DE2945762A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ANTIBIOTICA-PRODUCING MICROMONOSPORA STRAINS WITH MODIFIED GENETIC MATERIAL - Google Patents
PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ANTIBIOTICA-PRODUCING MICROMONOSPORA STRAINS WITH MODIFIED GENETIC MATERIALInfo
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- C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
- C12P19/48—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin
- C12P19/485—Having two saccharide radicals bound through only oxygen to non-adjacent ring carbons of the cyclohexyl radical, e.g. gentamycin, kanamycin, sisomycin, verdamycin, mutamycin, tobramycin, nebramycin, antibiotics 66-40B, 66-40D, XK-62-2, 66-40, G-418, G-52
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Description
DR. STEPHAN G. BESZEDES PATENTANWALTDR. STEPHAN G. BESZEDES PATENT ADVOCATE
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betreffendconcerning
Verfahren zur Herstellung von Antibiotica erzeugenden r.icroijjonospora-Stäminen mit verändertem genetischem MaterialProcess for the production of antibiotic-producing r.icroijjonospora strains with altered genetic material
Me Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Antibiotica erzeugenden Micromonospora- -Stämmen mit verändertem genetischem Material.Me invention relates to a new method of manufacture of antibiotic-producing Micromonospora strains with altered genetic material.
Bekanntlich ist die Antibioticumerzeugung genetisch bestimmt, weswegen von einer im genetischen Material desAs is well known, the production of antibiotics is genetically determined, which is why there is one in the genetic material of the
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erzeugenden Stammeβ eingetretenen Veränderung auch die Fähigkeit des Stammes zur Antibioticumerzeugung beeinflußt wird. Derartige stabile genetische Änderungen (Mutationen) kommen außerordentlich selten auch ßpontan vor. Die Häufigkeit der Mutationen kenn durch bekannte Verfahren mit UV-, Nah-UV-, Gamma- und Röntgenbestrahlung sowie durch Behandlung mit verschiedenen mutagenen Substanzen erhöht werden. Bei diesen Verfahren ist es nachteilig, daß die Mutation ein ungerichteter, das heißt zufälliger Vorgang ist und daß nicht alle die Mutationsbehandlung überlebenden Individuen Mutanten sind. Daher muß eine große Anzahl überlebender Individuen gesiebt beziehungsweise gesondert (gescreenert) werden, bis ein besser erzeugender Mutant gefunden wird.The change that has taken place in the producing tribes the ability of the strain to produce antibiotics is affected. Such stable genetic changes (Mutations) also occur extremely rarely spontaneously. The frequency of the mutations is known from known Procedures with UV, near UV, gamma and X-ray radiation as well as treatment with various mutagenic substances increase. In these methods it is disadvantageous that the mutation is undirected, that is to say is accidental and that not all individuals surviving mutation treatment are mutants. Therefore a large number of surviving individuals must be sieved or separately (screened) until one better producing mutant is found.
Es ist bekannt, daß der Spiegel sehr vieler Enzyme mit dem Anstieg der Gendosis ansteigt, das heißt, daß, wenn sich in einem bestimmten Chromosom ein Gen verdoppelt, der Spiegel des von diesem Gen codierten Eiweißes auch auf etwa das Doppelte sich erhöht. Wie es ferner bekannt ist, wird beim Anstieg des Spiegels des für die Synthese des Antibioticums verantwortlichen Enzymes die Synthese des betreffenden Antibioticums intensiviert. Der Mechanismus der Genverdoppelung ist nicht geklärt. Ebenfalls ist es unbekannt, welche iuutagener Substanzen in erster Linie eine Genverdoppelung verursachen.It is known that the level of very many enzymes increases with the increase in the gene dose, that is, when a gene doubles in a certain chromosome, as does the level of the protein encoded by this gene increased to about double. Also, as is known, when the level rises, it becomes necessary for synthesis of the enzyme responsible for the antibiotic intensifies the synthesis of the antibiotic in question. The mechanism the duplication of genes is not clear. It is also unknown which iuutagener substances in the first place Line cause a duplication of genes.
Es ißt daher verständlich, daß einem Verfahren, durch welches die Anzahl der Genverdoppelungen wesentlich erhöht werden kann, für die Erzeugung von Antibiotics erzeugenden Stämmen große Bedeutung zukommen würde.It is understandable, therefore, that a process by which the number of gene duplications is substantial can be increased would be of great importance for the generation of antibiotic producing strains.
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ORlQiNAL INSPECTEDORlQiNAL INSPECTED
Es kann technisch beziehungsweise industriell nützlich sein, aus 2 Hicromonospora-Arten, die ähnliche Antibiotica erzeugen, einen neuen Stamm, der bessere Kultur- oder Produktionseigenschaften als die Ausgangsstämme hat oder ein neues wertvolles Antibioticum, dessen Struktur der Struktur der von den Ausgangsstämmen erzeugten Antibiotica ähnlich ist, erzeugt, herzustellen. It can be technically or industrially useful, from 2 Hicromonospora species that produce similar antibiotics, a new strain that has better culture or production properties than the parent strains or a new valuable antibiotic whose structure is similar to the structure of the antibiotics produced by the parent strains is, produced, produced.
Das Verfahren der Protoplastfusion ist als zur Lösung der obigen Probleme geeignet zu erwarten.The protoplast fusion method is expected to be suitable for solving the above problems.
Abgesehen von einer einzigen Veröffentlichung (Beretta und Mitarbeiter: J. of Bact. 107 [1971], 415) wurde für den technisch beziehungsweise industriell wichtigen Genus Micromonospora kein Verfahren zur Übertragung genetischer Informationen veröffentlicht. Gegenüber der für Streptomycetes beschriebenen Rekombinationshäufigkeit von 10 konnten bei eigenen Versuchen mit klassischen Verfahren und Micromonospora-Stämmen überhaupt keine Rekombiaanten erhalten werden, während mittels des für die gleichen Stämme ausgearbeiteten Verfahrens der Protoplastfusion die übertragung der genetischen Informationen mit einer Häufigkeit von 10 J bis 10 gelang.Apart from a single publication (Beretta and co-workers: J. of Bact. 107 [1971], 415), no method for transferring genetic information has been published for the technically or industrially important genus Micromonospora. Opposite the recombination described for Streptomycetes of 10 could no Rekombiaanten are obtained with our own experiments with classical method and Micromonospora strains during managed by means of the elaborated for the same strains method of protoplast fusion the transmission of the genetic information with a frequency of 10 J to 10 .
Bei der Fusion der Protoplaste vereinigt sich das gesamte Zytoplasma von 2 oder mehr Protoplasten, das heißt das gesamte im Zytoplasma befindliche genetische Material. Bei der Selektion werden entweder stabile Merodiploide oder Rekombinanten erhalten. Bei den Merodiploiden kann die Anzahl der für die Antibioticumsynthese verantwortlichen Gene innerhalb einer Zelle auch dann erhöht sein, wenn nichtWhen the protoplasts fuse, the entire cytoplasm of 2 or more protoplasts unites, that is all genetic material in the cytoplasm. During the selection either stable merodiploids are found or recombinants obtained. In the case of the merodiploids, the number of those responsible for the synthesis of antibiotics can be Genes within a cell can also be increased, if not
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direkt auf Antibioticumerzeugung selektiert wurde. Auch bei der Rekombination kann eine Genverdoppelung eintreten. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß in den die Selektion überlebenden Individuen die vom Donor in den Rezipienten gelangenden großen Chromosomenstücke mit einer viel größeren Häufigkeit fixiert werden, als dies bei sämtlichen bisher in der Bakteriengenetik angewandten Verfahren der Fall war.was selected directly for antibiotic production. Even gene duplication can occur during recombination. Another advantage of the method is that in the the selection surviving individuals the large chromosome pieces with a Much greater frequency can be fixed than is the case with any of the methods previously used in bacterial genetics was the case.
Das Verfahren der Protoplastfusion wird seit langem für die Untersuchung der genetischen -Eigenschaften von Säugetier- und PfIe zenzellen sowie Pilzen verbreitet angewandt.The process of protoplast fusion has been around for a long time for studying the genetic properties of Mammal and plant cells as well as fungi are widespread applied.
Über die Fusion von Bakterienprotoplasten, insbesondere zu den Schwierigkeiten der Zellwandregenerierung, erschienen 1976 die ersten Veröffentlichungen: K. Fodor, L. Alföldi, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7± [1976], 2 14-7, P. Schaeffer und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 [1976], 2 151, D. A. Hopwood und Mitarbeiter, Nature 268 [1977], 171» R. H. Baltz, J. of Gen. Microb. 107 [1978], 93 und O. Godfrey und Mitarbeiter, Can. J. Microbiol. 24 [1978],The first publications on the fusion of bacterial protoplasts, in particular on the difficulties of cell wall regeneration, appeared in 1976: K. Fodor, L. Alföldi, Proc. Natl. Acad. May be. USA 7 ± [1976], 2 14-7, P. Schaeffer and coworkers, Proc. Natl. Acad. May be. USA 75 [1976], 2151, DA Hopwood et al., Nature 268 [1977], 171 »RH Baltz, J. of Gen. Microb. 107 [1978], 93 and O. Godfrey et al., Can. J. Microbiol. 24 [1978],
Über eine erfolgreiche Protoplastfusion innerhalb der Familie Micrononospora wird jedoch im Fachschriftturn nicht berichtet.About a successful protoplast fusion within the However, the Micrononospora family is not in the specialist journal reported.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein. Verfahren zur Herstellung von Antibiotica erzeugenden Micromonospora-Stämmen mit verändertem genetischem Material, durch welches die genetischen Eigenschaften vonThe invention is therefore based on the object. Process for the production of antibiotic-producing Micromonospora strains with altered genetic properties Material by which the genetic properties of
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Micromonospora-Stämmen mittels Protoplastfusion, und zwar auf dem Wege der Rekombination günstig verändert werden, zu schaffen.Micromonospora strains using protoplast fusion, namely can be changed favorably on the way of recombination to create.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.The above has surprisingly been made by the invention achieved.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotica erzeugenden Micromonospora- -Stämmen mit verändertem genetischem Material, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur genetischen Informationsübertragung aus den Kulturen von 2 Mutanten, von denen mindestens 1, vorzugsweise beide, genetisch markiert ist beziehungsweise sind, Antibiotica erzeugender Micromonospora-Stämme nach Züchtung an einem Glykokollnährnieriium unter, vorzugsweise mit Saccharose aufrechterhaltenem, Osmoseschutz mit dem Enzym Lysozym Protoplastsuspensionen bereitet werden, die beiden erhaltenen Suspensionen in Gegenwart eines Polyäthylenglykoles vereinigt und·bei Zimmertemperatur bebrütet werden, die erhaltenen verschmolzenen (fusionierten) Protoplaste in weichem Agar suspendiert, auf, vorzugsweise Saccharose, Prolin und anorganische Salze enthaltende, Agarplatten geschichtet und 20 bis JO Tage lang bebrütet werden und von den regenerierten Kolonien diejenigen, deren genetisches Material mit Sicherheit von dem der Eltern abweicht, ausgewählt werden.The invention relates to a method for production of antibiotic-producing Micromonospora strains with altered genetic material, which is characterized in that for genetic information transfer from the cultures of 2 mutants, of which at least 1, preferably both, are genetically marked is or are, antibiotic-producing Micromonospora strains after cultivation on a glycocolla nieriium under osmosis protection, preferably maintained with sucrose, with the enzyme lysozyme protoplast suspensions are prepared, the two suspensions obtained are combined in the presence of a polyethylene glycol and · at Are incubated at room temperature, the fused (fused) protoplasts obtained are suspended in soft agar, on agar plates, preferably containing sucrose, proline and inorganic salts, and Incubated for 20 to JO days and from the regenerated Colonies those whose genetic material is certain to differ from that of the parents are selected.
Zweckmäßig verden die Protoplaste aus am Beginn der logarithmischen Phase befindlichen Kulturen bereitet.The protoplasts are expediently prepared from cultures at the beginning of the logarithmic phase.
Vorzugsweise wird die genetische Informationsübertragung innerhalb eines Stammes vorgenommen.Genetic information transfer is preferred made within a tribe.
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Bevorzugt werden als Micromonospora-Stämme der Sisomycin erzeugende Stamm Micromonospora inyoensis, vorzugsweise der unter der Bezeichnung ATC3 27600 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegte und vor dem 13. November 1978 freigegebene (ist im Katalog der AMEEICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten) / der Gentamycin erzeugende Stamm Micromonospora purpurea var. nigrescens, vorzugsweise der unter der Bezeichnung MNG 00122 am 12. Dezember 1973 in der Nationalen Stammsajnmlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet) hinterlegte, der Gentamycin erzeugende Stamm Micromonospora purpurea (Holotyp), vorzugsweise der unter der Bezeichnung ATCC 15835 in der AMERICAN TYPE CULTUKE COLLECION hinterlegte und vor dem 13. November 1978 freigegebene (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten), der Gentamycin erzeugende Stamm Micromonospora echinospora, vorzugsweise der unter der Bezeichnung ATCC 15837 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegte und vor· dem 13· November 1978 freigegebene (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten) beziehungsweise der Fortemycin erzeugende Stamm Micromonospora olivoasterospora, vorzugsweise der unter der Bezeichnung ATCC 21819 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegte und vor dem 13· November 1978 freigegebene (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten) , verwendet.The Micromonospora strains are preferred Sisomycin producing strain Micromonospora inyoensis, preferably the one stored in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION under the designation ATC3 27600 and before the Released November 13, 1978 (is in the catalog of the AMEEICAN TYPE CULTURE COLLECTION) / the gentamicin-producing strain Micromonospora purpurea var. nigrescens, preferably the one under the designation MNG 00122 on December 12, 1973 in the National Tribal Assembly of the Hungarian National Institute for Health Care (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet) who Gentamicin-producing strain Micromonospora purpurea (Holotype), preferably that deposited under the name ATCC 15835 in the AMERICAN TYPE CULTUKE COLLECION and released before November 13, 1978 (is in Catalog of the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION), the gentamycin-producing strain Micromonospora echinospora, preferably the one deposited under the designation ATCC 15837 in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION and before · the 13 · November 1978 released (is contained in the catalog of the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) or the fortemycin-producing strain Micromonospora olivoasterospora, preferably the one under the name ATCC 21819 stored in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION and released before November 13, 1978 (is in Catalog of the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION included), used.
Besonders bevorzugt ü es, die genetische Informationsübertragung zwischen zweien der Stämme Micromonospora inyoensis, Micromonospora purpurea var. nigrescens,Particularly preferred is the genetic information transfer between two of the strains Micromonospora inyoensis, Micromonospora purpurea var.nigrescens,
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~7~ 23'o762 ~ 7 ~ 23'o762
Micromonospora purpurea (Holotyp), Micromonospora echinospora und Micromonospora olivoasterospora vorzunehmen. Micromonospora purpurea (holotype), Micromonospora echinospora and Micromonospora olivoasterospora.
Im einzelnen wird zweckmäßig wie folgt vorgegangen.In detail, the appropriate procedure is as follows.
Um das enzymatische Ablösen der Zellwand zu fördern, wird dem Kulturmedium Glykokoll (Glycin), vorzugsweise in einer Menge von 0,2 bis 0,5 Gew.-%, zugesetzt. Infolge der die Biosynthese der Zellwand hemmenden Wirkung des Glykokolles sind in allen mit Glykokoll sensibilisierten Kulturen die Myzelfäden kürzer und dicker als in Kulturen ohne Glykokoll und an den Myzelfäden erscheinen Anschwellungen. Nur aus Kulturen, die unter dem Mikroskop das beschriebene Bild zeigen, können mit zureichendem Wirkungsgrad Protoplastsuspensionen hergestellt werden.To promote the enzymatic detachment of the cell wall, Glycocolla (glycine) is added to the culture medium, preferably in an amount of 0.2 to 0.5% by weight. As a result of the biosynthesis of the cell wall inhibiting effect of glycocolles are sensitized in all with glycocolla Cultures the mycelial threads are shorter and thicker than in cultures without glycocolla and swellings appear on the mycelial threads. Only from cultures that show the described picture under the microscope can with sufficient efficiency Protoplast suspensions are prepared.
Die sensibilisierten Kulturen werden unter Osmoseschutz, vorzugsweise in einem, insbesondere 0,2 bis 0,35 MqI» Saccharose enthaltenden Medium mit Lysozym (siehe beispielsweise Römpp Chemie Lexikon, 5· Auflage, 1962, Spalte 3 041 bis 3 042) in einer Konzentration von 5 bis 10 mg/cnr 30 bis 90 Minuten lang behandelt.The sensitized cultures are protected against osmosis, preferably in a, in particular 0.2 to 0.35 MqI » Sucrose-containing medium with lysozyme (see, for example, Römpp Chemie Lexikon, 5th edition, 1962, column 3 041 to 3 042) in a concentration of 5 to 10 mg / cnr Treated for 30 to 90 minutes.
Die aus den verschiedenen Mutanten des Stammes erhaltenen Protoplastsuspensionen werden im Verhältnis von 1 : 1 vermischt und mit einem Polyäthylenglykol, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von 6 000, behandelt, wobei die Protoplaste verschmelzen. Die die verschmolzenen Protoplaste enthaltende Suspension wird auf Regenerieragar, der die für den Osmoseschutz notwendige Saccharose, das die Regeneration begünstigende Prolin und anorganisch· Salze,The protoplast suspensions obtained from the various mutants of the strain are in proportion 1: 1 mixed and treated with a polyethylene glycol, preferably with a molecular weight of 6,000, whereby the protoplasts fuse. The suspension containing the fused protoplasts is poured onto regeneration agar, the sucrose necessary for osmosis protection, the proline that promotes regeneration and inorganic salts,
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vorzugsweise Calciumchlorid (CaCIg)» Magneβiumchiorid (MgCIo) und/oder primäres Kaliumphoephat (KHpPO^) enthält, bei 30 bis 37°C bebrütet. Die Protoplaste regenerieren sich innerhalb 20 bis 30 Tege.preferably calcium chloride (CaCIg) »magnesium chloride (MgCIo) and / or primary potassium phate (KHpPO ^) contains, incubated at 30 to 37 ° C. The protoplasts regenerate within 20 to 30 days.
Die genetischen -Eigenschaften der ausgewählten Elternpaare müssen im Hinblick auf übliche Selektierverfehren so beschaffen sein, daß die sich aus ihnen bei der Fusion bildenden Bekombinanten durch Selektion abgetrennt werden können. Dies kann mittels der auch in der klassischen Mikrobengenetik mit Erfolg angewandten Antibioticum-Resistenz oder mittels unterschiedlicher Auxotrophe geschehen.The genetic traits of the selected pairs of parents must with regard to the usual selection procedures be of such a nature that the bekombinanten formed from them during the fusion are separated off by selection can. This can be done by means of antibiotic resistance, which has also been successfully used in classical microbial genetics or by means of different auxotrophs.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dos erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Falle des Sisoaycin erzeugenden Stammes Micromonospora inyoensis, hinterlegt unter der Bezeichnung ATCC 27600 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION und freigegeben vor dem 13. November 1978 (ist im Katalog der AMERICAN ΤΪΡΕ CULTURE COLLECTION enthalten), ein Elternpaar eingesetzt, bei dem der eine Partner zum Wachstum Casaminosäure braucht, aber rifampicinresistent ist, während der andere Partner zum Wachstum keine Caseminosäure braucht, aber rifampicinempfindlich (gegenüber 0,5 yuLg/cnr Kifampicin bereits empfindlich) ist. Nach der Fusion werden diejenigen Nachkommen gesucht, die zum Wachstum keine Casaminosäure brauchen und rifampicinresistent sind, das heißt auf einem Minimalnährmedium in Gegenwart von 10 ug/cm Kifampicin Kolonien bilden. Die Regenerierung wird auf einem nicht selektiven, optimale Regenerierungsbedingungen gewährleistenden Nährmedium vorgenommen. Zur Auswahl der rekombinanten Phünotypen werden die regenerierten Kolonien abgewaschen und die SuspensionAccording to a preferred embodiment of the invention In the case of sisoaycin, the process is generative Micromonospora inyoensis tribe, deposited under the Designation ATCC 27600 in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION and released before November 13, 1978 (is contained in the catalog of the AMERICAN ΤΪΡΕ CULTURE COLLECTION), A pair of parents used in which one partner needs casamino acid for growth, but is rifampicin-resistant while the other partner for growth is not a casemino acid needs, but sensitive to rifampicin (to 0.5 yuLg / cnr kifampicin is already sensitive). After Fusion will look for those offspring who do not need casamino acids for growth and are rifampicin-resistant i.e. form colonies on a minimal nutrient medium in the presence of 10 µg / cm kifampicin. the Regeneration is carried out on a non-selective nutrient medium that ensures optimal regeneration conditions. To select the recombinant phenotypes, the regenerated colonies are washed off and the suspension
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wird auf einem selektiven 10 ug/cnr Rifampicin enthaltenden Minimalmedium aufgefächert. Die hier wachsenden Kolonien entstehen axis den bei der Fusion erhaltenen rekombinanten Phänotypen.is on a selective containing 10 ug / cnr rifampicin Minimal medium fanned out. The colonies growing here arise axis the recombinants obtained in the fusion Phenotypes.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine neue Selektierverfahrensweise angewandt, bei der der eine Partner (Elternteil) durch Wärme inaktiviert wird. Die Wärmebehandlung muß energisch genug sein, um alle Lebensfähigkeit abzutöten, darf jedoch das genetische Material nicht angreifen. In diesem Falle wird das gesamte genetische Material des einen Partners in dss durch Wärme inaktivierte Zytoplasma des anderen Partners übertragen. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil, daß sie die Selektierung nach der Fusion auch in Fällen, in welchen nur einer der Partner genetisch markiert ist, ermöglicht.According to a further preferred embodiment of the The method according to the invention is a new selection procedure used in which one partner (parent) is inactivated by heat. The heat treatment must be energetic enough to kill all viability, however, must not attack the genetic material. In this case, all the genetic material of the one partner in the heat-inactivated cytoplasm of the other partner. This procedure has the advantage that it allows selection after the fusion even in cases in which only one of the partners is genetic is marked, enables.
Diese Verfahrensweise wurde beim Gentamycin erzeugenden Stamm Micromonospora purpurea var. nigrescens, hinterlegt unter der Bezeichnung MNG 00122 am 12. Dezember 1973 in der Nationalen Stainmsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), für ein Elternpaar aus einem streptoinycinempfindlichen Partner und einem streptomycinresistenten Partner angewandt. Zur Selektion der Rekombinanten werden die Protoplaste des streptomycinresistenten Partners vor der Fusion durch vorsichtige Wärmebehandlung (zweckmäßig bei 55°C) inaktiviert. Da die Streptomycinempfindlichkeit gegenüber der Streptomycinresistenz dominant ist, muß mit dem Selektieren der Rekombinanten einige Tage gewartet werden.This procedure has been deposited with the gentamicin-producing strain Micromonospora purpurea var. Nigrescens under the designation MNG 00122 on December 12, 1973 in the National Collection of Stems of the Hungarian National Institute for health care (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), for a parent couple from a streptoinycin sensitive Partner and a streptomycin resistant partner. The protoplasts are used to select the recombinants of the streptomycin-resistant partner prior to the fusion by careful heat treatment (expediently at 55 ° C) inactivated. Since the streptomycin sensitivity is dominant over the streptomycin resistance, must with the Selecting the recombinants must be waited for a few days.
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Nach 8 bis 10 Tagen werden 10 000 pg/cm Streptomycin auf die Regenerierplatten aufgebracht. Das genetische Material der nach 20 bis 30 Tagen erscheinenden Kolonien weicht von dem des £lternpaares ab.After 8 to 10 days, 10,000 pg / cm streptomycin appear the regeneration plates applied. The genetic material of the colonies that appear after 20 to 30 days gives way from that of the parents.
Unter Anwendung der Inaktivierungsverfahren3weise durch Wärmebehandlung und Ausnutzung der Tatsache, daß der Stamm Micromonospora purpurea var. nigrescens, hinterlegt unter der Bezeichnung MNG 00122 am 12. Dezember 1973 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), gegen Streptomycin um 2 Größenordnungen resistenter ist als Micromonospora inyoensis, hinterlegt unter der Bezeichnung ATCC 27600 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION und freigegeben vor dem 13. November 1978 (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten), wurde durch Protoplastfusion der interspezifische Hybrid zwischen den beiden Stämmen geschaffen. Dabei wird die aus dem genannten gegen Streptomycin resistenten Stamm Micromonospora purpurea var. nigrescens gewonnene Protoplastsuspension durch Wärmebehandlung inaktiviert und dann mit der Protoplast suspension des gegen Streptomycin empfindlichen Stammes Micromonospora inyoensis verschmolzen. Nach 8 bis 10 Tagen wird Streptomycin in einer Konzentration von 100 ug/cm enthaltender Agar auf die zu regenerierenden Protoplaste gestrichen. Die nach 20 bis 30 Tagen erscheinenden Kolonien sind interspezifische Hybride.Using the inactivation procedures3wise by heat treatment and exploitation of the fact that the strain Micromonospora purpurea var.nigrescens, deposited under the designation MNG 00122 on December 12, 1973 in the National Tribal Collection of Hungarian National Health Institute (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), against streptomycin is 2 orders of magnitude more resistant than Micromonospora inyoensis, deposited under the designation ATCC 27600 in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION and released before November 13, 1978 (included in the catalog of the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION), was by Protoplast fusion of the interspecific hybrid between the created by both tribes. In this case, the Micromonospora strain from the aforementioned Streptomycin-resistant strain purpurea var. nigrescens protoplast suspension obtained by heat treatment and then inactivated with the protoplast suspension of those sensitive to streptomycin Fused strain Micromonospora inyoensis. After 8 to 10 days, streptomycin is found at a concentration of Agar containing 100 µg / cm was streaked onto the protoplasts to be regenerated. Those that appear after 20 to 30 days Colonies are interspecific hybrids.
Die beschriebene Verfahrensweise wurde auch auf ein Elternpaar mit anderer genetischer Markierung angewandt. Der eine Partner braucht zum Wachstum Casaminosäure,The procedure described was also applied to a pair of parents with a different genetic mark. One partner needs casamino acid to grow,
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"^" 294S762"^" 294S762
der andere nicht. Zur Selektierung der Rekombinanten werden die Protoplaste des zum Wachstum Casaminosäure benötigenden Partners durch vorsichtige Wärmebehandlung inaktiviert. Die verschmolzenen Protoplaste werden auf Minimalagar aufgebracht. Die nach 20 bis 30 Tagen erscheinenden Kolonien haben Rekombinanteneigenschaften.the other not. To select the recombinants the protoplasts of the partner required for growth are casamino acid through careful heat treatment inactivated. The fused protoplasts are placed on minimal agar. Those that appear after 20 to 30 days Colonies have recombinant properties.
Zur Untersuchung der Antibioticumproduktivität der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Micromonospora-Stämme mit modifiziertem genetischem Material können die im einschlägigen Fachschrifttum beschriebenen Verfahren angewandt werden. Zur Bestimmung der Produktivität der aus dem den Gentamycin-Koraplex erzeugenden Stamm Micromonospora purpurea var. nigrescens, hinterlegt unter der Bezeichnung MNG 00122 em 12. Dezember 1973 in äer Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), gewonnenen Rekombinanten wird der zu untersuchende Stamm unter hinsichtlich der Antibioticumerzeugung als op.timal festgestellten Gär- beziehungsweise Fermentationsbedingungen gezüchtet (ungarische Patentschrift 168 778) und dann die biologische Gesamtaktivität der Kultur nach der Agardiffusionsverfahrensweise (Testorganismus: Staphylococcus epidermidis) und die Zusammensetzung des biosynthetisierten Gentamycin-Komplexes gemäß den Vorschriften des Code of Federal Register (21. Food and Drugs 1977 Apr. 1. § 444.20 a/b, Seite 433 bis 435) bestimmt. To investigate the antibiotic productivity of the Micromonospora strains obtained by the method according to the invention with modified genetic material, the methods described in the relevant specialist literature can be used can be applied. To determine the productivity of the Micromonospora strain that produces the gentamycin coraplex purpurea var. nigrescens, deposited under the name MNG 00122 on December 12, 1973 in äer National Master collection of the Hungarian National Institute for Health Care (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), won The strain to be examined is considered to be recombinant as op.timal with regard to antibiotic production established fermentation or fermentation conditions (Hungarian patent specification 168 778) and then the total biological activity of the culture according to the agar diffusion method (test organism: Staphylococcus epidermidis) and the composition of the biosynthesized gentamycin complex according to the regulations of the Code of Federal Register (21. Food and Drugs 1977 Apr. 1. § 444.20 a / b, pages 433 to 435).
Die Verfahrensweise der Protoplastfusion erwies sich wie bereits erwähat darüberhinaus für die übertragung genetischer Informationen auch bei anderen AminoglykosideAs already mentioned, the protoplast fusion procedure also proved to be useful for the transfer genetic information for other aminoglycosides as well
030021 /0852030021/0852
75"75 "
- Y- - Y-
erzeugenden Micromonoepora-Stämmen, wie Micromonospora purpurea [Holotyp], hinterlegt unter der Bezeichnung ATCC 15835 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION und freigegeben vor dem 13. November 1978 (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten), Micromonospora echinospora, hinterlegt unter der Bezeichnung ATCC 15837 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION und freigegeben vor dem 13. November 1978 (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten) und Micromonospora olivoasterospora, hinterlegt unter der Bezeichnung ATCC 21819 in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION und freigegeben vor dem 13. November 1978 (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten), als geeignet, wobei die Häufigkeit verhältnismäßig hoch ist.producing Micromonoepora strains such as Micromonospora purpurea [holotype], deposited under the name ATCC 15835 in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION and released before November 13, 1978 (is in the catalog of AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION), Micromonospora echinospora, deposited under the name ATCC 15837 in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION and released before November 13, 1978 (is in the catalog of AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) and Micromonospora olivoasterospora, deposited under the designation ATCC 21819 in the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION and released before November 13, 1978 (is in the catalog of AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) as suitable, although the frequency is relatively high.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated by the following examples explained in more detail.
Es wurde das tiefgefrorene vegetative Myzel der folgenden beiden Mutanten des Sisomycin erzeugenden Stainnes Micromonospora inyoensis, hinterlegt unter der Bezeichnung ATCC 27600 in der AFRICAN TYPE CULTURE COLLECTION und freigegeben vor dem 13· November 1978 (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten),It became the frozen vegetative mycelium of the following two mutants of sisomycin-producing Stainnes Micromonospora inyoensis, deposited under the designation ATCC 27600 in the AFRICAN TYPE CULTURE COLLECTION and approved before November 13, 1978 (is in the catalog of AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION included),
a) Casaminosäure erfordernd, rifampicinreeistent (cas~RifR) unda) Requiring casamino acid, rifampicin-resistant (cas ~ Rif R ) and
b) Casaminosäure nicht erfordernd, rifampicinempfindlich (cas+RifS)b) Casamino acid not required, sensitive to rifampicin (cas + Rif S )
- 13 030021 /0852- 13 030021/0852
!NSPECTED! NSPECTED
'**' 29Λ5762 '**' 29Λ5762
unter sterilen Bedingungen in je 100 cm steriles Impf- nährmedium (Inokulumnährmedium), das sich in 500 cm* Erlenmeyerkolben befand, geimpft. Das sterile Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung: inoculated under sterile conditions in 100 cm sterile inoculum medium, which was in 500 cm * Erlenmeyer flasks. The sterile nutrient medium had the following composition:
1 Gew.-% Sojamehl 1 Gew.-% Kartoffelstärke 1 Gew.-% Saccharose 0,4 Gew.-% Calciumcarbonat (CaCOz) in Leitungswasser1% by weight soy flour 1 % by weight potato starch 1% by weight sucrose 0.4 % by weight calcium carbonate (CaCOz) in tap water
— R- R
Die Kultur des Stammes Cas Kif wurde in einerThe culture of the Cas Kif tribe was in a
Schüttelmaschine 40 Stunden lang bei 570C bebrütet und dann steril auf 100 cm eines sterilen Nährmediums (in einem 500 cnr Erlenmeyerkolben) der folgenden Zusammensetzung überimpft.Shaker for 40 hours incubated at 57 0 C and then sterilized at 100 cm of a sterile nutrient medium (in a 500 cnr Erlenmeyer flask) of the following composition was inoculated.
0,1 Gew.-% Kaliumnitrat 0,05 Gew.-% sekundäres Kaliumphosphat 0,05 Gew.-% Kagnesiumsulfatheptahydrat0.1 wt% potassium nitrate 0.05 wt% secondary potassium phosphate 0.05 wt% magnesium sulfate heptahydrate
0^ . 7 H2O) 0,05 Gew.-% Natriuntchloi id (NaCl) 1 Gev.-% Glucose 0,1 Gew.-% Hefeextrakt 0,2 Gew.-% Glykokoll 0,3 Gew.-% Casaminosäure in destilliertem Wasser0 ^. 7 H 2 O) 0.05 % by weight sodium chloride (NaCl) 1 Gev. -% glucose 0.1 % by weight yeast extract 0.2% by weight glycocolla 0.3% by weight casamino acid in distilled water
- 14 -- 14 -
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Nach dem Überimpfen wurde die Kultur an diesem Nährmedium in einer Schüttelmaschine 4-8 Stunden lang bei 370C bebrütet.After seeding, the culture of this medium in a shaker was incubated at 37 0 C for 4-8 hours.
Die in das Impfnährmedium geimpfte Kultur des Stammes Cas Rif wurde in einer Schüttelmaschine 65 Stunden lang bei 37°C bebrütet und dann steril auf 100 cm eines sterilen Nährmediums (in einem 500 cnr Erlenmeyerkolben) der folgenden Zusammensetzung überimpft.The culture of Cas Rif strain inoculated in the inoculation medium was stirred in a shaker Incubated for 65 hours at 37 ° C and then sterile on 100 cm of sterile nutrient medium (in a 500 cnr Erlenmeyer flasks) of the following composition.
0,1 Gew.-% Kaliumnitrat 5 0,05 Gev.-Yo sekundäres Kaliumphosphat0.1% by weight potassium nitrate 5 0.05 % Yo secondary potassium phosphate
0,05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4 . 7 H2O)0.05% by weight magnesium sulfate heptahydrate (MgSO 4. 7 H 2 O)
0,05 Gew.-% Natriumchlorid (NaCl)0.05% by weight sodium chloride (NaCl)
1 Gew.-% Glucose1% by weight glucose
0,1 Gew.-% Hefeextrakt0.1% by weight yeast extract
0,5 Gew.-% Glykokoll0.5 wt% glycocolla
in Lösung in destilliertem Wasserin solution in distilled water
Nach dem überimpfen wurde die Kultur in einer Schüttelmaschine 23 Stunden lang bei 37°C bebrütet.After inoculation, the culture was placed on a shaker Incubated for 23 hours at 37 ° C.
Dann wurden beide Kulturen zentrifugiert (mit 6 000 Umdrehungen/Minute) und der Bodensatz wurde jeweils in 20 cm eines P,.-Nährmediums der folgenden Zusammensetzung suspendiert.Then both cultures were centrifuged (at 6,000 revolutions / minute) and the sediment was in each case in 20 cm of a P. nutrient medium of the following composition suspended.
030021 /0852030021/0852
in destilliertem Wasserin distilled water
*) mit einem Gehalt an*) with a content of
40 mg/1 Zinkchlorid mg/1 £isen(III)-chloridhexehydrat (FeCl, . 6 H2O)40 mg / 1 zinc chloride mg / 1 isen (III) chloride hexehydrate (FeCl,. 6 H 2 O)
10 mg/1 Kupfer(II)-chloriddihydrat (CuCl2 . 2 H2O)10 mg / 1 copper (II) chloride dihydrate (CuCl 2. 2 H 2 O)
10 mg/1 Mangan(ll)-c>loridtetrahydrat (MnCl2 . 4 H2O)10 mg / 1 manganese (ll) -c> loride tetrahydrate (MnCl 2. 4 H 2 O)
10 mg/1 Borax (Na2B4O7 . 10 H3O)10 mg / 1 borax (Na 2 B 4 O 7. 10 H 3 O)
10 mg/1 Ammoniummolybdattetrahydrat [(ΝΗ4)6Μο?024 . 4 H2O]10 mg / 1 ammonium molybdate tetrahydrate [(ΝΗ 4 ) 6 Μο ? 0 24 . 4 H 2 O]
-. 16 --. 16 -
030021/0852030021/0852
2 η /»Γ) 7 62 η / » Γ ) 7 6
Die erhaltenen Suspensionen wurden steril zentrifu giert (mit 6 000 Umdrehungen/Minute) und erneut in 2 cm des P^-Nährmediums der obigen Zusammensetzung sus- The suspensions obtained were centrifuged in a sterile manner (at 6,000 revolutions / minute) and resuspended in 2 cm of the P ^ nutrient medium of the above composition
3 3 3 3
pendiert. Zu 1 cm Jeder Suspension wurde Je 1 cnr einer sterilen Lysozymlösung mit einer Konzentration von 20 mg/cm zugegeben (die i-ndkonzentration des Lysozymes betrug 10 mg/cm ), wobei das Lysozym ein solches von 17 000 E/mg (Calbiochem/San Diego, Kalifornien) war; es war ebenfalls im P,.-Nährmedium der obigen Zusammensetzung gelöst. Die mit Lysozym versetzten Kulturen wurden pending. To 1 cm of each suspension was Depending 1 cnr a sterile solution of lysozyme at a concentration of 20 mg / cm was added (the i-ndkonzentration of Lysozymes was 10 mg / cm), wherein the lysozyme such 17 000 U / mg (Calbiochem / San Diego, California) was; it was also dissolved in the P. nutrient medium of the above composition. The cultures spiked with lysozyme were
ζ ηζ η
in 25 cnr Erlenmeyerkolben bei 37 C langsam geschüttelt.Shaken slowly in 25 cm Erlenmeyer flask at 37 ° C.
Wie es bei mikroskopischen Beobachtungen erkennbar war, wandelten sich die Kulturen nach 30 bis 60 Minuten quantitativ zu Protoplasten um. Die erhaltenen Protoplastsuspensione.i wurden steril zentrifugiert, dann erneut inAs was evident in microscopic observations, the cultures walked in 30 to 60 minutes quantitatively to protoplasts. The Protoplastsuspensione.i obtained were centrifuged sterile, then again in
2 cnr des P^-Nährmediums der obigen Zusammensetzung suspendiert und der beschriebene Arbeitsgang wurde wiederholt.Suspended 2 cnr of the P ^ broth of the above composition and the described operation was repeated.
Zum Zwecke der Protoplastfuaion wurden die Protoplastsuspensionen der beiden Mutanten im Verhältnis von 1 : 1 miteinander vermischt. Dann wurde 0,1 cm dieser Suspension 30 Minuten lang in 0,9 cnr einer 50%-igen wäßrigen Polyäthylenglykollösung (Molekulargewicht = 6 000), die 15% Diniethylsulfoxyd enthielt, str jengelassen. 0,05 cnr der mit dem Polyathylenglykol behandelten Suspension wurden einem weichen 0,5 Gew.-% Agar enthaltenden R--Nährmedium der folgenden Zusammensetzung zugetropft.For the purpose of protoplastfuaion, the protoplast suspensions of the two mutants were mixed with one another in a ratio of 1: 1. 0.1 cm of this suspension was then allowed to flow for 30 minutes in 0.9 cm of a 50% strength aqueous polyethylene glycol solution (molecular weight = 6,000) containing 15% diniethyl sulfoxide. 0.05 cnr of the suspension treated with the polyethylene glycol were added dropwise to a soft R nutrient medium containing 0.5% by weight agar and having the following composition.
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0,2 Mol Saccharose0.2 moles of sucrose
0,25 g/l Kaliumsulfat0.25 g / l potassium sulfate
1 Gew.-# Glucose
0,3 Gew.-# Prolin1 wt .- # glucose
0.3 wt. # Proline
0,01 Gew.-% Casaminosäure0.01 wt% casamino acid
2 cm /1 Spurenelementenlösung der oben2 cm / 1 trace element solution of the above
angegebenen Zusammensetzungspecified composition
0,025 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-0.025 mol tris (hydroxymethyl) aminomethane
-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 Millimol Magnesiumchlorid (KgCIp) Millimol Calciumchlorid (CaCl2) 0,2 Millimol primäres Kaliuraphosphat (KHpPO^) 0,1 Gew.-% Hefeextrakt-Buffer with a pH value of 7.5 millimoles magnesium chloride (KgCIp) millimoles calcium chloride (CaCl 2 ) 0.2 millimoles primary potassium urophosphate (KHpPO ^) 0.1% by weight yeast extract
in Lösung in destilliertem Wasserin solution in distilled water
Das erhaltene Gemisch wurde auf einen festen 2,2 Gew.-% Agar enthaltenden R,.-Nährboden der obigen Zusammensetzung aufgebracht.The resulting mixture was reduced to a solid 2.2% by weight R, agar-containing medium of the above composition upset.
Die nach 4 bis 6 Tage langem Bebrüten aif diesem Nährboden erschienenen Kolonien hatten ein im Vergleich zu den Eltern verändertes genetisches Material.After 4 to 6 days of incubation in this culture medium The colonies that appeared had an altered genetic material compared to that of the parents.
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* ' 2SA5762 * ' 2SA5762
Es wurde das tiefgefrorene vegetative Myzel der folgenden beiden Mutanten des Gentamycin erzeugenden Stanjces Micromonospora purpurea var. nigrescens, hinterlegt unter der Bezeichnung MNG 00122 am 12. Dezember 1973 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),It became the frozen vegetative mycelium of the the following two mutants of the gentamycin-producing Stanjces Micromonospora purpurea var. nigrescens, deposited under the designation MNG 00122 on December 12, 1973 in the national trunk collection of the Hungarian National Institute for Health Care (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
a) streptomycinresistent Sma) streptomycin resistant Sm
b) streptomycinempfindlich (Sm )b) streptomycin sensitive (Sm)
unter sterilen Bedingungen in je 100 cm* steriles Impfnährmedium, das sich in einem 500 cnr Erlenmeyerkolben befand, geimpft. Das sterile Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:under sterile conditions in 100 cm * sterile inoculation medium, which is in a 500 cnr Erlenmeyer flask found vaccinated. The sterile nutrient medium had the following composition:
1 Gew.-% Glucose 0,4 Gew.-% Pepton1 wt% glucose 0.4 wt% peptone
0,4 Gew.-% Hefeextrakt0.4% by weight yeast extract
0,3 Gew.-% Glykokoll0.3 wt% glycocolla
0,2 Gew.-% sekundäres Kaliumphosphat0.2% by weight secondary potassium phosphate
0,4 Gew.-% primäres Kaliumphosphat (2^0.4% by weight primary potassium phosphate ( 2 ^
0,05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4 . 7 H2O)0.05% by weight magnesium sulfate heptahydrate (MgSO 4. 7 H 2 O)
2 cm /1 Spurenelementenlösung der im2 cm / 1 trace element solution of the im
Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung Example 1 given composition
in Lösung in destilliertem Wasserin solution in distilled water
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ν! -ν! -
Die Kulturen wurden auf einem Schütteltisch (mit 320 Umdrehungen/Minute) 42 bis 44 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Dann wurden beide Kulturen steril zentrifugiert (»it 6 000 Umdrehungen/Minute bei 0°C). Der Bodensatz wurde in 20 cm eines Po-Nährmediums der folgenden Zusammensetzung suspendiert.The cultures were kept on a shaker table (at 320 revolutions per minute) for 42 to 44 hours 37 ° C incubated. Then both cultures were centrifuged in a sterile manner (6,000 revolutions / minute at 0 ° C.). The sediment was placed in 20 cm of a butt nutrient medium of the following Composition suspended.
Saccharose
Kaliumsulfat (K2SO^)
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan- -Puffer mit einem pH-Wert von 7,2Sucrose
Potassium sulfate (K 2 SO ^) tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer with a pH of 7.2
Calciumchlorid (CaCl2) Magnesiumchlorid (MgCl2) primäres KaliumphosphatCalcium chloride (CaCl 2 ) Magnesium chloride (MgCl 2 ) primary potassium phosphate
Spurenelementenlösung der im Beispiel 1 angegebenen ZusammensetzungTrace element solution of the composition given in Example 1
in Lösung in destilliertem Wasserin solution in distilled water
Die erhaltenen Suspensionen wurden unter sterilen Bedingungen zentrifugiert (mit 6 000 Umdrehungen/MinuteThe suspensions obtained were centrifuged under sterile conditions (at 6,000 revolutions / minute bei O0C) und erneut in 2 cm des Po-Nährmediums der obigenat O 0 C) and again in 2 cm of the P o nutrient medium of the above
^ 3 Zusammensetzung suspendiert. Zu 1 cm jeder Suspension^ 3 composition suspended. To 1 cm of each suspension wurde je 1 car einer sterilen Lysozymlösung mit einer Konzentration von 10 mg/cm zugegeben (die Endkonzentration des Lysozymes betrug 5 mg/cm ), wobei das Lysozym ein solches von 17 000 E/mg (Calbiochem, San Diego, Kalifornien) war; es war ebenfalls im Po-Nährmedium der obigen. Zusammensetzung gelöst. Die Lysozym enthaltenden Kulturen wurden in1 car of a sterile lysozyme solution with a concentration of 10 mg / cm was added (the final concentration of the lysozyme was 5 mg / cm), the lysozyme being a was that of 17,000 U / mg (Calbiochem, San Diego, California); it was also in the butt nutrient medium of the above. Composition dissolved. The cultures containing lysozyme were in
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25 cm Erlenmeyerkolben bei 37°C langsam (mit 30 Umdrehungen/Minute) geschüttelt. Wie es unter dem Mikroskop zu erkennen war, wandelten sich die Kulturen innerhalb 30 bis 45 Minuten quantitativ zu Protoplasten um. Die so erhaltenen Protoplasteuapensionen wurden unter sterilen Bedingungen zentrifugiert (mit 6 000 Umdrehungen/Minute).25 cm Erlenmeyer flask at 37 ° C slowly (at 30 revolutions / minute) shaken. As could be seen under the microscope, the cultures changed within 30 to 45 minutes quantitatively to protoplasts. The so Protoplast suspensions obtained were centrifuged under sterile conditions (at 6,000 revolutions / minute).
Die Protoplaste des streptomycinempfindlichen Mutanten wurden 2-mal in der Weise gewaschen, daß sie in 10 cm einer Rp-Nährflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung suspendiert wurden.The protoplasts of the streptomycin-sensitive mutant were washed 2 times in such a way that they were in 10 cm an Rp nutrient liquid of the following composition were suspended.
0,35 Mol
0,25 g/l
1 Gew.-% 0,3 Gew.-% 0,01 . Gew.-%0.35 moles
0.25 g / l
1 wt% 0.3 wt% 0.01. Wt%
SaccharoseSucrose
KaliumsulfatPotassium sulfate
Glucoseglucose
ProlinProline
CasaminosäureCasamino acid
50 Millimol Calciumchlorid (CaCl2) 50 Millimol Magnesiumchlorid (MgCl2) 0,2 Millimol primäres Ksliumphosphat50 millimoles of calcium chloride (CaCl 2 ) 50 millimoles of magnesium chloride (MgCl 2 ) 0.2 millimoles of primary calcium phosphate
2 cnr/1 Spureneleraentenlösung der im2 cnr / 1 trace element solution of the im
Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung Example 1 given composition
in Lösung in destilliertem Wasser .in solution in distilled water.
Nach dem Zentrifugieren wurde der ganze Arbeitsgang noch einmal wiederholt.After centrifugation, the whole operation was repeated once more.
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2V2V
Auch der streptomycinresistente Mutant wurde 2-malEven the streptomycin resistant mutant was 2 times
mit dem Po-Nährmedium der obigen Zusammensetzung gewaschenwashed with the P o nutrient medium of the above composition
3 *3 *
und dann wurde er auf 10 cm eines vorher in einem 25 cm3 and then he was on 10 cm one before in a 25 cm 3
Kolben auf 55°C erhitzten TRIS-Nährbodens der folgenden Zusammensetzung gegossen.Poured flask on 55 ° C heated TRIS medium of the following composition.
1,2 Gew.-# Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 0,035 Gew.-% Kaliumchlorid (KCl) 0,1 Gew.-% Ammoniumchlorid (NH^Cl) 0,03 Gew.-% Magnesiomchloridhexahydrat1.2 wt. # Tris (hydroxymethyl) aminomethane 0.035% by weight potassium chloride (KCl) 0.1% by weight ammonium chloride (NH ^ Cl) 0.03 wt% magnesiom chloride hexahydrate
(MgCl2 . 6 H2O)(MgCl 2. 6 H 2 O)
0,0058 Gew.-% Natriumchlorid (NaCl)0.0058 W e -.% Sodium chloride (NaCl)
0,03 Gew.-% Natriumsulfatdekahydrat0.03 wt% sodium sulfate decahydrate
(Na0SO. . 10 H0O)(Na 0 SO.. 10 H 0 O)
0,5 ug/cm* Eisen(ll)-chlorid (FeCl2)0.5 ug / cm * ferrous chloride (FeCl 2 )
0,35 Mol Saccharose0.35 moles of sucrose
in Lösung in destilliertem Wasserin solution in distilled water
Die Kolben wurden ohne Schütteln 3 Stunden lang bei 55 C bebrütet und dann wurden durch vorsichtiges Schütteln die Protoplaste suspendiert. Die nicht wärmebehandelte Protoplastsuspension des streptomycinempfindlichen Mutanten und die wärmebehandelte Protoplastsuspension des streptomycinresistenten Mutanten wurden im Verhältnis von 1 : 1 miteinander vermischt. 0,1 cm der erhaltenen Suspension wurde in 0,9 cm einer 50%-igen wäßrigen Polyäthylenglykollösung (Molekulargewicht « 6 000) 10 Minuten lang stehengelassen. 0,05 cnr der die verschmolzenen ProtoplasteThe flasks were incubated without shaking for 3 hours at 55 ° C. and then gently shaken the protoplasts are suspended. The non-heat treated protoplast suspension of the streptomycin sensitive mutant and the heat-treated protoplast suspension of the streptomycin-resistant Mutants were mixed together in a ratio of 1: 1. 0.1 cm of the suspension obtained was in 0.9 cm of a 50% aqueous polyethylene glycol solution (Molecular weight «6,000) Let stand for 10 minutes. 0.05 cnr of the fused protoplasts
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enthaltenden Suspension wurden 3 cm eines 0,4 Gew.-% Agar enthaltenden R^-Nährmediums der obigen Zusammensetzung zugetropft. Das erhaltene Gemisch wurde nuf ein festes 2,2 Gew.-% Agar enthaltendes R^-Nährmedium aufgebracht und bei 37°C bebrütet. Am 8-ten Tag wurden die Platten mit 3 cnr eines 0,5 Gew.-% Agar und 10 000 ug/cm Streptomycin enthaltenden TRIS-Nährmediums der obigen Zusammensetzung überschichtet. Die nach dem 20-sten Tag erschienenen Kolonien sind als Ergebnis der Protoplastfusion und der anschließenden Rekombination entstanden.suspension containing 3 were added dropwise to the above composition cm of a 0.4 wt .-% agar containing R ^ -Nährmediums. The resulting mixture was applied to a solid R ^ nutrient medium containing 2.2% by weight agar and incubated at 37.degree. On the 8th day, the plates were overlaid with 3 cnr of a TRIS nutrient medium of the above composition containing 0.5% by weight agar and 10,000 µg / cm streptomycin. The colonies that appeared after the 20th day were formed as a result of protoplast fusion and subsequent recombination.
Die folgenden beiden Mutanten des Gentamicin erzeugenden Stammes Micromonospora purpurea var. nigrescens, hinterlegt unter der Bezeichnung KNG 00122 am 12. Dezember 1973 in der Nationalen Staiamsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet) ,The following two mutants of gentamicin producing Tribe Micromonospora purpurea var. Nigrescens, deposited under the designation KNG 00122 on December 12, 1973 in the National Staiamsammlung of the Hungarian National Institute for healthcare (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet),
a) ζ im Wachstum Casaminosäure benötigend unda) ζ needing casamino acid in growth and
b) zum Wachstum Ce aminosäure nicht benötigendb) No amino acid required for growth Ce
wurden in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise der Protoplastfusion unterworfen. Der ohne Casaminosäure gewachsene Mutant wurde in der im Beispiel 2 für den streptomycinresistenten Mutanten beschriebenen Weise durch Wärme inaktiviert. Die aus dem prototrophen Partner bereitete durch Wärme inaktivierte Protoplastsuspension und die aus dem Casaminosäure benötigenden Partner were subjected to protoplast fusion in the manner described in Example 2. The mutant grown without casamino acid was inactivated by heat in the manner described in Example 2 for the streptomycin-resistant mutant. The heat-inactivated protoplast suspension prepared from the prototrophic partner and the partners required from the casamino acid
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23^576223 ^ 5762
bereitete nicht inaktivierte Protoplaetauspeneion wurden in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise verschmolzen. Das erhaltene Gemisch wurde auf ein festes 2,2 Gew.-% Agar, jedoch keine Casaminosäure enthaltendes R^-Nährmedium der im Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung aufgebracht und bei 37° C bebrütet. Die nach 20 bis 30 Tagen erschienenen Kolonien waren das Ergebnis der Protoplastfueion und der anschließenden Rekombination.not inactivated protoplasm were prepared fused in the manner described in Example 2. The resulting mixture was poured onto a solid 2.2% by weight agar, but no R ^ nutrient medium containing casamino acid the composition given in Example 2 is applied and incubated at 37 ° C. Those that appeared after 20 to 30 days Colonies were the result of protoplast fusion and subsequent recombination.
Zum Nachweis der Fusion zwischen 2 Spezies wurde das folgende Elternpaar verwendet:The following pair of parents were used to demonstrate the fusion between 2 species:
a) Micromonospora purpurea var. nigrescens, hinterlegt unter der Bezeichnung MNG 00122 am 12. Dezember 1973 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), gegen 100 ug/cm Streptomycin resistent unda) Micromonospora purpurea var. nigrescens, deposited under the name MNG 00122 on December 12, 1973 in the National Master collection of the Hungarian National Institute for Health Care (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), against 100 µg / cm streptomycin resistant and
b) Micromonospora inyoensis ATCC 27600, gegen 0,5 ug/cm Streptomycin resistentb) Micromonospora inyoensis ATCC 27600, against 0.5 µg / cm streptomycin resistant
Aus dem Stamm Micromonospora purpurea var. nigrescens, hinterlegt unter der Bezeichnung MNG 00122 am 12. Dezember 1973 in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), wurde in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise eine durch Wärme inaktivierte Proto-From the strain Micromonospora purpurea var.nigrescens, deposited under the designation MNG 00122 on December 12, 1973 in the National Tribal Collection of Hungarian State Institute for Health Care (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), in the example 2 described way a heat inactivated proto-
030021/0852030021/0852
29Α576229Α5762
plastsuspension hergestellt. Die wärmebehandelten Protoplnste wurden mit der aus dem Stamm Micromonospora inyoensis ATCC 27600 in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellten Protoplastsuspension im Verhältnis von 1 : verschmolzen und anschließend in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise regeneriert. Am 8-ten Tag wurden die Protoplaste mit 5 cm eines 0,5 Gew.-% Agar und 1 000 ug/cm Streptomycin enthaltenden TRIS-Nährmediums der im Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung überschichtet. Die am 20-sten Tag erschienenen Kolonien waren das Ergebnis der Protoplastfusion zwischen den beiden Spezies.plastsuspension produced. The heat-treated protoplasts were with that from the strain Micromonospora inyoensis ATCC 27600 protoplast suspension prepared in the manner described in Example 1 in a ratio of 1: fused and then regenerated in the manner described in Example 1. On the 8th Day the protoplasts with 5 cm of a 0.5 wt .-% agar and TRIS broth containing 1,000 µg / cm streptomycin the composition given in Example 2 is overlaid. The colonies that appeared on the 20th day were the result of protoplast fusion between the both species.
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