DE3224788A1

DE3224788A1 - Traegergebundenes immunogenes material

Info

Publication number: DE3224788A1
Application number: DE3224788A
Authority: DE
Inventors: Kirsten Jacobus van der Prof.Dr. Stellenbosch Merwe; Alfred Dr.-Chem. Camps Bay Polson
Original assignee: South African Inventions Development Corp
Current assignee: South African Inventions Development Corp
Priority date: 1981-07-17
Filing date: 1982-07-02
Publication date: 1983-02-03
Also published as: GB2101630A; US4894229A; JPS5824524A; GB2101630B

Description

Trägergebundenes immunogenes Material

Die vorliegende Erfindung betrifft ein trägergebundenes immunogenes Material mit einer oder mehreren immunogenen Determinanten zur Erregung einer gewünschten spezifischen immunogenen Reaktion in lebenden antikörpererzeugenden Zellen, wobei die immunogenen Determinanten, die die immunogene Information zur Erregung der spezifischen Reaktion enthalten, an der Aussenoberflache eines teilchenförmigen Trägers vorliegen.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Materials und auf Anwendungsmethoden fü"r das Material.

In der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff "immunogene Determinante " als Bezeichnung einer Substanz, eines Moleküls oder Teils eines Moleküls verwendet, deren /dessen Vorhandensein in einem Immunogen für eine spezifische Reaktion verantwortlich ist, wenn das Immunogen auf ein Immunsystem einwirkt, z.B. auf lebende antikörpererzeugende Zellen. Unter "Immunreaktion" sei die Bildung von Antikörpern verstanden als Reaktion auf einen immunogenen Stimulus seitens des Immunogens. Unter den Antikörpern befinden sich Antikörper, die mehr oder weniger spezifisch für die immunogenen Determinanten (oder deren Kombination) des Immunogens sind.

Der Begriff "Immunogen¹''gilt für eine Substanz, die, wie oben gesagt, die Bildung von Antikörpern anregt. Der Begriff "Antigen" bezeichnet eine Substanz, die mit einem entsprechenden Antikörper kuppelt und dadurch gebunden und vom Antikörper "neutralisiert" wird. In der Praxis sind "Antigene" und "Immunogene" in einem gegebenen Zusammenhang oft die gleiche Substanz und deshalb werden die beiden Begriffe häufig synonym verwendet.

Ein "Hapteii" .ist einemeist kleine immunogene Determinante, die." erst zum Immunogen wird, wennye an einen ausreichend grossen Träger für ein gegebenes Immunosystem gebunden wird. Verschiedene Immunosysteme (z.B. verschiedenerTierarten) unterscheiden sich hinsichtlich der Mindestgrösse (bzw. Molekulargewichte) der Immunogene, auf die sie befriedigend ansprechen können. Daraus ergibt sich, dass in manchen Fällen ein Antigen zwar mit einem gegebenen Antikörper kuppeln kann, aber trotzdem zu klein ist, um selbst die Bildung eines solchen Antikörpers in einem gegebenen Immunsystem anzuregen. In dem Falle, obwohl das "Antigen" "immunogene Determinanten" (bzw. "antigene Determinanten") besitzt, die für den gegebenen Antikörper spezifisch sind, ist solch ein Antigen für das gegebene Immunsystem kein "Immunogen" sondern ein Hapten.

Wohl" die ältesten, in der Vergangenheit bekannten,

trägergebundenen immunogene Determinanten tragenden Stoffe sind ·νο11 ständige Bakterienze.llen. Im Falle solcher Zellen befindet sich die immunogene Information, die zur Erregung der für solche Bakterien spezifischen Immunreaktion im Immunsystem eines lebenden Organismus oder lebender Zellen führt,(z.B. von Tieren,die der Infektion durch solche Zellen ausgesetzt sind, oder die mit den toten aber ansonsten unbeschädigten Bakterien*eilen geimpft werden) ganz oder überwiegend in der äussersten Schicht oder Zo/ne solcher Bakterienpartikel. In vielen Bakterien, z.B. Gramm-negativen Bakterien wie Salmonella^ ist diese natürliche immunogene Zone, die die "immunogenen Determinanten" dieser Bakterien darstellt, ganz oder überwiegend auf eine äussere Schicht oder Zone beschränkt, die die O-Antigene, d.h. die 0-spezifischen langkettigen polysacharidartigen immunogenen (antigenen) Determinanten enthält, kovalent an eine lipophile, ant.igenisch weitgehend inerte Oberfläche der Zellwand der Bakterienpartikel gebunden. Es war bereits bekannt, dass diese antigene Determinantenzone abgespalten werden kann. z.B. durch Säurehydrolyse im Falle von O-Antigenen, was dann zu"nackten Bakterien" führt, die weitgehend oder völlig ihVe natürliche charakteristische Immunogenität verloren haben. (C.Galanos, 0. Lüderitz und 0. Westphal, Enr. J. Biochem. 7Λ_ (1971), 116-122).

Man hat auch an die Möglichkeit gedacht, nach dem Abspalten dieses sogenannten Lipid A auf die dadurch gebildeten

-ίο- V-

"nackten Bakterien" durch Adsorption auf die äussere
lipophile Oberfläche eine gewisse Menge ausgewählter
anderer lipophiler Moleküle mit einer gewünschten
spezifischen immunogenen Information aufzutragen.
Man hatte gehofft, dass dieser Kunstgriff zu besonders günstigen Eigenschaften führen würde. Die Versuche, die der vorliegenden Erfindung zu Grunde 1iegen, ,förderten jedoch eine Anzahl unerwarteter grundsätzlicher Nachteile dieser Methodik zutage. Positive immunogene Ergebnisse wurden zwar mit manchen derart adsorptiv aufgetragenen immunogenen Determinanten erzielt, doch nicht mit einigen anderen. Einer der wesentlichsten mit dieser Methodik beobachteten Nachteile, ist die Reversibilität der Adsorption. Ein lipophiles Antigen wird nicht nur an
"nackten Bakterien" adsorbiert, sondern auch an anderen 1ipophi1 en Flächen, z.B. Glasoberflächen der Laborgeräte, der Innenseite von Kunststoffspritzen und auch an viele 1 ipophil en Körperbestandtei 1 en , Hierzu ist zu bedenken, dass Immunogene normalerweise in Versuchstiere in Form einer wässrigen Suspension in Puffer- oder physiologischer Kochsalzlösung eingespritzt werden. Totale Desorption führt zum vollständigen Verlust der Immunogenitat, und das kann sogar im Körper vorkommen.

Die öbpnrjenn nntr Vorf ahrrnswri r.e ist nussprriom nuf

immunogene Determinantenstoffe beschränkt, die einen ausreiche stark lipophilen Charakter haben, damit sie überhaupt

- 11 - ^tP

Die kcvalente Bindung anti gener Determinanten an Proteinmoleküle als Träger, wie beispielsweise Albumin oder Thyroglobulin, wurde ebenfalls vorgeschlagen (Methods in immunology and immunochemistry, Vol. I, Seite 120. CH. Williams und M.W. Chase), ergab aber ebenfalls eine Anzahl Nachteile. Damit das verwendete Protein nicht selbst eine immunogene Reaktion auslöst, muss der Träger möglichst stets vom gleichen Tier stammen, das immunisiert werden soll. Solche Proteinträger sind auch nicht allgemein und für alle Zwecke oder alle immunogenen Determinanten geeignet, und die Ergebnisse sind nicht voraussagbar. Manchmal stellt man fest, dass die Antikörper überwiegend oder ganz gegen das Proteinantigen statt gegen die gewünschten immunogenen Determinanten gebildet werden. Die Struktur der immunogenen Determinanten muss ebenfalls berücksichtig werden. Wenn z.B. gewisse immunogene Determinanten, insbesondere solche mit lipophilem Charakter kovalent an ein Protein angeknüpft werden, ändert sich die Struktur so, dass der lipophile Teil "eingewickelt" wird, und im Innern abgeschirmt vorliegt, was zum Verlust der immunogenen Wirkung dieses besonderen Teils des immunogenen Determinanten 'führt.

Ganz allgemein ist es die Aufgabe der Erfindung, die immunogene Wirksamkeit einer gegebenen immunogenen Determinant in einem gegebenen Immunosystem zu verbessern. Das betrifft die Quantität und/oder die gewünschte Qualität der gebildeten Antikörper, insbesondere die Aviditat' (Antigen-

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affinität). Mehr ins einzelne gehend, hinsichtlich verschiedener erfindungsgemässer Lösungsvorschläge wird einem immunogenen Material der obengenannten Art (gegebenenfalls auf Grund verhältnismässig einfacher Optimierversuche) eine verhäl tnismässig hohe immunogene Aktivität hin- _λ sichtlich seiner immunogenen Determinanten (Haptene) verliehen, die sonst verhältnismässig wenig oder gar keine Aktivität besitzen, eine verbesserte Stabilität und Lagerfähigkeit, die Möglichkeit verbesserter Herstellungskontrolle und Standardisierung der Herstellung, die Anwendbarkeit auf eine auss ergewöhnliche ialette (Vielfalt) inmunogener Determinanten und eine leichte ToIerierbarkeit für die Organismen, in welchen damit eine immunogene Reaktion erregt werden soll. Insbesondere sollen gemäss der Erfindungslehren Wege und Mittel gezeigt werden,anhand derer die Menge der auf einen Träger aufgetragenen immunogenen Determinanten beherrscht werden kann, wie auch die immunogenen Eigenschaften (chemischen Gruppen) die nach einer solchen Anknüpfung verfügbar bleiben, und in einer solchen Weise exponiert bleiben, dass sie sich zur Anregung einer immunogenen Reaktion eignen.

Erfindungsgemäss wird hierzu ein trägergebundenes immunogenes Material der eingangsbenannten Art vorgesehen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass als Trägersubstanz

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Bakterienteilchen dienen, an" deren Aussenseite durch kovalente Bindung eine.immunogene DeterminanteangehSngt ist, d/e · die immunogene Information zur Erregung der spezifischen Reaktion enthält.

In der Mehrzahl der Ausführungen der Erfindung ist dTe^- so kovalent gebundene immunogene Determinantedem Bakterienteilchen an welches sie angehängt ist, fremd. Tatsächlich sind der Vielzahl der Determinanten (grossen oder kleinen Molekulargewichts)^die so an die Bakterienträgerteilchen angehängt werden können, kaum Grenzen gesetzt. Die Erfindung sieht aber auch die Möglichkeit vor, an die Oberflächen von Bakterien ein solches zusätzliches Determinantenmaterial anzuhängen, das an sich bereits für die verwendeten Bakterien selbst charakteristisch ist, um damit die Immunogenität der Teilchen über deren herkömmliches Niveau anzuheben. Diese Methodik lässt sich z.B. zur Herstellung antibakterieller Vaccine erhöhter Wirksamkeit verwenden.

Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff der kovalenten Bindung auc-h die dative koordinative Bindung einschl iessen. In den bevorzugten Ausführungsbeispielen handelt es sich jedoch um einfache kovalente Bindungen wie sie sich aus üblichen Kondensationsreaktionen ergibt.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Bakterienteilchen um

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"nackte" BakterienzelVen, d.h. Bakterien, die ihrer, eigenen natürlichen antigenen Determinanten in der obenbeschriebenen Weise beraubt wurden. Diese nacktenBakterien dienen als Träger, die immunogen im wesentlichen oder völlig neutral sind (wenigstens in einigen Tieren). Trotzdem bewirkt die Kombination dieser Träger mit den immunogenen 'Determinanten eine überlegene immunogene Reaktion auf die Determinanten. Ganz überraschenderweise geht die beobachtete Verbesserung häufig weit über den Rahmen hinaus, den man aus einer blossen Vergrösserung der Tei1chengrösse des Immunogens erwarten würde. Grosse Verbesserung sowohl hinsichtlich der .Ausbeute an Antikörpern, als auch deren Qualität (insbesondere hinsichtlich der Avidität, d.h. der Intensität hinsichtlich Geschwindigkeit, Kapazität und Komplexbildungsstärke, mit welcher die Antigene von den Antikörpern eingefangen werden ) - werden selbst mit Substanzen beobachtet, die selbst bereits ein verhältnismässig hohes Molekulargewicht haben, und die bereits von sich aus gute immunogene Eigenschaften nach herkömmlichen Masstäben besitzen, sobald diese Substanzen kovalent an nackte Bakterien angehängt werden. Die Verbesserung scheint grosser zu sein, als s.ich auf Grund der Teil chengrösse erklären lässt. Anscheinend findet auch eine Art synergistischer Wirkung statt, .auf..Grund irgendwelcher Eigenschaften , die den Bakterienteilchen zu eigen sind. Möglicherweise liegt dies an einer natürlichen Anpassung des Immunsystems und

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dessen Fähigkeit, Immunogene mit bakteriellen Kennzeichen zu erkennen und daraufzu reagieren als Teil des natürlichen Abwehrmechanismus des Körpers gegen Bakterieninfektion. Die bakteriellen Trägerteilchen wirken somit als eingebautes Adjuvant, das dazu beiträgt, die Geschwindigkeit, mit welcher sich die Antikörper bilden, nach der Anregung des Systems durch das neue Immunogen, als auch die Ausbeute und Qualität der Antikörper zu verbessern.

Die kovalenten Bindungen sind wesentlich stärker als Adsorptionsbindungen, und dadurch wird dem Nachteil der Adsorptionsmethode, wo die immunogen Determinanten leicht wieder abgespalten werden, begegnet. Die Ungewissheit laut Stand der Technik mit adsorbierten lipophilen immunogenen Determinanten wird vermieden. Die Desorptionsprobleme, die es gab, wenn lipophile Determinanten adsorbiert in Olsuspension eingespritzt wurden, werden vermieden, wenn die immunogenen Determinanten kovalent an"nackte Bakterien" angehängt sind.

Die Menge an immunogenen Determinanten, die auf eine gegebene Menge "nackter Bakterien" als Träger aufgetragen wird, lässt sich leicht standardisieren, wenn d/e immunogene Determinante kovalent verknüpft statt an die nackten Bakterien adsorbiert wird.

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Weitere Erfindungslehren des bevorzugten kennzeichnenden Materials ergeben sich aus der Beschreibung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung des Materials und der beispielhaften Beschreibung gewisser bevorzugter Ausführungsweisen.

Ebenfalls gemäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Materials im obenbeschriebenen Sinne angegeben , wobei ein ausgewählter immunogener Determinant an einen Träger angehängt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die- immunogene Determinante durch kovalente Bindungsreaktion oder Reaktionen an die Aussenoberflache von Bakterienpartikeln als Träger angehängt wird.

In den meisten Ausführungsbeispielen des Materials und Verfahrens gemäss der Erfindung übernimmt die ausgewählte immunogene Determinantein ihrer Wirkung die immunogene Funktion der natürlich anwesenden antigenen Determinante' der Bakterienpartikel. In einigen Fällen lässt sich dies zum Teil dadurch erreichen, dass diese Determinanten von den ausgewählten neuen » immunogenen Determinanten überlager und abgeschirmt werden, d.h. durch kovalentes Anhaken an die reaktiven Gruppen, die in den natürlichen antigenen Determinanten der Bakterienzellen vorhanden sind. Die Moleküle, die so an die Bakterienzellen angehängt werden,, werden durch diese Reaktion in solcher Weise gekuppelt,

COFY

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JJ ···· ·· a

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zurückzuführen, dass Bakterien im Verdauungskanal und ähnlichen Bereichen des lebenden Organismus ständig degradiert werden und dabei Material liefern, das mit den obenbeschriehenen "nackten Bakterien" vieles gemeinsam hat. Daraus erklärt sich auch, weshalb in manchen geprüften höheren Lebewesenorganismen, z.B. Hennen, diese "nackten Bakterien" an sich gänzlich oder im wesentlichen immunogen inert waren, d.h. selbst nicht in der Lage waren, die Produktion von Antikörpern anzuregen. Im Hinblick auf diese Beobachtung war'_die besonders starke Immunogenität, die auf ansonsten immunogen schwache oder unwirksame immunogene Determinanten übertragen wird sobald sie auf diese an sich selbst immunogen inerten Teilchen aufgetragen worden sind, nicht voraussehbar, erst recht nicht im Hinblick auf einige enttäuschende Ergebnisse, die bisher mit den gleichen oder ähnlichen Determinanten beobachtet wurden, wenn diese auf andere Träger wie beispielsweise Proteine hohen Molekulargewichtes kovalent aufgetragen worden waren. Die beobachteten Verbesserungen, die sich aus der Erfindung ergeben, überschreiten oft die Wirkung herkömmlicher Adjuvantien bei weitem. Das vorliegende Verfahren ist vorstellbar als eines das zu immunogen ideal geformten und dimensionierten Trägerteilchen führt, die auf ihren Aussenf 1ächen die kovalent gebundenen Determinanten in verhäl tnismässig gleichmässiger Verteilung tragen. Es ist anzunehmen, dass diese gleichmässige Verteilung wesentlich zur Förderung der Bildung von Antikörpern hoher Avidität

. 22 - ^C0PY

und hoher Spezifizität in der Reaktion auf nach dem Verfahren hergestellte Produkte beiträgt. Eine solche gleichmässige Verteilung stimul iertjeweils eine kleine Auswahl der antikörperproduzierenden Zellen. Daraus wiederum ergibt sich ein enges Spektrum an Antikörpern mit verbesserter Spezifizität (sehr änlich wie monoclonale Antikörper - ohne den Aufwand und die Kosten, die jden monoclonalen Verfahren zu eigen sind) und häufig mit sehr hoher Avidität. (Die Avidität wird mathematisch als "K-Wert" angegeben. Dieser ist der Kehrwert der freien Antigenkonzentration, wenn die Hälfte der Antikörperbindungsstellen mit Antigen besetzt ist. Der Begriff "Affinität" kann dann an Stelle von "Avidität¹¹ verwendet werden, wenn die Antigene so klein sind, dass sie jewei nur mit einem einziqen Antikörper eine Bindung eingehen können. K-Werte von 10 bis 10 L/Mol kennzeichnen ei.-ne

11 12 geringe Avidität, während K-Werte von 10 bis 10 L/Mol als sehr hoch zu betrachten sind.)

Das obenbezeichnete erfindungsgemässe Verfahren wird vorzugsweise mit einem oder mehreren bifunktionel 1 en Kupplungsreagentlen durchgeführt mit jeweils zwei funktionel 1 en Gruppen, von denen wenigstens eine mit einer reaktiven Stelle des Bakterienteilchens eine kovalente Bindungsreaktion eingehen kann, während mindestens eine funktionelle Gruppe zur kovalenten Bindungsreaktion mit einer reaktiven Stelle der immunogenen Determinante bzw. eines die Determinante tragenden Moleküls geeignet i^-t,

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Jt

Die mindestens zwei funktionellen Gruppen des Kupplungsreagenses können gleich oder unterschiedlich sein. Falls sie unterschiedlich sind, wird die eine Gruppe spezifisch zur Reaktion mit einer bestimmten Art reaktiver Stelle des Bakterienteilchen ausgesucht, während die andere Gruppe spezifisch ausgesucht wird, um mit einer bestimmten 'Art reaktiver Stelle der immunogenen Determinante kovalent zu reagieren. Viele immunogene Determinanten besitzen verschiedene Arten reaktiver

von
Stellen, denen einige mit grösserer Wahrscheinlichkeit als andere zu der besonderen und spezifischen immunogenen Aktivität der Determinante · beitragen, d.h. die also eine grössere Rolle bei der Anregung einer Immunreaktion spielen_s die spezifisch für die Determinante ist. Aus · diesem Grund sollte man eine für die Bindung der immunogenen Determinante' an das Bakterienpartikel geeignete Stelle so aussuchen^ dass ein Maximum an spezifischer immunigener Aktivität der Determinante erhalten bleibt - gegebenenfalls mittels einfacher Versuche mit verschiedenen Kupplungsreagenten.

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Typische funktioneile Gruppen oder Kupplungsreagenben und deren Reaktionen werden in der Tabelle gemäss Anspruch 15 angegeben.

Bevorzugte Beispiele solcher Kupplungsreagent»en sind: Dialdehyde, insbesondere aliphatische Dialdehyde, vorzugsweise Glutaraldehyd und dessen höhere Homologen mit von 4 bis 20 Kohlenstoffatomen zwischen den Aldehydgruppen; (Pimelinaldehyd geht allerdings auch). "

Diamine, insbesondere solche , worin die Amingruppen mindestens 2, vorzugsweise zwischen 4 und 20 Kohlenstoffatome auseinander liegen, z.B. Hexamethylendiamin.

Cyanogenbromid. Dieses reagiert in der ersten Stufe mit den OH-Gruppen der Zuckerreste der PolysaccaridzelIwandkomponenten und bildet einen aktivierten Imidoester, der "seinerseits in der zweiten Stufe mit den Amingruppen des Antigens reagiert.

Der N-Hydroxysuccinimidester des N-(-4-Carboxocyclohexylmethyl )-maLeinimids ist eines der bevorzugten Beispiele sowohl für aktivierte Carboxylgruppen als auch fUrMaleinimidderivate. Weitere bevorzugte Kupplungsreagenten ergeben sich aus den Ausführungsbeispielen.

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Die obenbeschriebenen KupplungsreagentJen werden in an sich bekannter Weise mit den entsprechenden reaktiven Stellen zur Reaktion gebracht, insbesondere mit den in der Tabelle genannten Gruppen.

In einer bevorzugten Ausführungsweise des Verfahrens wird ein Kupplungsmittel zunächst mit einem der beiden zu verkuppelnden Reaktionspartner zur Reaktion gebracht und ein reaktives Zwischenprodukt gebildet, welches dann mit dem anderen Partner zur Reaktion gebracht wird. Dabei kann der erste Partner entweder d/e immunogene Determinanteoder das Bakterienteilchen sein.

Eineimmunogene. Determinantemit einer Hydroxylgruppe kann auch in folgender Weise konjugiert werden. Als Beispiel sei /J-Ecdyson genannt, ein Steroid, welches eine OH Gruppe enthält, die immunogen unwichtig ist.

Zunächst werden die nackten Bakterien succinil iert, wobei die Oberflächenamingruppen reagieren:

0 +

nackte
Bakterien;",
· c=0

C=O J

OH

Dadurch werden diese Amingruppen durch reaktive Carboxylgruppen ersetzt, die dann in der nä'chsten Verfahrensstufe verwendet werden. Die nackten Bakterienzwischenprodukte und das y^-Ecdxjson werden dann beide verestert, z.B. mit 1 -flt hy 1 -3 - (3 -ch"me t hy 1 am i η opr opy1)-carb od i i m i dhyd rochlorid, mit Hilfe eines Acylierkatalysators, z.B. 4-Dimethylaminopyridin, folgendermassen: '

nackte J — NH-C0-CH₂-CH₂-C00H

ι Bakterien*
>__"_"r__ I

• \/

l-Äthyl-3-(3 dimethyl-amino-

propyl)-carbodiimidhydrochlorid

■nackte

-ΈΟ-Ο^-CH₂-C

mit nackten Bakterien

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Als Alternative können •6«idi"PaHneV..3ei.^gegebenenfal 1 s jeweils für sich alleine) mit einer Kupplungsverbindung umgesetzt werden zur Bildung reaktiver Zwischenprodukte, die dann ihrerseits miteinander reaktiv kovalent verknüpft werden.

Zur Vermeidung unerwünschter Vernetzungsreaktionen dey immunogenen Determinante oder der Bakterienpartikel ist es vorteilhaft, eine Kupplungsverbindung mit zwei verschiedenen funktionel len Gruppen zu verwenden, wobei eine Gruppe selektiv ist für die reaktiven Stellen der immunogenen Determinante., während die andere Gruppe selektiv ist für die reaktiven Stellen der Bakterienteilchen. Ein Beispiel hierfür ist N-Succinimidyl-3(N-succinimidylVfropionat. Dieses Reagenz verwendet man zur Verkupplung der nackten Bakterien mit einer der Determinanten, der eine SH-Gruppe enthält.

0 0

nackte ;-_Nfr\ ₊ Il \~ CH_?- CH₉- ί -0 -N Rakterien ' ^c Ii/ c.c

Schritt I * 0

Zwischenprodukt von ₍ 1 ]L

N-Succinimidyl- ι nackte '„μη-γπ-γη — γη — ti

propionat und ,' Bakterien ! 2 ^LH2 "·

nackten bakterien · ·

Schritt II

!immunog. '— SH Oeterminantg >

} nackte

• Bakterien I

-NH-CO-CH₂-CH₂-N

- J ₁ immunog,

Determinantenkonjugat mit nackten Bakterien

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Wenn entweder der Determinante oder dem Bakterienteilchen oder beiden eine reaktive Gruppe fehlt, die sich für die kovalente Bindungsreaktion mit der bifunktionellen Kupplungsverbindung eignet, wird zunächst durch entsprechende chemische Einführung einer reaktiven Gruppe ein reaktives Derivat gebildet, z.B. mit Hilfe eines anderen bifunktionel1 en Kupplungsreagengeg. Das Gleiche gilt,falls es unerwünscht ist, eine der bestehenden reaktiven Gruppen des Antigens für die Kupplungsreaktion zu opfern, da dessen Erhaltung für die gewünschte Immunreaktion wichtig ist.

Aus Gründen der Geometrie und erhöhten Immunreaktivit'ät werden Kupplungsverbindung(en) bevorzugt, die eine verhältnismässig lange Verbindungskette, z.B. eine aliphatische Kohlenstoffkette von mindestens 3 und bis zu etwa 20, insbesondere zwischen 4 und 10 Kohlenstoffatomen zwischen der immunogenen Determinante, und Bakterienpartikel schaffen.

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Vorzugsweise wird die Menge einer bestimmten immunogenen ' Determinante .,die auf eine gegebene Menge des Bakterienteilchenmaterials aufgetragen wird, sorgfältig gemäss' der folgenden Kriterien bestimmt:

1. Die maximale Menge an Kupplungsverbindung und/oder immonogener Determinante , die sich binden lässt ohne anschliessend wieder abgewaschen zu werden, wird im Vorversuch bestimmt. Dazu bedient man sich beispielsweise einer Titrationsmethode, die die mittelbare oder unmittelbare Bestimmung der .tatsächlich verbrauchten Reagenzmenge gestattet. Man kann auch Reagentien mit radioaktiver Markierung verwenden. Im 1 etzteren .FaIIe misst man die Menge der fest|gebundenen Radioaktivität; oder man bestimmt den "Titrationsendpunkt" nach welchem die radioaktive Markierungssubstanz in der Waschflüssigkeit erscheint

2. Die optimale immunogene Aktivität erreicht man ehe die Partikeloberfläche einen Zustand der "Überladung" erreicht hat. Dieses Stadium bestimmt man für eine gegebene Determinante am besten durch eine einfache

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Vorversuchsserie, z.B. durch Immunisierung von Geflügelhennen (vorzugsweise der gleichen Zucht wie die, an denen später das erfindungsgemässe Mittel verwendet werden soll). Die Immunreaktion hängt mit geometrischen Faktoren zusammen, von denen die Verfügbarkeit der immunogen aktiven Stellen für das Immunsystem bestimmt wird.

3. Falls eine maximale Immunreaktion nicht kritisch.ist, führt man die Kupplung mit einer beschränkten Menge der Determinante durch,von der man erfahrungsgemäss erwarten kann, dass sie geringer ist, als die maximale Bindekapazität der Trägerteilchen.

Obwohl die Optimummenge wahrscheinlich mit der Oberflächengrösse der Teilchen zusammenhängt, ist es bequemer und im allgemeinen ausreichend genau die Mengen gewi chtsmässig auf die gesamte Bakterienmasse bezogen, zu bestimmen. Offensichtlich hängt diese Menge mit dem Molekular- oder Teilche gewicht deV immunogenen Determinante zusammen. Im Falle ' von· "nackten" Salmonel1 a minnesota (R595) Bakterien im Vakuum getrocknet, gelten folgende typische Werte pro Gramm:

Tri j>d-thyronin (Mokekulargewicht 651,0) 0,16 bis 0,83 /ig/g vorzugsweise 0,32^gZg, d.h. 0,00025 bis 0,0013, vorzugswei

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0,0005 Micromol/g.

Thyroxin (d.h. T,, auch bekannt als Tetrajod—thyronin Molekulargewicht 776,9), 0,2 bis l,Ojjg/g, vorzugsweise 0,4 jjg/g.

Kobragift (Naja nivea,Molekulargewicht '3000 - 30 000; 20 oder mehr Bestandteile) 6 bis 30 ^ig/g vorzugsweise 12 /jg/g.

Seramebaantigen (19 oder mehr verschiedene Antigene; Molekulargewicht bis zu 20 000) 4 bis 20 ug/g, vorzugsweise 8jjg/g.

TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon) - Molekulargewicht 25 000) 5-25 ug/g, vorzugsweise 10 jug/g.

Typische Steroide (Molekulargewicht etwa 325) 0,08 bis 0>4 Mg/g; vorzugsweise 0,16 ug/g.

Choleraantigen (Molekulargewicht 90 000) 10 bis 50^ig/g, vorzugsweise 20 jug/g .

Anhand des Obengesagten lassen sich auch die mit grösster Wahrscheinlichkeit geeigneten Mengen anderer immunogener Determinanten wenigstens annähernd abschätzen ( und für viele Zwecke mit ausreichender Genauigkeit), durch einfache

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Extra- bzw. Interpolation auf Grund des Molekulargewichtes der Immundeterminanten.

Als allgemeine Regel betragen geeignete "Beladungen" an immunogenen Determinanten 0,00001 bis 0,002, vorzugsweise 0,0002 bis 0,001 und insbesondere 0,0004 bis 0,0007 Micromol der immunogenen Determinante pro Gramm der Bakterienpartikel insbesondere pro Gramm der nackten Bakterien. In bevorzugten Ausführungen der Erfindung wird jedes Mol der immunogenen Determinanten an die Bakterienteilchen mit zwischen 1 und 3 Mol der bifunktionellen Kupplungsverbindung gebunden.

Wie für den Fachmann ohne weiteres verständlich sein dürfte, hängen Abweichungen von solchen berechneten oder geschätzen Annäherungswerten unter anderem von Faktoren wie Anzahl, chemischem Charakter und Geometrie der chemischen Gruppen oder Molekularbereiche der immunogenen Determinanten ab, die am wesentlichsten zur Erregung der gewünschten spezifischen Immunreaktion beitragen, sowie dem Umfang, in welchem immunogene Gruppen oder •Molekularbereiche durch die Bindungsreaktion oder ungünstige geometrische Anordnung verloren gehen.

Aus der Beschreibungseinleitung und den weiter unten beschriebenen Anwendungen der Erfindung ergibt sich, dass

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hinsichtlich der für die Erfindung in Frage kommenden immunogenen Determinanten praktisch keine Grenzen gesetzt sind.

Die. Erfindung war zunächst in erster Linie gedacht für die Kupplung immunogener Determinanten, die für sich alleine zu klein sind, um in einem gegebenen Immunsystem eine ausreichende Immunreaktion zu erregen. Das gilt in erster Linie für Immundeterminanten mit einem Molekülar-oder Partikelgewicht von weniger als 150 000, insbesondere weniger als 100 000 und ganz besonders solchen von weniger als 30 000 Dalton. Was die untere Molekulargewichtsgrenze betrifft, so kommen für die vorliegende Erfindung sogar verhältnismässig kleine Fragmente von Partikeln oder Molekülen in Frage, vorausgesetzt, dass diese die spezifische immunogene Information enthalten, auf die eine Reaktion zur Erregung der 3ildung hoch spezifischer Antikörper gewünscht wird.

Zum Beispiel im Falle von Substanzen wie T~ oder DTP liegt die untere Grenze in etwa bei Fragmenten, die wenigstens' 3 Amingruppen enthalten.

Die Erfindung bietet jedoch auch wesentliche Vorteile für immunogene determinantentragende Moleküle oder

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Partikel, die selbst bereits eine verhäl tnismä'ssig none Masse besitzen, d.h. bereits gross genug sind, LLrnselbst eine Immunreaktion zu erregen. Es hat sich iThiesen, dass die Anwendung der Erfindung zur Bildung von Antikörpern führte ie hinsichtlich ihrer physikalischen und Immuneigenschaften überlegene Eigenschaften besitzen.

Die Antikörper tragen eine besonders hohe Ladung. Sie sind stabiler und eignen sich besser für Bindungsstudien als solche mit geringeren, isoelektrischen Punkten. Die Aviditäten der Antikörper sind im allgemeinen hoch. In der Tat sind die Antikörper als neue bzw. verbesserte erfindungsgemässe Produkte zu b-etrachten, da sie sich hinsichtlich der obenjgenannten Eigenschaften eindeutig

und oft um ganze Grössenordnungen ^vom ^tana aer Tecnnik unterscheii

Der Bakteriencharakter der Trägersubstanz und die gleichmässige Verteilung der immunogenen Determinanten auf der Trägeroberfläche, zusätzlich zum erhöhten Partikelgewi ent,das sich aus der erfindungsgemässen Kupplung ergibt, tragen a'.le zu den gewünschten Qualitäts eigenschaften der Antikörper und den guten Ausbeuten bei.

Beispiele von Haptenen, bzw. Immunogenen, auf die die Erfindung besonders gut anwendbar ist, sind:

Patijogene und ni cht-patipgene Mikroben, z.B. solche, die zu klein sind, um in der ungekuppelten Form eine

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COPf

ausreichende Immunreaktion zu erzeugen, bzw. Fragmente solcher Mikroben, einschl i essl i ch verhältnismMssig kleine Vir£n,- Virusfragmente und sogenannte Viroide.

Gifte, z.B. von Schlangen, Spinnen, Skorpionen, Insekten, giftigen Fischen und Molusken; Toxine, Pflanzen- und synthetische Gifte, Arzneiwirkstoffe, Hormone.

Antikörper und andere körperlichen Stoffe die symptomatisch für einen pathologischen Zustand sind, ζ .B.'für eine aktive Infektion oder einen vergangenen Kontakt mit einer Krankheit, oder gegen die man Antikörper zu irgend einem Zweck benötig! z.B. für die Herstellung von trägergebundenen (immobilisierten) Immunosorbenten. In diesem Zusammenhang sei auf die Offenbarung der gleichzeitig eingereichten Anmeldung, entsprechend der südafrikanischen Priorität 81/4481 (Unser Zeichen: 1A-56' 218) hingewiesen. · Die darin

enthaltenen Lehren sind als Teil der vorliegenden Offenbarung zu betrachten.

RNA-oder DNA-Ketten bzw. bestimmte Fragmente davon. Enzyme oder spezifische Enzymfragmente.

Jede Art von Stoff, der bestimmte immunogene Information enthält, die für qualitative oder quantitative forensische, pathologische oder analytische Bestimmungen geeignet ist.

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Die erfindungsgemäss hergestellten immunogenen Erzeugnisse lassen sich für eine Vielzahl von Anwendungen verwenden.

Zu diesen Anwendungen gehören die aktive Immunisierung von Tieren oder Menschen ' zur Schutzimpfung gegen \ Krankheiten. Diese kann auf dem Wege der Injektion (subkutan, intravenös, intramuskulär, üepot ) stattfinden, oder durch orale oder nasale Anwendung, z.B. Inhalierung als Sprühstoff oder Rrosol . Diese Anwendungsweisen sind an sich bekannt und brauchen keine Erläuterung. Der besonders hohe Grad an Verträglichkeit der erfindungsgemäss verwendeten Trägerstoffe mit den Körpersystem-en von Tieren und Menschen ist ein besonderer Vorteil.

Die obengenannte Art der aktiven Immunisierung lässt sich aber auch in an sich bekannter Weise auf die Herstellung von Antikörperpräparaten anwenden, z.B.

(a) zur Verwendung als passives Immunisationsmittel oder Gegengift (Antiserum) ;

(b) für die Herstellung sogenannter "Diagnostika". Darunter fallen Anwendungen wie die Identifizierung und qualitative oder quantitative Bestimmung pathologischer Zustände in Tieren, Menschen und Pflanzen, die Identifizierung und Bestimmung von Mikroben (einschliesslich Bakterien, Viren und Viroiden (sowohl pathogeneV Art als auch nicht-pathogener Art, in biologischen oder anderen Proben, z.B. Wasser, Abwässern oder Erde);

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die Identifizierung und quantitative Bestimmung von Toxinen, Giften, Arzneiwirkstoffen in Körperflüssigkeiten, Geweben und anderen Proben, Gewebetypisierung, Identifizierung der Herkunft biologischer Proben, forensische Bestimmungen, kriminologische Pathologie und spezialisierte analytische Bestimmungen.

(c) Zur Verwendung in der immunoligisehen Extraktion, Konzentration und Reinigung von Stoffen aus Lösungen, z.B. Konzentration/Reinigung von hochspezifischen Partnern eines Antigen/Antikörperpaares. Auch hier wi-ed er um sind die verwendeten Prinzipien an sich dem Fachmann bekannt und brauchen nicht weiter erläutert zu werden..

(d) Für die Herstellung immobilisierter Immunpräparate. Auch in diesem Zusammenhang sind die Prinzipien, : Verfahrensweisen und Methoden dem Fachmann geläufig.

Für sämtliche dieser Zwecke lehrt die Erfindung entsprechend Immunisationsmethoden zur Bildung der gewünschten Antikörper gegen spezifische immunogene Determinanten mittels des erfindungsgemässen immunogenen Materials. Diese Anwendungsmethoden -und Anwendungen sollen ebenfalls unter Schutz gestellt sein. .

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In ganz breiten Zügen kann man diesen·· Aspekt der Erfindung auch bezeichnen als ein Verfahren für die Herstellung von Antikörperpräparaten, dadurch gekennzeichnet, dass anti körperzeugende lebende Zellen mit einem trägergebundenen immunogenen Determinantenmaterial gemäss der Erfindung zur Produktion von Antikörpern gegen diese Determinanten des Materials erregt werden, und die Antikörper konzentriert werden.

Soweit die Immunisierung auf Säugetiere (z.B. Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Schweine, Pferde, Schafe) angewandt wird, kann man hierzu an sich bekannte Immunisations-Prozeduren dem vorliegenden Zweck anpassen, mit oder ohne Adjuvans, z.B. Freunds Adjuvans oder unvollständigem Adjuvans . Die Seren der so immunisierten Tiere können gegebenenfalls gesammelt und in an sich bekannter Weise für die Gewinnung der Antikörper verarbeitet werden. Die gemäss der Erfindungslehre zustande gebrachte Erhöhung des Mol.ekular- bzw. Partikelgewichtes der immunogenen Determinanten, die Form der Teilchen und die Art, in der die Determinanten auf der Aussenfläche der Teilchen verteilt sind, wirken sich vielfach nicht nur günstig auf die Quantität, sondern auch die Qualität der so erregten Antikörper aus. Erfindungsgemäss hergestellte Antikörperpnäparate sollen ebenfalls in den Schutzumfang der j vorliegenden Erfindung fallen.

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Besonders bevorzugte AusfUhrungsweisen des Verfahrens, worin das erfindungsgemässe immunogene Material zur Herstellung von Antikörpern verwendet wird, beinhalten die Immunisierung von Geflügel tieren in an sich bekannter Weise und die Gewinnung von Antikörperpräparaten in an sich bekannter Weise aus dem Serum solcher Geflügeltiere , aber vorzugsweise aus den Eiern solcher Geflügelttere und insbesondere aus den Eidottern. In diesem Zusammenhang sei auf die Lehre gemäss der DE-OS 29 51 412 hingewiesen, die als Teil der vorliegenden Offenbarung zu betrachten ist, und deshalb nicht nochmal wiederhold wire

Die vorliegende Erfindung bietet besondere Vorteile im Zusammenhang mit der Immunisierung von Geflügel tieren zur Herstellung von IgY aus Eidottern. Es wurde bereits oben erläutert, dass die im Eidotter wahrnehmbare Immun-•reaktion auf die Immunisierung von Hennen mit immunogenem Determinantenmaterial eines Molekulargewichts unterhalb 30 000, im allgemeinen entweder minimal ist, oder ganz fehlt und im allgemeinen sogar im Falle von immunogenen Determinanten mit einem Molekulargewicht von unterhalb 100 000 schwach ist,oder gar ganz fehlt. Diese Erscheinung lässt sich sogar insofern praktisch nutzen, als die Stimulierung von Antikörpern im Eigelb sehr selektiv ist,

₄₀ BAD ORIGINAL

da die immunogene Reaktion auf sonst störende immunogene Determinanten verhäl tnismässig geringen Molekulargewichts' selektiv vermieden wird. Anti körper gegen immunogene Determinanten

geringen Mol ekulargewi cht's nachdem diese an die Bakterienpartikel von verhältnimsässig hohem Molekular- bzw Partikelgewicht angekettet worden sind, lassen sich dahingegen besonders leicht und mit dem gewünschten hohen Grad an Spezifizität herstellen. Obwohl die Erfindung die obengenannten besonderen Vorteile mit immunogenem Material mit Molekulargewichten unterhalb 150 000 und insbesondere unterhalb 100 000 bietet, ergeben sich trotzdem auch erhebliche Vorteile mit immunogenem Material verhäl tnismässig hohen Molekulargewichts beispielsweise mit Gammaglobulinen, wenn diese an die Bakterienpartikel gekuppelt werden. Selbst in diesem Fall wurden erheblich verbesserte Ausbeuten,Spezifizitäten und Aviditäten der Antikörper beobachtet.

Ferner ist die Erfindung nicht auf die Herstellung von Antikörpern in lebenden höheren Tieren beschränkt,- sondern lässt sich auch auf die Antikörperproduktion in ZeIlkulturen oder Bakterienkulturen, insbesondere monoklonen Hybridgewebe-bzw. Bakterienkulturen anwenden. Dazu bedient man sich der an sich bekannten Methoden, die deshalb keiner ausführlichen Beschreibung bedürfen:

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Gemäss einer Ausführungsweise wird das erfindungsgemässeimmunogene Material zunächst zur Immunosierung von Tieren in der obengenannten Weise verwendet und werden anschliessend die Zellen solcher Tiere, die Antikörper ausscheiden, hybridisiert, z.B. Lymphocyten aus der Milz des immunisierten Tieres mit Myelomazellen aus einer anderen Tierart, worauf die Hybridzellen kultiviert und in Einzelzellenkulturen (clone) vermehrt werden, wobei jede Einzelzellenkultur dann grosse Mengen identischer Antikörper gegen eine, einzige immunogene Determinante erzeugt.

Die Antikörperproduktion kann vollständig in vitro (in KuI türen") stattfinden oder Proben der Einzelzellenkultur werden in Tiere eingesprizt. Die diesbezüglichen Methoden wurden von Cesar Milstein in Scientific American 243 (4), Seite 56 bis beschri eben.

Beispiele

Bei spiel 1:

Kupplung von Digoxin an nackte Bakterien.

Zur Einführung einer reaktiven Amingruppe in Digoxin wird dieses zunächst mit Perjodat oxydiert

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und dann mit Hexamethylendiamin umgesetzt: 109 mg Digoxin (0,14 mMol) werden in 10 ml absolutem Äthanol bei Zimmertemperatur suspendiert. 5^1 0,1M NaIO. werden tropfenweise mit magnetischer Umrührung hinzugefügt, gefolgt nach 25 Minuten von 1,5 ml IM Äthylenglykol .

5 Minuten später wird das Reaktionsgemisch tropfenweise mit magnetischer Umrührung zu 2,44 g (0,02 Mol) Hexamethylendiamin in 10 ml Wasser hinzugefügt, wobei der pH-Wert vorher auf 9,5 mit 5% Kaliumcarbonat eingestellt worden war. Der pH-Wert wird im Bereich von 9₇0 bis 9,5 durch tropfenweise Hinzufügung von 5% Kaliumcarbonat bzw. 0,1 M HCl gehalten. Nach 45 Minuten stabilisiert sich derpH Wert und dann werden 0,075 g Natriumborhydrid, frisch gelöst in 5 ml Wasser, hinzugefügt. 16 Stunden später wird der pH-Wert mit 1 M Ameisensäure of 6,5 gesenkt. Nach einer Stunde bei pH 6,5 wird der pH-Wert wieder auf 8,5 durch Hinzufügung von 1 M Ammoniak erhöht.

Das Reaktionsgemisch wird mit einem Rotationsverdampfer getrocknet und der Rückstand wird in ein Gemisch von Chloroform und Äthanol (1:1) aufgenommen und auf Silikagel mittels eines Chloroform-Athanolgemisches (3:2), als Eluiermittel gereinigt. Auf diesem Weg wird eine

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99'

Amingruppe in das Digoxinmolekül durch die Konjugation mit Hexamethylendiamin eingeführt.

Die nackten Bakterien werden fölgendermassen zubereitet:

Salmonella minnesota R595 wird im wässrigen Kulturmedium folgender Zusammensetzung pro Liter gezüchtet:

15 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 3 g NaCl, 2 g Na₂₄ 12H 0, Na₂HPO₄. 12 H₂O, 0,2 g MgSO₄.7H₂O, 10 g Glukose

Die Bakterien werden 7 Tage bei 37 C inkubiert.

Danach wird Phenol (endgültige Konzentration 1%) zur Abtötung der Zellen hinzugefügt. Die Zellen werden abgetrennt und wiederholt gewaschen, zunächst zweimal mit desti11iertem"Wasser und zweimal mit Aceton und dann noch einmal mit Äther und anschliessend im Vakuum getrocknet. Dieses Produkt .kann bei Zimmertemperatur bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt wecdenv ■

Für die Hydrolyse zur Abspaltung der O-Antigendeterminanten werden die trockenen Bakterien zweimal mit 1% Essigsäure gewaschen und dann in λ% Essigsäure (1 g/ml) suspendiert und 2 Stunden lang auf Siedetemperatur erwärmt. Die Bakterienteilchen werden abgetrennt, zweimal mit distilliertem Wasser gewaschen, und anschliessend im Vakuum getrocknet. Das trockene Pulver

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stellt das nackte Bakterienmaterial dar.

Das Aminderivat von D'igoxin wird dann kovalent an die nackten Bakterien fölgendermassen gebunden:

Nackte J η Ο

"Bakteri en J ~^NH2 + V J ι

CH₉ CH_n

CH.

G =

ι

!Nackte

H₂O

CH₀

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CH,

CH₂
CH,

ι Nackte	ι I	C- I	CH₂-	CH₂	— C ι	•	L	-Π ρ	2
■ Bakterien	¹JY-	H			H	-N-	CH
							45

CH, ι

OH OH

HO

-L,

OH

Digoxinkonjugat der nackten Bakterien

30 mg der getrockneten nackten Bakterien werden durch Suspension in 6 ml Wasser und einstündige Inkubation bei 37⁰C rekonstituiert. Die überstehende Flüssigkeit wird bei 12 000 g abzentrifugiert. 6 ml , 0,25% wässriger GlutaraldehydTosung werden den Bakterien hinzugefügt mit anschliessender einstündiger Inkubation bei 37 C und anschliessender Zentrifugierung bei 12 000 g zur Abtrennung der Flüssigkeit.

Das Reaktionsprodukt wird eine Stunde lang bei 37⁰C mit 1 ml einer 1% Lösung des Digoxinderivats in Dimethylsul { ox.'id (DMSO) oder Methanol timgesetzt und anschliessend bei 12000 g zentrifugiert. Man lässt das Sediment eine Stunde mit 4,8 ml einer 0,33% wässrigen Äthanolaminlösung bei 37⁰C zur Blockierung der überschüssigen -Aldehydgruppen reagieren. Das Produkt wird bei 12 000 .g abzentrifugiert und zweimal mit 6 ml Portionen Wasser, jeweils mit anschliessender Zentrifugierung· bei 12 000 g gewaschen. Das Produkt wird dann in 18 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für die Immunisierung suspendiert.

Beispiel 2: Kupplung von T (Trijöd-thyronin) an nackte Bakterien.

30 mg hackte Bakterien,hergestellt gemäss Beispiel 1,werden in 6 ml Wasser suspendiert und eine Stunde zur Schwellung der Bakterien bei 37⁰C inkubiert. Die Suspension wird dann 10 Minuten bei 12 000 g zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. 6 ml 0,25% wässriger Glutar-

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aldehydlösung werden hinzugefügt. Anschliessend wird eine Stunde bei 37⁰C inkubiert, wonach die Suspension 15 Minuten lang bei 12 000 g zur Beseitigung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert wird.

1 ml einer 1% Methanollösüng des Natriumsalzes von Trijod-thyronin wird hinzugefügt und anschliessend wird eine Stunde bei 37⁰C inkubiert und dann 10 Minuten bei 12 000 g zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert.

4,8 ml, 0,33% Äthanolaminlösung werden hinzugefügt, gefolgt einstündiger Inkubation bei 37 C und 10 Minuten langer Zentrifugierung bei 12 000 g zur Entfernung der Flüssigkeit. Das Produkt wird jeweils zweimal mit '6ml Wasser aufgeschwämmt und wie oben zentrifugiert. Anschliessend wird das Produkt in 18 nil PBS für die Immunisierung suspendiert.

Beispiel 3:

Kupplung von T. (Teträjöd-thyronin) an nackte Bakterien

Die Prozedur ist die gleiche wie in Beispiel 2, wobei lediglich Tetrajod-thyroniη an Stelle von Trijod-thyronin verwendet wird.

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Beispiel 4: Kupplung von Thyroxin an nackte Bakterien:

Das vorliegende Beispiel veranschaulicht die Verwendung von Cyanogenbromid als Kupplungsverbindung. Zunächst werden die nackten Bakterien mit Cyanogenbromid (CNBr) folgendermassen "aktiviert": 2mg einer 25 mg/ml Lösung von CNBr werden in einem geeigneten Titriergefäss magnetisch gerührt, wobei der pH-Wert mittels eines pH-Staten mit 2 M Natriumhydroxydlösung automatisch auf 11,5 eingestellt

50 mg nackter Bakterien werden in 1 ml Wasser suspendiert und eine Stunde bei 37⁰C aufschwellen gelassen. Die Suspension wird dann zum obenjbeschri ebenen Reaktionsgemisch hinzugefügt, wonach man die Reaktion 6 Minuten stattfinden lässt, wobei der pH-Wert ständig bei 11,5 gehalten wird. Die nackten Bakterien werden dann auf einer Glasfritte mit Wasser gewaschen. Diese vorbehandelten nackten Bakterien kann man nun bei -10 C aufbewahren bis zur Verwendung in der nächsten Verfahrensstufe.

Das Antigen wird an die aktivierten nackten Bakterien folgendermassen gekuppelt:

1 ml einer 1% Thyroxinlösung wird zu einer Suspensionsmenge hinzugefügt, die 30 mg der obenbeschriebenen aktivierten

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Bakterien enthält. Das Gemisch wird über Nacht inkubiert und dann 10 Minuten bei 12 000 g zur Entfernung der Flüssigkeit zentrifugiert. Das .Sediment wird in 4,8 ml 0,5M NaHCO,-lösung suspendiert und zentrifugiert. Die Flüssigkeit wird verworfen. 4,8 ml Einer 0,33% Äthanolaminlösung wird hinzugefügt. Man lässt das Gemisch eine Stunde lang stehen und dann wird zentrifugiert. Die Flüssigkeit wird verworfen. 6 ml 0,01 NaCl werden hinzugefügt und danach wird die Flüssigkeit wieder abzentrifugiert. Man wiederholt dies mit 6 ml IM NaCl zweimal und dann mit 6 ml Wasser. Das gewaschene Sediment wird vollständig in einem Rotationsverdampfer getrocknet und dann in 18 ml PBS-lösung für die Immunisierung aufgenommen.

Genau die gleiche Prozedur.lässt sich auch hier wieder für die Kupplung von T, an Stelle von T. an nackte Bakterien anwenden.

Beispiel 5: Immunisierung von Geflügel mit an nackte Bakterien gekuppeltem

Antigen :

Die Immunisationssuspension gemäss einem der obenjbeschri ebenen Beispiele wird gründlich geschüttelt. Zu jeweils 1 ml Suspension wird 1 ml Freunds unvol1ständige$ Adjuvans hinzugefügt. Das Gemisch wird dann geschüttelt, bis sich eine

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• *

stabile Emulsion bildet. Die Emulsion wird in Hennen in einer Dosierung von 1 ml pro Tier eingespritzt, wobei jeweils 0,5 ml intramuskulär in jeden der beiden Brustmuskel des Vogels eingespritzt werden. Das entspricht einer Dosierung von etwa 0,8 mg Immunogen gemäss der Erfindung. Diese Immunisierung wird zweimal wöchentlich während der ersten drei Wochen wiederholt und anschliessend werden periodenweise Wiederholungsimpfungen vorgenommen, das erste Mal nach einer Woche und anschliessend monatlich. Diese Art der Hyperimmunisierung führt normalerweise nach drei bis vier Wochen zu ei nem Plateauwert der Antikörperkonzentration, zunächst im Serum und ansähliessend im Eigelb. Dieser Wert kann während der gesamten Legeperiode aufrecht erhalten werden oder steigt sogar allmählich (DE-OS 29 51 412). ■

Bei spi el 6:

Gewinnung von Geflügel-IgY 'nach Poison -(DE-OS 29 51 412)

Vom 21. Tag der in Beispiel 5 beschriebenen Immunisierung an, werden die Eier der immunisierten Hennen gesammelt, aufge-.brochen und das Eigelb sorgfältig abgetrennt und gewaschen, ohne die Vitell inmembranen zu zerre'issen. Anschl iessend wird die Membrane aufgerissen und das Eidottermaterial in einem Messgefäss gesammelt. Das Volumen wird gemessen und PoIyäthylenglykol, Molekulargewicht 6000, wird bis zu einer endgültigen Konzentration von 4 g/100ml PEG 6000 hinzugefügt.

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Das führt zur Fällung des Ovaibumins, der Lipoproteine und der caseinartigen Proteine sowie der Abscheidung der Lipide. Diese Stoffe werden nach Zentrifugierung durch Filtration der überstehenden Flüssigkeit durch einen Wattebausch abgetrennt. Das Volumen der klaren Flüssigkeit wird wieder gemessen und mehr PEG wird hinzugefügt bis zu einer Gesamtkonzentration von 12 g PEG/IOO ml. Dies führt zur Fällung der Antikörper, die nun abzentrifugiert und in einem Sechstel des ursprünglichen Eidottervolumens an Phosphatpuffer (pH 7,6, 0,1 M) gelöst werden. Die Lösung enthält etwa 25 mg Protein/ml. Das ganze oberJbeschriebene Verfahren findet bei neutralem pH (6,5 - 7,8) statt und deshalb verwendet'man vorzugsweise durchweg einen verdünnten Phosphatpuffer (0,1 M) als wässriges Lösungsmittel.

Beispiel 7: Immunisierung von Kaninchen mit an nackte Bakterien gekuppeltem

Antigen:

Die nackte Bakteriensupsension wird wie in Beispiel 5 beschrieben mit Freunds unvollständigem Adjuvans zubereitet. Die Kaninchen werden mit dieser Emulsion, jeweils mit zwei 0,5 ul Dosierungen an zwei verschiedenen Stellen subkutan geimpft. Man wiederholt zweimal wöchentlich 8 Wochen lang. Nach dieser Impfungsserie werden nur noch periodenweise Wiederholungsimpfungen gegeben. Sämtliche Impfungen erfolgen mit einer gleichzeitigen intramuskulären Einspritzung des

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SZ

allgemeinen Antibiotikums "Streptopen" (R) als Schutz gegen Infektion. ' Nach der ersten Woche werden 10 Minuten vor jeder Impfung als Vorbeugung gegen anaphylaktischen Schocks 0,5 ml einer 1:5 verdünnten Adrenalinlösung subkutan eingespritzt.

Beispiel 8: Antikörper gegen IgG:

Kaninchenimmunoglobulin wird mit Glutaraldehyd an nackte Bakterien gekuppelt gemäss der Methode in Beispiel 2. Dieses trägergebundene Immynoglobulin wird dann zur Immunisierung von Leghornhennen gemäss Beispiel 5 verwendet, und die Antikörper werden wie in Beispiel 6 beschrieben, gewonnen.

Zu Verg"! eichszwecken wurde die Immunisierung und Gewinnung der Antikörper an ähnlichen Leghornhennen wiederholt, wobei menschliches IgG als Immunogen.verwendet wurde, das nicht an einen Träger gebunden worden war. Die Antikörperausbeute gemäss Agglutinationstiter war für das an nackte Bakterien gebundene IgG um 4 Verdünnungsstufen höher, als für das "normale" IgG.

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Beispiel' 9:' ' Immunisierung 'von "Schafen:

Die Methode ist die gleiche, wie für Kaninchen gemä'ss Beispiel 7, nur dass mit grb'sseren Volumen geimpft wird. 2 ml der Immunogenemulsion werden jeweils eingespritzt, verteilt auf 2 Impfstellen. Die Adrenalin- und Streptopeneinspritzungen werden ebenfal 1s auf 1 ml bzw. 2 ml erhöht.

Man erzielt konsequent hohe Antikörpertiter und die Antikörper haben eine höhere Avidität als solche, die durch vergleichbare Impfungen mit vergleichbaren herkömmlichen Immunogenen erzeugt wurden. Das erfindungsgemässe Immunogen ist somit sowohl nützlich-für die kommerzielle Antikörperproduktion als auch als Vaccine für die Schutzimpfung gegen Pathogene.

Beispiel 10:

Isolierung von IgG aus Blut: .

Das Blut wird aus der Halsschlagader von Schafen bzw. aus der Hauptarterie des Ohres eines Kaninchens entzogen. Man lässt das Blut bei Zimmertemperatür (2O⁰C) 3 '" bis 5 Stunden lang gerinnen und zentrifugiert dann 30 Minuten lang bei 3000 g. Das so erhaltene klare Serum wird mit dem zweifachen Volumen von Boratpuffer (0,01 M, pH 8,6) verdünnt und sorgfältig vermischt.. Polyäthylenglykol(PEG 6000) wird

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bis auf eine Konzentration von 15% m/v hinzugefügt. Danach wird 10 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. Die gefällte Pille wird im gleichen Volumen des Boratpuffers suspendiert und die Fällung mit PEG 6000 unddielfintrifugierung werden wiederholt. Die Pille wird schliesslich in einem Volumen von Phosphatpuffer (0,1 M,pH 7,6) gelöst,das der Hälfte des ursprünglichen Serumvolumens entspricht.

Beispiel 11: Alpha-Fetoprotein-Antikörper:

Alpha-Fetoprotein-Antikörper sind kommerziell wertvoll, da sie sich für die Reihenuntersuchung schwangerer Frauen (z.B. mit RIA-Methoden) für Spinabifida und Anencephalie im Foetus verwenden lassen. Alpha-Fetoprotein (AFP) Molekulargewicht 70 000 Dalton wird zunächst von den embryonischen Dottersackzellen und später von den Leberzellen des Foetus syntheti siert. Es ist das erste Alphaglobulin welches in Erscheinung tritt und das überwiegende Serumprotein der frühen Säugetierembryogenese. Während der Schwangerschaft wird normalerweise eine gewisse Menge AFP in die amniotische Flüssigkeit und den Urin des Foetus im zweiten Trimester abgeschieden und langsam durch Schlucken des Foetus beseitigt. Wesentlich höhere AFP-Konzentrationen liegen in der amniotischen Flüssigkeit von Foetus vor mit offenen Neural röhrendefekten. In Folge der Wanderung des AFP durch die Placenta steigt die AFP-Konzentration während der Schwangerschaft im Serum der Mutter. Deshalb verwendet man AFP-Bestimmungen

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am Mutterserum als Andeutung dieser offenen Neuralrohrdefekte des Foetus im frühen Schwangerschaftsstadium. Es gibt erhebliche Strukturähnlichkeiten zwischen Albumin und AFP. Eine brauchbare Bestimmungsmethode muss somit eindeutig zwischen diesen beiden Verbindungen unterscheiden. In Vorversuchen wurde zunächst versucht, einige Hühner gegen Albumin und andere gegen AFP unmittelbar zu immunisieren. Die Immunreaktion war zu gering für die Herstellung brauchbarer IgY-Konzentrationen gegen diese Immunogene im Eigelb . Beide Verbindungen wurden dann an nackte Bakterien gemäss der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gekuppelt. Hennen wurden dann mit diesem immunogenen Material gemäss Poison's Methode immunisiert. In beiden Fällen wurden gute Ausbeuten an Anti körpern hoher Avidität erzielt. Die K-Werte für IgY Anti-AFP-Antikörper betrugen 2 χ 10 L/Mol. Das beste auffindbare und vergleichbare Handelsprodukt verwendet Kaninchen-IgG Anti-alphafetoprotein mit einer erheblich* geringeren Avidität, nämlich nur 6,0 χ Ί0⁹ L/Mol.

Der K-Wert für die erfindungsgemassen IgY Anti-Albuminantikörper betrug sogar 5,5 xlO L/Mol. Es gab keine Kr'euzreaktionen zwischen den AFP-Antikörpern und Albumin. Es gab wohl eine geringfügige Kreuzreaktion der Antialbuminantikörper mit AFP. Diese Kreuzreaktion ist jedoch im vorliegenden Zusammenhang unwesentlich. Die erfindungsgemassen Anti-AFP-Antikörper eignen sich ohne weiteres

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für eine FäTIungs- RIA-Methode und diese hat die gewünschte Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit

Beispiel 12:

Per.jodatoxidation von Pigoxin und Kupplung an nackte

Bakterien

430 mg Digoxin (0,56 mM) werden in 20 ml absolutem Alkohol bei Zimmertemperatur suspendiert. 20ml 0,1 M Natriummetaperjodat werden tropfenweise mit magnetischer Umrührung hinzugefügt. Nach 25 Minuten werden 0,6 ml IM Äthylenglykol hinzugefügt. 5 Minuten später wird das Reaktionsgemisch tropfenweise mit magnetischem Umrühren zu 600 mg' der nackten Bakterien" (siehe Beispiel i)in 20 ml Wasser, vorher auf pH 9,5. mit 0,4 ml 5% Kaliumcarbonat eingestellt, hinzugegeben. Der pH-Wert wird im Bereich 9,0-9,5 durch tropfenweise Hinzugabe von 2 ml 5% Kaliumcarbonat gehalten. Nach 45 Minuten ist der pH-Wert stabil und werden 0,4 g Natriumborhydrid^frisch in 20 ml Wasser gelöst,"hinzugegeben. 3 Stunden später folgen 7,6 ml IM Essigsäure zur Senkung des pH auf 6,5. Nach einer weiteren Stunde wird der pH-Wert auf 8,5 durch Hinzugabe von 1,5 ml I₁M Ammoniak angehoben. Das gesamte Reaktionsgemisch wird dann 10 Minuten bei 10 000g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird abgeschüttet. Die Pille wird dreimal mit PBS gewaschen und dann in 360 ml sterilem PBS suspendiert. Diese Suspension wird als Impfstoff verwendet.

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Beispiel 13:

Kupplung von Meerrettichperoxidase an nackte Bakterien

Meerrettichperoxidase ist ein Enzym mit einem hohen Gehalt an Kohlehydraten, die man mit Cyanogenbromid aktivieren und anschliessend mit nackten Bakterien (die ebenfalls Kohl erfiydratgruppen auf der Aussensei tenoberf lache enthalten) oder in umgekehrter .Reihenfolge reagieren lassen kann.

2 ml Cyanogenbromidlösung (25 mg/ml) werden in einem Gefäss mit 2 M NaOH Lösung auf pH 11,0 eingestellt. 50 mg Meerrettichperoxidase, in 2 ml. Wasser gelöst , werden zu dieser Lösung hinzugegeben. Das pH wird 6 Minuten lang während der Reaktion konstant gehalten. Danach senkt man den pH Wert auf 7 durch Hinzugabe von 0,1M Salzsäure. Die "aktivierte" Meerrettichperoxidaselösung wird durch Gelch.romatograf i e von ihren Begleitstoffen befreit und lyophilisiert.

5 mg des Lyophilats werden in 1 ml Phosphatpuffer (pH 7,6, 0,1N gelöst. Man lässt 60 mg nackter Bakterien 1 Stunde lang in 12 ml Wasser aufschwellen, wonach die Suspension 10 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert wird. Nach Abschütten der überstehenden Flüssigkeit wird die Pille in 5 ml 0,1 M Pho"sphatpuffer suspendiert. Dann wird die Lösung der aktivierten Meerrettichperoxidase zur nackten Bakteriensuspension hinzugegeben und lässt man die Reaktion 18 Stunden

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bei 25⁰C stattfinden. Die Suspension wird bei 10 000 g 10 Minuten lang zentrifugiert und nach Abschütten der überstehenden Flüssigkeit wird die Pille dreimal mit PBS gewaschen. Schliesslich wird die Pille in 36 ml steriler PBS suspendiert als Impfstoff. Die damit erhaltenen Antikörper verwendet man in einer ELISA-Bestimmung

ι Beispiel 14:

Reaktion von Carboxylgruppen mit Amingruppen

T₃ (siehe Beispiel 2) kann auch über seine Carboxylgruppen und über die Amingruppen an den Oberflächen nackter Bakterien an nackte Bakterien gekuppelt werden. (T₃ wird hier lediglich als typisches Beispiel verwendet.)

60 mg nackter Bakterien werden in 25 ml Wasser .gelöst und 30 g !-Cyclohexyl -3-(2-morphol inyl-4-äthyl)- carbodiamid-methop--toluolsul $ onat(Morpho-cdi) werden hinzugegeben.

20 mg des T₃ in seiner frei en' Säureform werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und dann tropfenweise mit Umrühr.en hinzugegeben., Der pH-Wert wird mit verdünnter Salzsäure bzw. Natriumhydroxid konstant auf 5,5 gehalten. Nach 10 Minuten wird eine weitere Menge von 10 mg des Carbodiamids hinzugegeben. Man hält die Suspension mi t· ständigem Rühren im Dunkeln 10 Stunden bei Zimmertemperatur- Die Suspension wird dann 10 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wird abgeschüttet und die

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Pille dreimal in PBS gewaschen.

Beispiel 15:

Reaktion von Carboxylgruppen mit Hydroxylgruppen

Dieses Beispiel illustriert den Fall, wo die Amingruppen an nackten Bakterien zunächst succi n\f liert werden und dadurch auf der nackten Oberfläche Carboxylgruppen eines reaktiven Zwischenproduktes, z.B. für die Kupplung an /3-Ecdyson (siehe Reaktionsschema weiter oben) verwendbar $'md.

60 mg nackte Bakterien werden in 2 ml trockenem DimethylsulHi ox.id (DMSO) suspendiert. Succinanhydrid (210 mg) wird in kleinen Teilmengen zur Suspension hinzugefügt. Man lässt die Reaktion 38 Minuten lang vonstatten gehen und fügt dann 10 ml Wasser hinzu. Die Suspension wird zentrifugiert und die Überstehende Flüssigkeit*abgeschüttet. Die Pille wird in 10 ml Wasser suspendiert, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird abgeschüttet. Diese Waschung wird zweimal wiederholt und man lyophi1isiert dann die Pille vor dem nächsten Verfahrensschritt.

Die wie oben beschrieben hergestellte Pille (60 mg) wird in 15 ml trockenem DMSO suspendiert. Zu dieser Suspension fügt man 30mg /3-Ecdyson 1 mg 4-Dimethylamino-fyridin und 422 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl )-c.arbodi imidhydrochl orid^TDas Gemisch wird 4J Stunden

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lang magnetisch gerührt. 15 ml destilliertes Wasser werden dann hinzugegeben und die Suspension wird 10 Minuten lang bei 10 000 g zentrifugiert. Nach Abschütten der Flüssigkeit wird die Pille in 20 ml destillierten Wassers suspendiert, zentrifugiert und das Wasser abgeschüttet. Der Waschvorgang wird zweimal wiederholt, wonach das nackte Bakterienkonjugat in 36 ml sterilen PBS für die Immunisierung suspendiert wird.

Beispiel 16: Reaktion aktivierter Carboxylgruppen mit prim'ären Aminen

Das vor-liegende Beispiel zeigt, wie aktivierte Carboxylgruppen durch Veresterung von Carboxylgruppen mit N-Hydroxy- £uccinimid gebildet werden.

Der N-Hydroxy-succinimidylester von Testosteron-3-(0-Carboxymethyl )ox'rd wird gemäss Tantchou et alia synthetisiert (0. of Immunoassay ,(1) , 129-147 (1980) ) auf Seite 133. Diese Verbindung wird dann mit nackten Bakterien fölgendermassen reagiert:

60 mg Nackte Bakterien werden in 12 ml destillierten Wassers 1 Stunde lang aufgeschwollen. 0,06 mg N-Hydroxy-succinimidyl ester von Testosteron werden in 0,2 ml Methanol gelöst. Die nackte Bakteriensuspension wird 10 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgeschüttet und das Pellet wird in 1 ml Wasser suspendi'ert.

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Hierzu fügt man die Lösung des N-Hydroxy-succinimidyl-•fcestosteronesters. Man lässt die Reaktion 2 Stunden lang bei 4⁰C verlaufen und fügt dann 10 ml kaltes (4⁰C) destilliertes Wasser hinzu. Es wird 10 Minuten lang bei 10 000 χ g zentrifugiert und die überstehende" Flüssigkeit abgeschüttet. Die Pille wird in 10 ml PBS suspendiert und 10 Minuten bei 10 000 χ g zentrifugiert. Diese Waschung wird noch einmal wiederholt, und die Pille wird dann für die Immunisierung in 36 ml PBS, steril ,gelöst.

Beispiel 17: Reaktion von Anydriden mit primären Aminen

Anhydride reagieren mit primären Aminen und bilden Amidbindungen, wodurch Carboxylgruppen an die Stelle der Amingruppen treten.

Man nehme 1 g Metochlorpramid und löst es in 5 ml trockenen Chloroforms. 0,346 g Succinanhydrid werden in 2 ml trockenen Chloroforms gelöst. Man gibt die Succinanhydridlösung vorsichtig zur Lösung des Metochlorpramids und lässt 4 Stunden unter Rückfluss reagieren. Das Chloroform wird dann abgedampft,und man kristallisiert das Produkt aus Äthylacetat mit einem klein wenig Petroläther. Es bilden sich etwa 1 g succin\jl i ertes Metochlorpramid als Beispiel eines succi rivjl i erten Derivats wie man sie aus vielen Stoffen durch Veresterung mit N-Hydroxy-

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succinimid und DCC nach dem Verfahren von Rudinger und Ruegg (Biochem. J. ]_3J.» ⁵³⁸> 1973) herstellen kann. Die so aktivierten Carboxylsäurederivate werden mit nackten Bakterien der obenlbeschriebenen Art wie in den vorangegangenen Beispiel zur Reaktion gebracht.

Beispiel 18: Maleinimidderivate von Antigenen

Maleinimidgrvippei werden in Antigene mittels des bifunktionellen Reagenzes N-Hydroxysuccinimidester des N-(-4-Carboxycyclohexylmethyl)maleimmfis eingeführt (Eur. J. Biochem. 101 , 395, 1979).

70 mg Albumin (Rinder-serumalbumin) werden in 15 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) gelöst. 1,5 mg N-Hydroxysuccinimidester des N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)-Maleinimic werden in 0,1 ml Dioxan gelöst und tropfenweise mit Rühren der Albuminlösung hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden lang bei 3O⁰C inkubiert. Anschliessend wird das reaktive Zwischenprodukt auf "Sephadex G 25" mit 0,1 M Phopshatpuffer,*pH 7,0 durch Gelfiltrationschromatographie isoliert.

Dieses Iialeinimidderivatwird dann an nackte Bakterien über natürlich vorkommende oder chemisch eingeführte

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SH-Gruppen gekuppelt. Gegebenenfalls werden zusätzliche SH-Gruppen nach dem Verfahren von Klokj und Heiney (Archives of Biochem. and Biophysics 9j>, 605,(1962)) eing( führt

60 mg nackter Bakterien mit SH-Gruppen werden in ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert. Eine Lösung von 5 mg des obenjbeschriebenen Maleinimidderivates von Albumin wird in 0,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 gelöst und zur nackten Bakteriensuspension hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 4⁰C unter einer Stickstoffatmosphäre inkubiert. Die nackten Bakterie werden dann durch Zentrifugierung isoliert und die Pille wird dreimal mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 gewaschen, wonach die Pille in'36 ml PBS (steril) für die Immunisierung suspendiert wird.

Beispiel 19: Abwandlung des Beispiels 18

Das Verfahren gemäss Beispiel 18 wird dahingehend abgewandelt, dass zunächst das Maleinimidderivat der nackten Bakterien hergestellt und dann eine Verbindung, die eine Th'iolgruppe enthält mit dem Derivat zur Kupplungsreaktion gebracht wird.

Man schwillt 60 mg nackter Bakterien 1 Stunde lang in

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0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 auf. 1,5 mg Des N-Hydroxysuccinimidesters des N-(4)-(Carboxy-cyclohexomethyl)-«aleinimi wird in 0,1 ml Dioxan gelöst,tropfenweise mit Umrühren der nackten Bakteriensuspension hinzugegeben. Man lässt die Reaktion 4 Stunden lang bei 3O⁰C vonstatten gehen, und isoliert dann das reaktive Zwischenprodukt durch Zentrifugieren und dreifaches Waschen mit Phosphatpuffer.· Die Pille wird schliesslich in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 suspendiert. 5 mg Insulin (als Beispiel eines Proteins mit SH-Gruppen) wird in 0,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer,pH 7,0 gelöst und mit dem nackten Bakterienzwischenprodukt 20 Stunden lang unter eine" Stickstoff atmosphäre reagieren gelassen. Schliesslich wird das nackte Bakterienkonjugat des Insulins durch Zentrifugieren und dreifaches Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer., pH 7,0 isoliert. Die Pille wird schliesslich in 36 ml PBS (steril) für die anschliessende Immunisierung suspendiert.

Beispiel 20: Kupplung über Disulfidaustausch

Im vorliegenden Beispiel ward sowohl das»Antigen als auch das nackte Bakterienmaterial zuerst durch Kupplung umgewandelt. Die Reaktion findet in drei Stufen statt:

1) Einführung einer l-(2-Piridyldithio)propionyl(PDP)-Gruppe in das Antigen (z.B. Protein) durch Ν-Succininndyl--

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3-(2)-f*fridyldithio(^ropiönat)(SBDP) wie folgt:

Rinderserumalbumin (BSA) wird als Antigen verwendet. Davon werden 80 mg in 2 ml Wasser gelöst und 0,3 ml 20 mM SPDP Lösung in absolutem Alkohol werden hinzugegeben. Die zwei Reagent'ien werden gemischt und 30 Minuten bei 25⁰C reagieren gelassen, wonach der überschuss an SPDP-ReagenS durch 72-stündige Dialyse gegen PBS bei 4⁰C entfernt wir
Bildung ein BSA-PDP-Konjugats.

gegen PBS bei 4.C entfernt wird. Daraus ergibt sich die

2) Kupplung der Dithioglykol säure (DTDG)an.nackte Bakterien mittels 1-Äthyl-3-(3-dHmethylaminopropyl)-carbodiimid (EDCI):

182- mg DTDG werden in 1 ml 2 M NaOH gelöst. Die Lösung wird auf 24 ml mit boratgepufferter Kochsalzlösung (pH 6) verdünnt. Es wird 1 ml der Suspension nackter Bakterien (60 mg) in boratgepufferter Kochsalzlösung (pH 7) hinzugefügt. Nach gründlicher Mischung wird eine frisch bereitete Lösung von 250 mg EDCi in 2,5 ml Wasser hinzugemis9ht. Man lässt die Suspension 30 Minuten mit gelegentlichem Umschwenken bei Zimmertemperatur stehen. Das nackte Bakterienkonjugat wird dann durch Zentrifugieren und dreifachem Waschen mit PBS entfernt, und dann gelöst in 2 ml PBS bei 4 C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

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3) Das vorher bereitete DTDG- nackte Bakterienkonjugat wird nun mit Dithiothreitol (DDT) reduziert zur Bildung des Thioglykolyl-nackte Bakterienderivats:

2 ml DTDG-nackte Bakteriensuspension werden auf Zimmertemperatur erwärmt und 1 M DDT werden hinzugemischt. Man lässt die Reaktion 1 Stunde lang mit magnetischem Umrühren stattfinden. Dann werden die nackten Bakterien abzentrifugiert , viermal mit PBS gewaschen und schliesslich mit 2 ml PBS für die Kupplung an BSA-PDTP suspendiert.

4) Kupplung von PDTP-BSA an das Thioglykolyl-nackte Bakterienderivat.

2 mg PDTP-BSA gelöst in PBS (200 /jI) werden mit 2 ml der vorher zubereiteten Thioglykolylnackten Bakteriensuspension vermischt und über Nacht bei Langsamem magnetischem Rühren reagieren gelassen. Das gebildete nackte Bakterienkonjugat wird abzentrifugiert, dreimal mit PBS gewaschen und schliesslich als Impfstoff in 36 ml'PBS (steril) suspendiert.

Beispiel 21: An nackte Bakterien gekuppelte Toxine Choleratoxin wird an nackte Bakterien in der in Beispiel

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κ a ·*··

2 beschriebenen Weise gekuppelt, dahingehend abgeändert, dass 10 mg Choleratoxin in 1 ml PBS statt 1 ml λ% methanolischer !"„-Lösung verwendet wird. Diese Verfahrensweise kommt auch für die Herstellung von Schlangengiftkonjugaten in Frage.

Beispiel 22: Trägergebundenes Testosteron

60 mg nackter Bakterien werden in 10 ml destillierten Wassers 1 Stunde lang wie in den bisherigen Beispielen aufgeschwollen.

Der Jod—histaminester von Testosteron-hemisuccinat wird gemäss Tanchou und Slaunwright in J. of Immunoassay, 1 (1), 129-147 (1980) in der dort auf Seite 139 unter der Überschrift: "Reaction of Iodohystamine with activated esters" hergestellt. ' 5 mg des Esters werden im Minimumvoü.umen Wasser gelöst der nackten Bakteriensuspension zugemischt mit gründlichem Umrühren. Die Suspension wird dann 5 Minuten lang mit UV-Licht (Wellenlänge 211 nm Qu'ecksilberlampe) bestrahlt und anschli essend 10 Minuten lang bei 10 000 χ g zentrifugiert. Die Pille wird dreimal mit 20 ml PBS gewaschen und anschliessend als Impfstoff in 36 ml PBS (steril) gelöst.

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Beispiel 23:

Ester von Dicarboxyl säuren als ICupplungsreägentien

Man stellt eine Lösung von 2-20 mg/ml des Diesters von Glutarsäure (oder Pimelinsäure), hergestellt durch Kondensation von N-Hydroxysuccinimid mit Dicyclohexylcarbodiimid her (J.Am. Chem. Soc. 86_, 1939-1942 (196.4) ). 60 mg packte Bakterien werden 1 Stunde lang in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 zum Schwellen gebracht. Von der obengenannten Lösung wird eine Menge^die 1,5 mg des Diesters enthält, den nackten Bakterien mit Umrühren zugemischt. Man lässt die Reaktion 6 Stunden lang bei Zimmertemperatur vonstatten gehen. IgY (5 mg) gelöst in 0,5 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) werden hinzugemischt. Man lässt über Nacht reagieren. Nicht reagierte reaktive Gruppen können anschliessend wahlweise mit Mercaptoäthylamin oder Äthan-olamin blockiert werden.

Man gewinnt und wäscht das nackte Bakterienkonjugat und suspendiert es wie in den bisherigen Beispielen.

Im vorliegenden Beispiel reagieren die Glutar- bzw. Pimi1insäurediester des N-Hydroxysuccinimids mit Amingruppen der Proteinmoleküle unter Freisetzung von N-Hydroxysuccinimic

Beispiel 24:

'Verwendung von Bismaleiniaiden als Vernetzungsmittel

Beispiel 23 wird dahingehend abgeändert ,dass als bifunktionelles Vernetzungsmittel ein Bismaleinimid der Strukturformel

N-CH-CH₂-CH₂-N

verwendet wird.

Dieses Reagenz wird gemäss Goodfriend et alia (Science, 144, 1344-1346 (1964)) hergestellt. Ansonsten ändert sich nichts an der Verfahrensweise.

Das Bismaleinimid reagiert mit Sulfhydrylgruppen des Proteins und ähnlicher Moleküle durch Addition an Doppelbindungen der Maleinimidringe.

Beispiel 25:

Beispiel 23 wird dahingehend abgeändert, dass als bifunktionelles Vernetzungsmittel der N-Hydroxysuccinimidester des N-( 4) -Carboxycycl ohexy Imcthy 1) -raaJ einiinldi; verv^nctet wird. Die dabei stattfindenden Reaktionen sind eine

ψ- ^ _ 69 _ ^Ο^ψ.

Kombination der Reaktionen gemäss Beispiel 23 und 24.

Beispiel 26:

Beispiel 23 wird dahingehend abgewandelt, dass als bifunktione!1 es Vernetzungsmittel der N-Hydroxysuccinimid· ester der 3(2-Piridyl-oithiopropionsäure) der Formel

K-O-C-CH₉-CH₉-S-S-Iv

verwendet wird. In diesem Beispiel.reagieren die Protein-Amingruppen oder dergleichen mit dem einen Ende des Vernetzungsmittels,wobei N-Hydroxysuccinimid abgeschieden wird, während das andere Ende'mit SuIfhydrylgruppen auf dem Wege des Disulfidaustausches reagiert, wobei 2-Mercaptopyridin abgespalten wird.

Die Blockierung unreagierter funktionel1 er Gruppen kann auch hier wahlweise mit Mercaptoäthylamin durchgeführt werden.

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Claims

.ύ "Tr'ägergebundenes immunogenes Material" Patentansprüche

1. Trägergebundenes immunoges Material mit einem oder mehreren immunogenen Determinanten zur Erregung einer gewünschten spezifischen immunogenen Reaktion in lebenden, antikörpererzeugenden Zellen, wobei die immunogenen Determinanten, die die immunogene Information zur Erregung der spezifischen Reaktion enthalten, an der Aussenoberflache eines teilchenförmigen Trägers vorliegen, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägersubstanz Bakterienteilchen dienen, an deren Aussenseite durch kovalente Bindung eineimmunogene Determinante angehängt ist, die die immunogene Information zur Erregung der spezifischen Reaktion enthält.

2. Immunogenes Material gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalent gebundene immunogene Determinantedem Bakterienteilchen, an welchessie angehängt ist, fremd ist.

3. Immunogenes Material gemäss Anspruch 1 oder 2,

dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienteilchen selbst für sich alleine im wesentlichen immunogen unwirksam sind.

4. Immunogenes Material gemäss einem der Ansprüche

1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterienteilchen aus "nackten" Bakterienzellen bestehen, d.h.

Bakterien, deren Aussenseite ihrer antigenen Determinanten durch deren Abspaltung entblosst worden ist.

5. Immunogenes Material gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass pro Gramm der Bakterienpartikel zwischen 0,00001 bis 0,002 mM des immunogenen Determinanten kovalent gebunden ist.

6. Immunogenes Material gemä'ss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel nackte Bakterien sind, und pro Gramm 0,00002 bis 0,001 mM des immunogenan Determinanten kovalent gebunden sind.

7. Immunogenes Material gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass cfie immunogene Determi nante, ein Molekular- oder Partikelgewicht von weniger als 150 000 Dalton besitzt.

8. Immunogenes Material gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekular- oder Partikelgewicht weniger als 100 000 Dalton beträgt.

9. Immunogenes Material gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekular- oder Partikelgewicht weniger als 30 000 Dalton beträgt.

10. Immunogenes Material gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die immunogene Determinanteein Antikörper ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen \ Materials gemäss Anspruch 1, wobei eineausgewählte immunogene. Determinante an einen Träger angehängt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die immunogene Determinante durch kovalente Bindung^Reaktion oder Reaktionen an die Aussenoberflache von Bakterienpartikeln als Träger angehängt wird.

12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst die natürlichen immunogenen Determinanten von Bakterienzellen von diesen abgespalten werden, und anschliessend freiliegende kovalent reaktive Stellen an den Bakterienpartikel oberflächen zur kovalenten Bindungsreaktion mit einer ausgewählten immunogenen Determinante

herangezogen wprden.

13. Vorfahren gema'ss Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es mit Hilfe eines oder mehrerer zweiseitig funktionell er Kupplungsreagenten durchgeführt wird, mit zwei funktionellen Gruppen, von denen mindestens eine mit einer reaktiven Stelle des Bakterienteilchen eine kovalente Bindungsreaktion eingehen kann, während mindestens eine funktionelle Gruppe zur kovalenten Bindungsreaktion

COP?'

mit einer reaktiven Stelle der immunogenen Determinante bzw. eines die¹ Determinante, tragenden Moleküls geeignet ist.

14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionellen Gruppen des Kupplungsreagenffes verschieden sind, wobei die eine Gruppe spezifisch zur Reaktion mit einer bestimmten Art reaktiver Stelle des Bakterienteilchens ausgesucht wird, während die andere Gruppe spezifisch ausgesucht wird, um mit einer spezifischen Art reaktiver Stelle der immunogenen Determinante kovalent zu reagieren.

15. Verfahren gemäss Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplungsverbindung zwei funktionelle Gruppen besitzt, die entweder gleich oder verschieden sein können, gemäss der folgenden Tabelle und dass diese mit reaktiven Gruppen der Determinante und des Teilchens gemäss der folgenden Tabelle zur Reaktion gebracht werden:

Funktionelle Gruppen reagiert mit

Aldehyd primäre Amine

Imide ρ r i m ä r e Am i η e

Am in Aldehyd

Cyano (z.B. als Cyanogen- Hydroxylgruppen amid)

Funktionelle Gruppen

reagiert mit

Halogen (z.B. Brom) Carboxyl gruppen

Aktivierte Carboxylgruppen (z.B. N-Succinimidylester von Carboxyl säuren)

Anhydride (z.B. Succinanhydrid und Mal einanhydrid

Maleimidderivate

Thiolgruppen primäre Amine

primäre Amine, bzw. Hydroxy gruppen

primäre Amine Thiolgruppen.

16. Verfahren gemäss einem der Ansprache 13 bis 15, worin ein Dialdehyd, ein Diamin, Cyanogenbromid, N-Succin im idyl-3(N-succin imidyl)proprionat oder N-Hydroxy■ Succinimidester von N-( -4-Carboxydcycl ohexyl )-mal einim'id als Kupplungsmittel verwendet wird-.

17. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein K-uppl ungsmi ttel zunächst mit einem der beiden zu verkuppelnden Reaktionspartner zur Reaktion gebracht und ein reaktives Zwischenprodukt gebildet wird, welches dann mit dem anderen Partner zur Reaktion gebracht wird.

18. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass beide Partner je mit einer Kupplungsverbindung zur Reaktion gebracht werden, und je ein reaktives Zwischenprodukt bilden, und dass die Zwischenprodukte ihrerseits mit einander durch Reaktion verbunden werden.

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19. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 13 bis 18,

dadurch gekennzeichnet, dass entweder der Determinante oder dem Bakterienteilchen oder beiden eine reaktive Gruppe fehlt, die sich für die kovalente Bindungsreaktion mit der ^:bifunktionellen Kupplungsverbindung eignet, und dass durch entsprechende chemische Einführung einer reaktiven Gruppe zunächst ein reaktives Derivat gebildet wird.

20. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Menge von 0,00001 bis 0,002 mM der immunogenen Determinante pro Gramm der Bakterienteilchen gebunden wird.

21. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge 0,0002 bis 0,001 mM beträgt und die Teilchen nackte Bakterien sind.

22. Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge 0,0004 bis 0,0007 mM beträgt.

23. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Mol der immunogenen Determinante mittels zwischen.1 und 3 Mol der bifunktionel1e; Kupplungsverbindung an die Bakterienteilchen gebunden wird.

24. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 11 bis 23,

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r ^: ·»····-· 322k788

dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindungsreaktion ganz oder teilweise über eine strahlungsinduzierte freie Radikalzwischenverbindung stattfindet.

25. Immunogenes Material gemäss einem der Ansprüche

I bis 10 bzw. hergestellt gemäss einem der Ansprüche

II bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass es als Vakzine, für die aktive Schutzimpfung gegen eine Krankheit oder einen pathologischen Zustand ausgebildet ist.

26. Verfahren zur Anregung von Antikörpern gegen eine immunogene ■ Determinante , dadurch gekennzeichnet, dass antikörpererzeugende lebende Zellen mit einem immunogenen Material gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 25, worin die Determinanten kovalent an Bakterienteilchen gebunden sind, zur Antikörperbildung angeregt werden.

27. Verfahren gemäss Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die gebildeten Antikörper konzentriert und gewonnen werden.

28. Verfahren gemäss Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörperbildung in Hühnern erregt wird, und die Antikörper aus den Eiern der Hühner gewonnen werden.