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DE3215065A1 - Einstufiges fermentationsverfahren zur herstellung von 9-hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsaeure und dabei verwendete mikroorganismus-mutante - Google Patents

Einstufiges fermentationsverfahren zur herstellung von 9-hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsaeure und dabei verwendete mikroorganismus-mutante

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DE3215065A1
DE3215065A1 DE19823215065 DE3215065A DE3215065A1 DE 3215065 A1 DE3215065 A1 DE 3215065A1 DE 19823215065 DE19823215065 DE 19823215065 DE 3215065 A DE3215065 A DE 3215065A DE 3215065 A1 DE3215065 A1 DE 3215065A1
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DE
Germany
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hydroxy
oxo
mutant
mycobacterium
carboxylic acid
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DE19823215065
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DE3215065C2 (de
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Alfred Benjamin Kalamazoo Mich. Garcia
John Costain Knight
Merle Gene Wovcha
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Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 17 (20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
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Description

/3
Beschreibung
Aus der ÜS-PS 4 029 549 ist die Verwendung von Mycobacterium fortuitum NRRL Β-8Ή9 zur Herstellung von 9-Hydroxy~3-oxo-4-pregnen-20-carbonsäure [j3-hydroxybisnoracidj bekannt. Dieselbe Mutante dient gemäß der US-PS 4 035 236 zur Herstellung von 9-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion [_9-hydroxyandrostendionJ bzw. gemäß der US-PS 4 214 051 zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4-
p
pregnen-20-carbonsäuremethylester [_9-hydroxybisnoracidmethylesterj .
Aus der EP-Patentanmeldung 79 104 372.2 ist ein zweistufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung der als
Zwischenprodukt bei der Synthese wertvoller Corticoide wertvollen 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)pregnadien-20-Carbonsäure bekannt. Bei dem bekannten Verfahren erfolgt zunächst eine Umwandlung von Sterinen in 3-Oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure durch Fermentation mit dem ^ =>
Mycobacteriumstainia NRRL B-8054. Danach wird diese Verbindung durch Inkubation mit irgendeinem zur Einführung einer Hydroxylgruppe in 9cC -Stellung befähigten Mikroorganismus in 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-
carbonsäure überführt.
30
Gegenstand der Erfindung ist demgegenüber ein einstufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung des wertvollen Zwischenprodukts 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-eicarbonsäure. Dieses Verfahren wird mit Hilfe einer neuen
Mutante von M. fortuitum NRRL B-8119 durchgeführt.
Andererseits läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren b
auch mit Hilfe neuer Doppelmutanten von in der US-PS 4 029 549 genannten Mikroorganismen-Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces durchführen« Von den Mikroorganismen dieser Gattungen ist bekannte daß sie Sterine abbauen. Die wilden Stämme dieser Arten bauen Sterine nicht selektiv zu ein geringes Molekulargewicht aufweisenden Verbindungen, beispielsweise CO3 und H2O, ab« Diese wilden Stämme lassen sich gemäß Beispiel 1 der ÜS-PS 4 029 549 in Mutanten, z.B. M. fortuitum NRRL B-8119, überführen.
Die gemäß Beispiel 1 der US-PS 4 029 549 hergestellten 2Q Mutanten der genannten Arten lassen sich dann in der im folgenden geschilderten Weise zu Doppelmutanten mutieren. Letztere Mutanten, beispielsweise M0 fortuitum NRRL B-12433, eignen sich dann zur Durchführung des erfindungsgemäßen einstufigen Fermentationsverfahrens zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure.
Das erfindungsgemäße einstufige Fermentationsverfahren stellt eine deutliche Verbesserung des aus der genannten EP-Patentanmeldung bekannten zweistufigen Fermentations-Verfahrens dar.
Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alyklseitenkette und zur An-Sammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-2O-carbonsäure als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnen, erhält man durch Mutation von Mikroorganismen
der Gattungen Arthobacter, Bacillus, Brevibacterium, 5
Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.
Im folgenden wird anhand eines Beispiels die Herstellung
einer im Rahmen des erfindungsgernäßen einstufigen Fer-10
mentationsverfahrens einsetzbaren neuen Mutante näher erläutert. Bei dieser Mutante handelt es sich um M. fortuituiu NRRL B-12433. Ähnliche Mutanten von anderen Mycobacteriuin-Arten und anderen Mikroorganismen-Gattungen (vgl. oben) . p. erhält man in analoger Weise.
Herstellung einer Mutante, die als Hauptprodukt eines Sterinabbaus 9-Hydroxy-3-oxo~4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure bildet.
Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 wird in einem Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 1 g Hefeextrakt, 5 g Glyzerin, 0,1% (w/v) Tween 80 und destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 310C wachsen gelassen. Das Medium wird durch 20 minütiges Erhitzen in einem Autoklaven unter einem Druck von 103 kPa sterilisiert. Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 χ 10 pro ml wachsen gelassen und dann auf einem sterilen 0,2 μιη-Filter gesammelt. Nachdem die Zellen mit einem gleichen Volumen eines starilen 0,1 M-Natriumcitratpuffers eines pH-Werts von 5,6 mit 0,1% Tween 80 gewaschen und dann in dem halben Volumen desselben Puffers resuspendiert wurden, wird N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 100 ug/ml zugesetzt, worauf die Zellensuspension 1 h bei 310C inkubiert wird. Nun werden die Zellen mit zwei Volumina eines sterilen 0,1 M-KaIiumphosphatpuffers eines pH-Werts von 7 mit 0,1% Tween 80 gewaschen
und dann in einem Volumen desselben Puffers resuspendiert.
Ferner wird ein Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 5 g NaCl und 5 g Glyzerin und destilliertem Wasser zubereitet. Nach Zugabe von Agar in einer Menge von 15 g/l wird das Medium 20 min lang unter einem Druck von 103 kPa 0 einer Autoklaven-Behandlung unterworfen und dann in sterile Petrischalen gegossen. Danach werden die mutierten Zellen auf dem geschilderten Medium gezüchtet. Die auf den Platten gewachsenen Kolonien werden danach im Rahmen von Versuchsfermentationen auf ihre Fähigkeit zur Umwandlung von 15 Sterinen in 9-Hydroxy-3-oxo-4ir 17 (20)-pregnadien-20-carbon-/ säure getestet. Der Nachweis der gewünschten Verbindung
erfolgt durch DünnSchichtchromatographie von Methylenchloridextrakten der Versuchsfermentationen unter Verwendung von Silicagel und Methylenchlorid/Aceton/Essigsäure (212/38/1) als Lösungsmittelsystem. Auf diese Weise läßt sich die zur Ansammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-44,17 (20) pregandien-20-carbonsäure als Hauptprodukt der biologischen Umwandlung von Sterinen anhäufende Mutante NRRL B-12433 isolieren.
25
Der Schlüssel für die Isolierung einer Mutante entsprechend der beschriebenen Mutante ist, daß man mit einer Mutante, z.B. NRRL B-8119, die hinsichtlich des Steroidringabbaus bereits derart blockiert ist, daß sie StL-Hydroxyandrostendion liefert, beginnt und diesen Mikroorganismus einer zweiten Mutation, die dann einen Einfluß auf den Sterinseitenkettenabbau besitzt, unterwirft.
Die die geschilderte biologische Umwandlung herbeiführende Mutante unterscheidet sich von ihrer Mutterkultur, besipielsweise Mycobycterium fortuitum
NKRL B-8119 lediglich in ihrer Wirkung auf Steroidinoleküle. Ih sämtlichen sonstigen Eigenschaften, z.B. der Morphologie und der Chemikalienempfindlichkeit, entspricht sie der Mutterkultur, wenn sie mit dieser nicht sogar identisch ist. Beide M. fortuitum-Kulturen sind säurefeste, nicht bewegliche, nicht sporenbildende Bazillen, die zur Familie "Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales gehören. Nach der Klassifizierung von Runyon (vgl. E.H. Runyon in "Med. Clin. North America", Bd. 43, S. (1959)) handelt es sich um ein nicht chromogenes Mycobacterium der Gruppe IV, d.h. um ein bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht pigmentierter Kolonien auf relativ einfachen Medien wachsendes Mycobacterium.
M.fortuitum NRRL B-8119 und NRRL B-12433 sind in der Dauersammlung von Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt und auf Anfrage von dieser Hinterlegungstelle erhältlich.
9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure eignet sich als Zwischenprodukt bei der Herstellung wertvoller Corticoide. So läßt es sich beispielsweise gemäß den Lehren der EP-Patentanmeldung 79 104 372.2 in Hydrocortisonaacetat überführen.
3® Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher erläutern. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Angaben "Prozente" - "Gewichtsprozente". Sämtliche Verhältnisse bei Lösungsmittelgemischen stellen,
soweit nicht anders angegeben, "Volumenverhältnisse" dar. 35
Beispiel 1
Fermentation von rohem Sitosterin
Das biologische Umwandlungsmedium bzw. Biotransforma- ^Q tionsmedium enthält (pro Liter) 8,0 g ücon, 5,0 g Cere- · lose, 3,0 g NH4Cl, 3,0 g CaCO37 3,0 Na3(citrat) · 2H2O, 2,0 g Tween 80, 1,0 g Sojamehl, 0,5 g KH0PO,,, 0,5 g Harnstoff und 30,0 g rohes Sitosterin in Leitungswasser. Der pH-Wert des Mediums ist auf 7,0 eingestellt» Mit jeweils 100 ml dieses Mediums gefüllte Kolben werden mit 10 ml Saatkulturen von bei 280C in einem Medium aus (pro Liter) 8,0 g Nährbrühe, 5,0 g Glyzerin, 1,0 g Hefeextract und 1,0 g Tween 80 in destilliertem Wasser (pH-Wert: 7,0) gezüchtetem M. fortuituxn NRRL B-12433 beimpft. Danach werden die Kulturen 336 h lang bei einer Temperatur von 280C auf einem Drehrüttler inkubiert. Nach der Inkubation wird entsprechend Beispiel 3 das Gemisch extrahiert und das Produkt isoliert.
Beispiel 2
Entsprechend Beispiel 1 werden anstelle von Sitosterin andere Sterinsubstrate in roher oder reiner Form, z.B.
Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet»
Beispiel 3
Isolierung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure aus M. fortuitum NRRL B-12433-Fermentation
1200 ml Fermentationsbrühe aus der mit Hilfe von M. fortuitum NRRL B-I2433 durchgeführten biologischen Sitosterinumwandlung werden angesäuert und zweimal mit gleichen Volumina Methylenchlorid extrahiert, wobei 29,2 g bzw. 8,9 g Rohextrakt erhalten werden.
Der erste Extrakt wird erneut in Methylenchlorid gelöst, worauf die alte Lösung mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen wird. Die wäßrigen Waschwässer werden gesammelt, unit verdünnter (4-N) HCl angesäuert und mit Methylenchlorid rückextrahiert. Der Extrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Beim Verdampfen des Lösungsmittels erhält man einen gelben Feststoff, der mit Methylenchlorid verrieben wird. Hierbei erhält man ein fahlgelbes Pulver. Dieses wird aus einem Gemisch aus Methylenchlorid und Methanol zur Kristallisation gebracht, wobei drei verschiedene Chargen, nämlich a) 3,8 g b) 2,1 g und c) 2,8 g, erhalten werden. Aufgrund einer Untersuchung durch Kernresonanzspektralphotometrie ergibt sieht, daß es sich hierbei um Ge-
mische der Säuren mit der & l '-Dehydroverbindung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure in Konzentrationen von 90%, 35% und 10% handelt.
Beim dreimaligen Umkristallisieren der ersten Charge aus Methylenchlorid/Methanol erhält man 1,8 g 9-Hydroxy-3-OXO-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure eines Fp von
240° bis 242°C und einer Drehung &Πvon 40,7° in Methanol, Das Massenspektrum zeigt ein Molekülion bei m/e 358
Beispiel 4
Beim Ersatz von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 im Rahmen des beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von M. fortuitum NRRL B-12433 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium,Nocardia, Protamiobacter, Serratia oder Streptomyces erhält man Mikroorganismus-Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit C-17 Seitenkette und zur Ansammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-
carbonsäure als Hauptprodukt (der Fermentation) auszeichnen.
Beispiel 5
Ersetzt man in Beispiel 1 M. fortuitum NRRL B-12433 durch gemäß Beispiel 4 hergestelle Mutanten, erhält man ebenfalls 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure.

Claims (6)

Patentansprüche
1. Einstufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
CH3 COGH
dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante der Mikroorganismen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia oder Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit einer C-17-Seitenkette und zur Anhäufung von 9-Hydroxy-3-OXO-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnet, unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit eines Steroids mit C-17-Seitenkette in einem wäßrigen Nährmedium züchtet.
2. Verfahren nac'i Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine. Mycobacterium-Mutante züchtet.
3. Verfahren nach Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 züchtet un<5 das gewünschte Produkt reindarstellt.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züch-
tung der Mutante in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehreren Steroiden durchführt=
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet„ daß man die Züchtung in Gegenwart von Sitosterin,, Cholesterin, Stigmasterin und/oder Campesterin durchführt»
6. Mycobacterium fortuitum NRRL B=I2433„
DE19823215065 1981-05-11 1982-04-22 Einstufiges fermentationsverfahren zur herstellung von 9-hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsaeure und dabei verwendete mikroorganismus-mutante Granted DE3215065A1 (de)

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Publications (2)

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GB (1) GB2098218B (de)
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