DE3035467A1

DE3035467A1 - Enzymatisches verfahren zur herstellung von (beta)-lactamantibiotika und acylverbindungen zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE3035467A1
Application number: DE19803035467
Authority: DE
Inventors: Tamio Amagasaki Hyogo Fujiwara; Eiji Ikeda Osaka Kondo; Takashi Izumiotsu Osaka Mitsugi; Ryonosuke Kyoto Muneyuki
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1979-09-19
Filing date: 1980-09-19
Publication date: 1981-04-09
Also published as: JPS5645196A; US4340672A; GB2058776A; GB2058776B; FR2465708A1; FR2465708B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ß-Lactamantibiotika, d.h. Penicillinen und Cephalosporinen, unter Einwirkung einer Acylase auf ein Penicillin- oder Cephalosporin-Kernamin als Substrat und auf einen Ester der allgemeinen

Formel I als Acylquelle 25

RCOO(CH„CHO)„Y (I)

, η

Dabei haben die einzelnen Reste die im Patentanspruch angegebenen Bedeutungen.

Die Umsetzung verläuft in homogener Lösung und eignet sich für eine kontinuierliche Verfahrensweise. Dabei werden die bisher bei der grosstechnischen Acylierung zur Herstellung von Penicillinen und Cephalosporinen unter Einwirkung von Acylasen auftretenden Schwierigkeiten vermieden.

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Es sind Verfahren zur Herstellung von Penicillinen oder Ce- . ' phalosporinen bekannt, bei denen man einen Methyl- oder Äthylester einer Säure, die den einzuführenden Säurerest aufweist, mit 6-Aminopenicillansäure,■7-Aminocephalosporansäure oder einem reaktiven Derivat dieser Verbindungen umsetzt; vgl. japani sche Patentveröffentlichungen 47-25388, 47-29588, 48-26985, 48-35090, 48-99393, 49-14687, 49-36890, 49-48892, 49-75787, 49-134893 und 52-110896. Festzuhalten bleibt, dass gemäss den Verfahren der vorstehenden Druckschriften als Acylquelle durchwegs niedere Alkylester, insbesondere Methylester, verwendet werden.

Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dass bei derartigen Umsetzungen viele niedere Alkylester in Wasser nur wenig löslich sind, so dass sich nur geringe Konzentrationen ergeben, die für eine wirksame Acylierungsreaktion nicht ausreichen..

Demzufolge treten bei bekannten Herstellungsverfahren mit immobilisierten Enzymen häufig Schwierigkeiten aufgrund der Bildung von 2 Phasen oder aufgrund von Verstopfungen in den Säulen auf, so dass eine glatt ablaufende Elution verhindert wird.

Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten wurden erfindungsgemäss zahlreiche Ester hergestellt und als Substrate für die Acylasen eingesetzt. Dabei stellte sich heraus, dass (Poly)äthylenglykolester und ähnliche Verbindungen besonders geeignet sind. Diese Ester sind mit Wasser frei mischbar und bilden bei der Acylierung in den Säulen keine Verstopfungen. Sie können daher mit Erfolg bei kontinuierlichen Umsetzungen unter Verwendung

30 von in Säulen gepackten immobilisierten Enzymen eingesetzt

werden. Dadurch ergeben sich u.a. folgende Vorteile: Verringerung des Molverhältnisses von Acylquelle zur Aminoquelle, erhöhte Ausbeuten, Erhöhung der Konzentration an Substraten und Produkten und leichte Gewinnung von Ausgangsmaterialien und

35 Produkten aus dem Reaktionsgemisch.

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Gegenstand der Erfindung ist somit ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von ß-Lactamantibiotika durch Umsetzung eines Esters der allgemeinen Formel I mit einer Aminoacetidinoncarbonsäure der allgemeinen Formel II in Gegenwart einer Acyläse in einem wässrigen Medium unter Bildung eines ß-Lactamantibiotikums der allgemeinen Formel III:

RCOO(CH₉CHO) Y ^t ⁿ

H₂N-Q

RCONH-Q

+ HO(CH-CHO) Y 2, η

(D

(ID

(III)

l_ Acylquelle_/ J_ Äminoquelle_7

f_ ß-Laetamaritibiotikum /

Dabei bedeuten RCO einen Acylrest,

X ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkyl- oder Hydroxy-

nieder-alkylrest,

Y ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkylrest,

η eine positive ganze Zahl und

Q einen Rest der Formeln

oder

COOH

0OH

worin Z ein Wasserstoff- oder Halogenatom, einen nucleophilen Rest, eine Methyl-, Halogenmethyl·- oder durch einen nucleophilen Rest substituierte Methylgruppe darstellt.

Wie nachstehend erläutert,·sind Enzyme aus Bakterien oder Pilzen als Acylasen im erfindungsgemässen Verfahren aus Gründen der Produktivität, Wirksamkeit, Kosten und Stabilität beson- · ders bevorzugt.

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γ -ι

Beispiele für entsprechende, Acyläse bildende Bakterien sind solche der Gattung Micrococcus, Arthrobacter und Bacillus. Spezielle Stämme sind Micrococcus roseus M-1054-1 (FERM-P 3744), Micrococcus luteus M-331-1, Arthrobacter globiformis M-345-2 (FERM-P 3743), Bacillus circulans M-1123-5 (FERM-P 5153) und Bacillus megaterium NRRL B-5385.

Gegenstand der Erfindung sind auch die Verbindungen der allgemeinen Formel I- Diese sind als Bestandteile für das erfindungsgemässe Verfahren unerlässlich. Sie sind in hohem Masse wasserlöslich bei gleichzeitiger Eignung als Substrat für die Acylasen. Diese Verbindungen stellen somit wertvolle Acylquellen dar.

In den vorstehenden Formeln bedeutet RCO einen Acylrest von natürlichen oder synthetischen Penicillinen oder Cephalospo-■ rinen, der in Form des Esterderivats der allgemeinen Formel I als Substrat für die Amido-acylasen geeignet ist.

Beispiele für die Gruppierung RCO sind geradkettige, verzweigte, cyclische oder partiell cyclische niedere Alkanoyl- oder niedere Alkenoylreste, . Monocyelo-nieder-aralkanoylreste, Monocyclo-aryloxy-nieder-aikanoylreste, 0-, N- oder S-Heterocyclonieder-alkanoylreste, 0-, N- oder S-Heterocyclo-thio-niederalkanoylreste, Cyanoacetylgruppen, Cyanomethylthioacetylgruppen, Monocyclo-arylglycylreste, Monocyclo-cycloalkenylglycylreste, Monocyclo-arylglykolylreste, N-Acyl-arylglycylreste, Monocyclo-arylmalonyl oder -arylsulfoalkanoylreste, wobei sämtliche vorstehenden Reste gegebenenfalls durch niedere Alkyl-

30 reste, Aminomethylgruppen, Halogenatome, Hydroxylgruppen,

niedere Alkanoyloxyreste oder niedere Alkoxyreste substituiert sein können und vorzugsweise 1 bis 15 Kohlenstoffatome aufweisen. · . "

35 Die Ester der allgemeinen Formel I weisen als Alkoholrest n-Äthylenglykoleinheiten der allgemeinen Formel -(CHpCHXO)-

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γ -ι

als Bestandteile auf. Der Wert von η beträgt im allgemeinen 1 bis 20 und vorzugsweise H bis 15. Beim Ende Y der Äthylenglykolkette kann es sich um ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkyläthergruppe handeln. Es wurde festgestellt, dass die enzymatische Aktivität auf die Aoylquelle durch die Länge der Äthylenglykolkette nicht sehr beeinflusst wird. Demzufolge kann als Acylquelle der allgemeinen Formel I ein Gemisch aus mehreren Estern mit verschiedenen η-Werten verwendet werden, wobei

man gleichwertige Wirkungen erzielt.
10

Diese Ester lassen sich nach herkömmlichen Verfahren herstellen, beispielsweise durch Umsetzung einer Säure RCOOH mit Glycerin., (Poly)äthylenglykol oder Äthylenoxid, durch Dehydratisierung, Kondensation, über ein Säurehalogenid oder über einen chemisch reaktiven Ester eines anderen Typs unter Umesterung.

Bei der Aminoacetidinoncarbonsäure der allgemeinen Formel II handelt es sich um ein Penicillin- oder Cephalosporinkernamin, das in Form eines wasserlöslichen Salzes oder Esters als Acylase-Substrat verwendet werden kann.

·. I

In der allgemeinen Formel II bedeutet Q einen Penicillin- oder Cephalosporinkern der folgenden Teilformein

²⁵ "V-r³^

oder

COOH ··- GOOH

wobei Z die vorstehende Bedeutung hat.

Der Rest Z ist ein Substituent in der 3-Stellung von Cephalosporinantibiotika, beispielsweise ein Wasserstoff- oder Halogenatom, ein nucleophiler Rest oder eine gegebenenfalls durch einen nucleophilen Rest substituierte Methylgruppe. Derartige nucleophile Reste sind beispielsweise in der japani schen Patentveröffentlichung 49-81381 beschrieben.

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_ ₁₀ - · 303546?

Der Rest Z kann bis zu 7 Kohlenstoffatome aufweisen. Beispiele für Z sind Wasserstoff- oder Halogenatome, niedere Alkoxyreste, monocyclische 0-, N- oder S-Heterocyclothioreste, niedere Alkylreste, monocyclische niedere Arälkylreste, niedere Alkanoyloxyreste, nieder-Alkanoyloxy-nieder-alkylreste, monocyclische 0-, N- oder S-Heterocyclo-thio-nieder-alkylreste und Pyridinium-nieder-alkylreste. Diese Reste können durch niedere Alkylreste, Carboxy-nieder-alkylreste, niedere Alkoxyreste, Carbamoylgruppen oder Halogenatome substituiert sein. Die heterocyclischen Ringe in RCO oder Z weisen 1 bis'4 Heteroatome auf.

Die Aminoacetidinoncarbonsäuren der allgemeinen Formel II können in Form von für enzymatische Reaktionen geeigneten

wasserlöslichen Salzen, wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze, oder in Form von wasserlöslichen Estern, wie Methansulf onyläthylester, Acetonylester und nieder-Alkoxy-nieder- . alkylester verwendet werden. Sie können auch in Form eines wasserlöslichen Salzes mit einer Säure, z.B. eines Salzes mit einer Mineralsäure, einer Carbonsäure oder einer Sulfonsäuren eingesetzt werden. Hierbei handelt es sich um bekannte Verbindungen oder um Verbindungen, die nach üblichen Verfahren hergestellt werden können.

Bei den erfindungsgemäss verwendeten Enzymen handelt es sich um Acylasen aus Pflanzen, Tieren, Pilzen oder Bakterien. Für die grosstechnische Produktion sind Pilz- und Bakterienenzyme aufgrund der leichten Zugänglichkeit besonders geeignet.. Die Enzyme können lange gelagert und wiederholt verwendet werden. Sie können in Konzentrationen eingesetzt werden, die über den minimalen Henm'konzentrationen der ursprünglichen Bakterien liegen.

Beispiele für Bakterien oder Pilze, die als Acylasequelle dienen können, sind Stämme der Gattungen Acetobacter, Achromobacter, Aeromonas, Alkaligenes, Arthrobacter, Brevibacterium,

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ORIGINAL INSPECTED

Beneckea, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia, Flavobacteriura, Gluconobacter, Kluyvera, Microbacterium, Micrococcus, Nocardia, Proteus, Pseudomonas, Rhodopseudoraonas, Spilirum, Staphylococcus, Xanthomonas, Aphanocladium oder Cephalosporium. Ferner können auch natürliche oder künstliche Mutanten oder Varianten dieser Mikroorganismen verwendet werden, sofern sie Acylasen für die erfindungsgemässe Kondensation bilden. Entsprechende Beispiele für Mikroorganismenstämme sind in Advances in Applied Microbiology, Bd. 20 (1976), S. 217, beschrieben. Bei der erfindungsgemässen Umsetzung können auch natürliche oder künstliche Mutanten der in dieser Literaturstelle aufgeführten Stämme verwendet werden.

Als Enzymquelle sind folgende drei Bakterienstämme besonders bevorzugt:

1. Micrococcus roseus M-1054-1, FERM-P 3744, ATCC 31251,

2. Arthrobacter globiformis M-345-2, FERM-P 3743, ATCC 31250,

3. Bacillus circulans M-1123-5, FERM Acceptance Nr. 5153.

Die vorgenannten Stämme weisen die folgenden Eigenschaften auf:

Micrococcus roseus M-1054-1

(1) Morphologische Eigenschaften (Fleischextrakt-Agar-Schrägkultur, 28°C,24 Stunden):

Kokken (Durchmesser 1,0 bis 1,2 μ) sind in einfachen oder doppelten Strängen verknüpft. Eine Beweglichkeit lässt sich nicht beobachten. Es werden keine Sporen gebildet. Nach 24-stündiger Inkubation ergibt sich eine positive Gramfärbung. Die Probe auf säurefeste Färbung ist negativ.

(2) Eigenschaften auf verschiedenen Medien:

a. Fleischextrakt-Agar-Kulturplatten (28°C, 2 Tage):

Es werden rosafarbene kreisförmige Kolonien mit glän- .· zender Oberfläche gebildet. Es handelt sich um vollständige, konvexe und opake Kolonien mit butterartiger Struktur. Eine Bildung von löslichem Pigment wird nicht beobachtet.

L -J

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b. Fleischextrakt-Agar-Schrägkultur (28°C, 1 Tag):

Es wird ein massiges rosafarbenes und filamentöses Wachstum beobachtet. Die Kolonien sind konvex und opak mit glänzender Oberfläche. Lösliches Pigment wird nicht

beobachtet.

c. Fleischextrakt-Flüssigkultur (28°C, 2 Tage): Filamentöses Wachstum an der Oberfläche mit homogener Trübung. Bildung von etwas Präzipitat...

d. Fleischextrakt-Gelatine-"stub"-Kultur (24°C, 30 Tage): 10 Auf der Oberfläche lässt sich Wachstum beobachten.

Es tritt jedoch keine Gelatineverflüssigung ein.

e. Lackmusmilch-Kultur (28⁰C,' 7 Tage):

Am Neutralpunkt tritt eine geringfügige Entfärbung ein. Eine Koagulierung und Peptonisierung der Milch wird nicht 15 beobachtet.

(3) Physiologische Eigenschaften:

Reduktion von Nitrat ■ +

Denitrifikation

MR-Test -

VP-Test -

Indolbildung Sehwefelwasserstoffbildung

Stärkehydrolyse	Oxidativ	Sauerstoffbedarf	+ (schwach)
Verwertung von Citronensäure	Fermentativ	O-F-Test	+
Verwertung von Ammoniumsalzen	+
Pigmentbildung	wasserunlöslich, . blassgelb
Urease	+
Oxidase	+ (positiv)
Katalase	+
Ammoniakbildung aus Arginin	■ -
Säurebildung aus Glucose (I.C.S.B.-Methode)
-
-
aerob
oxidativ

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Γ Π

pH-Wert für das Wachstum 6,1-, 7,0+, 7,9+, 8,8+,

9,8+

Wachstumstemperatur 4°C-, 1O⁰C-, 20⁰C+, 28°C++,

37°C+, 42⁰C-.

Zuckerverwertung

Zucker, begleitet von Säurebildung: L-Arabinose, D-Glucose,

D-Früctose.

Zucker ohne gleichzeitige Säurebildung: D-Xylose, D-Mannose,

D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, D-Trehalose, 10

D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin, Stärke.

(Bei keinem dieser Zucker kommt es zur Gasbildung).

Aufgrund der vorstehenden Eigenschaften wird der Mikroorganismus

als Micrococcus roseus eingestuft. Es handelt sich um einen '

neuen Stamm, da er keine Gelatineverflüssigung und keine Stärkehydrolyse bewirkt und bei Temperaturen unter 10⁰C kein Wachstum zeigt.

Arthrobacter globiformis M-345-2 20

(1) Morphologische Eigenschaften (Fleischextrakt-Agar-Schräg-

kultur, 28°C, 24 Stunden):

Stäbchen (0,7 bis 1,0 χ 1,5 bis 3,0 )x) sind in einfachen oder doppelten Strängen V-förmig verknüpft. Gelegentlich werden Verkettungen beobachtet. Beweglichkeit und Sporenbildung werden nicht festgestellt. Nach 6-, 18- und 24-stündiger Inkubation ist die Gramfärbung positiv. Der Test auf säurefeste Färbung verläuft negativ. Nach 3-tägiger Inkubation auf Fleischextrakt-Agar-Schrägkultur werden die Zellen zu Kokken (Durchmesser 0,-7 bis 1,2 μ) und kehren nach mehrstündiger Inkubation in Fleischextrakt-Flüssigmedium in die Stäbchenform zurück.

(2) Eigenschaften auf verschiedenen Medien:

₃₅ a. Fleischextrakt-Kulturplatten (28°C, 2 Tage):

Es werden blass-gelbstichige kreisförmige Kolonien mit

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glänzender Oberfläche gebildet. Es handelt sich um

vollständige, konvexe und opake Kolonien mit butterartiger Struktur. Die Bildung von löslichem Pigment wird nicht beobachtet.
⁵ b. Fleischextrakt-Agar-Schrägkultur (28⁰C, 1 Tag):

Es wird massiges, gelbliches und filamentöses Wachstum festgestellt. Die Kolonien sind konvex und opak mit glänzender Oberfläche. Es wird kein lösliches Pigment gebildet.
c. Fleischextrakt-Flüssigkultur (28°C, 2 Tage):

Es ergibt sich eine homogene Trübung ohne Wachstum mit wenig Präzipitat.

d. Fleischextrakt-Gelatine-"stub"-Kultur (24°C, 30 Tage): Es wird Wachstum an der Oberfläche ohne Gelatineverflüssigung festgestellt.

e. Lackmusmilch-Kultur (28°C, 7 Tage):

Es ergibt sich eine Entfärbung im alkalischen pH-Bereich, keine Koagulation und eine allmähliche Peptonisierung.

(3) Physiologische Eigenschaften: -

Reduktion von Nitrat +

Denitrifikation

MR-Test

VP-Test
Indolbildung · -

Schwefelwasserstoffbildung +

Stärkehydrolyse

Verwertung von Citronensäure +

Verwertung von Ammoniumsalzen + Pigmentbildung -

Urease . +

Oxidase + (schwach)

Katalase ■-.*. +

Zellwandaminosäuren: Glutaminsäure, Alanin und Lysin. Nährstoffbedarf: Thiamin (Das Wachstum wird durch Aminosäuren stimuliert)

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1 Sauerstoffbedarf aerob

O-F-Test oxidativ

pH-Wert für das Wachstum 6,1-, 7,0+, 7,9++, 8,8+, 9,8+ Wachstumstemperatur 4°C-, 10°C+_r 20⁰C++, 28°C++, 37°C++,

5 42⁰C-.

Zuckerverwertung:

Zucker unter gleichzeitiger Säurebildung: D-Fructose Zucker ohne gleichzeitige Säurebildung: L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, D-Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin, Stärke.
(Bei keinem dieser Zucker wird Gasbildung festgestellt). .

Die Eigenschaften dieses Stamms werden mit denen von Arthrobacter globiformis ATCC 8010 verglichen. Es ergibt sich, dass der vorgenannte Stamm M-345-2 sich in bezug auf die positive Gramfärbung in einem frühen Inkubationsstadium (28 C, 6 Stunden) und in bezug auf den Bedarf an Thiamin als Wachstumsfaktor unterscheidet. Abgesehen davon unterscheiden sie sich in bezug auf die Stärkehydrolyse und die Reduktion von Nitrat. Hierbei handelt es sich jedoch um keine gravierenden Unterschiede. Aufgrund dieser Tatsache wird der Stamm als Mutante (mit Thiaminbedarf) von Arthrobacter globiformis ATCC 8010 angesehen.

25 Bacillus circulans M-I123-5

(1) Morphologische Eigenschaften (Fleischextrakt-Agar-Schrägkultur 28°C, 24 Stunden):

Stäbchen (0,8 bis 1,0 χ 2,0 bis 4,5,U) sind in einfachen oder doppelten Strängen verknüpft. Nach 24-stündiger Inkubation lässt sich keine Beweglichkeit und keine positive Gramfärbung feststellen. Der Test auf säurefeste Färbung verläuft negativ.

Nach 4-tägiger Inkubation bei 28°C auf Sojabohnen-Agar-Schrägkulturen werden Sporen gebildet. Die Sporen sind zylinderförmig und weisen die Abmessungen 0,8 bis 1,0 χ

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1,5 χ 2,0 μ auf. Sie sind zentral oder geringfügig zum Ende hin angeordnet. Das Sporangium ist gequollen. Die Sporenfärbung verläuft positiv.

(2) Eigenschaften auf verschiedenen Medien;

a. Fleischagar-Plattenkultur (28°C, 2 Tage):

Es werden cremefarbene kreisförmige Kolonien mit glänzender Oberfläche gebildet, die eine voll-ständige, konvexe, opake und butterartige Struktur aufweisen. Lösliches ¹⁰ Pigment wird nicht gebildet.

b. Fleischextrakt-Agar-Medium (28°C, 1 Tag):

Es tritt massiges, cremefarbenes und filamentöses Wachstum auf. Die Kolonien sind opak mit glänzender Oberfläche.
15 c. Fleischextrakt-Flüssigkultur (28°C, 2 Tage):

Wachstum auf der Oberfläche wird nicht festgestellt, jedoch tritt eine homogene Trübung ein.

d. Fleischextrakt-Gelatine-"stub"-Kultur (24°C, 30 Tage): Es tritt Wachstum auf der Oberfläche und im Innern auf.

20 Die Verflüssigung verläuft schrittweise nach 10-tägiger Inkubation.

e. Lackmusmilch-Kultur (28°C, 7 Tage):

Im Neutralbereich tritt keine Veränderung auf. Die Ansäuerung beginnt etwa am 22. Tag unter allmählicher Koagulierung.

f. Sabouraud-Dextrose-Agar-Schrägkultur (28⁰C, 2 Tage): Es wird geringfügiges Wachstum festgestellt.

g. Sojabohnen-Agar-Schrägkultur (28⁰C, 2 Tage): Es wird massiges Wachstum festgestellt.

h. Tyrosin-Agar-Plattenkultur (28°C):

Es wird massiges Wachstum festgestellt. Das Medium nimmt keine Braunfärbung an.

(3) Physiologische Eigenschaften:
Reduktion von Nitrat +

Denitrifikation +

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Γ . "I

MR-Test
VP-Test
Indolbildung

Schwefelwasserstoffbildung +

Stärkehydrolyse +

Verwertung von Citronensäure + Verwertung von Ammoniumsalzen + Pigmentbildung

Urease +

Oxidase +

Katalase +

Desaminierung von Phenylalanin pH-Wert von VP-Brühe 6,1
Lecitinase -

Sauerstoffbedarf falkultativ anaerob

O-F-Test oxidativ +

fermentativ + pH-Wert für das Wachstum 5,2-, 6,1+, 7,0+, 7,9++, 8,8+,

9,8-.
20 Salzkonzentration für das Wachstum: 0,5 % +, 3 % +, 5 % +,

7 % -.
Temperatur für das Wachstum 4°C-, 10⁰C-, 20⁰C+, 28°C++,

37°C++, 42°C+, 52⁰C-. Zuckerverwertung:

25 Zucker unter gleichzeitiger Säurebildung: L-Arabinose, D-Mannose, D-Glucose, D-Fructose, Maltose, Saccharose, - Lactose, D-Trehalose, D-Mannit, Glycerin, Stärke.

Zucker ohne gleichzeitige Säurebildung: D-Xylose, D-Galactose, D-Sorbit, Inosit.
30 (Bei keinem dieser Zucker tritt Gasbildung auf).

Aufgrund der vorstehenden Befunde erfolgt eine Einordnung unter die in Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, (1974), S. 539 beschriebenen Stämme. 35

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Als Acylase-Präparate können Zellen oder zerkleinerte Zellen · dieser Pilze oder Bakterien, rohe Enzympräparate, reine Enzympräparate, immobilisierte Enzyme oder dergleichen dienen.

Die Zellen werden im allgemeinen unter aeroben Bedingungen gebildet, d.h. durch Züchtung in flüssigem Medium unter Belüftung. Beim Züchtungsmedium handelt es sich um eine wässrige Lösung vom pH-Wert 6 bis 8, die beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Hydrolysat von Sojaprotein, Sojabohnenextrakt oder Maisquellflüssigkeit als Stickstoffquelle, Sirup, Glucose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle, Phosphat, Magnesiumsalz oder' Natriumchlorid als anorganische Salze und ge- gebenenfalls eine entsprechende Menge eines Wachstumsfaktors enthält. Die Züchtung wird 10 bis 60 Stunden bei Temperaturen von 20 bis 40°C durchgeführt. Die auf diese Weise gebildeten Zellen werden abgetrennt, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und beispielsweise mit Wasser, Aceton, Methanol oder Äthanol gewaschen.

20 Bei extrazellulärer Acylasebildung, d.h. Anreicherung in der Gärbrühe, wird die Acylase gewonnen, indem man die Gärbrühe nach Entfernen der Zellen, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, mit einem Adsorptionsmittel versetzt. Zur Abtrennung des Enzyms kann man sich auch der Äussalzung,

25 beispielsweise mit Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, der

Ausfällung durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, oder eines ähnlichen Verfahrens bedienen. Gegebenenfalls kann eine weitere Reinigung durch Dialyse, Absorption, Umfällung, Gelfiltration,

30 Chromatographie oder Lyophilisation vorgenommen werden. Als

Acylasequelle kann auch die zellfreie Brühe verwendet werden. · Im Fall einer intrazellulären Enzymbildung werden feuchte Zellen, trockene Zellen oder dergleichen als Enzymquelle verwendet. Sie können durch Ultraschallbehandlung oder mechanische Mass-

35 nahmen zerkleinert werden und gegebenenfalls zur Abtrennung der Acylaseaktivität vom Zellkörper mit einem Detergens vermischt werden.

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Bei der grosstechnischen Durchführung kann die Acylase beispielsweise durch Absorption oder durch chemische Bindung an einen Träger gebunden werden, beispielsweise an Aluminiumoxid, Diatomeenerde, Celite, sauren Bentonit, aktiven Ton, Kaolin, Calciumphosphat, Hydroxyapatit, Fasern, Cellulose, Agar, Ionenaustauscherharze, synthetische Harze, Glasperlen, Sepharose, Sephadex oder Agarose. Auf diese Weise ergibt sich ein immobilisiertes Enzym.

Bei Einsatz einer durch einen Mikroorganismus gebildeten Acylase in Form eines absorbierten Enzyms wird das abgetrennte Enzym in Wasser oder Gärbrühe mit einem Sorptionsmittel, wie . Celite, Dicalite, Calciumphosphatgel, aktivem Ton, saurem Bentonit oder einem hochporösen synthetischen Polymerisat vermischt, um die Acylase daran zu absorbieren. Das Produkt wird filtriert, mit Wasser gewaschen und als Enzymquelle verwendet. Zur Herstellung eines ionengebundenen, immobilisierten Enzyms können Methacrylatcopolymerisate, Acrylatcopolymerisate, Maleatcopolymerisate, CarboXystyrolcopplymerisate, Sulfostyrolcopolymerisate, Carboxymethylcellulose oder Ionenaustauscherharze in Form von freien Säuren oder Salzen verwendet werden.

Durch chemische Bindung immobilisierte Enzyme lassen sich nach üblichen Verfahren herstellen; vgl. beispielsweise Methods in Enzymology, Bd. 44 (1976), S. 25. Beispiele für entsprechende Verfahren sind das Halogencyan-, Oxiran-, Divinylsulfonsäure-, Halogenacetylhalogenid-, Disulfid-, Aldehyd-Nitril- und Phenylendiamin-Cyclohexylisocyanid-Verfahren oder die Bestrahlung mit /'-Strahlen.

Bei Verwendung von Zellkörpern als Acylasequelle werden die Zellen nach üblichen Verfahren beispielsweise in einem PoIyacrylamidharz immobilisiert, wodurch man ein durch Einschluss, immobilisiertes Enzym erhält.

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¹MIt den vorstehend erläuterten Verfahren gelingt die Herstellung folgender Verbindungen: Cefaclor, Cefacetril, Cefazolin, Cefatrizin, Cefadroxyl, Cefapyrin, Cefamandol, Cefalexin, Cefaloglycin, Cefalotin, Cefaloridin, Cefaclomezin, Cefsulodin, Cef-

5tezol, Cefradin, CGP-9000, Phenylacetatamidocephalosporansäure, Phenoxyacetamidocephalosporansäure, Amoxicillin, Ampilliein, Carbenicillin, Phenox-ymethylpenicillin, Phenoxypropylpenicillin und Benzylpenicillin.

^ Das erfindungsgemässe Verfahren wird durchgeführt, indem man eine Acyläse mit dem Ester der allgemeinen Formel I und der Aminoacetidinoncarbonsäure der allgemeinen Formel II in Wasser, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 40 C in Kontakt bringt.

im allgemeinen beträgt die Konzentration der Aminoacetidinoncarbonsäure der allgemeinen Formel II 0,1 bis 50 mg/ml und vorzugsweise 5 bis 20 mg/ml. Die molare Konzentration des Esters der allgemeinen Formel I beträgt das 1- bis 10-fache und vorzugsweise das 2- bis 5-fache der Säure der allgemeinen Formel

Die Konzentration der Carbonsäure der allgemeinen Formel II kann unter 5 mg/ml liegen, was eine wirksame Umsetzung ermöglicht. In einigen Fällen lässt sich die gewünschte Verbindung der allgemeinen Formel III in mehr als 90-prozentiger Ausbeute erhalten. Der Umwandlungsgrad hängt von den Reaktionsbedingungen ab, insbesondere von der enzymatischen Aktivität. Im allgemeinen wird die Umsetzung bei Temperaturen von 35 bis 40 C bei einem pH-Wert von 6 bis 8 durchgeführt.

Die Acylase wird mit den Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formeln I und II in Kontakt, gebracht, indem man eine wässrige Lösung des rohen oder gereinigten Enzyms in das Reaktiorisgemisch einbringt.

35 Bakterien oder Pilze, die intrazellulär oder extrazellulär

Acylase bilden, können als Zellsuspension in Wasser oder Nähr-

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ι medium verwendet werden, wobei eine derartige Suspension dem Reaktionsmedium als Enzymquelle zugesetzt wird.

Die erwähnten immobilisierten Enzymformen können nach üblichen Verfahren dem Ansatz zugesetzt oder in Säulen verwendet werden. Die Reaktionszeit beim absatzweisen Verfahren sowie die Strömungsgeschwindigkeit und die Reaktionstemperatur beim Säulenverfahren lassen sich unter Berücksichtigung der Ausbeute am gewünschten Produkt oder aufgrund des Verbrauchs an Ausgangsmaterial festlegen. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung von festem Material filtriert, zur Entfernung von neutralen Substanzen mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise einem Ester der allgemeinen Formel I, gewaschen und nach einem herkömmlichen Verfahren, beispielsweise durch fraktionierte Extraktion, fraktionierte Absorption, Umkristallisation oder Chromatographie, zum gewünschten Produkt der allgemeinen Formel III aufgearbeitet.

Im erfindungsgemässen Verfahren werden als Acylquelle (PoIy)-äthylenglykolester der allgemeinen Formel I eingesetzt, die frei mit Wasser mischbar sind. Die Umsetzung wird in einer homogenen Phase durchgeführt, um im Fall, der Anwendung des Säulenverfahrens Verstopfungserscheinungen zu vermeiden. Dies stellt im Vergleich zu herkömmlichen Acylquellen, "d.h. Methylestern von geringer Löslichkeit (2-Thienylessigsäuremethylester ergibt bei Lösung in Wasser nur eine 1-prozentige Konzentration)· eine beträchtliche Verbesserung dar. Derartige Methylester führen nämlich zu Verstopfungen und behindern einen glatten Durchfluss. Im Fall von bekannten Methylestern blockieren

-30 hohe Substratkonzentrationen die enzymatische Reaktion. Bei der erfindungsgemässen Verwendung der wasserlöslichen Ester der allgemeinen Formel I erhält man die gewünschten Produkte auch bei derartigen höheren Konzentrationen in guter Ausbeute.-Ferner sind beim erfindungsgemässen Verfahren höhere Substrat- oder Produktkonzentrationen möglich, was eine Gewinnung von Ausgangsprodukt »oder gewünschtem Reaktionsprodukt aus dem Reaktionsgemisch erleichtert.

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1 Wie vorstehend erwähnt, eignet sich das erfindungsgemässe Verfahren insbesondere zur grosstechnischen Herstellung von ß-Lactamantibiotika.

5 Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispieli - .

Bacillus ciroulans M-I123-5 ' .

Rohes Enzym
10

Ein wässriges Medium mit einem Gehalt an 0,5 % löslicher Stärke, 0,5 Prozent Polypepton und 0,5 Prozent Maisquellflüssigkeit wird auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und mit Bacillus circulans M-1123-5 beimpft. Nach 24-stündiger Vorinkubation bei ■ 32°C wird die Brühe auf das 100-fache Volumen des vorstehend genannten wässrigen Mediums übertragen. Das Gemisch wird 42 Stunden bei 32°C geschüttelt. Die erhaltene Brühe wird zur Entfernung der Zellen bei 6500 U/min zentrifugiert 1 Der abgetrennte überstand (5 Liter vom pH-Wert 7,7) wird mit Salzsäure auf den pH-Wert 7 eingestellt, bis zu 70-prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat vermischt und zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 110 ml entionisiertem Wasser gelöst und durch Dialyse gegen 14 Liter entionisiertes Wasser entsalzt. Die dialysierte Lösung wird zur Entfernung von unlöslichen Verun- __c reinigungen zentrifugiert. Der überstand (227 ml) wird lyöphilisiert. Man erhält 1,65 g rohes Enzym.

Bindungsvermögen an verschiedene Trägerstoffe Eine bestimmte Menge der in Tabelle I aufgeführten Träger- _ stoffe wird in Wasser suspendiert und mit einer 10-prozentigen

wässrigen Bromcyanlösung vermischt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von wässriger 4 η Natrxumhydroxidlösung auf 11 gehalten wird.'Das Gemisch wird 10 Minuten bei 20⁰C gerührt, sodann filtriert und mit kaltem Wasser μηα 1/30 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8 gewaschen. Man erhält einen aktivierten Trägerstoff.

130015/09Q8

Dieser aktivierte Trägerstoff wird zu einer wässrigen Lösung des rohen Enzyms gegeben und über Nacht bei 4 C belassen. Das gebildete immobilisierte Enzym wird abfiltriert, gründlich mit

1/3BTmPhosphatpuffer gewaschen und bei Raumtemperatur gelagert. 5

Bestimmung des Acylierungsvermögens bei einem absatzweisen Verfahren

Eine Lösung von 15 mg 7-Aminocephalosporansäure (nachstehend kurz 7-ACA) und 75 mg 2-Thienylessigsäuretetraäthylenglykolester (nachstehend kurz TA-tetra) in 5 ml'1/20 m Phosphatpuffer wird mit einem auf die vorstehende Weise hergestellten, immobilisierten Enzym versetzt. Das Gemisch wird 40 Minuten bei 37°C geschüttelt. Das gebildete Cephalothin wird durch

Ermittlung der antibakteriellen Aktivität gegen Bacillus 15

subtilis PCI-219 bestimmt. -

Bestimmung des Acylierungsvermögens beim Säulenverfahren

Eine Lösung aus 5 mg/ml 7-ACA, 25 mg/ml TA-tetra in 1/20 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 wird bei 37°C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 25 ml/Std. über eine mit dem immobilisierten Enzym gepackte Säule gegeben.Im Eluat gebildetes CET wird durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität gegen Bacillus subtilis PCI-219 festgestellt, um den Urawandlungsgrad zu ermitteln.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

130015/0908

cn

	co ep	Herstellung und	10 ml	Tabelle I	89	immbobilisierten Enzymen	10 ml	Agarpulver	Sepharose	I
	O —A in	Trägerstoff Sephadex	10	Aktivität von	62	Cellulose- pulv:er Agargel	10			I
	8060/!	Immobilisiertes Enzym	30	G Avicel			30	1 g	20 ml
		Trägerstoff	18			1 g	18	20	40
		Suspension (ml)	89,1	1 g	-	10	26,3	30.	60
		10% BrCN wässr. (ml)	4	10	-	30	8,3	16	36
O		wässr. Lösung des rohen Enzyms, (ml)		30		18		82,2	87,5	- CaJ
RIGIN		Anteil gebundenes · ' . Protein (%)	111	18		25,3	230	12,5	21
>	L	feuchtes, gebundenes Protein (g)	85	52,3		4	92			Ol
!SPECTED		absatzweises Verfahren		3,2				390	290
		feuchtes, immobilisiertes Enzym (mg)				61		• 67	101
		7-ACA —> CET Umwandlungsgrad (%)	—.	• 4	11
		-		75,2
	Säulenverfahren				_	' 13
	feuchtes, immobilisiertes Enzym (ml)			-	87,6
	7-ACA-> CET . , Umwandlurigsgrad (%)	-

3Q35467

Reaktivität von TA-Estern ·

1. Absatzweises Verfahren

Eine Lösung von 30 mg 7-ACA und einer bestimmten Menge an TA-Estern in 10 ml 1/10 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 wird mit 0,9g eines an Sepharose 4B immobilisierten Enzyms versetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 37°C gerührt. Die CET-Konzentration im Reaktionsgemisch wird bestimmt, indem man die antibakterielle Aktivität gegen Bacillus subtilis PCI-219 ermittelt. Der Umwandlungsgrad von 7-ACA zu CET wird berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II Reaktivität von Estern beim absatzweisen Verfahren

Ester ursprüngliche Umwandlungs-

Menge (mg/ml) grad (%)

TA-Tetraester¹⁵ 15,0 77,1 TA-Pentaester ' lo,2 80,6 TA-Octaester³⁾ 17,7 76,2 TA-Tetraestermethyläther²⁰ 15,7 73,3 TA-Oetaestermethyläther⁵⁾ 24,0 68,2

TA-Glycerinester⁶^ 23,3 73,7

O-

CIf₂COOB S"

1) R = -[CH₂CE₂OUH '

2) R = - ( CF₂ CF₂ 0)_s H

3) Ä·== - [CH₂CH₂O)a H

4) B = -(CHzCH₂O)₄CHi 35

5} R = - (CH₂CH₂O)S CH₃

6} R = -CH₂CHOHCH₂OH L 130015/0908

_ ₂₆ _ 3Q35467

2. Säulenverfahren

Eine Lösung von 5 mg/ml 7-ACA und einer bestimmten Menge TA-Ester in 1/20 m Phosphatpuffer wird bei 37°C mit einer

Strömungsgeschwindigkeit von 25 ml/Std. über eine mit 12 ml

immobilisiertem Enzym gepackte Säule gegeben. Die CET-Kon-

zentration im Eluat wird durch Ermittlung der antibakteriellen Aktivität gegen Bacillus subtills PCI-219 bestimmt. · Daraus wird die in Tabelle III angegebene Ausbeute im laminaren Eluatstrom ermittelt.
10

Tabelle III

Reaktivität von TA-Estern beim Säulenverfahren	Mg/ml	-	Immobilisierung von gereinigtem Enzym	85,0 86,5 69,8
TA-Ester	25,0 17,0 29,6 26,1 55,0	7-ACA —^ GET Umwandlungsgrad (%)
	Sepharose4B Agargel
TA-Tetraester - TA-Pentaester²⁾ TA-Tetraestermethyläther ' TA-Octaestermethyläther TA-Gl'ycerinester	87,6 69,9 86,5 69,8 82,0

Ein wässriges Medium vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,5 Prozent löslicher Stärke, 0,5 Prozent Pepton und 0,5 Prozent Maisquellflüssigkeit wird mit Bacillus circulans

M-1123-5 beimpft und 24 Stunden bei 32°C geschüttelt. Das 30

durch die Vbrinkuba-tion gebildete Produkt wird auf das 100-fache Volumen eines wässrigen Mediums der vorstehend angegebenen Zusammensetzung übertragen und 2 Tage bei 32°C geschüttelt. Die Gärbrühe wird zur Entfernung der Zellen

zentrifugiert. Sodann wird zum Aussalzen der Proteinfraktion 35

mit wässriger 70-prozentiger Ammoniumsulfatlösung verdünnt.

130015/0908

Das Produkt wird durch Dialyse entsalzt und sodann lyophilisiert. Man erhält rohes Enzym. 1,1 g dieses rohen Enzyms werden in 200 ml 1/100 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 gelöst und über eine mit 73 ml DEAE-Cellulose (Whatman-DE 52) gepackte Säule der Abmessungen 24 mm Durchmesser χ 160 mm gegeben, wobei mit einem Wasser/Natriumchloridlösung-Gradienten (von 0 bis 0,6 m) eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, mit einem Kollodiumbeutel SM-13200 (Sartorius Co.) eingeengt und dialysiert. Man erhält 35 ml einer wässrigen Enzymlösung. Diese Lösung wird mit 20 ml 4prozentigem Agargel in Perlenform, das mit Bromcyan aktiviert ist, versetzt. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Es bildet sich immobilisiertes Enzym. Das Produkt wird gründlich mit 1/30 m Phosphatpuffer vom pH-.Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,5 m Natriumchlorid gerührt. Man erhält ein immobilisiertes Enzym.

Über eine mit 14,1 ml dieses festen Enzyms gepackte Säule vom Durchmesser 10 mm wird eine Lösung von 10 mg/ml 7-ACA und 142,2 mg/ml TA-Octaestermethyläther ' in 1/20 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gegeben. Die Temperatur beträgt 37°C und die Strömungsgeschwindigkeit 16 ml/Std. Das Eluatvolumen und der Umwandlungsgrad von 7-ACA zu CET sind in Tabelle IV angegeben. Im beobachteten Bereich bleibt der Umwandlungsgrad gleich, was die nahezu konstante E-nzymakti-

25 vität zeigt.

130015/0908

<n ο οι ο cn ο cn -* ~1

Tabelle IV Acylierunqsvermögen von reinem, immobilisiertem Enzym

Eluat (ml) 39 173' 306 405 731 782 917 1089 1156 1294 1432 1534

7-ACA-* CET- ·

Umwandlungsgrad (%) 84,8 85,2 85,3 90,4 85,7 86,3 88,5 86,9 86,6 82,5 83,1 82,0

Neben dem gewünschten CET enthält das Eluat auch TA-Tetraestermethyläther und 2-Thienylessigsäure. Diese Verbindungen können in Ausbeuten von 90 bis 95 Prozent, 60 bis 85 Prozent und 8 bis 10 Prozent aus dem Eluat gewonnen werden.

Absorbiertes Enzym

Ein wässriges Medium vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an' 0,5 Prozent löslicher Stärke, 0,5 Prozent Pepton und 0,5 Prozent Maisquellflüssigkeit wird mit Bacillus circulans M-1123-5 beimpft und 24 Stunden bei 32°C vorinkubiert. 1 Teil dieses vorinkubierten Produkts wird zu 100 Teilen eines wässrigen Mediums der vorstehend angegebenen Zusammensetzung gegeben. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 32°C gezüchtet. Sodann wird die Gärbrühe zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, durch

^⁵ Zusatz von 1 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7,0 eingestellt, mit 1/50 ihres Gewichts an Celite 560 (Johns-Manville Sales Co.) vermischt, 40 Minuten bei 0 bis 4°C gerührt und filtriert. Die feste Fraktion wird mit 1/20 m Phosphatpuffer gewaschen. Man erhält immobilisiertes, ab-

20 sorbiertes Enzym.

Über eine mit 4 g dieses absorbierten Enzyms gepackte Säule vom Durchmesser 10 mm wird eine Lösung von 5 mg/ml 7-ACA und TA-Tetraester in 1/20 m Phosphatpuffer gegeben. Die Temperatur beträgt 37 C und die Strömungsgeschwindigkeit 25 ml/Std. Nach einer Passage von 75 ml der Lösung wird das gebildete CET durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität gegen Bacillus subtilis PCI-219 ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V als prozentualer Anteil des

30 umgewandelten 7-ACA angegeben.

130015/0908

1 ' Tabelle V

Acylierungsvermögen von an Celite 560 absorbiertem

Enzym

TA-Tetraester (mg/ml) 25 25 25 18,8 12,5

pH 6,0 7,0 8,0 7,0 7,0

7-ACA -^ CET Umwandlungs

- Im Eluat 62,8 72,9 71,6 63,0 63,0

10 grad (%) _Isoliertes

Na-SaIz 48,5 67,2 49,3 64,2 53,0

Isolierung des Produkts' aus dem Reaktionsgemisch

Das Reaktionsgemisch wird zunächst 3 mal mit jeweils dem gleichen Volumen an Essigsäureäthylester extrahiert, um die TA-Ester im Extrakt zu gewinnen. Die verbleibende wässrige Phase wird auf den pH-Wert 3,6 angesäuert, mit Diäthyl_r äther gewaschen, auf den pH-Wert 2,0 eingestellt und mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die wässrige Phase enthält 7-ACA. Der zweite Extrakt wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Die konzentrierte Essigsäureäthylesterlösung wird mit 1,5 Moläquivalenten Natrium-2-äthylhexanoat vermischt, 24 Stunden bei 4°C stehengelassen und zur Gewinnung von CET-Natrium filtriert. Gemäss diesem Verfahren lassen' sich 80 bis 95·Prozent des CET aus dem Reaktionsgemisch gewinnen.

Selektivität der Acylasen . - ' .

Immobilisiertes Enzym

Gemäss den vorstehend erläuterten Verfahren werden Bacillus

circulans M-1123-5, Arthrobacter globiformis M-345-2 bzw. 35

Arthrobacter flagerum M-2183-1 gezüchtet und unter Bildung

130015/090 8

^Γ - 31 - 3035487

einer zellfreien Kulturbrühe filtriert. Aus der Brühe wird mit Natriumchlorid die Enzymfraktion ausgesalzt. Diese Fraktion wird gewonnen, dialysiert und an einer mit DEAE-Cellulose gepackten Säule chromatographiert. Man erhält partiell gereinigtes Enzym. Dieses Produkt wird mit 4-prozentigem Agargel, aktiviert mit Bromcyan, behandelt.

Reaktionslösung

Eine Lösung von 45 mg eines Esters der allgemeinen Formel I und 9 mg Aminoacetidinoncarbonsäure der allgemeinen Formel II in 3,0 ml 1/20 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 bis 7 wird mit 0,15 bis 0,5 g immobilisiertem Enzym versetzt und 3 3/4 Stunden bei 37°C gerührt. Nach der Umsetzung wird das Gemisch durch einen Wattebausch filtriert. Das erhaltene Filtrat

wird dünnschichtchromatographisch und mittels des Papierscheibenverfahrens unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI-219 als Testmikroorganismus untersucht, um die einzelnen Produkte nachzux^eisen und zu bestimmen. Die Ergebnisse sind

in Tabelle VI zusammengestellt. 20

13 0015/0908

(U ■Η

<D X) (0

Qf

•a

O O O

Of I

td

H I

cn co

to

CM

cn

CM

H H

Qf

- 32 -

OC

cc

is

. O O = O

H ι

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3Q3i54S7

to

ϊ<2

130015/0908 to

to

ο ο

10

-P U O ta

1-4 Φ CÖ

U O

OO t-l CNf

CV I

CM

•Η ϋ

- 33 -

ΙΩ

•ν

IfS

te

IO

•ν O

O O

■ο

-χ

130015/0908 .

Ii

O-

CH_x-

Y η

II

cn

Tabelle VI (Forts.)

■ COOH.

Rf

0,71

B.Circulans M-1123-5

iToriitis

Zersetzungmifr" _v ." Penicillinas

A. Γ rarxcrutn M-2183-1

• J

s^S.

OCB₂-

COOII

0,71

OCZi₂-

II 4.

COO//

0,71

Zersetzung

.mit

Penicillinase

21 ,0

8 Ό,

ω cn

cn

Tabelle VI (Forts.)

cn

	•	. ^u	I	Y	Q	ft /	B.Circulans	A.Rlobi-	A.frarcerum	•	-
		m.	η	_s N-N	0,5	M-1123-5	formis	M-2183-1
		CIh 5	coon ■		55,7	4 3,7	5 4,9
co O	-
cn		0~N^?- CIh*	0,13
'09OS	CH₉ 2	COOH		2 9, G	■ 10", 6

* SiOp-Platte/Aceton: Essigsäure: Wasser (Volumenverhältnis 95: 5 : 10)

B e i s ρ i e 1 2 '.

Arthrobacter globiformis M-345-2 Immobilisiertes Enzym

Ein wässriges Medium vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,5 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton und 0,5 Prozent Maisquellflüssigkeit wird mit Arthrobacter globiformis M-345-2 beimpft und 24 Stunden bei 28°C vorinkubiert. Anschliessend wird die Brühe in das 100-fache Volumen eines wässrigen Mediums der vorstehend angegebenen Zusammensetzung gegeben. Nach 2-tägiger Züchtung bei 28°C wird das Myzel abfiltriert und die Brühe mit 530 ml 70-prozentiger wässriger Ammoniumsulfatlösung vermischt. Der auf diese Weise ausgesalzte Niederschlag wird säulenchromatographisch an DEAE-' Cellulose gereinigt, mit einem Kollodiumbeutel eingeengt und dialysiert. Man erhält 24 ml einer Lösung des gereinigten Enzyms. 19 ml dieser Lösung werden mit 10 ml 4-proz.entigem Agargel oder 10 ml Sepharose 4B, jeweils gemäss Beispiel 1 mit 10 Prozent Bromcyan aktiviert, versetzt- Das Gemisch wird über Nacht umgesetzt. Das Produkt wird abfiltriert und mit Wasser und 1/30 m Phosphatpuffer gewaschen. Man erhält ein immobilisiertes Enzym. -

Über eine mit 10 ml dieses immobilisierten Enzyms"gepackte Säule von 10 mm Durchmesser wird bei 37 C eine Lösung mit einer bestimmten Menge 7-ACA und 120 mg/ml TA-Tetraester in 1/20 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gegeben. Die Strö-v mungsgeschwindigkeit beträgt 25 ml/Std. Die CET-Menge im Eluat wird durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivitat gegen Bacillus subtilis PCI-219 ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII als prozentuale Umwandlung von 7-ACA in CET angegeben. ·

130015/0908

Γ	r	c*>	ω cn	CO IO ο cn	IO -» ο cn	Trägerstoff	ο cn	I U)
		.00			Tabelle VII	Sepharose 4B		-J I
		)/SI		Acylierungsvermogen globiformis M-345-2	von immobilisiertem Enzym	Sepharose 4B	aus Arthrobacter
j 9 0 8	7-ACA	TA-Ester	mg	Sepharose 4B	Umwandlungsgrad (%)
1 mg/ml	TA-Tetraester	120	Sepharose 4B	83,7
2	TA-Tetraester	120	Agargel	71,0
3	TA-Tetraester	120	Agargel	56,3
1	TA-Tetraester	114	78,5
1	TA-Octaester- methyläther	114	76,5
1	TA-Octaester- methyläther	60	80,5

1 Belspiel3

Microcoeous luteus M-331-1

Myzel

Ein wässriges Medium mit einem Gehalt an 0,5 Prozent löslicher Stärke, 0,5 Prozent Pepton und 0,5 Prozent Maisquellflüssigkeit wird mit Micrococcus luteus M-331-1 beimpft. Das Medium wird 24 Stunden bei 28°C vorinkubiert. Die erhaltene Brühe wird in das 100-faehe ihres Volumens eines

J₀ wässrigen Mediums der vorstehend angegebenen Zusammensetzung gegeben. Die Inkubation wird 3 Tage bei 28⁰C durchgeführt. Sodann wird die Gärbrühe mit Salzsäure auf den pH-Wert 7 neutralisiert. Die"Zellen werden abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und durch Waschen mit Aceton getrocknet. Man er- -

₁₅ hält 1,302 g trockene Zellen.

26 mg der getrockneten Zellen werden in 1,5 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 0,5 fÄL einer Lösung von 20 mg/ml TA-Tetraester und 4 mg/ml 7-ACA in 1/2OmPhosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 ver-2Q dünnt. Die erhaltene Lösung wird 3 Stunden bei 37°C geschüttelt. Der CET-Umwandlungsgrad beträgt etwa 30 Prozent.

Immobilisierte, in Acrylamidgel eingeschlossene Zellen

1 g der vorstehend erhaltenen trockenen Zellen wird- in 4 ml einer Lösung von 750 mg monomerem Acrylamid und 40 mg Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid in 1/20 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 0,5 ml 5-prozentiger 3-Dimethylaminopropionitriliösung und 0,5 ml einer wässrigen 1-prozentigen Kaliumpersulfatlösung versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 25°C stehengelassen. Das gebildete Gel wird mit einem Mischer zerkleinert. Die gebildeten Teilchen mit einer Teilchengrösse über 0,149 mm (100 mesh) werden gesammelt, in ein Rohr vom Durchmesser 10.mm gefüllt und mit 1/2Om Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, gewaschen. Man erhält eine mit 10,2 ml immobilisierten Zellen gepackte Säule.

130015/0908

^Γ - ³⁹ - 303S467

Über diese Säule wird eine Lösung von 1 rag/ml 7-ACA und 30 mg/ml oder 6 mg/ml TA-Tetraester in 1/30 in Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gegeben. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 25 ml/Std. Die CET-Menge im Eluat wird durch Ermittlung der antibakteriellen Aktivität gegen Bacillus subtilis PCI-219 bestimmt. Es ergibt sich ein Umwandlungsgrad von 31,2 bis 34,1 Prozent bzw. 28,6 bis 32,5 Prozent.

Beispiel 4 10 Xanthomonas axanopodis M-621-1

100 ml eines wässrigen Mediums vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 1,0 Prozent Fleischextrakt, 1,0 Prozent PoIypepton und 0,5 Prozent Natriumchlorid werden in einem 500 ml fassenden Sakaguchi-Kolben mit Xanthomonas axonopodis M-621-1 beimpft. Sodann schüttelt man 24 Stunden bei 28⁰C." Hierauf wird die Brühe in 700 ml eines Mediums der gleichen Zusammensetzung in einen 3 Liter fassenden Mayer-Kolben gegeben.' Nach 41-stündigem Schütteln bei 28°C wird die Gärbrühe auf 6 30 Liter fassende Glasfermenter, die je-

weils 15 Liter wässriges Medium der vorstehend angegebenen Zusammensetzung enthalten, überimpft. Die Züchtung wird 2 Tage bei 28°C fortgesetzt. 'Nach Filtrieren der Gärbrühe erhält man 1320 g feuchte Zellen. Diese Zellen werden in 8 Liter 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert und mit einer Mühle vom Typ Dynomil (Wiley A. Bahoffer Manufacturing Engineers Co.) zerkleinert. Ein Teil des erhaltenen enzymatischen Extrakts (2,4 Liter) wird mit CaI-ciumphosphat behandelt. Der nach Zentrifugation erhaltene aktive überstand wird über eine mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz (AmberIite CG-50) gepackte Säule, die mit 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 äquilibriert worden ist, gegeben. Das auf der Säule festgehaltene Enzym wird mit 0,2 m Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 1 m Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wird mit 100 ml Sepharose 4B, die gemäss den vorstehenden Beispielen mit Bromcyan aktiviert worden ist, behandelt. 40 Prozent der enzymatischen

L 130015/0908

1 Aktivität werden gebunden.

Eine Lösung von 45 mg D-Phenylglycin-diäthylenglykolestermethyläther und 3 mg 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure wird mit 0,15 g des festen Enzyms versetzt und 3 1/2 Stunden bei'37°C gerührt.-Sodann wird das Reaktionsgemisch durch einen Wattebausch filtriert. Das im Filtrat gebildete Cephalexin wird mittels des Papierscheibenverfahrens bestimmt. ' Die Umwandlung von 7-Aminocephalosporansäure zu Cephalexin beträgt 26,3 Prozent.

Beispiel5 Micrococcus roseus M-1054-1

100 ml eines wässrigen Mediums vom pH-Wert 7»0 mit einem Gehalt an 0,5 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Polypepton und 0,5 Prozent Maisquellflüssigkeit wird mit Micrococcus roseus M-1054-2 beimpft. Das Medium wird sodann 3 Tage bei 28°C geschüttelt. Die Brühe wird auf den pH-Wert 7,0 eingestellt. 4,5 ml dieser Brühe werden zu einer Lösung von 7-ACA (3 Pro-²^ zent) und (1) 2-Thienylessigsäureglycerinester,(II) 2-Thienylessigsäuretetraäthylenglykolester oder (III) 2-Thienylessigsäureoctaäthylenglykolester in 0,5 ml 0,2 m Phosphatpuffer gegeben und 3 1/2 Stunden bei 37°C umgesetzt. Zur Entfernung der Zellen wird das Eeaktionsgemisch zentrifu- giert. Der Überstand wird nach dem Papierscheibenverfahren auf seine Aktivität gegen Bacillus subtilis PCI-219 untersucht. Es ergeben sich folgende Cephalotinausbeuten:

(I) 34 ;ig/ml,

(II) 26 ^g/ml und 30 (III) 22 jug/ml.

Beispiel 6 Nachstehend wird die Herstellung der für das erfindungsge-

mässe Verfahren verwendeten Ester erläutert. 35

130015/0908

1 I. 2-Thienylessigsäureester (1) Glycerinester

Ein Geraisch aus 3,2 g Glycerin, 3,12 g 2-Thienylessigsäureg methylester und 0,1 g Kaliumcarbonat wird 2 Stunden unter

vermindertem Druck auf 40°C erwärmt, wobei durch ein Kapillarrohr Stickstoff eingeleitet wird. Das Reaktionsgemisch wird sodann mit 60 ml Wasser verdünnt und mit 100 ml Essigsäureäthylester extrahiert. Der Extrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält 3,55 g 2-Thienylessigsäureglycerinester als öliges Produkt. Dünnschichtchromatographie: R„-Wert = 0,23 (Benzol/Essig-

säureäthylester =1:5/ SiOp)

nj° = 1,5405. IR-Spektrum:	12°4^S: ber.:	Film max	3400,	1740,	1175	, 705	cm" .	S ,82
C₉H	gef.:		49	C ,98	5	H ,59	14	,79
		49	,86	5	,69	14
(2)	Pentaäthylenglykolester-methyläther

Ein Gemisch aus 3,5 g Pentaäthylenglykolmonomethyläther, 1,32 g 2-Thienylessigsäuremethylester und 74 mg Kaliumcarbonat wird unter Stickstoff etwa 2 Stunden auf 40^aC erwärmt. Sodann wird das Reaktionsgemisch chromatographisch an Kieselgel gereinigt. Aus den mit Essigsäureäthylester eluierten Fraktionen erhält man 4,6 g 2-Thienylessigsäure-pentaäthylen-

glykolester-monomethyläther in Form eines Öls.

Dünnschicht Chromatographie: R„-Wer-t = 0,22 (Benzol/Essig-

säureäthylester = 1	: 5/SiO	2	)	-	705cm~¹	H	•	8	S
nj^=' 1,4920					,49		8	,51
IR-Spektrum ζ£*	1740,	1	1	10,	,35		,74
C₁₇H₂₈O S:	C
ber,:	54,23			7
gef.:	54,38			7

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1 (3) Tetraäthylenglykolester

Eine Lösung von 40 g Tetraäthylenglykol in 80 ml.Tetrahydrofuran und 6,23 g Triäthylamin wird tropfenweise mit einer Lösung von 9,48 g 2-Thienylessigsäurechlorid vom Kp. 112 bis 113°C (25 Torr) in 20 ml Tetrahydrofuran gegeben, wobei gerührt und mit Eis gekühlt wird. Nach einer Rührzeit von 1 Stunde wird das Gemisch zur Entfernung von festem ' Material filtriert. Das Filtrat wird unter Stickstoff bei 40⁰C eingedampft. Man erhält 48,6 g Rückstand. Dieser Rückstand wird zur Ausfällung von unlöslichem Material mit 100 ml Wasser verdünnt. Der überstand wird abgetrennt und. mit Essigsäureäthylester extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck unter Stickstoff eingedampft. Man erhält 9,06 g 2-Thienylessigsäure-tetraäthyleriglykolester. Dieses Produkt enthält keinen ω,ω»-Diester.

Dünnschichtchromatographie: R„-Wert = 0,17 (Benzol/Essigsäureäthylester = 1 : 1/SiOp). . ·

IR-Spektrum: ^Fllffl 3440, 1735, 1120 cm~¹.

on max

ng^u = 1,5080.

^{20 C}14^H22°6^S: .^{C H S}

ber.: 52,81 6,96 10,07

gef.: 52,62 7,06 . 10,09

NMR-Spektren: <f ^CDC13 5,28brs1H, 3,86s2H, 3,63-4,36mi6H, · ^ppm 6,90-6,96m2H, 7,15-7,31m1H.

(4) Polyäthylenglykolester-monomethyläther (Teil 1)

Polyäthylenglykolmonomethyläther (Handelsprodukt Uniox M-210 der Nippon Yushi Kabushiki Kaisha mit einem durchschnitt-

liehen Molekulargewicht von 210) wird bei einem Druck von 2 Torr erwärmt, um etwa 1/3 abzudampfen. Die restliche Flüssigkeit (15 g) wird mit 3,1 g 2-Thienylessigsäuremefchyl~ ester und 51 mg Kaliumcarbonat versetzt. Das Gemisch wird ₃_ unter Stickstoff und unter vermindertem Drück auf 80°C erwärmt. Nach 3 1/2 Stunden wird das Produkt säulenchromato-

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graphisch an Kieselgel (250- ml, 70 bis 230 mesh,(210 bis 63 ^im)) gereinigt. Die mit einem Gemisch aus Benzol und Essigsäureäthylester (1 : 1) eluierten Fraktionen werden eingedampft. Man erhält 2-Thienylessigsäure-polyäthylenglykolestermonomethyläther (n = 4 bis 13; vorwiegend η = 7, 8 und 9).

(5) Polyäthylenglykolester-monomethyläther (Teil 2)

Ein Gemisch aus 40 g Polyäthylenglykolmonomethyläther (Handelsprodukt Uniox M-400 der Nippon Yushi Kabushiki Kaisha mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 400), 3»12 g 2-Thienylessigsäuremethylester und 0,123 g Kaliumcarbonat wird unter vermindertem Druck und unter Stickstoff auf 75 C erwärmt. Nach 3 Stunden wird das Reaktionsgemisch mit 150 ml Wasser verdünnt und mit Essigsäureäthylester extrahiert. Der Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingedampft und an Kieselgel (40-faches Volumen) chromatographiert. Die mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (95 : 5) eluierten Fraktionen werden gesammelt und eingedampft. Man erhält 2-Thienylessigsäure-

polyäthylenglykolester-monomethyläther (n = 4 bis 13, vorwiegend η = 8).

II. Ester von anderen Säuren

Entsprechend dem vorstehend unter (I) bis (V) angegebenen Verfahren lassen sich folgende Verbindungen herstellen:

1. Phenylessigsäure-tetraäthylenglykolester

2. Phenoxyessigsäure-tetraäthylenglykolester

3 - Tetrazolylessigsäure-pentaäthylenglykolester-monomethyläther

4. Phenylglycin-diäthylenglykolester-monomethyläther.

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Claims

VO SSIUS VO SS IUS TAUC H NER H EU N EMANN RA UH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE A- ■ 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O 75 CABUE: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-Q9453VOPAT D u.Z.: P 816 1^. September 1980 Case: F 4023 SHIONOGI & CO., LTD. Osaka, Japan "Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von ß-Lactamantibiotika und Acylverbindungen zur Durchführung des Verfahrens" Priorität: 19. September 1979, Japan, Nr. 119 260/79 20 Patentansprüche

1. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Penicillinen oder Cephalosporinen aus deren Kernaminen unter Einwirkung einer Amido-acylase, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acylquelle einen Ester der allgemeinen Formel I • verwendet

RCOO(CH₀CHO) Y (I)

X
30

in der

RCO einen Acylrest für eine Penicillin- oder Cephalosporinseitenkette,

X ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkyl- oder Hydroxy nieder-a3,kylrest und

Y ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkylrest bedeutet *und

^L 130015/0908

Γ π

η eine positive ganze Zahl ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kernamin eine Verbindung der allgemeinen Formel 5 HpN-Q verwendet und als gewünschtes Penicillin oder Cephalosporin eine ß-Lactamverbindung der allgemeinen Formel RCONH-Q herstellt, wobei Q einen Penicillin- oder Cephalosporinkern der allgemeinen Formeln bedeutet

-"V ^SyCH^ oder

COOH

worin Z ein Wasserstoff- oder Halogenatom, einen nucleo-

philen Rest, eine Methyl-, Halogenmethyl- oder durch einen nucleophilen Rest substituierte Methylgruppe darstellt, und RCO die vorstehende Bedeutung hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X eine Hydroxymethylgruppe und Y ein Wasserstoffatom bedeutet und η den Wert 1 hat.

2g 4. Verfahren nach-Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X und Y Wasserstoffatome bedeuten und η einen Wert von Λ bis 15 hat.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Wasserstoffatom und Y einen niederen Alkylrest bedeutet und η einen Wert von 4 bis 15 hat.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass Y eine Methylgruppe bedeutet.

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γ -ι

"³ " 3035487

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acylase eine Amido-acylase aus Bakterien oder Pilzen verwendet.

& 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Acylase in immobilisierter Form verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eines der folgenden Produkte herstellt: Cefaclor, Cefacetril, Cefazolin, Cefatrizin, Cefadroxyl, Cefapyrin, Cefamandol, Cefalexin, Cefaloglycin, Cefalotin, Cefaloridin, Cefaclomezin, Cefsulodin, Ceftezol, Cefradin, CGP-9000, · Phenylacetamidocephalosporansäure, Phenoxyacetamidocepha-losporansäure, Amoxicillin, Ampicillin, Carbenicillin, Phenoxymethylpenicillin, Phenoxypropylpenicillin und Benzylpenicillin.

10. Verbindungen der allgemeinen Formel

₂₀ RCOO(CH₂CHO)_nY

in der R, X, Y und η die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben.

11. Verbindungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass

X eine Hydroxymethylgruppe und Y ein Wasserstoffatom bedeutet und η den Wert 1 hat.

12. Verbindungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Wasserstoffatom und Y ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet und η einen Wert von 1 bis 20 hat.

13. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 10 als Acyl-

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" * " ' 303548?

1 quelle bei der enzymatischen Acylierung nach Anspruch 1.

14. Ausführungsform nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Acylierung ein Gemisch aus Produkten mit 5" verschiedenen η-Werten verwendet.

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