DE3105121C2

DE3105121C2 - 1-(Phenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Verbindungen, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE3105121C2
Application number: DE3105121A
Authority: DE
Inventors: Shiyoichiro Miyahara; Yutaka Okazaki; Hiroshi Mobara Chiba Tokuda; Yoshitsugu Oomuta Fukuoka Yamada
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1981-02-12
Publication date: 1987-01-02
Also published as: GB2069496B; JPS6332765B2; IT8147788A0; FR2476082A1; JPS56127370A; DE3105121A1; FR2476082B1; IT1170714B; US4446133A; GB2069496A

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine neue Piperazin-Verbindung der allgemeinen Formel (I) (1. Formel) worin X für ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Alkoxy-, Carboxy- oder Alkoxycarbonyl-Gruppe oder eine R ↑3-CO-Gruppe steht, worin R ↑3 für eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, R ↑1 für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe und R ↑2 für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe steht. Diese Verbindung ist als Immunverstärker gegen chronisch rheumatoide Arthritis und für die Immuntherapie von Krebs von Wert.

Description

worin X wie oben definiert ist, mit einem Amin der Formel (HI)
C₂H₅

^HN (Hl)

oder ein 1 -Phenylpiperazin der allgemeinen Formel (I V)

^X~O~^N' ^{NH (IV)}

worin X wie oben definiert ist, mit Diäthylcarbamoylchlorid der Formel (V) C₂H₅

CICN (V) f

Il \ f?

O C₂H₅ <3

kondensiert wird und gegebenenfalls die so erhaltenen Verbindungen mit einer anorganischen oder organischen Säure in das entsprechende Salz überführt werden. Pi 3. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit den pharmazeutisch üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

Beschreibung

Die Erfindung betrifft den Gegenstand der Ansprüche.

Das Arzneimittel wird als Immunverstärker gegen chronisch rheumatoide Arthritis und zur Immuntherapic von Krebs verwendet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden nach der durch das folgende Reaktionsschema veranschaulichten Umsetzung erhalten:

S-N &Ngr;—C-Cl+ HN

C₂H₅ \

O C₂H₅

(&Pgr;&Igr;)

C₂H,

C₂H₅

(IV)

NH + ClCN

Il ^v &ogr;

(V)

C:Hs

Im einzelnen findet die Umsetzung durch Kondensieren, wenn gewünscht, in einem inerten Lösungsmittel, wie Melhylenchlorid, Chloroform, Benzol oder Toluol statt. Sie erfolgt bei etwa 0 bis etwa 120° C und ist in 1 bis 5 Stunden im wesentlichen beendet.

Die Verbindung der allgemeinen Formel (I), nach der obigen Umsetzung erhalten, kann nach einem herkömmlichen Verfahren isoliert und gereinigt werden, z. B. einem Verfahren, bei dem das Reaktionsgemisch mit einer verdünnten Säure extrahiert, der Extrakt zur Freisetzung der gewünschten Verbindung alkalisch gemacht und unter verminderten Druck destilliert wird. Ferner kann ein Verfahren gewählt werden, bei dem das Produkt in Form eines Säureadditionssalzes gereinigt und dieses dann mit geeignetem Alkali behandelt wird, um eine freie Base zu erhalten.

Die Verbindung der allgemeinen Formel (N) oder (V) kann nach einem bekannten Verfahren hergestellt werden, z. B. einem Verfahren, bei dem eine entsprechende Aminoverbindung mit Phosgen umgesetzt wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben pharmakologische Wirksamkeit. Es wurde gefunden, daß sie hohe immunaktive Wirkung haben. Die Toxizität der Verbindungen ist sehr gering. Sie sind daher als Arzneimittel sehr wertvoll.

Bekannt ist, daß Diäthylcarbamazin immunverstärkende Wirkungen besitzt (vgl. C. A. 70 [1969], 56 183 z, C. A. 76 [1972], 81 242 z und C. A. 85 [1976], 87 247 n), jedoch mit anderer Wirkungsrichtung und Intensität der Wirkungen als bei den erfindungsgemäßen Verbindungen, die der in gleich hoher Dosis zum Vergleich hei angezogenen, gut wirksamen Verbindung Levamisol überraschend überlegen sind.

Dieser Umstand wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Tests im einzelnen beschrieben:

Zur Bestimmung der immunverstärkenden Wirkung sind verschiedene Testsysteme unter Verwendung von Tieren vorgeschlagen worden. Nachfolgend werden nun Ergebnisse des Tests zur Verstärkung der verzögerten Überempfindlichkeit, unter diesen Tests ein typischer Test, beschrieben.

Die verzögerte Überempfindlichkeit, induziert, wenn Picrylchlorid (2-Chlor-l,3,5-trinitrobenzol) auf die Haut einer Maus aufgebracht wird, ist als typische Zeilimmunität bekannt und stellt eines der Testsysteme dar, die weltweit verarbeitet gewählt werden (vgl. Asherson, G. L. und Ptak, W.: Contact and Delayed Hypersensitivity in the Mouse I, Active Sensitization and Passive Transfer, Immunology 15,405—416 [1968]).

Dieses System wurde bei dem Test auf Verstärkung der verzögerten Überempfindlichkeit angewandt.

Test 1 (Test auf Verstärkung der verzögerten Überempfindlichkeit)
Testarbeitsweisen

Eine Gruppe von acht männlichen ICR-Mäusen, jede mit einem Körpergewicht von etwa 30 g, wurde für den Test verwendet.

Die Sensibilisierung erfolgte durch Aufbringen einer 7°/oigen Lösung von Picrylchlorid in einem 4/1-Gemisch aus Olivenöl und Aceton auf dem rasierten Unterleib der Maus.

Gleichzeitig mit der Sensibilisierung wurde eine Lösung oder Suspension der prfjnd'jngsgemäßen Verbindung in ö,2%iger Lösung von Carboxymethylcellulose in einer physiologischen Salzlösung der Maus oral in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Ähnlich wurde der Kontrollgruppe eine 0,2%ige Carboxyme-Ihylcellulose-Lösung in physiologischer Salzlösung verabreicht.

Die verzögerte Überempfindlichkeit wurde 7 Tage nach der Sensibilisierung auf die Probe gestellt, indem das Ohr der Maus mit einer Pinzette oder Zange gegriffen wurde, die mit einem mit einer 1%igen Lösung von Picrylchlorid in Olivenöl imprägnierten Filz belegt war, und das Ohr mit der Lösung überzogen wurde. Die Dicke des Ohres wurde davor und 24 Stunden danach gemessen, und das Verhältnis der Dickenzunahme (Durchschnittswert beider Ohren bei acht Mäusen ± Standardabweichung) wurde erhalten, wie in Tabelle I

gezeigt

Zum Vergleich erfolgt der Test ähnlich unter Verwendung von Levamisol-Hydrochloi id, und auch diese erhaltenen Ergebnisse zeigt Tabelle I. F ■ f-Tests wurden durchgeführt Die Gruppe, in der das Testergebnis bei einem Wert von /*<0,05 signifikant war, wurde durch ^# markiert, und die Gruppe, bei tier das Testergebnis bei einem Wert von P<0,0\ siginifikant war, wurde mit^#* markiert

Ergebnisse

Wenn die erfindungsgemäße Verbindung gleichzeitig mit der Sensibilisierung verabreicht wurde, wurde die &iacgr;&ogr; durch die Herausforderung verursachte Überempfindlichkeit verstärkt, und der verstärkende Einfluß war höher als der durch Levamisol erzielte.

So wurde bestätigt daß die erfindüngsgemäße Verbindung eine die Zeilimmunreaktion aktivierende Wirkung (immunverstärkende Wirkung) bei Mäusen hat und diese Wirkung ist höher als die von Levamisol.

Tabelle I

Testergebnisse zur Verstärkung der verzögerten Überempfindlichkeit

20 Verbindung

Verhältnis der Ohr-Dickenzunahme

(Durchschnittswert

± Standiirdubweichtinn (%))

²⁵ Kontrolle

CH₃O-

C₂H₅ /

-N N —C —N X Hydrochlorid

^ Il \

O C₂H₅

C₂H₅

H₅C₂OOC-

-N N —C —N

29.6 ± 1.9

44.0 ± 5.0* 42.3 ± 3.7** 40.1 ±4.2* 39.1 ±4.0*

HOOC

CH₃CO

O	C₂ \	C₂H₅
C-N &Mgr;	H₅
Il O	\ C₂H₅
C-N	C. I
Il 0	C;
	;H₅
-H₅

37.7 ±3.0* 38.8 ± 3.5*

_fe5 Levamisol-Hydrochlorid

Die durch Injektion eines Mycobacterium tuberculosis-Adjuvans verursachte Adjuvans-Arthritis in Ratten wird häufig als Modelltest für chronisch rheumatoide Arthritis beim Menschen herangezogen.

Der Mechanismus für das Inerscheinungtreten dieser Krankkeit ist nicht vollständig geklärt worden, bekannt ist aber, daß die Zellimmunität eine wichtige Rolle spielt. Die immunverstärkende Wirkung der erfindungsgemä-Bcn Verbindung wurde nach diesem bekannten Adjuvans-Arthritis-Test getestet.

Test 2 (Adjuvans-Arthritis-Test, Tabelle 11) Testarbeitsweisen

Eine Gruppe von 10 männlichen, 9 Wochen alten SD-Ratten wurde für diesen Test verwendet. In 0,1 ml flüssigem Paraffin wurden 0,4 mg trockene, tote Zellen von Mycobacterium tuberculosis suspendiert, und die Suspension wurde unter der Fersenhaut der rechten Hinterpfote injiziert. Die erfindungsgemäße Verbindung wurde neunmal insgesamt vor und nach der Injektion des Adjuvans subkutan verabreicht. Die Testverbindung wurde in einer physiologischen Salzlösung gelöst und in einer Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Das Schwellungsvolumen des linken Hinterbeins wurde in der Zeit vom Tag der Injektion bis zum Tag der Beendigung des Tests gemessen und das Schwellungsverhältnis errechnet.

Zum Vergleich erfolgte der Test ebenso unter Verwendung von Levamisol-Hydrochlorid. Tabelle II zeigt die erhaltenen Ergebnisse. F ■ f-Tests wurden mit den erhaltenen Testergebnissen durchgeführt. Die Gruppe, in der das Testergebnis bei einem Wert von P<0,05 signifikant war, wurde durch * markiert, und die Gruppe, bei der das Testergebnis bei einem Wert von P<0,01 signifikant war, wurde durch ** markiert.

Ergebnisse

Die Sekundärentzündung der Adjuvans-Arthritis wurde durch die erfindungsgemäße Verbindung bemerkenswert gesteuert, und die Wirkung war im Hinblick auf die Kontrollgruppe, der keine Verbindung verabreicht worden war, statistisch signifikant. Die Wirkung durch die erfindungsgemäße Wirkung war höher als die von Levamisol, das als Vergleichsverbindung verwendet wurde, zwischen den beiden Verbindungen besteht aber kein statistisch signifikanter Unterschied. So wurde bestätigt, daß die erfindungsgemäße Verbindung eine immunmodulierende Aktivität und eine antiarthritische Wirkung hat, und diese Wirkungen sind höher als die von Levamisol.

Tabelle II

Ergebnisse des Adjuvans-Arthritis-Tests Verbindung

Schwellungsverhältnis

(Durchschnittswert ± Standardabweichung,"/,,)

15 Tage 18 Tage 21 Tage

Kontrolle

84.4 ± 9.0 103.2 ± 9.7 107.5 ± 13.3

C₂H₅

-N N — C — N X Hydrochlorid 47.0 ± 8.0** 52.4 ± 9.2** 59.8 ±12.1"

^ Il \

O C₂H₅

C₂H

₂H₅

^-N N—C—N

O C₂H₅

57.9 ±11.1 55.7 ± 9.7** 62.8 ± 10.9*

C₂H₅

CH₃O-

-N N-C-N x Hydrochlorid 60.1 ± 11.3 57.1 ± 8.8** 64.4 ± 10.5*

O C₂H₅

N —C —N 63.7 ±12.0 60.4 ±9.2** 66.9 ±11.1

Il \

O C₂H₅

C₂H₅ UOOC-^f V—N N —C —N

^ Il \

O C₂H₅

C₂H₅ 65.0 ± 10.2 64.6 ± 7.9** 70.8 ± 10.7*

CH₃CO

N N-C-N

x Hydrochlorid 61.4 ± 10.4 62.2 ± 8.8** 68.4 + 12.0*

O C₂H₅

Levamisol x Hydrochlorid

65.2 ±5.9 69.3 ±7.1* 80.7 ±9.6

Wie in den Tests 1 und 2 veranschaulicht, ist die erfindungsgemäße Verbindung als Immunverstärker sehr wirksam, und daher ist sie als Heilmittel für Krankheiten wirksam, die von einer Herabsetzung oder anomalen Änderung der Immunfunktionen begleitet werden, z. B. von Autoimmun-Erkrankungen, wie chronisch rheumatoidcr Arthritis.

Als Immuntherapie für Krebs kann ein Verfahren angesehen werden, bei dem eine spezifische oder nicht-spe-/ifischc Immunreaktion, durch den krebsträchtigen Zustand herabgesetzt, durch die eine oder die andere Reaktion verstärkt wird und dem lebenden Körper die Widerstandsfähigkeit gegenüber Krebs erteilt wird, um dem Krebs abzuhelfen. Die Beteiligung von Makrophagen bei einer solchen Reaktion ist unausweichlich. Im einzelnen (1) hat der aktivierte Makrophage eine krebszellvermittelnde Zytotoxizität, (2) ist der Makrophage eine der Einflußverstärkerzellen für die Antikörper-abhängige, zellvermittelnde Zytotoxizität und (3) wenn eine spezifische Immunität gegenüber Krebszellen aufgebaut ist und tötende T-Zellen induziert sind, sollte das Krebs-Antigen auf den Krebszellen übertragen werden auf die T-Zellen und als Antigen erkannt werden. Zu diesem Zweck werden die durch die Reaktionen (1) und (2) vermittelten Krebszellen vom Makrophagen phagozytisiert. Der Makrophage ist also sehr wichtig für die Immuntherapie des Krebses.

Die Teslergebnisse zur Wirkung des erfindungsgemäßen wirksamen Bestandteils auf den Makrophagen werden nun unter Bezugnahme auf den folgenden Test 3 beschrieben. Insbesondere wurden der abgetrennte Makrophage und EL-4-Leukämie-Zellen gemischt und gezüchtet, und ³H-Thymidin wurde einem Kulturmedium zugesetzt und die Menge von in die EL-4-Zelle eingebautem ³H-Thymidin bestimmt, um die Aktivität des Makrophagen zu prüfen. Wenn der Makrophage durch Verabreichen des wirksamen Bestandteils gemäß der Erfindung aktiviert ist, wird eine Hemmung des Wachstums der EL-4-Zelle, d. h. Phagozytose der Krebszelle durch den Makrophagen, beobachtet. Wenn also die Menge des aufgenommenen ³H-Thymidins gemessen und diese Menge verringert ist, ist bestätigt, daß der Makrophage aktiviert worden ist.

Test 3 (in-vitro-Test der Hemmung des Wachstums von Krebszellen durch Makrophagen)

Testarbeitsweisen

Einer Gruppe von drei weiblichen ddY-Mäusen (mit einem Körpergewicht von 25 g) wurden 0,5 ml einer Suspension von 2 mg des wirksamen Bestandteils gemäß der Erfindung in 5 ml einer physiologischen Salzlösung intrapcriloneal verabreicht. Die Dosis war 8 mg/kg Körpergewicht. Ähnlich wurde einer Kontrollgruppe eine physiologische Salzlösung verabreicht. Nach 4 Tagen wurden abgeschiedene Unterleibzellen gesammelt und auf eine Kunststoff-Petrischale gebracht, um Makrophagen zu sammeln.

Dann wurden 1 &khgr; 10⁶ der so erhaltenen Makrophagen und 1 &khgr; 10⁵ EL-4-Leukämie-Zellen einer C57 BL/6J-Maus gemischt und in einem RPMI-1640-Kulturmedium gezüchtet, dem 10% Rinderembryonalserum zugesetzt wurden (bei 37°C in Gegenwart von 5% CO2), und zwar für 24 Stunden. Dann wurde 0.1 &mgr; Ci ³H-Thymidin zugesetzt und 16 Stunden weiter kultiviert. Zellen wurden aus dem Kulturmedium auf einem Filter gesammelt und die aufgenommene Menge an ³H-Thymidin durch einen Flüssig-Szintillationszähler bestimmt. Das Aufnahmeverhältnis (%) wurde nach folgender Formel berechnet:

(ZahlderZählimpulse (ZahlderZählimpulse

im Falle der Mischkultur) - im Falle derEinzelkultur

Aufhahmcvcrhältnis(%) = von Makrophagen) _&khgr; _m%

Zahl der Zählimpulse der Einzelkultur von EL-4-Zellen)

Der Durchschnittswert (%) in einer Gruppe von drei Mäusen wurde bestimmt, um die in Tabelle III wiedergegcbenen Ergebnisse zu erhalten. Zum Vergleich erfolgte der Test ähnlich unter Verwendung von Levamisol-Hydrochlorid.

Ergebnisse

Es bestätigte sich, daß der wirksame Bestandteil gemäß der Erfindung die Aufnahme von 'H-Thymidin durch EL-4-Leukämie-Zelleri hervorragend hemmt, während Levamisol-Hydrochlorid eine solche Wirkung nicht zeigt.

Im einzelnen wurde bestätigt, daß der wirksame Bestandteil gemäß der Erfindung den Makrophagen dazu aktiviert, eine Phagozytosis von Krebszellen zu bewirken, während Levamisol eine solche Wirkung kaum zeigt.

	der	Hemmung	des	Wachstums	31	05 121	Makrophagen	Aufnahmeverhältnis (Durchschnittswert, %)
Tabelle III
In-vitro-Test				von	Krebszellen durch
Verbindung

Kontrolle

C₂H₅

-N &Ngr; —C-N X Hydrochlorid

-s Il \

O C₂H₅

C₂H₅

-N &Ngr; —C-N

O C₂H₅

C₂H₅ CH₃O-< >—N &Ngr; —C-N X Hydrochlorid

^w Il \

O C₂H₅

C₂H₅

H₅C₂OOC-

-N N —C —N

Il \

O C₂H₅

C₂H

₂n₅

HOOC

-N &Ngr; —C-N

^ Il \

O C₂H₅

C₂H₅

CH₃CO-

-N N —C —N

Il \

O C₂H₅

X Hydrochlorid

Levamisol x Hydrochlorid

80.2

24.4

20.5

27.7

30.3

29.8

27.4

49.0

Nun werden unter Bezugnahme auf die folgenden Tests 4 und 5 die Ergebnisse der Bekämpfung von Krebs bei Tieren durch den wirksamen Bestandteil gemäß der Erfindung beschrieben.

Test 4 (Test uf Antitumor-Wirkung gegenüber Sacroma 180 durch orale Verabreichung)

Testarbeitsweisen

Line Gruppe von sechs weiblichen ICR-Mäusen wurde intradermal mit 2x10" Sarcoma 180-Zellen beimpft, und während einer Zeit von 10 Tagen nach Ablauf von 24 Stunden wurde eine Lösung oder Suspension der wirksamen Verbindung in einer physiologischen Salzlösung in einer Dosis von 0,1 ml/10 g Körpergewicht einmal &kgr; pro Tag oral verabreicht Der Kontrollgruppe wurde eine physiologische Salzlösung ebenso verabreicht. Die Dosis der Verbindung betrug 100 mg/kg Körpergewicht. Der Durchmesser D (mm) des Tumors wurde gemessen, und der Durchschnittswert und die Anzahl N der lebenden Mäuse wurde bestimmt, um die in Tabelle IV wiedergegebenen Ergebnisse zu erhalten.

Ergebnisse

Die eingeimpften Tumorzellen wurden hochgezüchtet und wuchsen zu festen Tumoren. Wurde jedoch der wirksame Bestandteil gemäß der Erfindung wiederholt oral verabreicht, wurde die Größe des Tumors verringert, oder er verschwand. 2C

Zum Vergleich wurde der Test unter Verwendung von Levamisol-Hydrochloiid ebenso durchgeführt, es wurde aber keine wesentliche karzinostatische Wirkung beobachtet.

Tabelle IV

Test auf karzinostatischen Einfluß auf Sarcoma 180 durch orale Verabreichung

Verbindung Zeit (Wochen)

0 2 4 6 8 10

Kontrolle

C₂H₅ /

V_N N —C —N x Hydrochlorid

^w Il \

O C₂H₅

C₂H₅

D - 10.6 15.2 22.4 31.5 37.6 N 6 6 6 6 5 1

D - 7.8 6.6 3.7 0.9 0 ,V 6 6 6 6 6 6

D - 7.1 5.8 3.0 0 0 N 6 6 6 6 6 6

C₂H₅

-N N-C-N x Hydrochlorid

O C₂H₅

C₂H₅

H₅C₂OOC

D- 8.1 4.6 5.0 2.2 N 6 6 6 6 6 6

Z) - 9.2 7.4 4.8 3.2 0 N 6 &bgr; 6 6 6 6

D - 6.8 3.5 4.4 2.2 0 iV 6 6 6 6 6 6

C₂H₅

CH₁CO

N N-C-N

x Hydrochlorid

O C₂H₅

Levamisol x Hydrochlorid

Anmerkung:

D: Durchschnittlicher Durchmesser (mm) des Tumors. .V: Anzahl der lebenden Mäuse.

D - 8.4 4.7 5.1 6.6 0

N 6 6 6 6 6 6

D - 10.2 16.2 20.7 29.6 28.

N 6 6 6 6 6 3

10

ti i,

Test 5 (Test auf Antitumor-Einfluß auf Sarcoma 180 durch subkutane Verabreichung)

Testarbeitsweisen

Der Test erfolgte in der gleichen Weise, wie in Test 4 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die wirksame 5 Verbindung subkutan verabreicht und die Dosis zu 20 mg/kg Körpergewicht geändert wurde.

Ergebnisse

Die Änderung des Durchmessers £>(mm) des Tumors und die Anzahl der lebenden Mäuse wurde geprüft, um io die Tabelle V wiedergegebenen Ergebnisse zu erhalten. Wenn die Dosis V5 der im Falle oraler Verabreichung
gewählten Dosis war, konnte der gleiche Einfluß erzielt werden, wie bei oraler Verabreichung. Im Gegensatz
dazu hatte Levamisol-Hydrochlorid keine wesentliche karzinostatische Aktivität.

Tabelle V

Test auf Antitumor-Einfluß auf Sarcoma 180 durch subkutane Verabreichung

Verbindung

Zeit (Wochen)

0 2 4 6 8 IO

Kontrolle

CI-<

CH₃O-

CH₅ / -N N — C — N x Hydrochlorid

Il \

O C₂H₅

C₂H₅

-&ngr;' "&ngr;—c—n Il \

O C₂H₅

C₂H₅ -N N-C-N X Hydrochlorid

Il \

O C₂H₅

C₂H₅

CH₃CO^f 5^N N-C-n'

&khgr; Hydrochlorid

O C₂H

2"5

Levamisol-Hydrochlorid

Anmerkung:

D Durchschnittlicher Durchmesser (mm) des Tumors. &Lgr; . /\ii7uhl der lebenden Miiuso.

D - 10.8 16.6 20.3 31.3 40.5 //6 6 6 6 4 1

D - 2.9 4.1 4.8 1.0 0 N 6 6 6 6 6 6

D - 2.3 2.1 3.8 0 0 &Lgr;' 6 6 6 6 6 6

D - 3.0 1.0 2.2 5.3 W 6 6 6 6 6 6

D - 3.2 3.4 3.8 2.5 N 6 6 6 6 6 6

D- 2.1 4.4 4.8 3.9 0 <V 6 6 6 6 6 6

D- 4.1 7.7 8.5 4.3 0

N 6 6 6 6 6 6

D - 7.7 14.8 14.4 30.2 31.6

&Lgr;' 6 6 6 6 3 2

Sicht in a &eegr; die bei den Tests 4 und 5 erhaltenen Ergebnisse /iisummcn mit den bei den Tests 1 und 3 erhaltenen Ij^ebnissL·. zeigt sich, daß der wirksame Bestandteil gemäß der Erfindung die immunisierende Funktion des Krebs in sich tragenden Wirtes aktiviert und somit eine Antitunior-Aktivität zeigt. Der Antitumor-Einfluß der erfindungsgemäßen Verbindung ist viel höher als der von Lcvamisol. :

Die Toxizität der erfindungsgemäßen wirksamen Verbindung wird nun unter Bezugnahme auf den folgenden Test 6 beschrieben.

Test 6: Test auf akute Toxizität bei oraler Verabreichung (ausgeführt mit sämtlichen Verbindungen nach der

Erfindung gemäß den vorangegangenen Tabellen) &kgr;

Testarbeitsweisen

Eine Lösung oder Suspension der Verbindung in physiologischer Salzlösung wurde einer Gruppe von drei männlichen ddY-Mäusen oral verabreicht, und nach 7 Tagen wurde der geschätzte LD-_)U-Wert ermittelt. &igr;:

Ergebnisse

Der geschätzte LDm-Wert des erfindugnsgemäß wirksamen Bestandteils lag im Bereich von 600 bis 1500 mg/ kg, was viel höher ist als der geschätzte LDso-Wert von Levamisol-Hydrochlorid. der im Bereich von 150 bis 2( 200 mg/kg lag. So wurde bestätigt, daß die Toxizität der erfindungsgemäßen Verbindung sehr gering ist.

Wird die erfindungsgemäße Verbindung als Arzneimittel verwendet, kann sie in Form einer freien Base verwendet werden. Im Hinblick auf die Stabilität und die Bequemlichkeit der Zusammenstellung eines Arzneimittels jedoch wird die Verbindung bevorzugt in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, z. B. eines Hydroehlorids, eines Citrats oder eines Phosphats, verwendet, insbesondere, wenn, wie im Falle einer Injektion, 2: Wasscrlöslichkeit gefordert wird.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann in Form einer üblichen Rezeptur gemäß einer üblichen Methode, wie sie für herkömmliche Immunverstärker- oder Antitumormitte! angewandt wird, verabreicht werden Beispielsweise kann als Präparat für orale Verabreichung eine Kapsel, Granulat, eine Pille, ein feines Granulat, eine Tablette und ein Sirup erwähnt werden. Ferner eignet sich ein Suppositorium zur direkten rektalen Verabreichiing. Ferner kann eine Injektion für intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung eingewandt werden.

Der crfindungsgemäße Immunverstärker kann zur Abhilfe bei Krankheiten verwendet werden, die von einer Herabsetzung oder einer anomalen Änderung der Immunisierungsfunktion begleitet werden, z. B. bei Autoimmunerkrankungen, wie chronisch rheumatoider Arthritis und multipler Myositis.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Beispiel 1
i-Phenyl-4-diäthylcarbamoylpiperazin

In 70 ml ('loroform wurden 12.0 g (0.074 Mo!) 1-Pheny!piperazin bei Raumtemperatur gelöst, und eine Lösung von 10,9 g (0.08 Mol) Diäthylcarbamoylchlorid in 30 ml Chloroform wurde der obigen Lösung über 30 Minuten zugetropfl. Dann wurde das Gemisch 5 Stunden bei 40⁰C gerührt und darauf gekühlt. Die ausgefallenen weißen Kristalle wurden entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und 50 ml einer 25°/oigen wäßrigen Natronlauge zugesetzt. Das Gemisch wurde zweimal mit 50 ml Benzol extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde destillativ entfernt, um rohes i-Phenyl-4-diäthylcarbamoylpiperazin als Rückstand zu erhalten. Durch Destillieren unter vermindertem Druck wurden :i,7 g eines gcreinigicn Produkts mit einem Siedepunkt von 180.5⁰C bei 2,3 mm Hg erhalten. Die Ausbeute betrug 29.5%. Die Elcmentaranalysenwerte waren wie folgt:

Berechnet ^Jr

C = 68,93%; H =8,87%; N = 16,08%;
gcf.:

C =68.74%; H =8,94%; N = 15,70%.

Beispiel 2
i-Phenyl-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid

In 50 ml Chloroform wurden 2,6g (0,01 Mol) l-Phenyl-4-diäthylcarbamoylpiperazin bei Raumtemperatur gelöst, und die Lösung wurde mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt und eine gewisse Zeit geruht. Das lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck destillativ entfernt. Dann wurden 50 ml Aceton dem Rückstand /ugcscizt und das Gemisch eine bestimmte Zeit gerührt. Der ausgefallene kristalline Niederschlag wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen, in 50 ml Aceton gerührt, um die Waschwirkung zu erhöhen, und zu 2.1 g 1 -Phenyl^-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid mit einem Schmp. von 190- 192"C getrocknet Ausbeute 70,9%.

Elementaranalyse:
ber. für Ci5H₂₄N₃OCI:

C = 60,49%: H = 8.I2%: N = 14,11%; Cl = ll,91%;
gef.:
C =60,63%; H = 8.24%; N = 14,09%; CI = 11,93%.

Beispiel 3
l-(4-Chlorphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin

In 40 ml Methylenchlorid wurden 4,0 g (0,02 Mol) l-(4-ChIorphenyl)-piperazin bei Raumtemperatur gelöst. Dann wurde eine Lösung von 3,0 g (0,022 Mol) Diäthylcarbamoylchlorid in 30 ml Methylenchlorid über 30 Minuten zur obigen Lösung getropft und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Niederschlag wurde entfernt und das Filtrat durch Zugabe von 30 ml einer 35%igen wäßrigen Lösung von NaOI I alkalisch gemacht und mit 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel destillativ unter vermindertem Druck entfernt, um rohes l-(4-Chlorphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin als Rückstand zu erhalten. Die tiefsiedende Komponente wurde destillativ unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand aus &eegr;-Hexan zu 1,8 g eines gereinigten Produkts mit einem Schmp. von 63 -64⁵C umkristallisiert. Ausbeute 29,9%.

Elementaranalyse:
ber. TUrC₁₅H₂₂N₃ClO:

C = 60,89%; H = 7,51%; N = 14,21%; Cl = ll,98%;
gef.:

C = 60,56%; H = 7,70%; N = 13,96%; Cl = 11,68%.

Beispiel 4
l-(4-Methoxyphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin

In 75 ml Chloroform wurden 10,4 g (0,054 Mol) l-(4-Methoxyphenyl)piperazin bei Raumtemperatur gelöst, und eine Lösung von 7,4 g (0,054 Mol) Diäthylcarbampylchlorid in 50 ml Chloroform zur obigen Lösung über 30 Minuten zugetropft. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 50⁰C gerührt, die unlösliche Substanz entfernt, das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und 100 ml einer 35%igen wäßrigen Natronlauge und 300 ml Äther dem Konzentrat zugesetzt. Das Gemisch wurde eine bestimmte Zeit gerührt und die Ätherschicht mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck destillativ entfernt, der Rückstand wurde durch Kieselgelchromatographie und Destillation unter vermindertem Druck gereinigt, um 7,4 g gereinigtes 1-(4-Methoxypheny!)-4-diäthylcarbamoylpiperazin mit einem Sdp. von 195"C/0,5 min Hg zu erhalten. Ausbeute 47.0%.

Elementaranalyse:
ber. für Ci₆H₂₅N₃O₂:

C = 65,95%; H = 8.65%: N = 14,42%:
gef.:
C = 65.71%: H = 8.77%; N = 14,38%.

Beispiel 5

1 -^-Methoxyphenyl^-diäthylcarbamoylpiperazin- Hydrochlorid

In 50 ml Chloroform wurden 2,9 g (0,01 Mol) l-(4-MethoxyphenyI)-4-diäthylcarbamoylpiperazin gelöst und die Lösung mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt und 3 Stunden bei 40⁰C gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck destillativ entfernt. Der Rückstand wurde mit 30 ml eines Lösungsmitlclgemischs aus Äthylacetat und Methanol gemischt. Die unlösliche Substanz wurde entfernt und der kristalline Niederschlag abfiltriert, um 1.7 g l-^-Methoxyphenyl^-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid mit einem Schmp. von 174-184^CCzu erhalten. Ausbeute 52,1%.

Elementaranalyse:
ber. für Ci 6H₂₆N₃O₂CI:

C = 58,61%; H = ,799%; N = 12,82%: Cl = 10,82%;
W) gef·:

C = 58,00%; H = 7.96%: N = 12,57%: Cl=10.59%.

Beispiel 6
hi l-^-Äthoxycarbonylphcnyl^-diäthylcarbamoylpiperazin

In 90 ml Chloroform wurden 3,6 g (0,0152 Mol) l-(4-Äthoxycarbonylphenyl)piperazin bei Raumtemperatur gelöst. Die Temperatur wurde auf 50⁰C erhöht, und eine Lösung von 1,54 g (0,0114 Mol) Diäthylcarbiimoylchlo-

rid in 45 nil Chloroform wurde in 30 Minuten zu obiger Lösung getropft. Das Gemisch wurde erwärmt und 2 Stunden rückflußgekocht, die unlösliche Substanz entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert. Der Rückstand wurde mit 50 ml einer 35%igen wäßrigen Natronlauge gemischt. 200 ml Toluol wurden zugesetzt und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die wäßrige Schicht wurde entfernt und die organische Schicht mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck deslillaliv entfernt. Der Rückstand wurde mit 20 ml Benzol vermischt und das Gemisch eine bestimmte Zeit gerührt. Die Benzol-unlösliche Substanz wurde entfernt und das Filtrat der Kieselgelchromatographie unterworfen, um 3,6 g t-(Äthoxycarbonylphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin mit einem Schmp. von 77 —82^CC zu erhalten.

Elementaranalyse:

C = 64,84%; H =8,16%; N = 12,60%;
gcf.:

C = 64,82%; H =8,34%; N = 12,53%.

Beispiel 7
l-(4-Carboxyphenyl)-4-diäthylcaramoylpiperazin

Zu 3,3 g (0,01 Mol) l-^-Äthoxycarbonylphenyl^-diäthylcarbamoylpiperazin, in Beispiel 6 erhalten, wurden 90 ml Äthanol, 10 ml Wasser und 1,0 g Natriumhydroxid gegeben und das Gemisch wurde erhitzt und unter Ruhen 3,5 Stunden rückflußgekocht. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck destillativ entfernt, 100 ml Wasser wurden dem Rückstand zugesetz und die unlösliche Substanz entfernt. Der pH-Wert des Filtrats wurde mit 2 &eegr; Salzsäure auf 3 eingestellt.

Der Niederschlag wurde abfiltriert und in einer verdünnten wäßrigen Natronlauge gelöst, der pH-Wert wieder mit 2 &eegr; Salzsäure auf 3 eingestellt. Der Niederschlag wurde aus Methanol umkristallisiert und lieferte 1,5 g 1-(4-Carboxyphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin mit einem Schmp. von 207 —209,5⁰C.

Klementaranalyse:

bcr. für ChH₂₃N₃O₃:

C = 62,93%; H =7,59%; N = 13,76%;
gcf.:

C = 62,71%; H =7,58%; N = 13,79%.

35 Beispiel 8

l-(4-Acetylphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin und sein Hydrochlorid

In 50 ml Chloroform wurden 10,2 g (0,05 Mol) l-(4-Acetylphenyl)-piperazin bei Raumtemperatur gelöst, und 6,8 g (0,05 Mol) Diäthylcarbamoylchlorid wurden der Lösung über 30 Minuten zugetropft. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt und die unlösliche Substanz entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand mit 4 &eegr; wäßriger Natronlauge alkalisch gemacht und mit 100 ml Toluol extrahiert. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel destillativ unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde aus einem Benzol/Hexan-Lösungsmiltelgemisch umkristallisiert, um l-(4-Acetylphenyl)-4-diäthy!carbamoylpiperazin mit einem Sdp. von 72 —76°C zu erhalten. Die so erhaltene freie Base wurde in Chlororform gelöst und die Lösung mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt und eine bestimmte Zeit gerührt. Dann wurde die Lösung einer Nachbehandlung nach üblichen Arbeitsweisen unterworfen, um 8,6 g i-^-Acetylphenyl^-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid mit einem Schmp. von 145 —152°C zu erhalten.

Elemcntaranalyse:
DCrJUrCnH₂₆N₃O₂CI:

C = 60,07%; H =7,71%; N = 12,37%; 0 = 10,43%;
gcf.:

C = 59,89%; H = 7,76%; N = 12,28%; Cl = 10,38%.

Anwendungsbeispiel
A.Tabletten, die i-Phenyl-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid als wirksamen Bestandteil enthalten

Ein Gemisch aus 50 g l-Phenyl-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid, 38 g Lactose. 35 g Maisstärke und 20 g kristalliner Cellulose wurde genügend gerührt und geknetet und mit einer Lösung von 5 g Hydroxypropylccllulo.se in 100 ml Wasser granuliert und 4 Stunden bei 50° C getrocknet. Das granulierte Gemisch wurde mit 2 g Magnesiumstearat gemischt und zu Tabletten von jeweils 150 mg Gewicht in einer Tablettiermaschine gepreßt.

B. Kapseln mit 1 -(4-Chlorphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin als wirksamen Bestandteil

Ein Gemisch aus 100 g l-(4-Chlorphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin, 94 g Lactose, 60 g Maisstärke, 40 g kristalliner Cellulose und 6 g Magnesiumstearat wurde genügend gerührt und in einer Menge von '300 mg pro Kapsel unter Verwendung einer Einkapselungsmaschine in harte Kapseln gefüllt.

C.Granula mit l-(4-Äthoxycarbonylphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin als wirksamem Bestandteil

Ein Gemisch aus 100 g l-^-Äthoxycarbonylphenyl^-diäthylcarbamoylpiperazin, 152 g Lactose, 140 g Maisstärke und 80 g kristalliner Cellulose wurde genügend gerührt, und das Gemisch wurde mit einer Lösung von 20 g Hydroxylpropylcellulose in 400 ml Wasser genügend geknetet und granuliert und 4 h bei 50°C getrocknet. Die Granula wurden durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,68 mm (12 mesh) klassiert und mit 8 g Magnesiumstearat vermischt und die Mischung genügend gerührt, um Granula zu erhalten.

D. Suppositorien mit 1 -(4-Carboxyphenl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin als wirksamem Bestandteil

Ein Gemisch von 10 g 1 -^-Carboxyphenyl^-diäthylcarbamoylpiperazin und 90 g Suppositorienmasse auf der Basis von modifizierten Triglyceriden gesättiger Pflanzenfettsäuren (Witepsol W-35 der Dynamill Novel Chemicals) wurden auf 60°C erwärmt und geschmolzen, und die Schmelze wurde in Formen gegossen, so daß das Gewicht eines jeden Suppositoriums 1,5 oder 3 g betrug. Die vergossene Schmelze wurde gekühlt und erstarrte zu Suppositorien.

E. Injektionen mit l-(4-Methoxyphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid als wirksamem Bestandteil

Ein Gemisch aus 10 g l-(4-Methoxyphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid und 0,4 g Natriumchlorid wurden in einer geeigneten Menge destillierten Wassers für Injektionen gelöst, so daß die Gesamtmenge 100 ml betrug. Die so hergestellte Injektionslösung eignete sich für intravenöse Verabreichung.

F. Injektionen mit 1 -(4-Acetylphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid als wirksamem Bestandteil

Ein Gemisch aus 10 g l-(4-Acetylphenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Hydrochlorid und 0,4 g Natriumchlorid wurde in einer geeigneten Menge destillierten Wassers für Injektionen gelöst, so daß die Gesamtmenge 100 ml betrug. Die so hergestellte Injektionslösung eignete sich für intravenöse Verabreichung.

Claims

Patentansprüche

1.1 -(Phenyl)-4-diäthylcarbamoylpiperazin-Derivate der allgemeinen Formel (I)

C₃H₅

X-<>—N N —C—N

O C₂H₅

worin X für ein Wasserstoff- oder Chloratom, die Methoxy-, Äthoxycarbonyl-, Carboxy- oder die Acetylgruppe steht, und deren anorganische oder organische Säuresalze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise eine 1 -Phenylpiperazinverbindung der allgemeinen Formel (II)