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DE2921148A1 - Neue metaboliten, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Neue metaboliten, ihre herstellung und verwendung

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Publication number
DE2921148A1
DE2921148A1 DE19792921148 DE2921148A DE2921148A1 DE 2921148 A1 DE2921148 A1 DE 2921148A1 DE 19792921148 DE19792921148 DE 19792921148 DE 2921148 A DE2921148 A DE 2921148A DE 2921148 A1 DE2921148 A1 DE 2921148A1
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DE
Germany
Prior art keywords
iii
compounds
micromonospora
see
log
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19792921148
Other languages
English (en)
Inventor
King Hamilton Dr Delisle
Camilla Dr Keller-Juslen
Max Kuhn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sandoz AG
Original Assignee
Sandoz AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sandoz AG filed Critical Sandoz AG
Publication of DE2921148A1 publication Critical patent/DE2921148A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/29—Micromonospora

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Description

- 2 - 100-5037
8. Ein S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/Λ-ΙΙΙ und/oder S 54832/A-IV produzierender Stamm.
9. Der Stamm KRRL 11299 oder ATCC 31465.
9098SO/O655
2921H8
- 4 - 100-5037
C-NMR-Spektrura von S 54832/A-I
mg in 1,2 ml DMSO + TMS
171.18 112.23
168.25 111.06
167.73 103.78
167.21 95.53
167.02 79.67
165.07 74.93
163.77 73.56
160.91 69.40
160.07 67.39
159.94 65.25
159.42 63.10
158.31 62.52
153.89 57.45
150.97 55.95
149.67 49.52
149.41 25.80
148.56 17.80
147.39 13.58
142.65
134.91
134.39
129.78
129.20
128.16
127.25
126.47
125.36
124.19
123.09
119.97
119.38
909850/0655
- 5 - 100-5037
Löslichkeit^ S 54832/A-I ist leicht löslich in Dimethylformamid, Pyridin, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, massig löslich in Chloroform, schwer löslich in Methanol, Aethanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
Amino säurennaly_se
Bei der Aminosäureanalyse wurde, neben nicht identifizierten Aminosäuren, eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
K— und_Aeguival ent-Bes tim
Dazu wurden 6,403 mg S 54832/A-I in 2 ml Methylcellosolv-Wasser (84 : 16) gelöst und mit 0,1 N Tetramethylammoniumhydroxyd in Wasser titriert.
PK1 =7,65
pK2 >10,69
Aequivalentgewicht: 1521
S 54832/A-II
Hellgelbes amorphes Pulver Smp. > 310 °
Analyse: 1. Gef. C 48,5 H 3,8 N 12,4 %
2. Gef. C 50,3 H 4,3 N 12,4 0 21,7 S 12,0 % UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 4.
■ 7\jnax 218 nm log {'=1,90
' 293 nm log £'=1,40
362 nm log ^1=1,16
IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 5.
H-NMR-Spektrum in DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner -Standard, vgl. Fig. 6.
9O085O/O6BB
- 6 - 100-5037
l£Ü£iihi:i!:i S 54832/Δ-ΙΙ ist leicht löslich in Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Pyridin, Diinethylsulfoxyd, massig löslich in Chloroform, schwer löslich in Methanol, Aethanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
£minosäureanaly_sej_
Bei der Aiiiinosäureanalyse wurde, neben nicht identifizierten Amino säuren, eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
S 54832/A-III
Hellgelbes amorphes Pulver
Snip. >310°
Analyse: Gef. C 48,1 H 4,1 N 12,3 %
UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 7.
71 max 218 nra log (' = 1,86
292 um log £'- 1,36
302 mn log £'- 1,14
IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 8.
2£Ü£lii t: S 54832/Δ-ΙΙΙ ist leicht löslich in Dimethylsulfoxyd, Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Pyridin, massig löslich in Chloroform, schwer löslich in Methanol, Aethanol und unlöslich in Hasser und Hexan.
Bei der Aiiiinosäureanalyse wurde, neben nicht identifizierten Ar..inosäuren, eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
S 54832/A-IV
Hellgelbes amorphes Pulver
smp.>3io ° 9 09850/0655
- 7 - 100-5037
2Ω
[a]D =+ 153,2 ° (c= 0,752 in Pyridin)
Analyse: Gef. C 49,0 H 4,0 N 12,7 O 21,8 S 11,6 .% UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig.
?lmax 218 ran log <?' =1,88 292 nm log £' = 1,41 360 mn log £' = 1,15
IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig.
H-NMR-Spektrum in DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner Standard, vgl. Fig. 11.
C-IMR-Spektrum in DMSO auf einem BRUICER HX-90E Spektrometer bei 22,63 MHz aufgenommen (interner Standard TOIS = Oppm), siehe folgende Tabelle:
909850/0655
- 8 - 100-5037
13C-KMR-Spektruui von S 54832/A-IV 100 mg in 1,2 ml Dl-ISO + TMS
174.95 96.57
172.22 80.65
169.36 75.90
168.84 74.60
168.38 70.51
168.06 68.43
164.81 66.28 161.95 65.80 161.17 64.80 160.46 64.14 154.87 · 61.93 151.68 58.55 151.36 57.06 150.45 50.88 149.54 49.39 148.50 46.53
143.82 26.84 136.02 19.10 .135.69 , 14.55 131.02
130.30
129.20
128.61
127.51
126.40
125.30
124.13
121.07
120.42
113.34
112.17
909860/0665
2821148
100-5037
Lösliclilce^tJ^ S 54832/A-IV ist leicht: löslich in Dimethylformamid, Pyridin, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxyd, massig löslich in Chloroform, schwer löslich in Methanol, Aethanol und unlöslich in Hasser und Hexan.
Aminosäureanalyse:
Bei der Aminosäureanalyse wurden, neben nicht identifizierten Amino—. säuren, zwei Aminosäuren gefunden, die die gleichen Retentionszeiten wie Threonin bzw. Alanin aufweisen.
Titrimetri£che_£K-_und_Aer[uivalent^bestimmung
Dazu wurden 6,406 mg S 54832/A-IV in 2 ml Methylcellosolv-Wasser (84 : 16) gelöst und mit 0,1 N Tetraraethylanimoniunihydroxyd in Wasser titriert.
PK1 « 7,31
PK2 >10,70
Aequivalentgewicht: 1554
In der folgenden Tabelle sind die R -Werte von S 54832/A-I, S 54832/Λ-ΙΙ, S 54832/A-III und S 54832/A-IV im Dünnschichtchromatogramin angegeben (Kieselgel Merck 60-Platten, Schichtdicke 0,25 mm, Laufstrecke 14,7 cm)*
R -Werte (Nosiheptid als Referenzsubs.tanz) A-I A-II A-III A-IV Kosiheptid
Fliessmittel 0,40 0,28 0,32 0,27 0,32
Methylenchlorid-Methanol-Wasser
(88 : 11 : 1)		 0,54 0,44 0,49 0,44 0,49
Methylenchlorid-Methanol-Wasser
(80 : 17,5 : 2)
Nosiheptid zeigt dieselben R -Werte wie S 54832/A-III, unterscheidet sich aber von S 54832/A-III aufgrund der Analysendaten sowie der UV- und IR-Spektren. 909850/065$
- 10 - 100-5037
2921H8
Als Nachweisreagenz kann Jod verwendet werden. Beim Ansprühen mit einer 0,2 %-igen Ce(SO ) -Lösung in 50 %-iger Schwefelsäure und Erwärmen auf 130 ° geben alle vier Verbindungen eine graubraune Anfärbung. S 54832/A-I bis A-IV zeigen alle eine charakteristische gelbe Fluoreszenzfarbe bei 366 mn und können ohne Sprühreagenz in Dünnschichtchromatograir.m detektiert werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich nach bekannten Methoden ausführen. Eine Probe der Kultur des S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54S32/A-IV produzierenden Stammes wurde am
26. April 1978 beim United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, 111., USA, deponiert und steht der Oeffentlichkeit unter der Bezeichnung NRRL 11299 zur Verfugung. Eine weitere Probe wurde am 8. Dezember 1978 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA, deponiert und steht der Oeffentlichkeit unter der Bezeichnung ATCC 31465 zur Verfugung. Diese Kultur ist auch bei Sandoz AG, Basel, Schweiz, erhältlich.
Doch können auch S 54832/Λ-Ι, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV produzierende Stämme verwendet werden, die aus dem Ausgangsstamm von-Micromonospora globosa durch Mutation unter Einwirkung von Strahlen oder Behandlung mit mutagenen Substanzen oder durch Selektion gewonnen werden können.
909850/0655
- 11 - 100-5037
2321148
Charakteristikum des Stammes MRRL 11299 oder ATCC 31465
Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm KRRL 11299 oder ATCC 31465 wurde 1976 in Cullera, Spanien, aus einer frischen Erdprobe aus einem Reisfeld isoliert. Dieser Stamm gehört zum. Genus Micromonospora nach der Beschreibung in Bergey's Manual, 8. Auflage, S. 846 und stimmt auch mit der Beschreibung einer Micromonospora globosa-Spezies überein, wie in Bergey's Manual S. 847 - 848 beschrieben. Er wurde wie folgt weiter charakterisiert:
Die Kultur bildet kein Luftmycel, und wächst als Substrat- oder als vegetative Myceltnasse in einzelnen, jedoch hohen orangefarbigen Kolonien von unrege!massiger Form. Die Myzelien mit einem Durchmesser zwischen 0,5 ^um und 0,7 ^um sind gerade bis leicht gewellt und tragen seitliche und endständige Sporen. Die Seitensporen treten oft einzeln auf» es gibt aber auch doppelte Sporen, die über-
15' einander angeordnet sind, wobei die unteren grosser sind. Manchmal befinden sich auch gleichzeitig zwei Sporen am Ende eines Sporenträgers. Die Sporen sind elliptisch bis oval oder rund mit einem Durchmesser von 1,0 bis 1,3 /um. In den meisten Agarmedien sind die vegetativen Myzelien mittelmässig gelb-rosa oder hell-aprikosenfarbig und weich, mit der Tendenz zum Fragmentieren, jedoch nicht wie im Falle der Spezies Nocardia. Man beobachtet in einigen Medien unregelmässige Schwellungen, zwiebelähnliche Strukturen, die 2 bis 3 Mal die Grosse der Sporen erreichen können, von denen man annimmt, sie seien ungewöhnliche Formen, wie man sie bei anderen Actinomyceten-Spezies sieht. Auf einem Saccharosemedium erscheinen die Sporen in traubenähnlichen Büscheln, während auf allen anderen Medien die Sporen entweder einfach oder doppelt vorkommen und von relativ langen Sporenträgern (2-3 xim) getragen werden. Der Stamm NRRL 11299 oder ATCC 31465 wächst nur spärlich auf synthetischen Medien, baut lediglich drei der geprüften Zucker ab und gedeiht sehr gut auf Medien mit komplexen proteinhaltigen Substanzen.
909850/0655
100-5037
28211A8
Die Wachstumseigenschaften des Stammes HRRL 11299 oder ATCC 31465 auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt:
Wachs tiimseigenscliaf ten
Kulturmedium Kultur-Charakteristiken Mycelform - LM
tialz-Hcfe-Extrakt-
Agar		 W: ausgezeichnet, orange
R: orange (R3ea)*
LM: ke ine s
LP: keine		 -
Hafermehl-Agar W: mittelmässig, orange
R: hellorange (R3ea)*
LM: keines
LP: keine
Stärke- anorga
nische Salze-
Agar		 Wf schwach, hellorange
R: beige (R3ea)*
LM: keines
LP: keine		 -
Glycerin-
Asparagin-
Agar		 W: schwach, hellorange
R: beige (R3ea)*
LIi: keines
LP: keine		 -
W: Wachstum
R: Rückseite
LM: Luftmycel
LP: Lösliches Pigment
Referenz mit Bezug auf das "Color-wheels System" (Tresner and Bachus, 1963)
909850/0855
100-5037
2321148
Assimilation von Kohlenstoffverbindungen
Wachstum Kohlenstoffquelle
+ D-Cellobiose, Cellulose, D-Saccharose
D- & L-Arabinose, Dextrin, Dulcitol, D-Fructose,
D-Glucose, D~Galactose, Glycerin, m-Inositol,
Inulin, D-Lactose, D-Maltose, D-lfannitol, D-Mannose,
D-Melibiose, D-Melezitose, D-Raffinose, D-Ribose,
L-Rhamnose» D-Salicin, D-Sorbitol, D-Xylose, Starke
+ί Schwache Kohlenstoffverwertung -: Keine "
Der neue Stamm NRRL 11299 oder ATCC 31465 besitzt folgende physiologische Eigenschaften:
Nitrat-Reduktion negativ
Stärkehydrolyse positiv (schwach)
Cellulose-Abbau positiv (schwach)
Tyro sin-Reaktion negativ (rosa lösl. Pigment)
Milch-Koagulation positiv
Milch-Peptonisierung positiv (langsam)
Gelatine-Verflüssigung negativ
Melaninbildung negativ (wächst auf Medium)
Der neue Stamm NRRL 11299 oder ATCC 31465 lässt sich auf verschiedenen Nährmedien mit den üblichen Nährstoffen züchten, z.B. wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
909850/0655
- 14 - 100-5037
Die Züchtung des Stammes NRRL 11299 oder ATCC 31465 kann nach aerober Oberflächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen.
Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge der neuen Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV produziert worden ist, was z.B. durch die Aktivität gegen Staphylococcus aureus festgestellt werden kann, wird das Mycel aus der Kulturbrühe abgetrennt und extrahiert. Die im Kulturfiltrat vorhandene Menge der Verbindungen kann durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Aethylacetat, Butylacetat, n-Butanol, gewonnen werden. Eine andere Ausführungsform besteht darin, dass man den Mycelanteil in der Kulturbrühe homogenisiert, z.B. mit einem Ultraturrax, und die Verbindungen durch Extraktion mit den erwähnten Lösungsmitteln gewinnt.
Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die Brühe durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren in Mycel und Kulturfiltrat getrennt wird. Das Mycel wird danach mit Methanol oder mit Aceton unter Homogenisieron mit einem Turrax extrahiert, das Zellmaterial abzentrifugiert und die organische Phase unter Wasserzugabe auf Wasser konzentriert.
Danach wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. n-Butanol, oder Aethylacetat, extrahiert und die Extrakte bei niederer Temperatur, vorzugsweise 40-50°, im Vakuum eingedampft. Der im Kulturfiltrat verbleibende Anteil an aktiven Verbindungen kann mit den oben erwähnten Lösungsmitteln extrahiert werden. Aus den so erhaltenen Rohextrakten können die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV durch an sich bekannte chromatographische Methoden isoliert und rein dargestellt werden. Vorteilhaft hat sich als erste Operation eine Fällung der Rohextrakte mit Petroläther erwiesen, wobei lipophile Begleitstoffe entfernt werden können.
909850/0655
~ 15 " 100-5037
2921H8
Aus dem Fällungsprodukt können anschliessend zuerst durch Gelfiltration an Sephadex LH und nachfolgende wiederholte Chromatographie an Kieselgel die reinen Verbindungen S 54832/A-I bis A-IV erhalten werden. Die Verbindungen fallen als hellgelbes amorphes Pulver anj nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei 20° zeigen sie einen Smp.>310° (Zers.).
Die Erfindung umfasst auch Fermentationsbrühen, die bei der Züchtung eines S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV produzierenden Stammes von Micromonospora globosa gewonnen werden.
Die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV sind als Heilmittel geeignet. Sie zeigen eine Hemmwirkung gegenüber Mikroorganismen wie gram-positive Bakterien, Mycoplasmen und Neisserien, aber keine Aktivität gegen Hefen und Pilze.
Die sehr breite Aktivität gegen gram-positive Bakterien erstreckt sich auf deren pathogene Vertreter, wie Staphylokokken, Streptokokken, Corynebakterien und Mycobakterien. In der folgenden Tabelle sind die minimalen HeiDmkonzentrationen (MIC-Werte) von S 54832/A-I bis A-IV gegen einige Mikroorganismen angegeben. Die MIC-Werte werden auf bekannte Weise in Verdünnungsreihen bestimmt. Die Bestimmung erfolgte durch Inkubation in Trypticase Soy Broth bei 37 ° während 24 Stunden.
Inoculumdichte: 10 Keime/ml.
909860/0656
100-5037
2921U8
Orgaiii sinus MIC /ug/ml - S /A-II 54832 /A-IV
/A-I ^0,01 /A-III «0,01
Staphylococcus aureus 0,03 0,01 0,03
Staphylococcus aureus res. Penicillin ÜSÜ3 <0,01 0,03
Staphylococcus aureus res. Tetracyclin «0,01 0,01 0,03
Staphylococcus aureus res. Rifamycin 0,03 0,03
Staphylococcus aureus 6538P 0,03 <0,01
Staphylococcus aureus «0,01 0,08 0,03
Streptococcus aronson 0,03 0,15 0,03 0,1
Streptococcus faecalis 0,1 0,03 0,15 0,1
Streptococcus faecalis 0,03 0,15 1
Streptococcus pyogenes 0,1 0,3
Streptococcus faecalis 0,03 1
Streptococcus haeniolyticus 0,1 1
Diplococcus pneuraoniae 0,1 1
Corynebacterium equi 0,03 <0,01
Sarcina lutea res. Erythromycin 40,01 1
Bacillus subtilis 40,01 0,3
Clostridium sphenoides 0,3 0,03
Clostridium pasteurianua <0,01 0,1
llycobacterium thänmophesos «0,01 0,1
llycobacteriuni smegmatis 4:0,01 0,03
llycoplasma laidlawii 0,03 0,3
Neisscria catharalis 0,1 40,01 0,03
Neisseria pharyngis 40,01 0,15
Die Hemmwirkung der Verbindungen S 54832/A-I bis A-IV gegenüber Streptokokken und Staphylokokken wurde in vivo bei Dosen zwischen ca. 0,2 und 50 rag/kg an der Maus bestätigt.
&0Ö8B0/06ER
- 17 - 100-5037
Die neuen Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/Λ-Γ1, S 54832/Α-ΠΙ und S 54832/A-IV könrmn als Heilmittel allein, und zwar in reiner Form oder in den entsprechenden Heilmittelformen für topicale, enterale oder parenterale Verabreichung oder bei Tieren als Futtermittelzusatz verwendet werden.
In den nachfolgenden Beispielen, Vielehe die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Teniperaturangaben in Celsiusgraden.
ÜÖ98S0/QGB&
100-50.;7
292 1KB
Be_i^piel_l: Ziicjaung_ des
a)
NFlRL 11299 oder ATCC 31465 '> η j=m
Die als Ausgangi^uiterial verwendete Agarkultur des Stamnes KJ.:l;L 11299 oder ATCC 31465 erhält man, indem man ein Kulturmedium (I) folgender
Zusammenset zung:
p/Liter
Glucose 10,0
Stärke löslich 10 N-Z-Amine Typ A (Caseinhydrolysat) CaCO Hefe-Extrakt Agar (Bacto) destilliertes Wasser
20,0
5,0
1,0
5,0 15,0
1 Liter
mit einer auf an sich bekannte Weise hergestellten Sporensuspension des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 31299 oder ATCC 31465 bek.pft. Das Medium wird vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt und beträgt nach der Sterilisation (20 Minuten bei 120 °) pH 6,8 bis 7,0.
b)
Eine gut gov/achseno Agar-Ausgangskultur des Stammes NRRL 11299 oder ATCC 31465 wird mit 5 ml steriler, 0,9 %-iger Kochsalzlösung versetzt, was eine dichte Sporensuspension -ergibt.
c) Vorkultui" und Zwischenkultur
Von dieser . εροΓβη3υερεΉδΐ-οην£ΐ\Ιη-5 ml. zur Ef;impfung eines 200 ul Erlen meyer-KoHens v?er-/endet, der 50 ml des folgenden Vorkulturnediinns (IIJ enthält:
§09850/0655
Dextrin Glucose Pepton Hefeextrakt CaCO
destilliertes Wasser
100-5037
2921 H 8
g/Liter 10,0 10,0
5,0
5,0
1,0
1 Liter
Der pH-Wert wird mit KaOlI auf 7,2 eingestellt. Das Vorkulturmedium wird in einem Autoklaven bei 120° während 20 Minuten sterilisiert, vorauf der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
Die so angesetzte Vorkultur wird während 4 Tagen bei 27° auf einer Eundschüttclmaschine (100 U/Min.) aerob inkubiert und zur Beimpfung
einer Zwischenkultur verwendet, indem 5 ml der Vorkultur in einen 500 ml Er lenmeyei'—Kolben, mit 100 ml des folgenden Mediums (III) überimpft werden:
Fleischextrakt Trypton Glucose Stärke löslich Hefeextrakt CaCO
destilliertes Wasser
g/Liter 3,0 5,0
1,0 24,0 5,0 2,0 1 Liter
der pH-Wert wird mit NaOII auf 7,2 eingestellt und das Medium in einem
Autoklaven bei 120° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
- 20 - 100-5037
d) Hau£tkultur
Die Zwischenkultur wird während 3 Tagen bei 27° auf einer R-:udschüttelmaschine (220 U/Min.) aerob inkubiert und wird dann direkt zur Beimpfung einer Hauptkultur verwendet, indem 5 ml der Zwischenkultur in einen ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des folgenden Mediums (IV) überimpft werden:
g/Liter
Stärke löslich 20,0
Hefeextrakt 10,0
Glucose 10,0
Casein-Hydrolysat 5,0
CaCl2.2H2O 4,0
Kobalt (II)-chlorid 0.00013
destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 120° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 6,8 bis 7,0 beträgt. Die so angesetzte Hauptkultur wird während 5 Tagen bei 27° auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) inkubiert.
Beispiel 2: Züchtung des Stammes NRRL 11299 oder ATCC 31465 in einer Fermentationskultur
Die zur Beimpfung der Vorkultur verwendete Sporen- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 11299 oder ATCC 31465 hergestellt, welche 21 Tage bei 27 ° auf einem Agarmedium folgender Zusammensetzung
g/Liter
Lösliche Stärke 20
Agar 15
Glucose 10
Hefeextrakt 5
N-Z-Amine Typ A 5
CaCO 1
Entmineralisiertes Wasser
9098B0/0655 		1 Liter
■'- _ 21 - 100-5037
2921U8
gezüchtet wird. Sporen und Mycel dieser Kultur werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.
Mit je 50 ml dieser Suspension werden fünf 2-Liter-Erlenmeyerkolben mit je 1 Liter Medium folgender Zusammensetzung
g/Liter
Dextrin 10
Glucose 10
Pepton 5
Hefeextrakt 5
CaCO 1
Entmineralisiertes Wasser 1 Liter
angeimpft und auf einer Rundschüttelmaschine (180 UPM, r = 5 cm) 4 Tage bei 27° inkubiert. Der pH-Wert der Nährlösung wird vor der Sterilisation mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
Mit 5 Liter dieser Vorkultur werden 50 Liter Medium folgender Zusammensetzung
g/Liter
Lösliche Stärke * 24 Trypton 5
Hefeextrakt , 5 Fleischextrakt 3
taCO 2
Glucose 1
Entmineralisiertes Wasser 1 Liter
in einem 75-Liter-Stahlfermenter angeimpft. Die Zwischenkultur wird Tage bei 27° unter Rühren (200 UPM, Blattrührer) und Belüftung (1 Liter Luft/Liter Medium/Min.) und bei einem Ueberdruck von 0,5 bar inkubiert.
9098SG/0BBS
- 22 - 100-5037
Die Hauptkiiltur im 750-^Liter-Fermenter mit 500 Liter Nährlösung folgender Zusammensetzung
g/Liter
Lösliche Stärke 20
Hefeextrakt 10
Glucose 10 Casein-Hydrolysat 5
CaCl .2HO 4
Kobalt (II)-chlorid 0,00013
Entmineralisiertes Wasser 1 Liter
wird unter Rühren (110 UPM, Blattrührer) und Belüftung ( 1 Liter Luft/ Liter Medium/Min.) 4 Tage bei 27° und 0,5 bar Ueberdruck fermentiert. Der pH-Wert wird auch auf dieser Stufe mit NaOII vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt.
Beispiel 3: Isolierung der Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II,
S 54832/A-III und S 54832/A-IV
470 Liter Fermentationsbrühe (nach Beispiel 2 gewonnen) werden mit 2N Natronlauge auf pH 7,0 gestellt und mit einem Westfalia-Klärseparator aufgetrennt, wobei 450 Liter Kulturfiltrat und 22 kg Mycel anfallen. Das Kulturfiltrat wird dreimal mit je 500 Liter Aethylacetat extrahiert. Nach dem Waschen der Extrakte mit 50 Liter Wasser wird die organische Phase bei 20-50° Konzentrattemperatur zur Trockne eingedampft, wobei 117 g öliger Rohextrakt anfallen.
Das Mycel wird einmal mit 70 Liter Methanol und danach einmal mit 70 Liter 90%-igem Methanol je 1 Stunde mit einem Ultra-Turrax-Gerät homogenisiert. Die inethanolischen Extrakte, die man durch Abnutschen des Feststoffes erhielt, werden vereinigt und unter Wasserzugabe auf ca. 150 Liter konzentriert. Diese wässrige Phase wird danach dreimal mit je Liter Aethylacetat extrahiert und die Extrakte mit 100 Liter Wasser gewaschen. Die vereinigten Extrakte werden wie oben zur Trockne einge-
909BB0/06BB
_ 23 '-■-'■' 100-5037
. 2921HI
dampft und liefern 66 g Rohextrakt.
Die 183 g vereinigten öligen Extrakte Λν-erden unter Rühren zu 1 Liter Petroläther gegeben. Die überstehende Lösung wird abdekantiert und der ölige Rückstand im Vakuum bei 50° vom Lösungsmittel befreit. Danach wird das Fällungsprodukt in Methylenchlorid-Methanol (1:1) gelöst und die Lösung auf eine mit Methylenchlorid-Methanol (1:1) bereitete Säule von 1,5 kg Sephadex LH gebracht. Die Elution mit Methylenchlorid-Methanol (1:1) liefert 11,5 g Fraktionen mit Aktivität gegen Staphylococcus aureus. Dieses Material wird in Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) gelöst und die Lösung auf eine mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) bereitete Säule von 1 kg Kieselgel Merck (Korngrösse 0,063-0,2 mm) gebracht. Die Elution mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) liefert
- . zuerst 984 mg stark angereicherte Fraktionen von S 54832/A-I. Die späteren Eluate ergeben nach Eindampfen im Vakuum eine Mischfraktion von S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV mit inaktiven Eegleitstoffen.
Die Fraktion von S 54832/A-I (984 mg) wird in 50 ml Methylenchlorid-Methanol (1:1) gelöst und bei Raumtemperatur auf ca. 20 ml eingeengt, . V7obei & 54832/A-I ausfällt..Die Substanz wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Man erhält S 54832/A-I als amorphes, hellgelbes Pulver. Smp.> 310° (nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur).
Zur Reinisolierung von S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV wird die Mischfraktion der drei Verbindungen (594 mg) in Methylenchlorid-Methanol-Wasser (92:7,5:0,5) gelöst und die Lösung auf eine mit Methylenehlorid-Methanol-Wasser (92:7,5:0,5) bereitete Säule von 500 g Kieselgel Merck (Korngrösse 0,04-0,063mm) gebracht, wobei zuerst S 54832/A-II, dann S 54832/A-III und zuletzt S 54832/A-IV eluiert werden.
Die letzte Reinigung der Verbindungen erfolgt jeweils durch eine Ausfällung aus Methanol, analog wie für S 54832/A-I beschrieben.
9098B0/Ö6S5
ORIGINAL INSPECTED
- 24 - 100-5037
Die Reinstoffe S 54832/A-II, S 54832/A-III und S 54832/A-IV fallen als amorphes hellgelbes Pulver an und zeigen alle einen Snip. ^? 310° (nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur).
3700/WY/ER SANDOZ-PATENT-GMBH
909860/06SS

Claims (7)

SaiiJoz-Patent-Gmbl! . Lörräch ' Case 100-5037 Neue Metaboliten, ihre Herstellung und Verwendung Pat e-nt anspräche:
1. DLe Verbindungen S 54832/A-I, S 54032/A-II, S 5/(832/A-III und S 54832/A-IV.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV, dadurch gekennzeichnet, dass man einen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV produzierenden Stamm in Gegenwart; eines Nährrrediums züchtet.
3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen S 54832/A-I, 5i 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV, dadurch gekennzeichnet, dass man einen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A—IV produzierenden Stamm von Micromonospora in Gegenwart eines Nährmediums züchtet.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen S 54832/A-I, 3 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV, dadurch gekennzeichnet, dass man einen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV produzierenden Stamm von Micromonospora globose, in Gegenwart eines Nährmediums züchtet.
5. Fermentationsbrühen, die bei der Züchtung eines S 54832/A-I,
S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/Λ--IV produzierenden Stammes gewonnen werden.
6. Fermentationsbrühen, die bei der Züchtung des Stammes NIlRL 11299 oder ATCC 31465 gewonnen werden.
7. Heilmittel oder Futtermittelzusatz, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II5 S 54832/Λ-ΙΙΙ und/oder S 54832/A-IV enthält.
ORIGINAL INSPECTED
2921U8
- 3 - 100-5037
Neue Metaboliten, ihre -Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/A-II1 S 54832/A-III und S 54832/A-IV.
Erfindungsgeraäss gelangt man zu S 54832/Λ-Ι, S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV, indem man einen S 54832/A-I, S 54832/A-II, S 54832/A-III und/oder S 54832/A-IV produzierenden Stamm, beispielsweise von Micromonospora, z.B. von Micromonospora globosa, in Gegenwart eines Nährmediums züchtet.
Die Verbindungen S 54832/A-I, S 54832/Λ-ΙΙ, S 54832/A-III und S 54832/A-IV besitzen folgende Charakteristika:
S 54832/A-I
Hellgelbes amorphes Pulver
Smp. >310°
20
[α] =+ 118,7° (C=I,140 in Pyridin)
Analyse: Gef. C 50,2 H 4,2 N 13,1 0 21,7 S 11,3 % UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 1.
7\max 219 nm log £' = 1,86
287 nm log £'= 1,41
3C4 nm log p = 1,13
IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 2.
H-NMR-Spektrum in DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner Standard, vgl. Fig. 3.
C-NMR-Spektrum in DMSO auf einem BRUIiER HX-90E Spektrometer bei 22,63
Milz aufgenommen (interner Standard TMS =0ppm), vgl. Tabelle, Seite 2.
909850/0656
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