylthio und Z Wasserstoff

13· Formulierung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Rg Diäthylamino, Rg Diäthylamino und Z Wasserstoff

, Formulierung nach Anspruch 1O, dadurch gekennzeichnet,

daß Rg n-Buty1amino, Rg Benzylthio und Z Wasserstoff ist.