DE3032606A1 - Thrombolytic streptokinase polysaccharide deriv. - prepd. by reacting pre:oxidised dextran with streptokinase, then reducing - Google Patents
Thrombolytic streptokinase polysaccharide deriv. - prepd. by reacting pre:oxidised dextran with streptokinase, then reducingInfo
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Abstract
Description
Beschreibung description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die chemischpharmazeutische Industrie, insbesondere auf ein neues Poly saccharidderivat der Streptokinase, ein Verfahren zu dessen Herstellung und Anwendung. Das genannte neue Polysaccharidderitat der Streptokinase findet Verwendung als Wirkstoff eines Arzneimittels das eine thrombolytische Wirksamkeit besitzt, sowie für biologische Untersuchungen. The present invention relates to chemical-pharmaceutical Industry, in particular a new polysaccharide derivative of streptokinase Process for its manufacture and use. The said new polysaccharide deritat the streptokinase is used as an active ingredient of a drug that is a thrombolytic Has effectiveness, as well as for biological studies.
Zur Zeit ist eine Streptokinase bekannt, die in der Medizin als thrombolytisches Arzneimittel bei der Behandlung solcher Erkrankungen wie Myokardinfark, Thrombosen und Thromboembolien der Sungenarterien breit verwendet wird. Das Präparat wird intravenös währen einiger Tage eingeführt. Jedoch wird die Therapie mit Streptokinase durch zwei Umstände erschwert.At present, a streptokinase is known which is used in medicine as a thrombolytic Medicines in the treatment of such diseases as myocardial infarction, thrombosis and thromboembolism of the pulmonary arteries is widely used. The preparation is intravenous introduced over a few days. However, the therapy with streptokinase gets through two circumstances complicated.
Erstens wird Streptokinase, ebenso wie alle Fermentpräparate, unter physiologischen Bedingungen unter Einwirkungen von pH, Temperatur endogenen Proteasen und Naturinhibitoren schnell inaktiviert und aus dem Blutstrom schnell entfernt, was zur Notwendigkeit fiihrt, hohe Fermentdosen während einer längeren Frist einzuführen. Zweitens stellt Streptokinase ein artfremdes Protein dar, das eine starke immunologische Reaktion des Organismus hervorruft. Ausserdem kann eine häufige oder wiederhoLte Anwendung der Streptokinase unerwünschte Nebenreaktionen bis an den anaphylaktischen Schock sogar bei deren ersten Anwendung auslösen.First, streptokinase, like all ferment supplements, is under physiological conditions under the influence of pH, temperature endogenous proteases and natural inhibitors quickly inactivated and quickly removed from the bloodstream, which leads to the need to introduce high fermentation doses over a longer period of time. Second, streptokinase is an alien protein that has a strong immunological Reaction of the organism. It can also be frequent or repeated Use of streptokinase unwanted side reactions up to the anaphylactic Trigger shock even on first use.
Zur Zeit ist es bekannt, dass die Bindung der Fermente mit löslichen bioverträglichen Polymeren in vielen Fellen gestattet, Arzneimittel zu erhalten, die im Vergleich zu nativen Fermenten eine recht erhöhte Stabilität inbezug auf verschiedene inaktivierende Einwirkungen, eine verlangsamte Elimination aus dem Organismus und herabgesetzte antigene Eigenschaften besitzen. At present it is known that the binding of the ferments with soluble biocompatible polymers in many pelts allowed to obtain drugs, which compared to native ferments have a rather increased stability in relation to different inactivating effects, a slowed elimination from the organism and have reduced antigenic properties.
Es sind Polysaccharidderivate der Streptokinase, insbesondere Streptokinasederivat mit dem mit Bromcyan aktivierten löslichen Dextran bekannt (US-PS Nr. 3639213, 1972). They are polysaccharide derivatives of streptokinase, especially streptokinase derivatives known with the soluble dextran activated with cyanogen bromide (US-PS No. 3639213, 1972).
Das Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen sieht die Aktivierung von Dextran mit einer hochtoxischen Verbindung, Bromzyan, vor. Deswegen ist die Verwendung der genannten Verbindungen zu medizinischen Zwecken unmöglich.The process for the preparation of the compounds mentioned sees the Activation of dextran with a highly toxic compound, bromocyanine. Because of this the use of the compounds mentioned for medical purposes is impossible.
Ausserdem ist die Bioverträglichkeit solch eines Trägers problematisch, weil die dort vorhandenen Äktivgruppen der cycli schen Iminokarbonate durch eine hohe Reaktionsfähigkeit gekennzeichnet werden und mit anderen Proteinen des Organismus reagieren können.In addition, the biocompatibility of such a carrier is problematic, because the there active groups of the cyclic iminocarbonates by one high reactivity are characterized and with other proteins of the organism can react.
Das erfindungsgemässe Polysaccharidderivat der Strepto kinase ist neu und wurde in der Literatur nicht beschrieben. The polysaccharide derivative according to the invention of strepto kinase is new and has not been described in the literature.
Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrundegelegt, ein neues Polysaccharidderivat der Streptokinase, dRs zu medizinischen Zwecken verwendet werden kann, das eine thrombolytische Wirksamkeit, erhöhte Stabilität, herabgesetzte antigene Rigenschaften und erhöhte Zirkulationsdauer im Blutstrom besitzt, unter Verwendung eines Trägers zu entwickeln, der den medizinischen Forderungen entspricht und nach der Immobilisierung keine freien reaktionsfähigen Gruppen enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung von genanntem Streptokinasederivat mit einer einfacheren Technologie auszuarbeiten, die den Einsatz toxischer Reagentien ausschliesst. The invention was based on the object of a new polysaccharide derivative of streptokinase, which can be used for medicinal purposes, the one thrombolytic effectiveness, increased stability, reduced antigenic properties and has increased circulation time in the blood stream, using a carrier to develop that meets the medical requirements and after immobilization contains no free reactive groups, and a method of preparation to elaborate from said streptokinase derivative with a simpler technology, which excludes the use of toxic reagents.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass das erfindungs gemässe Polysaccharidderivat der Streptokinase die folgende Formel atifweist: worin NH-Streptokinase native Streptokinase, X von 100 bis 1000 bedeuten, und das Protein in einer Menge von IO bis 20 Gew.% enthält.The object was achieved in that the polysaccharide derivative of the streptokinase according to the invention has the following formula: wherein NH streptokinase is native streptokinase, X is from 100 to 1000, and the protein is contained in an amount of from 10 to 20% by weight.
Erfindungsgemäss besteht das Verfahren zur Herstellung des genannten Polysaccharidderivats der Streptokinase darin, duss man Streptokinase mit dem vorher oxydierten wasserlöslichen Dextran der allgemeinen Formel (C6H10O5) X, worin X von 100 bis 1000 bedeutet, bei einer Temperatur von 8 bis 30°C tind einem pH-Wert von 6,0 bis 10,5 umsetzt, anschliessend das erhaltene Produkt mit Natriumborhydrid reduziert und das Endprodukt isoliert. Das erhaltene Endprodukt stellt die mit dem oxydierten Dextran gebundene Streptokinase, dar. Der Oxyda tionsgrand von Dextran betragt von 5 bis 35 %. Die Bindung des Ferments mit dem oxydierten Dextran geht nach dem Bildungsmechanismus der Schiffschen Basen zwischen den Aldehydgruppen von Dextran und Aminogruppen des Ferments vor sich. Die Bindungsreaktion verläuft in der Lösung während 30 bis 120 Minu ten. Nach der Bindung mit dem Ferment werden nicht umgesetzte 130012/0788 Aldehydgruppen des Trägers in inerte Oxygruppen unter Binv/irlcung des Reduktionsmittels, Natriumborhydrid, leicht übergeffihrt. Das Endprodukt wird durch die lyophile Trocknung nach der Reduktion mit Natriumborhydrid und nach der Dialyse gegen Wasser während 18 bis 40 stunden bei einer Temperatur von 4 bis 7 °C zwecks der zusätzlichen Reinigung des Präparats isoliert. Das Molekulargewicht des erfindungsgemässen Polysaccharidderivats der Streptokinase beträgt 100000-300000, der Proteingehalt 10 bis 20 %, der Dextrangehalt 60 bis 80 %. Diese Verbindung besitzt eine thrombolytische Wirksamkeit, er höhte Stabilität, herabgesetzte antigene Eingenschaften und eine erhöhte Zirkulationsdauer im Organismus. Die erfindungsgemäse Yerbindung hält vollständig seine biologische Wirksamkeit laut den Angaben der Untersuchungen in vivo und in vitro aufrecht und besitzt eine ganze Reihe von Vorteilen im Vergleich zur nativen Streptokinase Die biologische Wirksamkeit und - die Toxizität der erfindungsgemäsen Verbindung wurden im Tierversuch untersucht. Die Untersuchung wurde an mannlichen Kaninchen der Chinchilla-Rasse von 2,2 bis 2,5 kg Körpergewicht und an nicht reinrassigen Hunden von 12 bis 13 kg KGrpergewicht durchgeführt. According to the invention, there is a method for producing said Polysaccharide derivative of streptokinase in that streptokinase must be mixed with before oxidized water-soluble dextran of the general formula (C6H10O5) X, wherein X of 100 to 1000 means at a temperature of 8 to 30 ° C and a pH of 6.0 to 10.5 reacted, then reduced the product obtained with sodium borohydride and isolate the final product. The final product obtained represents that with the oxidized one Dextran-bound streptokinase, represents. The Oxyda tion grand of dextran amounts to 5 to 35%. The binding of the ferment with the oxidized dextran takes place according to the formation mechanism the Schiff bases between the aldehyde groups of dextran and amino groups of Ferments in front of you. The binding reaction takes place in the solution for 30 to 120 hours Minu th. After binding with the ferment, unreacted 130012/0788 Aldehyde groups of the carrier into inert oxy groups with binding of the reducing agent, sodium borohydride, easily transferred. The final product is made by lyophilic drying after reduction with sodium borohydride and after dialysis against water for 18 to 40 hours at a temperature of 4 to 7 ° C for the purpose of additional cleaning of the preparation isolated. The molecular weight of the polysaccharide derivative of the invention Streptokinase is 100,000-300,000, the protein content 10-20%, the dextran content 60 to 80%. This compound has thrombolytic activity, he said Stability, reduced antigenic properties and increased circulation time in the organism. The compound according to the invention retains its biological properties completely Efficacy according to the data of the studies in vivo and in vitro upright and has a number of advantages compared to the native streptokinase die biological effectiveness and - the toxicity of the compound according to the invention examined in animal experiments. The study was carried out on male chinchilla rabbits from 2.2 to 2.5 kg body weight and on non-purebred dogs from 12 to 13 kg body weight carried out.
Ausgehend von der vermutlichen prolongierten fibrinolytischein Wirkung des erfindungsgemäßen Streptokinasederivats wurde die zu untersuchende Praparatdosis, 30000 bis 240000 IE/kg Körpergewicht, in der physiologischen Lösung für Kaninchen in 20 bis 30 ml, für Hunde in 50 bis IOO ml gelöst und mit einer Spritze während 20 Minuten intravenös strahlartig eingeführt. Based on the presumed prolonged fibrinolytic effect of the streptokinase derivative according to the invention, the preparation dose to be investigated was 30,000 to 240,000 IU / kg body weight, in the physiological solution for rabbits dissolved in 20 to 30 ml, for dogs in 50 to 100 ml and with a syringe during Immediately injected intravenously for 20 minutes.
Die Einführung des Versuchs- (und Kontroll-) präparats begann man eine Stunde nach der Thrombendildung. Das Präparat wurde den aninchen in die Vene an der Seite der Thrombenbildung in der Drosselvene, den Hunden - in die Vene der hinteren PBote injiziert. The introduction of the experimental (and control) preparation began one hour after thrombus formation. The preparation became the rabbit into the vein on the side of thrombus formation in the jugular vein, the dogs - in injected the vein of the posterior PBote.
Die Blutanalyse wurde vor dem Beginn des Versuchs,2 Stunden 3 Stunden und 1, 2, 3 Tage nach der Thrombenbildung unter~ nommen. FSr jede Serie der Blutanalysen des Tiers wurden 10 bis 12 ml Blut aus den unbeschädigten Venen genommen Der Blutverlust wurde durch die Einführung der gleichen Menge der sterilen physiologischen Lösung kompensiert. Die Dynamik der Thrombendildung und Thrombolyse wurde im laufe der ersten 6 Stunden des Versuchs und nach 1, 2 und 3 Tagen visuell und manuell beobachtet. Die Ängiographie und Fluometrie wurden vor dem Beginn des Versuchs, nach 1, 2 und 3 Tagen, durchgeführt. Nach Beendigung des Versuchs wurden die Tiere getötet. Danach wurden für die histologische Untersuchung die Stückchen der Blutgefässe in den Stellen der Thrombenfixation genommen. Die Prüfergebnisse haben ergeben, dass die erfindungsgemässe Verbindung eine prolongierte Wirkung besitzt. The blood analysis was done before the start of the experiment, 2 hours 3 hours and 1, 2, 3 days after thrombus formation. FS for each series of blood tests of the animal, 10 to 12 ml of blood was drawn from the undamaged veins. The blood loss was made by introducing the same amount of sterile physiological solution compensated. The dynamics of thrombogenesis and thrombolysis has been increased over the course of the observed visually and manually in the first 6 hours of the experiment and after 1, 2 and 3 days. The angiography and fluometry were performed before the start of the experiment, after 1, 2 and 3 days. After the end of the experiment, the animals were sacrificed. Thereafter For the histological examination, the fragments of the blood vessels in the places taken from the thrombus fixation. The test results have shown that the inventive Connection has a prolonged effect.
Die thrombolytische Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindung wurde am Modell der Thromben der Oberschenkelschlagadern und -venen der Hunde und der Drosselvene des Kaninchens untersucht (Tabelle 1). The thrombolytic activity of the compound according to the invention was modeled on the thigh arteries and veins thrombi in dogs and of the rabbit's jugular vein examined (Table 1).
Tabelle 1 Versuchs Benennung des Prä- Zahl Zahl der Unter- Räufiggruppen parats der Be- suchungsmetho- keit der der obach- der für jedes Anwendung Tiere tungen Tier jeder Untersuch. Table 1 Experiment Designation of the pre-number Number of the sub-frequency groups ready for the inspection method of the observer for every application animals animal every investigation.
methode 1 2 3 4 1. Untersuchung am Modell des Thrombus der Drosselvene eines Kaninchens Kontrolle - 5 2-3 1-3 Versuch I native Streptoki- 3 14-15 4-6 nase Versuch II das erfindungs- IO 14-15 2-6 gemässe Streptokinasederivat 2. Untersuchungen am Modell des Thrombus der Oberschenkelvene eines Hundes Kontrolle - 2 2-3 1-3 Versuch 1 native Streptoki- 1 15 1-6 nase Versuch II das erfindungsge- 2 15 1-6 mässe Streptokinasederivat 3. Untersuchung am Modell des Thrombus der Oberschenkelschlagader eines Hundes Kontrolle - 2 2-3 1-3 Versuch 1 native Streptoki- 1 15 1-6 nase Versuch II das erfindungsge- 2 15 1-6 mässe Streptokinasederivat Die an Stunden erhaltenen Ergebnisse bestätigten die Gesetzmässigkeiten der an Kaninchen festgestellten thrombolytischen Therapie. method 1 2 3 4 1. Examination on the model of the thrombus of the jugular vein of a rabbit control - 5 2-3 1-3 trial I native streptoki- 3 14-15 4-6 nose Experiment II the streptokinase derivative according to the invention IO 14-15 2-6 2. Investigations on the model of the thigh vein thrombus of a dog Control - 2 2-3 1-3 attempt 1 native streptokinase 1 15 1-6 nasal experiment II the streptokinase derivative according to the invention 3. Examination on the model of the thrombus of the femoral artery of a dog Control - 2 2-3 1-3 experiment 1 native streptoki- 1 15 1-6 nose experiment II the invention 2 15 1-6 degree streptokinase derivative The results obtained in hours confirmed the regularities of the thrombolytic found in rabbits Therapy.
Zur Untersuchung der thrombolytischen Wirksamkeit der nativen Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasederivats werden die Präparate nach der Methode der einmaligen intravenösen strahlartigen Infusion während 20 Minuten eingeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angeführt. To study the thrombolytic effectiveness of native streptokinase and the streptokinase derivative according to the invention, the preparations are made by the method a single intravenous jet infusion for 20 minutes. The results are shown in Table 2.
Tabelle 2 Charakteristik Versuchsprä- Thrombenloka- Präparat- Effektider Tiergruppe parat lisation dosis in vität IE/kg der fib-Körper- rinolytigewicht schen Therapie 1 2 3 4 5 Kontrolle - Drosselvene - keine des Kaninchens -"- - -"--"- - -"-Vene des - -"-Hundes Arterie des Hundes Versuch I native Drosselvene 50.000 keine Strepto- des Eaninkinase chens -"- 50.000 vollständige Lyse -"- 75.000 -"--"- 85.000 -"- (Fortsetzung der Tabelle 2) 1 2 2 3 4 5 Drosselvene 85.000 Volldes Kanin- ständige Lyse chens -"- 100.000 -"- 100.000 Vene des 70.000 voll-Hundes standige Lyse Arterie 70.000 volldes Hundes ständige Lyse Versuch II das erfin- Drosselvene 40.000 keine dungsgemäse des Kanin Streptokina- chens sederivat - T1 - 50,000 vollständige lyse » - 50.000 keine - 50.000 vollständige lyse -"- 100.000 vollständige Lyse r " - 100.000 keine -"- 125.000 vollständige Lyse -"- 210.000 -"--"- 240.000 -"-Vene des 55.000 keine Lyse Hundes -"- 70.000 vollständige Lyse Arterie des 55.000 keine Lyse Hundes -"- 70.000 vollständige lyse Aus den erhaltenen Daten folgt also, dass die minimale therapeutische Dosis des erfindungsgemassen Streptokinasederivats 50.000 IE/kg, die optimale - über 100.000 IE/kg be trägt, und die thrombolythische Wirksamkeit der nativen Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasederivats diegleiche ist. Table 2 Characteristics of the experimental pre-thrombocyte preparation effector Animal group preparation dose in vity IU / kg of fib body rinolytic weight Therapy 1 2 3 4 5 control - jugular vein - none of the rabbit - "- - -" - "- - - "- vein of the - -" - dog artery of the dog attempt I native jugular vein 50,000 none Strepto- des eanin kinase - "- 50,000 complete lysis -" - 75,000 - "-" - 85,000 - "- (Continuation of Table 2) 1 2 2 3 4 5 Jugular vein 85,000 Full of rabbit constant lysis - "- 100,000 -" - 100,000 vein of the 70,000 full dog permanent lysis artery 70,000 full of the dog permanent lysis attempt II the invented Jugular vein 40,000 none according to the canine streptokina- chens sederivat - T1 - 50,000 complete analysis »- 50,000 none - 50,000 complete analysis -" - 100,000 complete lysis r "- 100,000 none -" - 125,000 complete lysis - "- 210,000 - "-" - 240,000 - "- Vein of 55,000 no lysis dog -" - 70,000 complete lysis Artery of the 55,000 no lysis dog - "- 70,000 complete lysis the end it follows from the data obtained that the minimum therapeutic dose of the invention Streptokinase derivative 50,000 IU / kg, the optimal - over 100,000 IU / kg, and the thrombolytic activity of native streptokinase and that of the invention Streptokinase derivative is the same.
Es wurden die Veränderungen des Blutgerinnungs- und des fibrinolytischen Blutsystems untersucht, Es wurde die Zeit der Plasmarekalzifikation nach der Einführung den Versuchs tieren des erfindungsgemäss vorgeschlagenen Streptokinasederivats oder der nativen Streptokinase gemessen (in sec). There were changes in blood coagulation and fibrinolytic Blood system examined, the time of plasma recalcification after the introduction was examined the experimental animals of the streptokinase derivative proposed according to the invention or the native streptokinase measured (in sec).
Es wurde festgestellt, dass bei der Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats die Zeit der Plasmarekalzifikation wesentlich erhöht wird. It was found that when the inventive Streptokinase derivative the time of plasma recalcification is significantly increased.
Ausserdem wurde die Fibrinogenkonzentration bei den Versuchstieren in mg% nach G.A. Ruthberg durch das Wägen des bei der Rekalzifikation des Zitratplasmas gebildeten lufttrockenen Fibrinpfropfens bestimmt. In addition, the fibrinogen concentration in the test animals in mg% according to G.A. Ruthberg by weighing the during the recalcification of the citrate plasma formed air-dry fibrin plug determined.
Es Wurde Sestgestellt, dass die Fibrinogenkonzentration im Blutplasma der Xaninchen in den ersten Stunden nach der Einführung der Streptokinasepräparate stark herabgesetzt wird. It was found that the concentration of fibrinogen in blood plasma of the rabbits in the first hours after the introduction of the streptokinase preparations is greatly reduced.
Nach 24 Stunden erreicht die Fibrinogenkonzentration den Ausgangswert oder übersteigt diesen. Bei den Tieren, bei welchen die Thrombolyse nach der Einführung der immobilisierten Streptokinase stattfand, wuchs die Fibrinogenkonzentration nach 24 Stunden in geringerem Masse, als bei den Tieren an,bei denen die Thrombolyse nicht stattfand Bei Hunden sank stark die Fibrinogenkonzentration 2 Stunden nach der Einführung der Ver s1lchspräpatate und erreichte die Norm nach 24 Stunden, nachher stieg diese an.After 24 hours the fibrinogen concentration reaches the initial value or exceeds this. In animals in which thrombolysis after introduction the immobilized streptokinase took place, the fibrinogen concentration increased again 24 hours to a lesser extent than in the animals in which the thrombolysis did not take place In dogs, the fibrinogen concentration fell sharply after 2 hours the introduction of the sedative drug and reached the norm after 24 hours, afterwards rose this on.
Neben der Erhöhung der Zeit der Plasmarekalzifikation und der Herabsetzung der Fibrinogenkonzentration 2 bis 3 Stunden nach der Einführung der Praparate wurde auch die Verkürzung der Zeit der Lyse der Euglobulinplasmafraktion nachgewissen, die nach Kovarik bestimmt wird. Besides increasing the time of plasma recalcification and decreasing it the fibrinogen concentration 2 to 3 hours after the introduction of the preparations also demonstrated the shortening of the lysis time of the euglobulin plasma fraction, which is determined according to Kovarik.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt. The results are shown in Table 3.
Tabelle 3
Die Veränderung der Lyse der Euglobulinplasmafraktion bei Kaninchen nach der Einführung der Versuchs- und Kontrollmuster der Streptokinase wurden so deutlich ausgeprägt, dass der Pfropfen aus der Euglobulinplasmafraktion momentan lysierte. Die Wiederherstellung der thrombolytischen Blutaktivität bis zum Ausgangswert ist nach 24 Stunden nach der Präparateinführung vollendet. Vor dem Versuch ging die Thrombolyse des Euglobulinpfropfens mindestens für 4 Stunden vor sich. Manchmal wurde keine lyse sogar nach 24 Stunden nachgewiesen. Jedoch ging die Lyse im Blutplasma, das 2 Stunden nach der Praparateinführung genommen wurde, sehr schnell vor sich; dabei wurde bei Kaninchen eine deutliche Gesetzmässigkeit beobachtet ~ wenn die Pfropfenlyse nicht beschleunigt wurde, fand die Thrombolyse in der Regel statt-e Die Veränderung der Lyse der Buglabulinblutfraktion ei Hunden ist nicht so wesentlich, wie bei Kani'nchen, und erreicht die Norm in .24 Stunden üm die Veränderungen des fibrinolytischen und des Blutgerinntingssysteas bei Kaninchen je nach der Einführung der native ten Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasedervats zu klären, wurden thrombenelastographische Untersuchungen (TEG) an einen Thrombenelastographen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt. The change in lysis of the euglobulin plasma fraction in rabbits after the introduction of the test and control samples of streptokinase became so clearly pronounced that the plug from the euglobulin plasma fraction momentarily lysed. Restoring blood thrombolytic activity to baseline is completed within 24 hours after the introduction of the preparation. Before trying went thrombolysis of the euglobulin plug for at least 4 hours. Once in a while no lysis was detected even after 24 hours. However, the lysis in the blood plasma went that was taken 2 hours after the preparation was introduced very quickly; a clear regularity was observed in rabbits - if the Plug lysis was not accelerated, thrombolysis usually took place - e The change in lysis of the buglabulin blood fraction in dogs is not as significant as as with rabbits, and reaches the norm in .24 hours about the changes in the fibrinolytic and coagulation systems in rabbits depending on the introduction the native streptokinase and the streptokinase derivative according to the invention clarify, were thrombus elastographic examinations (TEG) on a thrombus elastograph carried out. The results are shown in Table 4.
Tabelle 4
k (in mm) ma (in mm) c.i. k (in mm) ma (in mm) c.i.
Durch- Schwan- Durch- Schwan- Durch- Schwanschnitts- kungs- schnitts- dungs- schnitts- kungsdaten bereich daten bereich daten bereich 27 21-48 47 33-63 1,O 0,5-1,3 35 14-60 im 33 9-48 0,9 0,3-1,7 im 1. Versuch 1. Versuch k=260 0,01 41 36-48 38 29-44 0,4 0,3-0,6 78 45-118 41 28-55 0,3 0,1-0,4 75 59-92 im 40 34-47 0,3 0,2-0,4 im 1.Versuch 1.Versuch k=260 c.i.0,01 17 9-23 57 53-61 1,7 1,0-2,9 41 18-60 36 23-59 0,6 0,3-1,0 22 21-22 56 50-60 1,0 0,8-1,2 39 12-92 50 23-65 1,2 0,3-1,8 50 49-52 in 17 IO-27 0,3 0,7-0,5 in -2 Versuchen 2 Versuch k=260 ci. 0,01 84 40-123 30 22-47 0,2 16 12-20 55 40-62 1,5 0,9-1,7 Anmerkung: wenn "k"=260 ist, so bedeutet es, dass während 30 min die Breite der thromboelastographischen Zweige 20 mm nicht erreicht, d. h. es wird Hypokoaguation beobachtet (die Geschwindigkeit des Bandziehens beträgt 8,7 mm pro 1 min). In diesem Fall betragt c.i weniger als 0,01, d.h. die Gerinnung ist stark verlangsamt.Average Swan Average Swan Average Swan Section Average intersection data area data area data area 27 21-48 47 33-63 1, O 0.5-1.3 35 14-60 in 33 9-48 0.9 0.3-1.7 in 1st attempt 1st attempt k = 260 0.01 41 36-48 38 29-44 0.4 0.3-0.6 78 45-118 41 28-55 0.3 0.1-0.4 75 59-92 in 40 34-47 0.3 0.2-0.4 in 1st attempt 1st attempt k = 260 c.i.0.01 17 9-23 57 53-61 1.7 1.0-2.9 41 18-60 36 23-59 0.6 0.3-1.0 22 21-22 56 50-60 1.0 0.8-1.2 39 12-92 50 23-65 1.2 0.3- 1.8 50 49-52 in 17 IO-27 0.3 0.7-0.5 in -2 attempts 2 attempts k = 260 ci. 0.01 84 40-123 30 22-47 0.2 16 12-20 55 40-62 1.5 0.9-1.7 Note: when "k" = 260, it means it that during 30 min the width of the thromboelastographic branches is not 20 mm achieved, d. H. hypocoaguation is observed (the speed at which the tape is pulled is 8.7 mm per 1 min). In this case, c.i is less than 0.01, i.e. the Coagulation is greatly slowed down.
Die angeführten Daten zeigen, dass bei den Kaninchen, bei denen die Thrombolyse nach der Einführung der erfindungsgemässen Streptokinasederivats stattfand, wesentliche Veränderungen der TEG-Indexe nur nach 24 Stunden nachgewiesen wurden (die Verlängerung von "r", die der unsichtbaren Ge rinnung entspricht, und die Verlangerung von "k", die den Beginn der Bildung des Fibrinpfropfens kennzeichnet). Die Verlängerung der Zeit dieser zwei Werte zeugt von der Hypokoagulation. Es verminderte sich die Amplitude "ma"m die von der Herabsetzung der Viskosität des geronnenen Bluts zeugt. Der Koagulationsindex (c.i) sinkt auch wesentlich nur nach 24 Stunden (um 70 % vom Äusgangswert). The data shown show that in the rabbits in which the Thrombolysis took place after the introduction of the streptokinase derivative according to the invention, significant changes in the TEG indices were only detected after 24 hours (the lengthening of "r", which corresponds to the invisible coagulation, and the lengthening of "k", which marks the beginning of the formation of the fibrin plug). The extension the time of these two values is evidence of hypocoagulation. It decreased the Amplitude "ma" m which testifies to the decrease in the viscosity of the clotted blood. The coagulation index (c.i) also only drops significantly after 24 hours (by 70% from Initial value).
Bei der Einführung der nativen Streptokinase wurden die meisten Veränderungen der TEG-Indexe schon 2 Stunden nach der Einführung des Präparats beobschtet. Der Koaguationsindex sank um 75 % und nach 2 Tagen erreichten die TEG-Indexe die Norm. Bei der Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats blieben die TEG-Indexe bis 5 Tage nach der Präparateinführung stark verandert, d.h. es wurde die Wirkungsprolongation des erfindungsgemässen Streptokinasederivats im Vergleich zur nativen Streptokinase beobachtet. Bei Tieren, bei welchen keine Thrombolyse nach der Einführung des erfindungsgemäßen Streptokinasederivats stattfand, erreichten die TEG-Indexe, die sich 2 Stunden nach der Praparateinf\:ihrung verandert hatten, nach 24 Stunden praktisch die Norm; Nach den Angaben der Koagulographenaufnahme wurde eine scharfe Verlangsamung der Zeit der Gerinnung 2 Stunden und 24 Stunden nach der Einfuhrung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats nachgewiesen. Nach 2 Tagen erreichte die Gerinnungszeit den Normwert. Im Falle der. Einführung den Versuchstieren derselben Dosis der nativen Streptokinase wurde die Gerinnungszeit schon zu Ende der ersten 24 Spunden bis zum Ausgangswert beschleunigt. Most of the changes were made with the introduction of native streptokinase the TEG index is observed already 2 hours after the introduction of the preparation. Of the Coagulation index decreased by 75% and after 2 days the TEG indexes reached the norm. When the streptokinase derivative according to the invention was introduced, the TEG indices remained up to 5 days after the introduction of the preparation changed significantly, i.e. the effect was prolonged of the streptokinase derivative according to the invention in comparison to the native streptokinase observed. In animals in which no thrombolysis after the introduction of the invention Streptokinase derivative took place, the TEG indexes reached, which were 2 hours after the introduction of the preparation had changed, practically the norm after 24 hours; To According to the information from the coagulograph record, there was a sharp slowdown in time the coagulation 2 hours and 24 hours after the introduction of the invention Streptokinase derivative detected. The clotting time reached after 2 days the Standard value. In case of. Introduce the same dose to the test animals as the native one Streptokinase was already at the end of the first 24 bungs to the clotting time Output value accelerated.
In den Versuchen, wo den Kaninchen eine hohe Dosis des erfindungsgemässen Streptokinasederivats (über 100.000 IE/kgg Körpergewicht) eingefiihrt wurde, wurde fast nach allen Testen die Prolongation der Präparatwirkung bis 3 Tage festgestellt. In the experiments where the rabbits were given a high dose of the invention Streptokinase derivative (over 100,000 IU / kgg body weight) was introduced After almost all tests, the prolongation of the effect of the preparation up to 3 days was found.
Dabei wurde am Thromboelastogramm eine scharfe Verlangerung der Gerinnungszeit, eine Verminderung der Fläche der TEG-Zweige und eine Senkung des Gerinnungsindexes bestimmt. Die Prolongation der Wirkung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats im Laufe von 2 bis 3 Tagen wurde auch durch die Angaben des Koagulogramms bestätigt, d.h. die Verlängerung der Zeit der Plasmarekalzifikation und die Senkung der Aktivität des FGF (fibringerinnender Faktor), Plasmatoleranz gegen Heparin.The thromboelastogram showed a sharp increase in the coagulation time, a decrease in the area of the TEG branches and a decrease in the coagulation index certainly. The prolongation of the effect of the streptokinase derivative according to the invention in the course of 2 to 3 days it was also confirmed by the details of the coagulogram, i.e. the increase in the time of plasma recalcification and the decrease in activity of FGF (fibrin clotting factor), plasma tolerance to heparin.
Bei der Durchführung ähnlicher Untersuchungen an Hunden erreichte der Thrombotest die Norm nach 24 Stunden (Veränderung der TEG-Indexe, Verlangerung von "rtt und "kt', Verminderung der Amplitude "ma", Senkung des Koagulationsindexes "c.i" um 70 % vom Äusgangswert). When doing similar research on dogs, achieved the thrombotest the norm after 24 hours (change in TEG indexes, prolongation of "rtt and" kt ', decrease in amplitude "ma", decrease in coagulation index "c.i" by 70% of the initial value).
Die Toxizität des erfindungsgemässen Streptokinasederivats wurde im akuten Versuch an weissen Mäusen und Kaninchen untersucht. In den Versuchen an Mäusen CWP von 18 bis 20 g Körpergewicht wurden die native Streptokinase, das erfindungsgemässe Streptokinasederivat und das oxydierte Dextran, das die Matrize des erfindungsgemässen Präparats darstellt, intravenös in Form von wässrigen Lösunggen in einer Menge von 0,5 ml eingeführt. Die Tiere wurden während 7 Tage beobachtet. The toxicity of the streptokinase derivative according to the invention was investigated in acute experiments on white mice and rabbits. In the trials on Mice CWP of 18 to 20 g body weight became the native streptokinase, the one according to the invention Streptokinase derivative and the oxidized dextran, which is the template of the invention Preparation represents intravenous in the form of aqueous solutions in the amount of 0.5 ml introduced. The animals were observed for 7 days.
Es wurde festgestellt, dass die einiallge Einführung der nativen Streptokinase in Dosen von 1 g/kg, des erfindungsgemässen Streptokinasederivats und des oxydierten Dextrans in Dosen bis 2 g/kg kein Sterben der Mäuse hervorruft und deren Verhalten und Aussehen nicht beeinflusst. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. It was found that the introduction of the native Streptokinase in doses of 1 g / kg, of the streptokinase derivative according to the invention and the oxidized dextran in doses up to 2 g / kg does not cause death of the mice and does not affect their behavior and appearance. The results obtained are shown in Table 5.
Die erhaltenen Ergebnisse gestatten zu behaupten, dass die beiden Präparate bei der einmaligen intravenösen Einfdlirung den Mäusen in Dosen, die die therapeutischen Maximaldosen um 50 bis 100mal übersteigen, von den Tieren gut vertragen werden und dass das erfindungsgemässe Streptokinasederivat keine höhere Toxizität als die native Streptokinase besitzt. The results obtained allow us to state that both Preparations for a single intravenous administration to the mice in doses corresponding to the the maximum therapeutic dose by 50 to 100 times, well tolerated by the animals and that the streptokinase derivative according to the invention does not have any higher toxicity than the native streptokinase possesses.
Tabelle 5 Zahl der ein gegangenen (Zähler) und der überlebenden (Nenner) Mäuse bei der intravenösen Einführung der untersuchten Präparate Präparat Aktivi- Dosen (mg/kg) und Ergebnisse Seriennummer tät der Bestimmungen IE/mg 250 500 750 100 2000 native Streptokinase 12500 0,6 0/6 0/6 0/6 0/6 das erfindungsge- 5250 0/6 0/6 0/6 0/6 zu 0/6 mässe Streptokinas ederiv at das erfindungsge- 5000 0,6 0/6 0/6 0/6 0/6 masse Streptokina sederivat das oxydierte Dextran 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Das erfindungsgemässe Streptokinasederivat wurde auch von Kaninchen gut vertragen. Die intravenöse Einführung des Präparats in Dosen von 50 und 100 Tausend IE/kg wurde durch keine Äusserungen der toxischen Wirkung begleitet, ausgenommen eine unbedeutende Erhöhung der fibrionolytischen Elutaktivität. Table 5 Number of received (numerator) and survivors (denominator) Mice during the intravenous introduction of the examined preparations preparation activi- Doses (mg / kg) and results Serial number of determinations IU / mg 250 500 750 100 2000 native streptokinase 12500 0.6 0/6 0/6 0/6 0/6 the invention 5250 0/6 0/6 0/6 0/6 to 0/6 levels of streptokinas ederiv at the inventive 5000 0.6 0/6 0/6 0/6 0/6 mass of streptokina sederivat the oxidized dextran 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 That The streptokinase derivative according to the invention was also well tolerated by rabbits. the intravenous introduction of the preparation in doses of 50 and 100 thousand IU / kg was made accompanied by no manifestations of the toxic effect, except for an insignificant one Increase of the fibrionolytic elutactivity.
Nach der Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats in einer Dosis von 200 Tausend IE/kg wurde eine etwas ausgeprägtere Fibrinolyse beobachtet, aber auch diese Präparatdosis beeinflusste keinesfalls den Zustand der Tiere.After the introduction of the streptokinase derivative according to the invention in a slightly more pronounced fibrinolysis was observed at a dose of 200 thousand IU / kg, but even this dose of preparation did not in any way affect the condition of the animals.
Allergene Eigenschaften des erfindungsgemässen Streptokinasederivate wurden an Meerschweinchen untersucht. Allergenic properties of the streptokinase derivatives according to the invention were examined on guinea pigs.
Um die anaphylaktogene Aktivität des erfindungsgemässen Streptokinasederivate zu bestimmen, wurden die Meerschweinchen einmalig mit den Dosen von 0,1, 0,5, o13 und 0,05 und 0,005mg Protein/kg immunisiert, was, bezogen auf die Aktivität, 31000, 15500, 4200, 1700 und 155 IE/kg beträgt, Die Ergebnisse die-. To the anaphylactogenic activity of the streptokinase derivatives according to the invention to determine the guinea pigs were given once with the doses of 0.1, 0.5, o13 and 0.05 and 0.005 mg protein / kg immunized, which, based on the activity, 31000, 15500, 4200, 1700 and 155 IU / kg, the results are the-.
ser Untersuchungen, sowie deren Vergleich zu den Daten mit der nativen Streptokinase und anderen Fermenten, die die thrombolytische Wirksamkeit besitzen, sind in Tabelle 6 angeführt.these examinations, as well as their comparison to the data with the native Streptokinase and other enzymes that have thrombolytic activity, are listed in Table 6.
Tabelle 6 Anaphylaktogene Eingeschaften des erfindungsgemässen Streptokinasederivats, der nativen Streptokinase und der thromboiytischen Mikrobenproteinasen Sensibilisierende Anaphylaktische Indexe der Fermente Dosis Streptokinasen ing Protein lE kg kg native Strep- das er- @oly tokinase findungs- tin gemässe Streptokinasederivat 1 2 3 4 5 6 1,0 31000 0,3 0,3 - -0,5 15500 0 0 1,8 2,3 (Fortsetzung der Tabelle 6) 1 2 3 4 5 6 0,13 4200 0 0 - -0,C5 1550 ° ° 1,0 1,4 0,005 155 0 0 1,3 2,0 Anmerkung: "-" wurde nicht bestimmt, 0 - die anaphylaktische Reaktion fehlt. Unterstrichen sind die Dosen, die der maximalen, der therapeutischen (summarisch) = =1,85 Mill. IE entsprechen, 250 Tausend lE und die minimale therapeutische Ausgangsdosis. Table 6 Anaphylactogenic properties of the streptokinase derivative according to the invention, the native streptokinase and the thrombocytic microbial proteinases sensitizing Anaphylactic indexes of the ferments dose streptokinases ing protein lE kg kg native Streptokinase according to the invention, the streptokinase derivative 1 2 3 4 5 6 1.0 31000 0.3 0.3 - -0.5 15 500 0 0 1.8 2.3 (Continuation of the Table 6) 1 2 3 4 5 6 0.13 4200 0 0 - -0, C5 1550 ° ° 1.0 1.4 0.005 155 0 0 1.3 2.0 Note: "-" was not determined, 0 - the anaphylactic reaction is absent. Underlined are the doses that correspond to the maximum, the therapeutic (summary) = = 1.85 million IU, 250 thousand IU and the minimum therapeutic starting dose.
Wie die Untersuchungen ergeben haben, besitzt das erfindungsgemässe Streptokinasederivat praktisch keine anaphylaktogene Wirksamkeit besonders im Vergleich zu solchen Fermenten wie Terrilytin und Hygrolytin. As the investigations have shown, the according to the invention has Streptokinase derivative practically no anaphylactogenic activity especially in comparison to such ferments as terrilytin and hygrolytin.
Die hautsensibilisierende Aktivität des erfindungsge mässen Streptokinasederivats wurde an Meerschweinchen und Kaninchen untersucht. Jeder Versuch schloss 3 Tiergruppen zu 5 bis 6 Tiere ein, denen die Präparate einmalig in Dosen von 31000, 4200 und 1700 IE/kgg eingefiihr't wurden. Die Hautreaktionen wurden nach 3 und 24 Stunden geschätzt, In allen Versuchen wurden negative Ergebnisse erzielt. The skin-sensitizing activity of the streptokinase derivative according to the invention was studied in guinea pigs and rabbits. Each experiment included 3 groups of animals to 5 to 6 animals, for which the preparations are given once in doses of 31000, 4200 and 1700 IU / kgg were introduced. The skin reactions were after 3 and 24 hours Estimated, negative results were obtained in all experiments.
Die erhaltenen Ergebnisse zeugen davon, dass das erfindungsgemässe Streptokinasederivat im untersuchten Dosisdiapason praktisch keine nautsensibilisierede Aktivität aufweist, was mit den Angaben der systemischen Anaphylaxie (AA) und den Ergebnissen der Durchführung der passiven Hautanaphylaxie (PHa) übereinstimmt. The results obtained show that the inventive Streptokinase derivative in the examined dose diapason practically no nautsensibilisierede Has activity, what with the indications of the systemic anaphylaxis (AA) and the Results of the implementation of passive skin anaphylaxis (PHa) are consistent.
Somit kann man anhand der Untersuchung der anaphylaktogenen und hautsensibilisierenden Eingenschaften des er9indungsgemässen Streptokinasederivats schliessen, dass das Ferment ein unbedeutendes allergisierendes Potential für Labortiersebesitzt. Thus one can look at the study of anaphylactogenics and skin-sensitizing properties of the streptokinase derivative according to the invention conclude that the ferment has insignificant allergenic potential for laboratory animals.
Es wurde die Modellierung der Bedingungen der Verwendung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats im sensibilisier ten Organismus durchgeführt. It was the modeling of the conditions of use of the inventive Streptokinase derivative carried out in the sensitized organism.
Es ist gut bekannt, dass im Laufe seines Lebens der Mensch mehrmals mit Erregern der Streptokokkusinfektionen zusammenstößt.Im Ergebnis solch eines Kontaktes wird bei vielen Menschen ein erhöhter Gehalt an Antistreptokinaseantikörpern beobachtet. Im Zusammenhang damit war es notwendig, den Einfluss der vorangegangenen Sensibilisierung gegen das native Ferment auf die immune Antwort gegen die modifizierte Form zu klaren. Die Versuche wurden an Mäusen, Meerschweinchen und Kaninchen vorgenommen. Um den Antistreptokinasehintergrund zu schaffen, wurden die Tiere durch die einmalige intravenöse Einführung der nativen Streptokinase in einer Dosis von 0,77 mg Protein/kg immunisiert. Nach 3 Wochen wurde diesen Tieren das modifizierte Ferment in 3 vermutlichen therapeutischen Dosen eingefiihrt (Tabelle 7). It is well known that in the course of his life man several times collides with pathogens causing strep infections. As a result, such a thing Many people have high levels of anti-streptokinase antibodies observed. In connection with this it was necessary to consider the influence of the preceding Sensitization to the native ferment on the immune response to the modified one Clear shape. The experiments were carried out on mice, guinea pigs and rabbits. In order to create the antistreptokinase background, the animals were given the unique intravenous introduction of native streptokinase at a dose of 0.77 mg protein / kg immunized. After 3 weeks, these animals became suspected of having the modified ferment in 3 therapeutic doses (Table 7).
Tabelle 7 Immune Antwort gegen das erfindungsgemässe Streptokinasederivat bei den mit dem nativen Ferment immunisierten Kaninchen Dosis des erfindungsge- Durchschnittliche geometrische massen Streptokinasederi Antikörpertiter in der Zeit (Tage) vats IE/kg mg Protein/kg 7 15 A. Ohne vorherige Immunisation mit der nativen Streptokinase 1700 0,05 3,2 3,2 4200 0,13 3,0 2,2 33000 1,0 2,6 3,0 Ba Nach der vorherigen Immunisation mit der nativen Streptokinase 1700 0,05 2,0 3,0 4200 0,13 2,0 2,2 33000 1,0 2,8 2,8 Wie aus den dargestellten Daten zu ersehen ist, veränderte die vorherige Immunisation mit dem nativen Ferment die immune Antwort gegen das erfindungsgemässe Streptokinase derviat. Die AntikörpErtiter in beiden Gruppen unterscheiden sich praktisch nicht. Noch mehr, praktisch wird keine Ubersteigung der Antikörpertiter über den Antikörpertiter der normalen Tiere nachgewissen. ähnliche Ergebnisse, die zeigen, dass die vorläufige Immunisation die immune Antwort gegen die modifizierte Form nicht verandert, sondern verstärkt, wurden in den Versuchen an Mäusen erhalten. Es ist wichtig zu betonen, dass bei Kaninchen oder Mäusen keine minimalen Merkmale der anaphylaktischen Reaktion beobachtet werden. Table 7 Immune response to the streptokinase derivative according to the invention in the rabbits immunized with the native ferment dose of the invention Average geometric mass streptokinasederi antibody titers over time (Days) vats IU / kg mg protein / kg 7 15 A. Without prior immunization with the native Streptokinase 1700 0.05 3.2 3.2 4200 0.13 3.0 2.2 33000 1.0 2.6 3.0 Ba After the previous immunization with native streptokinase 1700 0.05 2.0 3.0 4200 0.13 2.0 2.2 33000 1.0 2.8 2.8 As can be seen from the data presented, changed the previous immunization with the native ferment the immune response against that streptokinase according to the invention derviat. The antibody titers differ in both groups practically not. Even more, there is practically no excess in the antibody titre detected via the antibody titer of normal animals. similar results that show that the preliminary immunization modified the immune response against the Shape not changed, but increased, were obtained in the experiments on mice. It is important to emphasize that rabbits or mice have no minimal characteristics the anaphylactic reaction can be observed.
In den versuchen an Meerschweinchen wurde der Einfluss der vorherigen Immunisation nach der Methode der aktiven systemischen Anaphylaxie eingeschätzt. Es wurde festgestellt, das die Durchführung der antigenen Provokation mit dem erfindunggsgemässen Streptokinasederivat bei den Tieren, die früher das Präparat der nativen Streptokinase erhielten, zu keiner merklichen Schockreaktion führte. In the experiments on guinea pigs, the influence of the previous one Immunization assessed by the method of active systemic anaphylaxis. It was found that the implementation of the antigenic provocation with the erfindunggsgemässen Streptokinase derivative in animals that used to be the preparation of native streptokinase received no noticeable shock reaction.
Es wurde festgestellt, dass die vorherige Einführung des nativen Ferments bei den Versuchstieren die immune An>-wort gegen das erfindungsgemässe Streptokinasederivat nicht verstärkt. It was found that the previous introduction of the native Ferments in the test animals the immune response to the invention Streptokinase derivative not reinforced.
Das Ausbleiben der ausgeprägten humoralen Antwort gegen das erfindungsgemässe Streptokinasederivat, das volle Ausbleiben oder eine schwache Äusserung der anaphylaktogenen und hautsensibilisierenden Aktivität in den von uns untersuchten Dosen zeugt davon, dass das allergisierende Potential des Präparats nicht hoch ist0 Die Antigeneigenschaften des Streptokinasederivats nach der Erfindung wurden in den Versuchen zur Plasmaerschöpfung untersucht. Dazu wurde in die Glasröhrchen solch eine Menge des Präparates der nativen Streptokinase eingetragen, die die Äntistreptokinaseantikorper vollstandig bindet und deswegen geht keine I«se des kunstlichen Thrombus vor sich. Weiter wurden verschiedene Mengen des erfindungsgemässen Streptokinasederivats und des Thrombins zugegeben. The absence of a pronounced humoral response to the one according to the invention Streptokinase derivative, the complete absence or weak expression of the anaphylactogenic and skin sensitizing activity in the doses we investigated testifies to that the allergenic potential of the preparation is not high0 The antigenic properties of the streptokinase derivative according to the invention were used in the experiments on plasma depletion examined. For this purpose, such a quantity of the preparation of the native Streptokinase entered, which binds the anti-treptokinase antibodies completely and therefore there is no breakdown of the artificial thrombus. Then there were various Amounts of the streptokinase derivative according to the invention and of the thrombin are added.
Es erwies sich, dass zum Erhalten der Pfropfenlyse diegleiche-(nicht abir die gerIngere) Menge des erfindungsgemässen Streptokinasederivats wie in den Proben erforderlich ist, wo das native Ferment vorher nicht zugegeben wurde Wenn anfangs das erfindungsgemässe Streptokinasederivat zugegeben wird, ist es zur Offenbarung der katalytischen Aktivität notwendig, diegleiche Menge des nativen Ferments die in den Versuchen ohne Erschöpfung hinzuzufügen. Somit zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass das erfindungsgemäß Vorgeschlage ne Streptokinasederivat mit den Antikörpern des M£.nschen zusammenwirkt.It turned out that the same - (not Abir the smaller) amount of the streptokinase derivative according to the invention as in the Samples is required where the native ferment was not added beforehand If the streptokinase derivative according to the invention is initially added, is it is necessary to reveal the catalytic activity the same amount of the native Ferments add those in the trials without exhaustion. Thus, the obtained show Results that the streptokinase derivative proposed according to the invention with the Antibodies of the human interacts.
Die Untersuchung des Einflusses des Blutplasmas der Kaninchen auf die Aktivität der nativen Streptokinase und des Streptokinasederivats nach der Erfindung zeigte auch keine ausgeprägte Wechselwirkung der Antikörper m:% Enzymen. The study of the influence of the rabbit's blood plasma on the activity of the native streptokinase and the streptokinase derivative according to the invention also showed no pronounced interaction of the antibodies m:% enzymes.
Die Plasmaproben erhielt man in den Versuchen von den mit verschiedenen Dosen der Präparate der nativen Streptokinase und des erfindungsgemässen Streptokinasederiv at 5 immur i si ert en Tieren. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind iii Tabelle 8 dargestellt.The plasma samples were obtained in the experiments from those with different Doses of the preparations of native streptokinase and of the streptokinase derivative according to the invention at 5 immur i ed animals. The results of the determinations are in Table III 8 shown.
Tabelle 8 Resistenz des Blutplasmas der Kaninchen gegen die native Streptokinase und das erfindungsgemässe Streptokinasederiv at Immunisieren- Fermentmenge (IE), Verhalten der Antikörde Dosis, die mit 1 ml Plasma Mengen des er- pertiter IE/kg gebunden wird findungsgemässen native das erfindungs- Streptokinase-Strep- gemässe derivats zur netiven Streptotokinase Strepto- kinase, die mit kinasederi- 1 1 ml Plasma gevat bunden werden 1 2 3 4 5 1. Immunisation mit dem nativen Ferment 31000 12 192 16 16 4200 6 48 8 8 (Fortsetzung der Tabelle 8) 1 2 3 4 5 4200 3 48 16 16 4200 6 96 16 8 1700 6 144 24 16 1700 12 - 144 12 16 1700 12 192 16 16 2. Immunisation mit dem erfindungsgemässen Streptokinasederiv at 31000 6 96 16 8 31000 3 48 16 2 31000 6 96 16 4 4200 3 48 16 4 4200 9 48 5,3 2 4200 15 240 16 4 4200 6 96 16 4 Die in Tabelle 8 gezeigten Antikörpertiter wurden in der Reaktion der indirekten Hämagglutination bestimmt> Die entsprechen den Maximalverdünnungen der Blutseren, die mit dem homologen Testantikörper reagieren. Table 8 Resistance of the rabbit blood plasma to the native Streptokinase and the streptokinase derivative according to the invention at immunize fermentation amount (IE), behavior of the antibody dose with 1 ml plasma amounts of the pertiter IE / kg is bound according to the invention native the streptokinase streptokinase strep- according to derivative for the netive streptotokinase streptokinase, which with kinasederi- 1 ml of plasma are bound to evat 1 2 3 4 5 1. Immunization with the native ferment 31000 12 192 16 16 4200 6 48 8 8 (Continuation of Table 8) 1 2 3 4 5 4200 3 48 16 16 4200 6 96 16 8 1700 6 144 24 16 1700 12 - 144 12 16 1700 12 192 16 16 2. Immunization with the streptokinase derivative according to the invention at 31000 6 96 16 8 31000 3 48 16 2 31000 6 96 16 4 4200 3 48 16 4 4200 9 48 5.3 2 4200 15 240 16 4 4200 6 96 16 4 The antibody titers shown in Table 8 were in the Indirect hemagglutination reaction determined> These correspond to the maximum dilutions of the blood sera that react with the homologous test antibody.
Somit zeigten die durchführten Untersuchungen folgendes 1. Die effektive Minimaldosis des erfindungsgemäss vorgeschlagenen streptokinasederivats beträgt 50.000 IE/kg Körpergewicht. Die Thrombolyse beginnt erste anderthalb Stunden nach der Infusion und nach 24 Stunden wird die Durchgängigkeit der Blutgefässe völlig wiederhergestellt. Thus, the investigations carried out showed the following 1. The effective Minimum dose of the streptokinase derivative proposed according to the invention is 50,000 IU / kg body weight. Thrombolysis begins the first hour and a half after the infusion and after 24 hours the patency of the blood vessels becomes complete restored.
2. Die Normalisierung der durch die Einführung des erfindungsgemässen Streptokinasederiv at s erzeugten Veränderungen des Butgerinnungssystems tritt bei den Versuchstieren am 2; bis 3. Tag ein, was von der Verlängerung der fibrinolytischein Aktivität des Präparats um das 2 bis 3fache im Vergleich zur nativen Streptokinase zeugt. Die Prolongation des Fibrinolyseeffekts beim erfindungsgemässen Streptokinasederivats erhöht sich mit der Erhöhung der Präparatdosis. 2. The normalization of the by the introduction of the invention Streptokinase derivative at s produced changes the blood coagulation system occurs in the test animals on 2; to 3rd day, what of the extension of the fibrinolytic activity of the preparation by 2 to 3 times compared to the native one Streptokinase testifies. The prolongation of the fibrinolysis effect in the inventive Streptokinase derivative increases with the increase in the preparation dose.
3. Das Streptokinasederivat nach der Erfindung besitzt eine geringe Toxizität. Die intravenöse Einfuhrng des Präparats in Dosen, die die therapeutischen Maximaldo,en um 50 bis 100mal übersteigen, wird von den Tieren gut vertragen. 3. The streptokinase derivative according to the invention has a low Toxicity. The intravenous introduction of the preparation in doses corresponding to the therapeutic The animals tolerate the maximum value by 50 to 100 times.
4. Das allergisierende Potential des erfindungsgemässen Streptokinasederivates ist nicht hoch, weil bei der Untersuchung an Meerschweinchen die anaphylaktogene und hautsensibilisierende Aktivität praktisch ausblieb. 4. The allergenic potential of the streptokinase derivative according to the invention is not high, because when tested on guinea pigs the anaphylactogenic and skin sensitizing activity was practically absent.
5. Die antigene Aktivität des erfindungsgemäss Streptokinssederivats ist im Vergleich zur nativen Streptokinase herabgesetzt Erfindungsgemäss stellt das erfindungsgemäss vorgeschlagene Polysaccharidderivat der Streptokinase den Wirkstoff -des Präparats dar, das eine thromboiytische Wirksamkeit besitzt. Das erfindungsgemasse ArZneimittel wird in Injektionsform verwendet. Es enthält den Wirkstoff in einer Menge von 150000 IE in 1 ml. Als pharmazeutisches Losungsmittel enthält das Präparat vorzugsweise bidestilliertes Wasser oder eine physiologische Lösung, Das Präparat wird zur Behandlung akuter Thromboembolien und Thrombosen der Lungenartierien, Gehirngefässen, peripheren Arterie (bevor sich Gangrane entwickelt hat), bei Thrombophlebitis, Thrombose der peripheren Venen, beim akuten Myokardinfarkt, bei Thrombose der Zentralvene oder der Arterie der Augennetzhaut verwandt. 5. The antigenic activity of the streptokins derivative according to the invention is reduced according to the invention compared to native streptokinase the proposed according to the invention polysaccharide derivative of streptokinase the active ingredient -of the preparation which has a thrombocytic activity. The invention Medicinal product is used in injection form. It contains the active ingredient in one Quantity of 150,000 IU in 1 ml. The preparation contains as a pharmaceutical solvent preferably double-distilled water or a physiological solution, the preparation is used to treat acute thromboembolism and thrombosis of the pulmonary arteries, cerebral vessels, peripheral artery (before gangrane developed), in thrombophlebitis, thrombosis of the peripheral veins, in acute myocardial infarction, in thrombosis of the central vein or the artery related to the retina of the eye.
Das erfindungsgemässe Präparat wird einmalig in einer Dosis von 3.000.000 IE in 20 ml physiologischer Lösung intravenös während 30 Minuten bis a Stunde verwendet. Die Wirkung des Präparats hält während 2 bis 3 Tage an. Das Praparat hat keine Kontraindikationen und ruft keine Nebenerscheinungen hervor Das Präparat nach der Erfindung ermöglichts die vieltägigen intravenösen Tropfenverfahren zur Einführung durch das einmalige intravenöse strahlartige Verfahren zu ersetzen, die Kurdosis zu reduzieren und dadurch die Komplikationsmenge herabzusetzen und die Effektivität der thrombolytischen Therapie zu erhöhen. The preparation according to the invention is used once in a dose of 3,000,000 IU in 20 ml of physiological solution used intravenously for 30 minutes to an hour. The effect of the preparation lasts for 2 to 3 days. The preparation has no contraindications and does not cause any side effects. The preparation according to the invention makes it possible the multi-day intravenous drop procedures for introduction by the one-time To replace intravenous jet-like procedures, to reduce the cure dose and thereby reduce the number of complications and the effectiveness of thrombolytic therapy to increase.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden folgennle Beispiele der Verwirklichung des Verfahrens zur Herstellung des Polysaccharidderivats der Streptokinase angeführt. For a better understanding of the present invention, the following are made Examples of realizing the process for producing the polysaccharide derivative of streptokinase.
Beispiel 1 Man löst 2 g Dextran mit einem Molekulargewicht von 35000 bis 50000 in 40 ml destilliertem Wasser und gibt 1,226 g Kaliumperjodat zu. Man fuhrt die Oxydation bei einer Temperatur von 22-3 °C unter ständigem Rühren während 1 Stunde durch. Example 1 2 g of dextran with a molecular weight of 35,000 are dissolved up to 50,000 in 40 ml of distilled water and adds 1.226 g of potassium periodate. Man carries out the oxidation at a temperature of 22-3 ° C with constant stirring during 1 hour through.
Man lässt die erhaltene Lösung des oxydiertes Dextran durch die mit 10 g Anionenaustauscher in Azetatform gefüllte chromatographische Kolonne durch, verwirft ein Eluatvolumen, das dem freien KOlonnenvolumen - 6 ml - gleich ist, und sammelt die übrigen 40 ml. The resulting solution of the oxidized dextran is allowed to pass through the 10 g of anion exchanger in acetate form filled through a chromatographic column, discards an eluate volume that is equal to the free column volume - 6 ml - and collects the remaining 40 ml.
Man mischt 40 ml oxydiertes und gereinigtes Dextran mit IO ml 0,5 Mol Sodapufferlösung mit einem pH-Wert von 9,25 und gibt unter leichtem Rühren I000 mg native Streptokinase hinzu, Man lässt das Reaktionsgemisch in einem Volumen von 50 ml bei einem pH-Wert von 9,25 einer Temperatur von 200C während 1 Stunde stehen, kühlt dann auf 40C ab und setzt in kleinen Portionen 450 mg Natriumborhydrid hinzu. Die Reduktion ist wahrend 1 Stunde bei einem pH-Wert von 9,25. beendet. 40 ml of oxidized and purified dextran are mixed with 10 ml of 0.5 Moles of soda buffer solution with a pH of 9.25 and gives under 1000 mg of native streptokinase are added to gentle stirring. The reaction mixture is left in a volume of 50 ml at a pH of 9.25 at a temperature of 200C Stand for 1 hour, then cool to 40C and set in small portions 450 mg sodium borohydride added. The reduction is during 1 hour at pH of 9.25. completed.
Man verdünnt die Lösung des erfindungsgemässen Streptokinasederivats mit dem apyrogenen Wasser bis 400 ml und diafiltriert. Danach konzentriert man die Lösung bis 25 ml. The solution of the streptokinase derivative according to the invention is diluted with the pyrogenic water up to 400 ml and diafiltered. Then you concentrate them Solution up to 25 ml.
Man lässt die konzentrierte Lösung des erfindungsgemäss vorgeschlagenen Streptokinasederivats durch einen sterilen Filter (Porendurchmesser) beträgt 0,45 #m) durch und trocknet lyophil. The concentrated solution of the proposed according to the invention is left Streptokinase derivative through a sterile filter (pore diameter) is 0.45 #m) and dries lyophilized.
Die Ausbeute an Präparat beträgt 1500 mg mit einer spezifischen Aktivität von 4300 IR/mg Prärparat und der Gesamtaktivität von 6500000 lE, was 50 % vom Ausgangswert beträgt. The yield of the preparation is 1500 mg with a specific activity of 4300 IR / mg preparation and the total activity of 6500000 IU, which is 50% of the initial value amounts to.
Das erhaltene Produkt hat ein Molekulargewicht von etwa I00000 und stellt eine geruch- und geschmacklose poröse Masse von weisser Farbe dar. Das Produkt ist hygroskopisch, leicht wasserlöslich, in isotonischer 0,9'er Natriumchloridlösung leicht löslich* im gegen Alkohols Äther und Chloroform praktisch unlöslich. The product obtained has a molecular weight of about 100,000 and represents an odorless and tasteless porous mass of white color. The product is hygroscopic, easily soluble in water, in isotonic 0.9'er sodium chloride solution Easily soluble * and practically insoluble against alcohol, ether and chloroform.
Beispiel 2. Example 2.
Man löst 1 g Dextran mit einem Molekulargewicht von 150000 in 20 ml destilliertem Wasser und gibt 613 mg Kaliumperjodat zu. Man führt die Oxydation bei einer Temperatur von 22+2 °C unter staildigem Rühren während 1 Stunde durch. 1 g of dextran with a molecular weight of 150,000 is dissolved in 20 ml of distilled water and add 613 mg of potassium periodate. Oxidation is carried out at a temperature of 22 + 2 ° C with constant stirring for 1 hour.
Man leitet die erhaltene Lösung des oxydierten Dextrans mit einem Oxydationsgrad von 20-2% durch eine Kolonne mit 5 g Anionenaustauscher in Azetatform durch. Man verwirft am Kolonnenausgang ein Rluatvolumen, das dem freien Kolonnenvolumen gleich ist, und sammelt 20 ml, die das oxydierte und gereinigte Dextran in einer Konzentration von 50 mg/ml enthalten. The resulting solution of the oxidized dextran is passed with a Degree of oxidation of 20-2% through a column with 5 g of anion exchanger in acetate form by. A volume equal to the free column volume is discarded at the column outlet is the same, and collects 20 ml, which contains the oxidized and purified dextran in one Concentration of 50 mg / ml included.
Man vermischt 20 ml oxydiertes und gereinigtes Dextran mit 5 ml 0,5 Mol SodapufSerlösung mit einem pH-Wert von 9,4 und gibt unter leichtem Rühren 500 mg native Streptokinase hinzu. Mix 20 ml of oxidized and purified dextran with 5 ml of 0.5 Mol of soda puff solution with a pH value of 9.4 and gives 500 with gentle stirring mg native streptokinase added.
Man Zässt das Reaktionsgemisch in einer Menge von 25 ml bei einem pH-Wert von 9,4, einer Temperatur von 20-2°C während 40 Minuten stehen, kühlt am Eisbad au9 eine Temperatur von 4 oC ab und setzt in kleinen Portionen 224 mg Natriumborhydrid hinzu. The reaction mixture is added in an amount of 25 ml at a Standing at a pH of 9.4, a temperature of 20-2 ° C for 40 minutes, cools on Ice bath lowers a temperature of 4 oC and sets 224 mg of sodium borohydride in small portions added.
Die Reduktion ist in 30 Minuten beendet.The reduction is completed in 30 minutes.
Nachher dialysiert man die Lösung des erfindungsgemassen Streptokinasederivats gegen destilliertes Wasser während 18 Stunden bei einer Temperatur von 4 bis 7°C und trocknet lyophil. The solution of the streptokinase derivative according to the invention is then dialyzed against distilled water for 18 hours at a temperature of 4 to 7 ° C and dries lyophil.
Die Ausbeute an Präparat beträgt 1100 mg mit einer spezifischen Aktivität von 1700 IE/mg Präparat und einer Gesamtaktivität von 1875000 IE, was 30 % vom Ausgangswert beträgt. The yield of the preparation is 1100 mg with a specific activity of 1700 IU / mg preparation and a total activity of 1875000 IU, which is 30% of the initial value amounts to.
Das erhaltene Produkt Weist ein Molekulargewicht von 200000 bis 250000 auf und stellt eine porose geruchlose und geschmacklose Masse von weisser Farbe dar. Das Produkt ist hygroskopisch, leicht wasserlöslich, in isotonischer unter Natriumchloridlösung leicht löslich, in 95% gem Alkohol, Äther und ChloroSorm praktisch unlöslich. The product obtained has a molecular weight of 200,000 to 250,000 and forms a porous, odorless and tasteless mass of white color The product is hygroscopic, easily soluble in water, in isotonic under Sodium chloride solution easily soluble, practical in 95% alcohol, ether and ChloroSorm insoluble.
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