DE29708743U1

DE29708743U1 - Apheresis device

Info

Publication number: DE29708743U1
Application number: DE29708743U
Authority: DE
Original assignee: Kuebler Dr GmbH
Current assignee: Kuebler Dr GmbH
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2007-05-17
Also published as: WO1998053314A1; DE29823979U1

Description

ApheresevorrichtungApheresis device

Die Erfindung betrifft eine tragbare Apheresevorrichtung zur Isolierung und Kultivierung von transformierten Zellen aus Blut.The invention relates to a portable apheresis device for isolating and culturing transformed cells from blood.

Es ist bekannt, daß sich transformierte Zellen bzw. Tumorzellen in einem Organismus von einem Tumor absiedeln und in den Blutstrom übertreten können. Über die Bedeutung von im Blutstrom zirkulierenden transformierten Zellen für die Ausbildung von Metastasen berichtet A. J. Salsbury in "Significance of Circulating Cancer Cells"; Wiliam Heinemann Medical Books, New Aspects of Breast Cancer, Bd. 3, S 245 ff., 1977. Dabei können zirkulierende Tumorzellen in den meisten Fällen, d.h. bereits lange bevor der Primärtumor klinisch nachgewiesen werden kann, im Blutstrom auftreten (P. M. GuIlino, Dev. Oncol, 49, 251-271, 1986.It is known that transformed cells or tumor cells can settle in an organism from a tumor and enter the bloodstream. A. J. Salsbury reports on the importance of transformed cells circulating in the bloodstream for the formation of metastases in "Significance of Circulating Cancer Cells"; Wiliam Heinemann Medical Books, New Aspects of Breast Cancer, Vol. 3, p. 245 ff., 1977. In most cases, circulating tumor cells can appear in the bloodstream, i.e. long before the primary tumor can be clinically detected (P. M. GuIlino, Dev. Oncol, 49, 251-271, 1986).

Für die Therapie von Tumorerkrankungen ist es äußerst vorteilhaft, wenn die tumoröse Erkrankung bereits in einem sehr frühen Stadium erkannt wird, d.h. bevor es zur Metastasenbildung gekommen ist. Je früher eine derartige tumoröse Erkrankung diagnostiziert werden kann, um so besser sind die Heilungschancen für den Patienten.For the treatment of tumor diseases, it is extremely advantageous if the tumorous disease is detected at a very early stage, i.e. before metastases have formed. The earlier such a tumorous disease can be diagnosed, the better the patient's chances of recovery.

Im Stand der Technik sind Verfahren zur Isolation von transformierten Zellen über eine Dichtegradienten-Zentrifugation bekannt, wie sie üblicherweise zur Isolierung von Lymphozyten unter Verwendung eines Ficoll-Gradienten eingesetzt werden. Dabei sind jedoch große Blutmengen ab 1500 ml Blut erforderlich, was für den Patienten sehr belastend ist. Ferner ist der apparative Aufwand sehr groß, so daß diese Verfahren nicht zu einer routinemäßigen Untersuchung eingesetzt werden können. Weiterhin werden durch dieses konventionelle 5 Zentrifugationsverfahren die meist in sehr geringer Zahl vorhandenen Tumorzellen beschädigt oder verunreinigt.In the state of the art, methods for isolating transformed cells using density gradient centrifugation are known, as are usually used to isolate lymphocytes using a Ficoll gradient. However, this requires large amounts of blood, starting from 1500 ml of blood, which is very stressful for the patient. Furthermore, the equipment required is very large, so that these methods cannot be used for routine examinations. Furthermore, this conventional 5 centrifugation method damages or contaminates the tumor cells, which are usually present in very small numbers.

Gemäß dem der DE 42 28 389 zugrundeliegenden Verfahren wurde festgestellt, daß sich bei Zentrifugation einer Blutprobe in der zwischen den Erythrozyten und dem Blutplasma anordnenden Schicht aus Leukozyten, dem sogenannten Buffy-Coat, auch abgesiedelte transformierte Zellen des Primärtumors befinden. In der DE 42 28 389 wird weiter ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von im Blutstrom eines Individuums zirkulierenden transformierten Zellen beschrieben, wobei man durch Zentrifugation von Blut mittels einer zur Abtrennung von Lymphozyten geeigneten, kontinuierlichen Zentrifuge einen Buffy-Coat, der die transformierten Zellen, Leukozyten und Lymphozyten enthält, über einen der Zentrifuge nachgeschalteten Bypass entnimmt und den Buffy-Coat unter Vermehrung der transformierten Zellen kultiviert.According to the method underlying DE 42 28 389, it was found that when a blood sample is centrifuged, the layer of leukocytes located between the erythrocytes and the blood plasma, the so-called buffy coat, also contains dispersed transformed cells from the primary tumor. DE 42 28 389 further describes a method for isolating and cultivating transformed cells circulating in the bloodstream of an individual, whereby a buffy coat containing the transformed cells, leukocytes and lymphocytes is removed via a bypass downstream of the centrifuge by centrifuging blood using a continuous centrifuge suitable for separating lymphocytes, and the buffy coat is cultivated while the transformed cells multiply.

Nachteilig ist jedoch, daß sich dieses Verfahren nur in Anlagen durchgeführt werden kann, die nur mehrere einzelne, zum Teil sehr zeitaufwendige Arbeitsschritte zuläßt, die dieses Verfahren für eine routinemäßige Analyse nicht geeignet machen.The disadvantage, however, is that this method can only be carried out in systems that only allow several individual, sometimes very time-consuming work steps, which makes this method unsuitable for routine analysis.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine kleine kompakte Vorrichtung, die eine vereinfachte und schnelle Analyse von Blutproben auf in den Blutproben enthaltene transformierte Zellen ermöglicht, bereitzustellen.The object of the present invention is to provide a small, compact device that enables a simplified and rapid analysis of blood samples for transformed cells contained in the blood samples.

Die vorstehende Aufgabe wird durch eine tragbare Apheresevorrichtung zur Isolierung und Kultivierung von transformierten Zellen aus Blut, wobei die Apheresevorrichtung umfaßt:The above object is achieved by a portable apheresis device for isolating and culturing transformed cells from blood, the apheresis device comprising:

0 eine erste Abtrennvorrichtung zur Anreicherung und Abtrennung der Leukozytenfraktion, die Leukozyten und transformierte Zellen umfaßt, aus dem Blut, und mit je einer Zuführ- und Entnahmeeinrichtung,0 a first separation device for enriching and separating the leukocyte fraction, which comprises leukocytes and transformed cells, from the blood, and with a supply and removal device,

erste Überführungsmittel zur Überführung der Leukozytenfraktion aus der ersten Abtrennvorrichtung in eine zweite Abtrennvorrichtung,first transfer means for transferring the leukocyte fraction from the first separation device to a second separation device,

die zweite Abtrennvorrichtung zur Trennung derthe second separating device for separating the

transformierten Zellen und der Leukozyten, mit je einer Zufunrund Entnahmeeinrichtung,transformed cells and leukocytes, each with a supply and removal device,

zweite Überführungsmittel zur Überführung der transformierten Zellen aus der zweiten Abtrennvorrichtung in eine Zellkulturvorrichtung,second transfer means for transferring the transformed cells from the second separation device into a cell culture device,

die Zellkulturvorrichtung mit einer Zuführ- und Entnahmeeinrichtung für transformierte Zellen, wobei die erste Abtrennvorichtung, die ersten Überführungsmittel, die zweite Abtrennvorrichtung, die zweiten Überführungsmittel und die Zellkulturvorrichtung in einer kontinuierlichen Downstreamanordnung miteinander hintereinander verbunden in einer tragbaren Einheit angeordnet sind.the cell culture device with a supply and removal device for transformed cells, wherein the first separation device, the first transfer means, the second separation device, the second transfer means and the cell culture device are arranged in a continuous downstream arrangement connected one behind the other in a portable unit.

Durch die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung wird ein kompaktes Laborgerät für die Routineuntersuchung auf im Blutstrom zirkulierende transformierte Zellen, d.h. Tumorzellen bereitgestellt. Die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung ist dabei für den Einsatz in kleinen Labors gedachtm, kann platzsparend auf jedem Labortisch angeordnet werden und ist 0 hervorragend zur zur Untersuchung von Mengen an Blut in bereits kleinen Mengen von z.B. 250 ml oder noch geringere Mengen von 10 bis 100 ml geeignet.The apheresis device according to the invention provides a compact laboratory device for routine testing for transformed cells circulating in the bloodstream, i.e. tumor cells. The apheresis device according to the invention is intended for use in small laboratories, can be arranged on any laboratory table to save space and is ideal for testing blood quantities in small amounts of e.g. 250 ml or even smaller amounts of 10 to 100 ml.

Die Zuführung von Blut kann automatisiert werden, indem das zuvor dem Patienten abgenommene und in einem Behälter gelagerte Blut mittels einer Entnahmevorrichtung aus dem Behälter entnommen und in die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung eingebracht wird. Möglich ist aber auch die manuelle Einbringung von Blut in die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung zum Beispiel über die Injektion des Blutes mittels einer Spritze. Weiterhin ist es möglich, das Blut über über einen permanenten venösen Zugang direkt in die Apheresevorrichtung einzuleiten.The supply of blood can be automated by removing the blood previously taken from the patient and stored in a container from the container using a removal device and introducing it into the apheresis device according to the invention. However, it is also possible to introduce blood manually into the apheresis device according to the invention, for example by injecting the blood using a syringe. It is also possible to introduce the blood directly into the apheresis device via a permanent venous access.

5 Unter einer Downstreamanordnung wird im Sinne der Erfindung verstanden, daß die einzelnen Funktionseinheiten der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung von der Einbringung des5 A downstream arrangement is understood in the sense of the invention to mean that the individual functional units of the apheresis device according to the invention are separated from the introduction of the

Blutes über die Abtrennung der Leukozytenfraktion, die die gegebenenfalls im Blutkreislauf zirkulierenden Tumorzellen umfaßt, bis zur Abtrennung der Tumorzellen von Leukozyten und einer ersten Kultivierung der Tumorzellen kontinuierlich hintereinander angeordnet und miteinander verbunden, d.h. nahezu vollautomatisch arbeiten.Blood, through the separation of the leukocyte fraction, which includes any tumor cells circulating in the bloodstream, to the separation of the tumor cells from leukocytes and a first cultivation of the tumor cells, continuously arranged one after the other and connected to one another, i.e. operate almost fully automatically.

Unter einer tragbaren Einheit wird im Sinne der Erfindung verstanden, daß die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung in einer funktioneilen Einheit ausgebildet ist, d.h., daß die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung zum Beispiel in einem Gehäuse oder in Form eines Standzylinders, die ohne größeren Aufwand von einem Ort an den anderen transportiert werden können, bereitgestellt wird. Es ist erfindungsgemäß selbstverständlich, daß die erfindungsgemäße Aphereseeinrxchtung auch in Form einer Miniaturvorrichtung und/oder in Form beispielsweise einer Wegwerfeinheit ausgeführt werden kann, wobei die einzelnen Funktionseinheiten in kostenkünstiger Bauweise ausgeführt sind.A portable unit is understood in the sense of the invention to mean that the apheresis device according to the invention is designed as a functional unit, i.e. that the apheresis device according to the invention is provided, for example, in a housing or in the form of a standing cylinder, which can be transported from one place to another without great effort. It is self-evident according to the invention that the apheresis device according to the invention can also be designed in the form of a miniature device and/or in the form of, for example, a disposable unit, with the individual functional units being designed in a cost-effective manner.

Im folgenden werden die funktionellen Einheiten der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung beschrieben.The functional units of the apheresis device according to the invention are described below.

Vorteilhaft umfaßt die erste Abtrennvorrichtung eine kontinuierliche Zentrifuge, die mit einer im Stand der Technik zur Auftrennung von Blut in seine Bestandteile bekannten Drehzahl mittels eines Motors oder Pressluft betrieben wird, mit einem Durchflußrotor. Ein Durchflußrotor, der erfindungsgemäß bevorzugt 60-90 ml Fassungsvermögen aufweist, 0 ermöglicht sehr vorteilhaft eine zügige und zuverlässige, kontinuierliche und schonende Trennung von Erythrozyten, der Leukozytenfraktion (dem sogenannten Buffy-Coat), und des Blutplasmas voneinander. Der Durchflußrotor ist vorteihaft glockenartig oder konisch ausgebildet, so daß die Entnahme der aufgetrennten Blutfraktionen in der Nähe der zentralen Rotorachse erfolgen kann.The first separation device advantageously comprises a continuous centrifuge, which is operated at a speed known in the art for separating blood into its components by means of a motor or compressed air, with a flow rotor. A flow rotor, which according to the invention preferably has a capacity of 60-90 ml, very advantageously enables a rapid and reliable, continuous and gentle separation of erythrocytes, the leukocyte fraction (the so-called buffy coat), and the blood plasma from one another. The flow rotor is advantageously bell-shaped or conical, so that the separated blood fractions can be removed near the central rotor axis.

Dadurch, daß der Rotor als Durchflußrotor ausgebildet ist, kann die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung kontinuierlich arbeiten. Sehr vorteilhaft ist dabei, daß aufgrund der kontinuierlichen Arbeitsweise die Gefahr von einer Kontamination der erzeugten Zellkulturen minimiert wird. Die Gefahr einer Kontamination der erzeugten Zellkultur mit Bakterien, Hefen oder Pilzen wird um so größer, je mehr Bearbeitungsschritte manuell ausgeführt werden.Because the rotor is designed as a flow rotor, the apheresis device according to the invention can work continuously. It is very advantageous that the risk of contamination of the cell cultures produced is minimized due to the continuous operation. The risk of contamination of the cell culture produced with bacteria, yeasts or fungi increases the more processing steps are carried out manually.

Bevorzugt umfaßt die Zentrifuge eine Detektionsvorrichtung zur Messung der Fraktionen, bzw. Bestimmung der Fraktionsgrenzen . Eine Detektionsvorrichtung zur Detektion der in dem Rotor voneinander getrennten Bestandteile des Blutes ermöglicht eine zuverlässige Trennung des Buffy-Coat von den Erythrozyten und dem Blutplasma. Eine derartige Detektionsvorrichtung umfaßt zum Beispiel einen Optiksensor, der die Transmission bzw, die Änderung der Transmission des von einer Lichtquelle ausgestrahlten Lichtes mißt. Dabei kann zum Beispiel in der Rotorachse eine Lichtquelle und in der Zentrifuge der Optiksensor vorgesehen sein. Weiterhin ist umfangsmäßig in der Innen- und Außenwandung des Rotors jeweils ein lichtdurchlässiger Streifen in der Rotorwand vorgesehen, so daß das von der Lichtquelle abgestrahlte Licht durch den Rotor auf den Optiksensor trifft. Sobald die während der Zentrifugation aufgetrennten Fraktionen des Blutes den lichtdurchlässigen Streifen passieren, ändert sich die Transmission, was von dem Optiksensor detektiert wird. Die Transmission ändert sich dabei sprungartig beim Übergang der Plasmafraktion zu der optisch dichteren Leukozytenfraktion und wiederum beim Übergang zu der 0 Erythrozytenfraktion. Die Signale des Optiksensors werden über eine Regeleinheit zur Steuerung der Stellung eines Mehrwegeventils verwendet, um die Lymphocytenfraktion von den übrigen Blutbestandteilen abgetrennt, über die ersten Überführungsmittel abzuführen.The centrifuge preferably comprises a detection device for measuring the fractions or determining the fraction boundaries. A detection device for detecting the blood components separated from one another in the rotor enables reliable separation of the buffy coat from the erythrocytes and the blood plasma. Such a detection device comprises, for example, an optical sensor that measures the transmission or the change in the transmission of the light emitted by a light source. For example, a light source can be provided in the rotor axis and the optical sensor in the centrifuge. Furthermore, a light-permeable strip is provided in the rotor wall on the inside and outside walls of the rotor, so that the light emitted by the light source hits the optical sensor through the rotor. As soon as the blood fractions separated during centrifugation pass through the light-permeable strip, the transmission changes, which is detected by the optical sensor. The transmission changes abruptly when the plasma fraction changes to the optically denser leukocyte fraction and again when the erythrocyte fraction changes. The signals from the optical sensor are used via a control unit to control the position of a multi-way valve in order to separate the lymphocyte fraction from the other blood components and to discharge it via the first transfer medium.

Vorteilhaft umfassen die ersten Überführungsmittel eine zwischen der ersten Abtrennvorrichtung und der zweitenAdvantageously, the first transfer means comprise a device between the first separating device and the second

6 6

Abtrennvorrichtung angeordnete Verbindungsleitung. Die Verbindungsleitungen sind dabei zum Beispiel Schlauchverbindungen oder starre Leitungen.Connecting line arranged in a separating device. The connecting lines are, for example, hose connections or rigid lines.

Sehr vorteilhaft sind eine Steuerungseinrichtung zur Stellungsregelung des Mehrwegeventils über die von der Detektionsvorrichtung empfangenen Signale und mindestens ein Mehrwegeventil mit je einer Verbindungsleitung zu einem Behälter zur Aufnahme aus der Vorrichtung abgeleiteter Flüssigkeit und einer Verbindungsleitung zu einem Vorratsbehälter für physiologische Lösungen und gegebenenfalls mindestens eine Mischkammer vorgesehen.Very advantageously, a control device for controlling the position of the multi-way valve via the signals received from the detection device and at least one multi-way valve, each with a connecting line to a container for receiving liquid drained from the device and a connecting line to a storage container for physiological solutions and optionally at least one mixing chamber, are provided.

Die von dem Optiksensor in Form von Transmissionsänderungen aufgenommenen Signale werden dann an eine Steuerungsvorrichtung weitergeleitet, die dann zum Beispiel die Stellung der ansteuerbaren Mehrwegeventilen ändert. Nachdem die Leukozytenfraktion vom Optiksensor detektiert wurde, wird das Mehrwegeventil, gegebenenfalls unter Berücksichtigung des Totvolumens der Verbindungsleitungen, so gestellt, daß die Leukozytenfraktion nicht aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung, sondern in Richtung der zweiten Abtrennmittel geleitet wird. Die zuvor aus der Apheresevorrichtung geleitete Plasmafraktion kann in einen sterilen Behälter, für weitere Untersuchungszwecke, etc., oder aber auch direkt in einen Behälter für Flüssigabfall geleitet werden.The signals recorded by the optical sensor in the form of transmission changes are then forwarded to a control device, which then, for example, changes the position of the controllable multi-way valves. After the leukocyte fraction has been detected by the optical sensor, the multi-way valve is set, possibly taking into account the dead volume of the connecting lines, so that the leukocyte fraction is not led out of the apheresis device according to the invention, but in the direction of the second separation means. The plasma fraction previously led out of the apheresis device can be led into a sterile container for further examination purposes, etc., or directly into a container for liquid waste.

Sobald die Erythrozytenfraktion von dem Optiksensor detektiert wird, wird das Mehrwegeventil erneut, gegebenenfalls unter Berücksichtigung des Totvolumens der Verbindungsleitungen, über die Steuerungsvorrichtung geschaltet, so daß die Erythrozyten entweder in einen sterilen Behälter, für weitere Untersuchungen, etc., oder auch in einen Behälter für Flüssigabfall abgeleitet werden.As soon as the erythrocyte fraction is detected by the optical sensor, the multi-way valve is switched again via the control device, if necessary taking into account the dead volume of the connecting lines, so that the erythrocytes are either drained into a sterile container for further examinations, etc., or into a container for liquid waste.

Gegebenfalls kann die so abgetrennte Leukozytenfraktion durchIf necessary, the leukocyte fraction separated in this way can be

Zugabe einer physiologischen Lösung in einer Mischkammer odervorrichtung verdünnt werden. Die Zugabe der physiologischen Lösung aus einem Vorratsbehälter erfolgt über eine entsprechende Ansteuerung des Mehrwegeventils durch die Steuervorrichtung.Addition of a physiological solution in a mixing chamber or device. The physiological solution is added from a storage container via a corresponding control of the multi-way valve by the control device.

Die abgetrennte Leukozytenfraktion wird mit oder ohne Zugabe der physiologischen Lösung zur Verdünnung/Verflüssigung aus der ersten Abtrennvorrichtung über die Verbindungsleitung in die zweite Abtrennvorrichtung gespült, die besonders vorteilhaft in Form eines Kapillarsiebes oder -bettes oder einer Trennsäule ausgebildet ist.The separated leukocyte fraction is flushed with or without the addition of the physiological solution for dilution/liquefaction from the first separation device via the connecting line into the second separation device, which is particularly advantageously designed in the form of a capillary sieve or bed or a separation column.

Wenn ein Kapillarsieb Verwendung findet, kann dieses Kapillarsieb bevorzugt einen der Bodengröße des Rotors in Abhängigkeit von der eingesetzten Blutmenge angepaßten Durchmesser mit einer Porengröße von etwa 7,5 /im aufweisen. Unter einem Kapillarbett werden dabei zueinander parallel angeordnete Kapillaren verstanden, wobei die Leukozytenfraktion am oberen Ende des Kapillarbettes in die Kapillaren eingebracht wird und unter Einwirkung der Schwerkraft und durch nachströmende physiologische Lösung duch die Kapillaren gespült wird. Je größer die Anzahl der Kapillaren ist, um so kürzer ist die Gesamtdauer für die Trennung von Leukozyten und Tumorzellen. Auch die Länge der Kapillaren und der Durchmesser kann ohne weiteres variiert werden. Der Fachmann ist in der Lage, diese Parameter jederzeit an die entsprechenden Anforderungen einzustellen.If a capillary sieve is used, this capillary sieve can preferably have a diameter adapted to the base size of the rotor depending on the amount of blood used, with a pore size of about 7.5 /im. A capillary bed is understood to mean capillaries arranged parallel to one another, with the leukocyte fraction being introduced into the capillaries at the upper end of the capillary bed and being flushed through the capillaries under the influence of gravity and by the flow of physiological solution. The greater the number of capillaries, the shorter the total time for the separation of leukocytes and tumor cells. The length of the capillaries and the diameter can also be easily varied. The expert is able to adjust these parameters to the corresponding requirements at any time.

Ein Kapillarbett oder -sieb bewirkt aufgrund des kleinen Kapillardurchmessers eine optimale Flußrate der Zellsuspension durch die Kapillaren. Aufgrund dieser optimalen Flußrate können die Leukozyten hervorragend mit den Kapillarinnenwänden, die geeignetereise mit einem Adhäsionssystem für Leukozyten beschichtet sind, in Kontakt treten, was für die Trennung von Leukozyten und Tumorzellen sehr vorteilhaft ist.Due to the small capillary diameter, a capillary bed or sieve ensures an optimal flow rate of the cell suspension through the capillaries. Due to this optimal flow rate, the leukocytes can come into excellent contact with the inner walls of the capillaries, which are suitably coated with an adhesion system for leukocytes, which is very advantageous for the separation of leukocytes and tumor cells.

'8'8th

Anstelle des Kapillarbettes kann auch eine Trennsäule verwendet werden, die mit den üblichen Materialien zur Trennung von
Zellen befüllt ist, zum Beispiel auf Basis von Baumwolle oder Nylonwolle, die auch modifiziert sein können.
5Instead of the capillary bed, a separation column can also be used, which is equipped with the usual materials for the separation of
Cells are filled, for example based on cotton or nylon wool, which can also be modified.
5

Unter einem Adhäsionssystem wird im Sinne der Erfindung jedes System verstanden, daß eine spezifische Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenstrukturen auf den Leukozyten und Molekülen, die auf den Innenwänden der Kapillaren bzw. auf dem Säulenmaterial aufgebracht sind. Unter spezifischen Wechselwirkingen v/erden van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und/oder
ionische Wechselwirkungen verstanden.In the sense of the invention, an adhesion system is understood to be any system that has a specific interaction between cell surface structures on the leukocytes and molecules that are applied to the inner walls of the capillaries or to the column material. Specific interactions include van der Waals forces, hydrophobic interactions and/or
ionic interactions.

Ganz besonders bevorzugt umfaßt das Adhäsionssystem für
Leukozyten immobilisierte Moleküle mit einer Affinität für
Zelloberflächenstrukturen der Leukozyten.Most preferably, the adhesion system for
Leukocyte immobilized molecules with an affinity for
Cell surface structures of leukocytes.

Unter Molekülen mit einer Affinität für
Zelloberflächenstrukturen der Leukozyten werden im Sinne der Erfindung alle Moleküle verstanden, die eine spezifischeAmong molecules with an affinity for
Cell surface structures of leukocytes are understood in the sense of the invention to mean all molecules that have a specific

Wechselwirkung im obigen Sinne mit den Leukozyten ermöglichen. Diese Moleküle werden auf der Innenseite der Kapillaren bzw. auf dem Säulenmaterial durch herkömmliche Techniken
immobilisiert.interaction with the leukocytes in the above sense. These molecules are deposited on the inside of the capillaries or on the column material by conventional techniques
immobilized.

Diese Moleküle umfassen insbesondere organische Gruppen, die als Affinitätsgruppe wirken, Rezeptoren und Liganden, d.h.
insbesondere isolierte Zelloberfächenmoleküle, Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle,
Lektine und Glykoproteine, als auchThese molecules include in particular organic groups that act as affinity groups, receptors and ligands, i.e.
in particular isolated cell surface molecules, cell-cell adhesion molecules,
Lectins and glycoproteins, as well as

0 Antikörper. Die Antikörper können monoklonal oder auch0 antibodies. The antibodies can be monoclonal or

polyklonal sein. Die Verwendung von polyklonalen Antikörpern bzw. eine Mischung aus monoklonalen Antikörpern ist sehr
vorteilhaft, da dann sehr viele verschiedene Epitope auf der Leukozytenoberfläche erkannt werden, was eine zuverlässigere Abtrennung der Leukozyten bewirkt.polyclonal. The use of polyclonal antibodies or a mixture of monoclonal antibodies is very
advantageous because many different epitopes on the leukocyte surface are then recognized, which results in a more reliable separation of the leukocytes.

Insbesondere werden Antikörper gegen CD45, einemIn particular, antibodies against CD45, a

Leukozytenantigen, bevorzugt. Als Zeiladhäsionsmolekül kann
auch CD22, der Ligand für CD45, auf dem Säulenmaterial bzw. auf der Innenseite der Kapillaren aufgebracht werden.Leukocyte antigen is preferred. As cell adhesion molecule
CD22, the ligand for CD45, can also be applied to the column material or to the inside of the capillaries.

Vorteilhaft ist die zweite Abtrennvorrichtung als der tragbaren Aphereseeinheit entnehmbare Einheit ausgebildet, die die rasche Wiederinbetriebnahme der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung
ermöglicht. Dabei wird die "verbrauchte" Abtrennvorrichtung
einfach aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung entnommen und entsorgt. Anstelle der "verbrauchten" zweitenAdvantageously, the second separating device is designed as a unit that can be removed from the portable apheresis unit, which enables the rapid restart of the apheresis device according to the invention
This enables the "used" separating device
simply removed from the apheresis device according to the invention and disposed of. Instead of the "used" second

Abtrennvorrichtung wird dann eine neue, gebrauchsfertige zweite Abtrennvorrichtung eingesetzt. Durch Verwendung einer solchen
Einmal-Abtrennvorrichtung wird auch zuverlässig eine
Kontamination bei nachfolgenden AbtrennungsvorgängenA new, ready-to-use second separator is then inserted. By using such a
Disposable separator will also reliably
Contamination during subsequent separation processes

verhindert.prevented.

Bevorzugt umfassen zweiten Überführungsmittel eine zwischen der zweiten Abtrennvorrichtung und der Zellkulturvorrichtung
angeordnete Verbindungsleitung. Die Verbindungsleitungen sindPreferably, the second transfer means comprise a device between the second separation device and the cell culture device
arranged connecting line. The connecting lines are

0 dabei zum Beispiel Schlauchverbindungen oder starre Leitungen.0 For example, hose connections or rigid lines.

Vorteilhaft ist in der Verbindungsleitung zwischen der zweiten
Abtrennvorrichtung und der Zellkulturvorrichtung oder in der
Zellkulturvorichtung eine Entnahmevorrichtung zur sterilenIt is advantageous in the connecting line between the second
separation device and the cell culture device or in the
Cell culture device a removal device for sterile

Entnahme der physiologischen Lösung vorgesehen, die eine
sterile Entnahme der sich in der Zellkulturvorrichtung
ansammelnden physiologischen Lösung erlaubt. Durch die Entnahme wird zuverlässig ein Überlaufen der erfindungsgemäßen
Apheresevorrichtung verhindert.Removal of the physiological solution is provided, which
sterile removal of the cells in the cell culture device
accumulating physiological solution. The removal reliably prevents overflow of the inventive
Apheresis device prevented.

Sehr vorteilhaft umfaßt die Zellkulturvorrichtung eine
entnehmbare Zellkulturplatte. Wenn der Flüssigkeitsspiegel der
physiologischen Lösung über Entnahme von Flüssigkeit durch
vorgenannte Entnahmevorrichtung abgesenkt wurde, können dieVery advantageously, the cell culture device comprises a
removable cell culture plate. If the liquid level of the
physiological solution by removing fluid through
the aforementioned removal device has been lowered, the

5 Zellkulturplatten aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung entnommen werden und in einem Inkubator unter
Zellkulturbedingungen weiter inkubiert werden. Sehr vorteilhaft5 Cell culture plates are removed from the apheresis device according to the invention and placed in an incubator under
Cell culture conditions can be further incubated. Very advantageous

·&Igr;1 Q·&Igr;1 Q

ist dabei, daß die erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung somit für einen weiteren Abtrennvorgang wieder zur Verfügung steht. Die schnelle Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung ist insbesondere in einem Routinelabor sehr erwünscht.is that the apheresis device according to the invention is thus available again for a further separation process. The rapid availability of the apheresis device according to the invention is particularly desirable in a routine laboratory.

Äußerst vorteilhaft ist die Zellkulturvorrichtung mit einer Heizung, einem Befeuchter und/oder einer CO₂-Quelle versehen. Die isolierten Tumorzellen können somit unter optimalen Zellkulturbedingungen gehalten werden, d.h. bei 37°C, einer feuchten Atmosphäre sowie bei zum Beispiel 5% CO₂ und 95 % Luft.It is extremely advantageous if the cell culture device is provided with a heater, a humidifier and/or a CO ₂ source. The isolated tumor cells can thus be kept under optimal cell culture conditions, ie at 37°C, a humid atmosphere and, for example, at 5% CO ₂ and 95% air.

Die isolierten Tumorzellen können somit auch in der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung direkt inkubiert werden. Eine Entnahme der Tumorzellen aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung ist auch dadurch möglich, daß die Tumorzellen über am Boden vorgesehene Einstichkanäle unter Zuhilfenahme einer Kanüle abgesaugt werden können. 20The isolated tumor cells can thus also be incubated directly in the apheresis device according to the invention. The tumor cells can also be removed from the apheresis device according to the invention by sucking the tumor cells out using a cannula via puncture channels provided on the floor. 20

Weiterhin ist es bevorzugt, wenn vor der ersten Abtrennvorrichtung ein zweites Mehrwegeventil angeordnet ist. Dieses zweite Mehrwegeventil ermöglicht eine erleichterte Spülung der gesamten erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung.Furthermore, it is preferred if a second multi-way valve is arranged in front of the first separation device. This second multi-way valve enables easier rinsing of the entire apheresis device according to the invention.

5 Dadurch kann die gesamte Vorrichtung innerhalb einer sehr kurzen Zeit für die nächste Routineanalyse wieder bereit gestellt werden, was sehr vorteilhaft ist.5 This allows the entire device to be made ready for the next routine analysis within a very short time, which is very advantageous.

Sehr vorteilhaft ist es dabei, wenn das zweite Mehrwegeventil 0 wenigstens mit je einer Zuführung für Blut, Spüllösung aus einem Vorratsbehälter und physiologischer Lösung aus weiteren Vorratsbehälter verbunden ist.It is very advantageous if the second multi-way valve 0 is connected to at least one supply each for blood, rinsing solution from a storage container and physiological solution from another storage container.

Nach einer routinemäßigen Analyse einer Blutprobe, wird das 5 zweite Mehrwegeventil von der Blutzuführung auf die Zuführung einer Spüllösung umgeschaltet. Die Spüllösung wird dann in den Rotor eingebracht und spült das in dem Rotor enthaltene BlutAfter a routine analysis of a blood sample, the 5 second multi-way valve is switched from the blood supply to the supply of a rinsing solution. The rinsing solution is then introduced into the rotor and rinses the blood contained in the rotor

über die Entnahmeeinrichtung und das erste Mehrwegeventil, daß in Richtung des Behälters für Flüssigabfall geöffnet ist, aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung. Nach dem Spülen mit einer Spüllösung wird das zweite Mehrwegeventil so geschaltet, daß eine Sterilisierungslösung, wie zum Beispiel 70 % Ethanol, durch den Rotor und über die Entnahmevorrichtung und über das erste Mehrwegeventil in den Behälter für Flüssigabfall überführt. Anschließend wird nach einer erneuten Schaltung des zweiten Mehrwegeventils die erfindungsgemäße Apheresevorrichtung mit einem sterilen physiologischen Puffer auf dem gleichen Wege gespült.via the removal device and the first multi-way valve, which is open in the direction of the container for liquid waste, from the apheresis device according to the invention. After rinsing with a rinsing solution, the second multi-way valve is switched so that a sterilization solution, such as 70% ethanol, is transferred through the rotor and via the removal device and via the first multi-way valve into the container for liquid waste. Then, after switching the second multi-way valve again, the apheresis device according to the invention is rinsed with a sterile physiological buffer in the same way.

Unter physiologischer Lösung wird im Sinne der Erfindung jede physiologische Salzlösung, physiologische Pufferlösung oder ein Zellkulturmedium verstanden.For the purposes of the invention, a physiological solution is understood to mean any physiological saline solution, physiological buffer solution or cell culture medium.

Die im folgenden beschriebene Ausführungsform der erfindungsgemäße Apheresevorrichtung ist nur beispielhaft zu verstehen und es sind verschiedene Modifikationen und 0 Abwandlungen dem fachmann aufgrund der detailierten Beschreibung möglich.The embodiment of the apheresis device according to the invention described below is to be understood as an example only and various modifications and variations are possible for the person skilled in the art on the basis of the detailed description.

Die Abtrennvorrichtung zur Anreicherung und Abtrennung der Leukozytenfraktion aus dem Blut umfaßt eine Zentrifuge mit einem glockenförmigen Rotor wie zum Beispiel nach Art einer sogenannten Latham-Glocke. Die Latham-Glocke wird von der Firma Hemonetics hergestellt und ist in der Gebrauchsanweisung des Multikomp MCS3P beschrieben.The separation device for enriching and separating the leukocyte fraction from the blood comprises a centrifuge with a bell-shaped rotor, such as a so-called Latham bell. The Latham bell is manufactured by the company Hemonetics and is described in the instructions for use of the Multikomp MCS3P.

Die grundsätzliche Funktionsweise der Latham-Glocke wird im folgenden beschrieben. Die Latham-Glocke besteht aus einem rotierenden Teil und einem feststehenden Bereich mit Einlaßöffnung, Zulauf- und Ablaufkanal sowie der Auslaßöffnung. Der davon getrennte, rotierende Teil besteht aus der 5 Verarbeitungskammer und der Drehdichtung. Die Drehdichtung ist eine Abdichtung des sterilen Inneren der Glocke gegen die Umgebung und ist der einzige Punkt, wo der feststehende TeilThe basic functionality of the Latham bell is described below. The Latham bell consists of a rotating part and a fixed area with an inlet opening, inlet and outlet channels and the outlet opening. The separate rotating part consists of the 5 processing chamber and the rotary seal. The rotary seal is a seal of the sterile interior of the bell against the environment and is the only point where the fixed part

der Glocke Kontakt mit dem sich drehenden Teil hat.the bell is in contact with the rotating part.

Das aufzutrennende antikoagulierte Blut tritt durch die Einlaßöffnung in die Glocke ein und wird durch den Zulaufkanal zum Boden der Glocke geleitet. Hier wandert das Blut aufgrund der vorhandenen Zentrifugalkräfte in der sich drehenden Glocke in den äußeren Bereich der Glocke. Während dies geschieht, wird die in der Glocke vorhandene sterile Luft in einen Sammelbeutel abgeleitet. Das Blut wird weiter in die Glocke gepumpt, wo es weiter zentrifugiert wird. Die Blutkomponenten trennen sich entsprechend ihrer jeweiligen Dichte, wobei die schweren Erythrozyten in den Randschichten an der Glocke verbleiben. Der Erythrozytenschicht folgen radial innenwärts Schichten aus Leukozyten, Thrombozyten und Plasma.The anticoagulated blood to be separated enters the bell through the inlet opening and is guided through the inlet channel to the bottom of the bell. Here, the blood migrates to the outer area of the bell due to the centrifugal forces in the rotating bell. While this is happening, the sterile air in the bell is drained into a collection bag. The blood is pumped further into the bell, where it is centrifuged further. The blood components separate according to their respective densities, with the heavy erythrocytes remaining in the outer layers on the bell. The erythrocyte layer is followed radially inwards by layers of leukocytes, thrombocytes and plasma.

Wenn die Glocke vollständig gefüllt ist, fließt das Plasma, welches die leichteste Blutkomponente ist, als erstes durch die Ablauföffnung aus der Glocke ab. Nach dem Plasma können im Anschluß grundsätzlich, wenn gewünscht, fließen dann die 0 Thrombozyten und Leukozyten aus der Glocke ab. Sofern weiter zentrifugiert wird, treten dann auch die Erythrozyten aus der Glocke aus.When the bell is completely full, the plasma, which is the lightest component of the blood, is the first to flow out of the bell through the drain opening. After the plasma, the thrombocytes and leukocytes can then flow out of the bell if desired. If centrifugation continues, the erythrocytes will also come out of the bell.

Erfindungsgemäß wird jedoch eine Zentrifuge mit einem Durchflußrotor nach Art einer Latham-Glocke wie folgt verwendet. Bei der erfindungsgemäßen Ausführungsform werden unter Rotation des Rotors beispielweise 60-90 ml humanes Vollblut zentral, d.h. entlang der Rotationsachse bzw. durch die hohle Rotorachse, in den Rotor nach Art einer Latham-Glocke 0 eingebracht, wobei das Blut dem Durchmesser des Rotors entsprechend, mit z.B. 4800 UpM zentrifugiert wird.According to the invention, however, a centrifuge with a flow rotor in the style of a Latham bell is used as follows. In the embodiment according to the invention, for example 60-90 ml of human whole blood are introduced centrally, i.e. along the axis of rotation or through the hollow rotor axis, into the rotor in the style of a Latham bell 0 while the rotor rotates, whereby the blood is centrifuged at a speed corresponding to the diameter of the rotor, for example at 4800 rpm.

Am oberen kleineren Umfang der Latham-Glocke wird nach der Auftrennung des Blutes in seine Bestandteile, d.h. in die 5 Erythrozytenfraktion, die Leukozyten- und Thrombozytenschicht (den Buffy-Coat), die die transformierten Zellen, falls vorhanden, enthält, und die Plasmafraktion, dann zunächst dasAt the upper, smaller circumference of the Latham jar, after the blood has been separated into its components, i.e. into the 5 erythrocyte fraction, the leukocyte and platelet layer (the buffy coat), which contains the transformed cells, if present, and the plasma fraction, then first the

sich über dem Buffy-Coat (radial innenwärts) angesammelte Blutplasma über den Ablauf/Abführung aus. Durch ein hinter dem Ablauf befindliches Stellventil wird das abgetrennte Blutplasma aus der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung in einen Behälter für Flüssigabfall geleitet.Blood plasma that has accumulated above the buffy coat (radially inwards) is discharged via the drain/discharge. The separated blood plasma is directed from the apheresis device according to the invention into a container for liquid waste via a control valve located behind the drain.

Durch einen im oberen Bereich der Latham-Glocke positionierten Optiksensor wird der an der äußeren Wandung innen im Rotor aufsteigende Buffy-Coat aufgrund seiner geringeren Lichttransmission detektiert. Über den Optiksensor wird die Einstellung des Stellventils reguliert. Das zuvor in Richtung des Behälters für Flüssigabfall offene Stellventil, über das das Blutplasma abgeführt wurde, wird, nachdem der Optiksensor den Buffy-Coat detektiert hat, so gestellt, daß die Abführung in den Behälter für Flüssigabfall geschlossen und die Abführung in Fließrichtung der zweiten Abtrennvorichtung geöffnet wird, so daß die sich in dem Buffy-Coat befindlichen Leukozyten und transformierten Zellen in die Abtrennvorrichtung gelangen.An optical sensor positioned in the upper area of the Latham bell detects the buffy coat rising on the outer wall inside the rotor due to its lower light transmission. The optical sensor regulates the setting of the control valve. The control valve, which was previously open in the direction of the liquid waste container and through which the blood plasma was drained, is set so that the drain into the liquid waste container is closed and the drain in the flow direction of the second separation device is opened after the optical sensor has detected the buffy coat, so that the leukocytes and transformed cells in the buffy coat reach the separation device.

Nachdem mittels des Optiksensors festgestellt wurde, daß die gesamte Menge des Buffy-Coats aus dem Rotor in die Abführleitung zur zweiten Trennvorrichtung geleitet wurde, wird das Stellventil so eingestellt, daß in die Leitung zur zweiten Trennvorrichtung Zellkulturmedium wie zum Beispiel RPMI 164 0, das gegebenenfalls mit fetalem Kälberserum ergänzt wurde, zugeführt und mit den Leukozyten sowie den transformierten Zellen vermischt wird. Die dadurch entstehende verdünnte Zellsuspension wird dann über eine Schlauchverbindung in die zweite Abtrennvorrichtung zur Abtrennung der transformierten Zellen aus der Leukozytenfraktion überführt. Bei der Zugabe des Zellkulturmediums werden in etwa die folgenden Zellzahldichten von 100 bis 1000 eingestellt.After the optical sensor has determined that the entire amount of buffy coat from the rotor has been directed into the discharge line to the second separation device, the control valve is set so that cell culture medium such as RPMI 164 0, which may have been supplemented with fetal calf serum, is fed into the line to the second separation device and mixed with the leukocytes and the transformed cells. The resulting diluted cell suspension is then transferred via a hose connection to the second separation device to separate the transformed cells from the leukocyte fraction. When adding the cell culture medium, the following cell count densities of 100 to 1000 are set.

Sobald die Erythrozytenfraktion von dem Optiksensor aufgrund ihrer, verglichen mit dem Buffy-Coat, noch geringeren Lichttransmission detektiert wird, wird das Stellventil wieder so gestellt, so daß die aus der Glocke austretendenAs soon as the erythrocyte fraction is detected by the optical sensor due to its even lower light transmission compared to the buffy coat, the control valve is again set so that the

Erythrozyten, gegebenenfalls mit einer Spüllösung, in den Behälter für Flüssigabfall geleitet werden.Erythrocytes, if necessary with a rinsing solution, are directed into the liquid waste container.

Die derart abgetrennten Leukozyten und transformierten Zellen werden in der zweiten Abtrennvorrichtung voneinander getrennt, wobei die zweite Abtrennvorrichtung ein Kapillarsystem oder Kapillarsieb und wobei auf der Innenseite der Kapillaren/Kapillarsiebes monoklonale anti-CD45 Antikörper immobilisiert wurden. Die anti-CD45 Antikörper stammen zum Beispiel aus der der Hybridoma-Zellinie H130 und sind bei der Firma Pharmingen, USA, erhältlich.The leukocytes and transformed cells separated in this way are separated from one another in the second separation device, where the second separation device is a capillary system or capillary sieve and monoclonal anti-CD45 antibodies are immobilized on the inside of the capillaries/capillary sieve. The anti-CD45 antibodies come, for example, from the hybridoma cell line H130 and are available from Pharmingen, USA.

Die Abtrennung von CD4 5⁺ Zellen kann jedoch noch wirkungsvoller sein, wenn ein polyklonales anti-CD45 Serum, bzw. eine Mischung von monoklonalen Antikörpern auf der Innenseite der Kapilaren / des Kapillarsiebes immobilisiert wurden. Bei Verwendung eines polyklonalen anti-CD45 Serums oder einer Mischung aus monoklonalen anti-CD45 Antikörpern zur Beschichtung der Innenseite der Kapillaren werden bei dem nachfolgenden Abtrennungsschritt entsprechend mehrere bzw. viele verschiedene Epitope des CD45-Moleküls erkannt und dadurch die Abtrennungseffizienz deutlich verbessert.However, the separation of CD4 5 ⁺ cells can be even more effective if a polyclonal anti-CD45 serum or a mixture of monoclonal antibodies is immobilized on the inside of the capillaries/capillary sieve. When using a polyclonal anti-CD45 serum or a mixture of monoclonal anti-CD45 antibodies to coat the inside of the capillaries, several or many different epitopes of the CD45 molecule are recognized in the subsequent separation step, thereby significantly improving the separation efficiency.

Über spezifische Wechselwirkungen, die auf van-der-Waals-Kräften und ionischen Wechselwirkungen beruhen, werden dann die Zellen, die das Zeiloberflächenmolekül CD45 an der Zelloberfläche exprimieren, d.h. insbesondere die Leukozyten, von den anti-CD4 5 Antikörpern gebunden und dadurch in dem Kapillarsystem zurückgehalten. Die CD45" Tumorzellen werden 0 nicht von den Antikörpern gebunden und somit nicht in dem Kapillarsystem zurückgehalten. Die gesamte Apheresevorrichtung ist während des Abtrennvorgangs der Tumorzellen bevorzugt bei 37°C temperiert.Through specific interactions based on van der Waals forces and ionic interactions, the cells that express the cell surface molecule CD45 on the cell surface, i.e. in particular the leukocytes, are then bound by the anti-CD45 antibodies and thus retained in the capillary system. The CD45" tumor cells are not bound by the antibodies and thus are not retained in the capillary system. The entire apheresis device is preferably kept at a temperature of 37°C during the separation process of the tumor cells.

Über das Kapillarsystem erfolgt eine Anreicherung der Tumorzellen, bezogen auf die Leukozyten, von ca 80% Tumrozellen. Die aus dem Kappilarsystem austretenden mit demThe capillary system leads to an accumulation of tumor cells, based on the leukocytes, of about 80% tumor cells. The cells emerging from the capillary system with the

Zellkulturmedium austretenden Tumorzellen fallen durch eine säulenartige Verbindung in das Zellkultursystem.Tumor cells emerging from the cell culture medium fall into the cell culture system through a column-like connection.

Das Zellkultursystem besteht aus einer herkömmlichen Zellkulturplatte mit einer gewünschten Anzahl an Vertiefungen die mit herkömmlichem Zellkulturmedium, wie z.B. RPMI 1640 mit 10 % fetalem Kälberserum., befüllt sind. Aufgrund der Schwerkraft sinken die Zellen ab und werden auf herkömmlichen Zellkulturmaterialien, wie zum Beispiel in einer 96-well, 48-well, 24-well, 12-well oder 6-well Zellkulturplatte aus Polystyrol kultiviert. Bedingt durch das über die zweite Abtrennvorrichtung nachströmende Zellkulturmedium steht das Zellkulturmedium in einer Schicht über den Vertiefungen der Zellkulturplatte.The cell culture system consists of a conventional cell culture plate with a desired number of wells that are filled with conventional cell culture medium, such as RPMI 1640 with 10% fetal calf serum. Due to gravity, the cells sink and are cultivated on conventional cell culture materials, such as a 96-well, 48-well, 24-well, 12-well or 6-well cell culture plate made of polystyrene. Due to the cell culture medium flowing in via the second separating device, the cell culture medium is in a layer above the wells of the cell culture plate.

Nach Entnahme des über der Zellkulturplatte überschüssigen Mediums über eine in der säulenartigen Verbindung oberhalb der Zellkulturplatte angeordnetes Entnahmevorrichtung kann die Zellkulturplatte der Apparatur entnommen werden.After removing the excess medium above the cell culture plate via a removal device arranged in the column-like connection above the cell culture plate, the cell culture plate can be removed from the apparatus.

Anstelle einer einer Zellkulturplatte mit mehreren Vertiefungen kann auch eine Zellkulturplatte mit nur einer Vertiefung, nach Art einer Petrischale, genommen werden. Vor Entnahme der Petrischale wird dann das überschüssige Medium zum Beispiel über einen vorgesehenen Auslaß am Boden der Platte abgenommen. Anstelle eines vorgesehenen Auslasses kann das überschüssige Zellkulturmedium auch über eine eingestochene Kanüle entfernt werden. Vorteilhaft kann dadurch auch der Spiegel des Zellkulturmediums in der Zellkulturplatte abgsenkt werden, was insbesondere bei der Entnahme der Zellkulturplatte vorteilhaft ist.Instead of a cell culture plate with several wells, a cell culture plate with only one well, similar to a Petri dish, can be used. Before removing the Petri dish, the excess medium is then removed, for example, via an outlet provided on the bottom of the plate. Instead of a designated outlet, the excess cell culture medium can also be removed via a cannula. This can also advantageously lower the level of the cell culture medium in the cell culture plate, which is particularly advantageous when removing the cell culture plate.

Die in der Zellkulturplatte vorhandenen Tumorzellen, sofern vorhanden, werden dann in einem Inkubator unter herkömmlichen Zellkulturbedingungen (z.B.: 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit, 5% CO₂) weiter inkubiert.The tumor cells present in the cell culture plate, if present, are then further incubated in an incubator under conventional cell culture conditions (e.g.: 37°C, 95% humidity, 5% CO ₂ ).

Alternativ kann die Zellkulturplatte auch in der Apheresevorrichtung weiter unter optimalen Zellkulturbedingungen inkubiert werden, da die Zellkulturvorrichtung mit einem Befeuchter, einer Heizung in Form eines Peltierelementes und einer CO₂-Quelle versehen ist.Alternatively, the cell culture plate can also be further incubated in the apheresis device under optimal cell culture conditions, since the cell culture device is equipped with a humidifier, a heater in the form of a Peltier element and a CO ₂ source.

Die Tumorzellen können dann, nachdem sich die Tumorzellen durch Zellteilung vermehrt haben, der Zellkultur entnommen werden, indem der Boden der jeweiligen Vertiefung zum Beispiel mit einer Kanüle durchstochen wird, und die Tumorzellen abgesaugt werden.After the tumor cells have multiplied through cell division, they can be removed from the cell culture by piercing the bottom of the respective well, for example with a cannula, and sucking out the tumor cells.

Nachdem sich die Zellen mehrfach geteilt haben und somit ausreichende Zellzahlen zur Verfügung stehen, können die Tumorzellen, und damit der Primärtumor, über herkömmlich bekannte Verfahren wie zum Beispiel auf molekularbiologischer Ebene mittels PCR, auf zellbiologischer Ebene mittels Durchflußzytometrie oder auf proteinchemischer Ebene mittels SDS-PAGE und ELISA näher charakterisiert werden.After the cells have divided several times and sufficient cell numbers are available, the tumor cells, and thus the primary tumor, can be characterized in more detail using conventional methods such as at the molecular biological level using PCR, at the cell biological level using flow cytometry or at the protein chemical level using SDS-PAGE and ELISA.

Die Apheresevorrichtung kann wie folgt wieder für den nächsten Routineablauf bereitgestellt werden:The apheresis device can be made available again for the next routine procedure as follows:

Nachdem der Buffy-Coat aus der Glocke abgeleitet wurde, wird das vor der Glocke angeordnete zweite Stellventil so gestellt, daß aus dem Behälter mit Spülflüssigkeit die Spülflüssigkeit über die Zuleitung in die Glocke gelangt, die Restmenge an Blut verdrängt, welches dann über das erste Stellventil in den Behälter für Flüssigabfall geleitet wird. Danach wird die Glocke zunächst mit einem Sterilisierungsmittel, wie zum Beispiel 70 % Ethanol, und nachfolgend mit sterilem Puffer oder Zellkulturmedium gespült. Nach Reinigung der Latham-Glocke steht die Zentrifuge für einen neuen Einsatz bereit.After the buffy coat has been drained from the bowl, the second control valve in front of the bowl is set so that the rinsing liquid from the container with the rinsing liquid flows into the bowl via the supply line, displacing the remaining amount of blood, which is then fed into the container for liquid waste via the first control valve. The bowl is then first rinsed with a sterilizing agent, such as 70% ethanol, and then with sterile buffer or cell culture medium. After cleaning the Latham bowl, the centrifuge is ready for use again.

Das Kappilarsystem, mit dem die Leukozyten entfernt wurden, 5 wird der Apheresevorrichtung entnommen und verworfen. Die Schlauchverbindung zur zweiten Abtrennvorichtung kann entsprechend gespült und sterilisiert werden, wenn das ersteThe capillary system used to remove the leukocytes 5 is removed from the apheresis device and discarded. The tubing connection to the second separation device can be rinsed and sterilized accordingly if the first

Mehrwegeventil auf Durchfluß in Richtung zweiter Abtrennvorrichtung geschaltet ist. Nach Einsatz eines neuen mit z.B mit anti-CD45 Antikörpern beschichteten Kapillarsystems kann dann eine erneute Isolierung von Tumorzellen aus dem Blut des gleichen oder eines weiteren Patienten durchgeführt werden.Multi-way valve is switched to flow in the direction of the second separation device. After using a new capillary system coated with, for example, anti-CD45 antibodies, tumor cells can then be isolated again from the blood of the same or another patient.

Im folgenden wird anhand der beiliegenden einzigen schematischen Zeichnung eine Ausführungsform beispielhaft veranschaulicht:The following is an example of an embodiment using the attached single schematic drawing:

Über die Einfüllöffnung (20) wird das Blut über das Mehrwegeventil (1) über die Leitung (21) entlang der Rotorachse in die Glocke (2) eingebracht. An der äußeren Wandung der rotierenden Glocke (2) (Antrieb nicht gezeigt) steigt das in seine Bestandteile aufgetrennte Blut empor. Über den Optiksensor (19) werden die aufgetrennten Fraktionen des Blutes detektiert. Der Optiksensor (19) gibt die gemessenen Transmissionen über Datenleitungen (nicht gezeigt) an eine Steuerungseinheit (nicht gezeigt) weiter, die die Stellung des Mehrwegeventils (4) und des Mehrwegeventils (1) regelt. Über die Leitung (3) wird das zuerst aus der Glocke austretende Plasma über das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall überführt. Sobald der Optiksensor (19) eine Transmissionsänderung an die Steuerungseinheit (nicht gezeigt) weiter gibt, wird das Mehrwegeventil (4) in Richtung des Kapillarbettes (8) geöffnet. Die im Anschluß an die Plasmafraktion aus der Glocke (2) austretende Leukozytenfraktion wird dann über die Leitung (3) und die Leitung (7) in Richtung des Kapillarbettes (8) geleitet. Über 0 das Regelungsventil (4) kann gegebenenfalls physiologischer Puffer aus dem Behälter (6) zugeführt werden, um die Leukozytenfraktion, gegebenenfallls in einer nicht gezeigten Mischkammer, zu verdünnen. Sobald der Optiksensor (19) die Erythrozytenschicht detektiert, wird das Mehrwegeventil (4) erneut in Richtung des Behälters (5) für Flüssigabfall geöffnet, so daß die aus der Glocke austretenden Erythrozyten in den Flüssigabfall geleitet werden. Nachdem die (verdünnte)The blood is introduced into the bell (2) via the filling opening (20) via the multi-way valve (1) and the line (21) along the rotor axis. The blood, separated into its components, rises up the outer wall of the rotating bell (2) (drive not shown). The separated fractions of the blood are detected via the optical sensor (19). The optical sensor (19) transmits the measured transmissions via data lines (not shown) to a control unit (not shown), which regulates the position of the multi-way valve (4) and the multi-way valve (1). The plasma that first emerges from the bell is transferred via the line (3) via the multi-way valve (4) into the container (5) for liquid waste. As soon as the optical sensor (19) transmits a transmission change to the control unit (not shown), the multi-way valve (4) is opened in the direction of the capillary bed (8). The leukocyte fraction emerging from the bell (2) after the plasma fraction is then guided via the line (3) and the line (7) towards the capillary bed (8). Physiological buffer can be added from the container (6) via the control valve (4) if necessary in order to dilute the leukocyte fraction, if necessary in a mixing chamber (not shown). As soon as the optical sensor (19) detects the erythrocyte layer, the multi-way valve (4) is opened again towards the container (5) for liquid waste, so that the erythrocytes emerging from the bell are guided into the liquid waste. After the (diluted)

Leukozytenfraktion die Leitung (7) verlassen hat, wird die Leukozytenfraktion durch das Kapillarbett (8) geleitet. Im Anschluß an das Kapillarbett (8) gelangen, nach Abtrennung der von den Antikörpern gebundenen Leukozyten, die Tumorzellen durch das Verbindungsstück (9) in die ZellkulturvorrichtungLeukocyte fraction has left the line (7), the leukocyte fraction is passed through the capillary bed (8). Following the capillary bed (8), after the leukocytes bound by the antibodies have been separated, the tumor cells pass through the connector (9) into the cell culture device

(22) mit der Zellkulturplatte (10). Die Zellkulturplatte (10) kann nach Lösen der Gewindeschrauben (12) der Zellkulturvorrichtung (22) entnommen werden. Das Kapillarbett (8), das Verbindungsstück (9) und die Zellkulturvorrichtung(22) with the cell culture plate (10). The cell culture plate (10) can be removed after loosening the threaded screws (12) of the cell culture device (22). The capillary bed (8), the connecting piece (9) and the cell culture device

(22) mit der Zellkulturplatte (10) werden über die Heizung (14) bei 37⁰C gehalten. Aus dem CO₂-Behälter (13) wird das CO₂ über die Leitung (18) in das verbindungsstück (9) geleitet. Die Entnahmevorrichtung (11) dient zur Entnahme von überschüssiger physiologischer Lösung. Über den Einstichkanal (17) können die Zellen mittels einer eingeführten Kanüle auch abgesaugt werden.(22) with the cell culture plate (10) are kept at 37 ⁰ C via the heater (14). The CO ₂ is fed from the CO ₂ container (13) via the line (18) into the connecting piece (9). The removal device (11) is used to remove excess physiological solution. The cells can also be sucked out via the puncture channel (17) using an inserted cannula.

Zur Reinigung der erfindungsgemäßen Apheresevorrichtung wird, nachdem der Optiksensor (19) die Erythrozytenschicht detektiert hat, über die Steuerungsvorrichtung (nicht gezeigt) das Mehrwegeventil (1) so geschaltet, daß aus dem Behälter (15) eine Spüllösung durch die rotierende Glocke (2) über die Leitung (3) und das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall geleitet. Im Anschluß wird das Mehrwegeventil (1) so geschaltet, daß aus dem Behälter (16) Sterilisierungsmittel durch die Glocke (2) über die Leitung (3) und das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall überführt. Zum Schluß wird das Mehrwegeventil (1) so eingestellt, daß aus dem Behälter (6) sterile physiologische Pufferlösung durch die Glocke (2) über die Leitung (3) und das Mehrwegeventil (4) in den Behälter (5) für Flüssigabfall geführt.To clean the apheresis device according to the invention, after the optical sensor (19) has detected the erythrocyte layer, the multi-way valve (1) is switched via the control device (not shown) so that a rinsing solution is passed from the container (15) through the rotating bell (2) via the line (3) and the multi-way valve (4) into the container (5) for liquid waste. The multi-way valve (1) is then switched so that sterilizing agent is transferred from the container (16) through the bell (2) via the line (3) and the multi-way valve (4) into the container (5) for liquid waste. Finally, the multi-way valve (1) is set so that sterile physiological buffer solution is passed from the container (6) through the bell (2) via the line (3) and the multi-way valve (4) into the container (5) for liquid waste.

Claims

Protection claims

1. A portable apheresis device for isolating and culturing transformed cells from blood, the apheresis device comprising:

a first separation device for enriching and separating the leukocyte fraction, which comprises leukocytes and transformed cells, from the blood, and with a supply and removal device,
first transfer means for transferring the leukocyte fraction from the first separation device to a second separation device,

the second separating device for separating the

transformed cells and leukocytes, each with its own feeding and removal device,

second transfer means for transferring the transformed cells from the second separation device into a cell culture device,

the cell culture device with a supply and removal device for transformed cells, wherein the first separation device, the first transfer means, the second separation device, the second transfer means and the cell culture device are arranged in a continuous downstream arrangement connected one behind the other in a portable unit.

2. A portable apheresis device according to claim 1, wherein the first separation device comprises a continuous centrifuge with a flow rotor.

3. Portable apheresis device according to claim 2, wherein the centrifuge comprises a detection device for measuring the fractions.

5

4. Portable apheresis device according to one of the preceding claims, wherein the first transfer means comprises a device between the first separating device and the second

Separating device arranged connecting line.

5. Portable apheresis device according to claim 4, wherein a control device for controlling the position of the multi-way valve via the signals received from the detection device and at least one multi-way valve, each with a connecting line to a container for receiving liquid drained from the device and a connecting line to a storage container for physiological solutions and optionally at least one mixing chamber are provided.

6. Portable apheresis device according to one of the preceding claims, wherein the second separation device is in the form of a capillary bed or a separation column.

7. Portable apheresis device according to one of the preceding claims, wherein the second separation device comprises an adhesion system for leukocytes.

8. Portable apheresis device according to claim 7, wherein the adhesion system for leukocytes comprises immobilized molecules having an affinity for cell surface structures of the leukocytes.

9. Portable apheresis device according to one of the preceding claims, wherein the second separation device is designed as a unit that can be removed from the portable apheresis unit.

10. Portable apheresis device according to one of the preceding

0 claims, wherein the second transfer means comprise a connecting line arranged between the second separation device and the cell culture device.

11. Portable apheresis device according to claim 1, wherein in the

5 Connecting line between the second separation device and the cell culture device or in the cell culture device a removal device for sterile removal of the physiological

solution is provided.

12. Portable apheresis device according to one of the preceding claims, wherein the cell culture device comprises a removable cell culture plate.

13. Portable apheresis device according to one of the preceding claims, wherein the cell culture device is provided with a heater, a humidifier and/or a CO ₂ source.

14. Portable apheresis device according to one of the preceding claims, wherein a second multi-way valve is arranged upstream of the first separation device.

15. Portable apheresis device according to claim, wherein the second multi-way valve is connected to at least one supply each for blood, rinsing solution from a storage container and physiological solution from another storage container.