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DE2908670A1 - Verfahren zur herstellung von metallcorrinoiden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von metallcorrinoiden

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Publication number
DE2908670A1
DE2908670A1 DE19792908670 DE2908670A DE2908670A1 DE 2908670 A1 DE2908670 A1 DE 2908670A1 DE 19792908670 DE19792908670 DE 19792908670 DE 2908670 A DE2908670 A DE 2908670A DE 2908670 A1 DE2908670 A1 DE 2908670A1
Authority
DE
Germany
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metal
corrinoids
free
yellow
ions
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19792908670
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English (en)
Inventor
Bernd Dipl Chem Dr Rer Dresow
Ortrud Ebelmann
Volker Dipl Chem D Koppenhagen
Gerhard Dipl Chem Schlingmann
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GESELSLCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH
Original Assignee
GESELSLCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH
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Publication date
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Priority to GB8007586A priority patent/GB2048891B/en
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

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Description

Anmelder: Gesellschaft für Biotechnologische !Forschung /mbHf £βΓ) Hascheroder Weg 1, 3300 Braunschweig-Stöckheim
Verfahren zur Herstellung von Metallcorrinoiden
Rote metallfreie Corrinoide könnentdurch mikrobiologische Verfahren gewonnen werden, die z.B. in der OE-OS 1 642 749 angesprochen sind. Derartige rote Corrinoide werden u.a. dazu verwendet, Metallcorrinoide herzustellen, indem man in die metallfreien Corrinoide radioaktive Kobaltionen oder andere Metallionen als Kobaltionen einführt, die auch radioaktiv sein können.
Es ist z.B. aus der genannten DE-OS bekannt, daß die roten •netallfreien Corrinoide durch Säuren, Alkali oder lichteinwirkung irreversibel in gelbe metallfreie Corrinoide umgewandelt werden, die durch Hauptabsorptionen lambdame„ von 480 und 290 nm
uxci JL
gekennzeichnet sind. Darüber hinaus wird in der Patentanmeldung P (Verfahren zur Gewinnung von metallfreien Corrinoi-
den) derselben Anmelderin und vom selben Anmeldetag beschrieben, daß sich diese gelben metallfreien Corrinoide auch aus dem •Kulturmedium von Rhodopseudomonas-Arten gewinnen lassen. Diese gelben metallfreien Corrinoide lassen sich nun nicht in rote metallfreie Corrinoide zurückwandeln bzw. umwandeln, wie man z.B. der genannten DE-OS entnehmen kann. Sie konnten bisher auch nicht in dieselben Metallcorrinoide wie die roten metallfreien Corrinoide übergeführt worden.
TEUEFON:
030038/0103
- - ζ- 3 ■
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren bereitgestellt, nach, dem eich gelbe aetallfreie Corrinoide in rote Metallcorrinoide überfuhren lassen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man gelbe metallfreie Corrinoide mit Hauptabsorptionen lambda„„-von 480 und 290 nm in flüssigem Medium
(a) mit komplexbildenden Metallionen zu gelben Metallcorrinoiden umsetzt und
(b) die gebildeten gelben Metallcorrinoide alkalisch behandelt, wobei man rote Metallcorrinoide erhält.
Als flüssiges Reaktionsmedium können Wasser, Alkohole, wie Ithanol, und deren Gemische dienen· Der Fachmann ist mit der Umsetzung von metallfreien Corrinoiden mit komplexbildenden Metallionen vertraut; vgl. z.B. DE-OSen 1 642 749 und 2 520 722; Koppenhagen et al., J. Biol. Chem., 245 (1970) 5865-5867, 246 (1971) 3075-3077, 248 (1973) 7999-8002 und 249 (1974) 6532-6540; Tand Dresow, Dissertation, Braunschweig 1978. Den Ablauf der alkalischen Behandlung kann der !Fachmann regeln bzw. überwachen, indem er die charakteristischen Absorptionsmaxima im sichtbaren Bereich mißt (alpha- und ß-Banden). Die alkalische Behandlung kann man, z.B. im wäßrigen Medium bei einem pH von 9 bis 13, vorzugsweise 10 bis 11 durchführen.
Bei dem erfindungsgemäSen Verfahren kann ©an von gelben metallfreien Corrinoiden ausgehen, die
(a) bei mikrobiologischen Verfahren gebildet wurden oder
(b) durch Umwandlung von bei mikrobiologischen Verfahren gebildeten roten metallfreien Oorrinoiden mit Hauptabsorptionen lambdamöV von 524, 498 und 329 nm mit Hilfe von
Alkali hergestellt wurden oder
(c) synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt wurden.
Als komplexbildende Metallionen kann man Kobaltoder Rhodiumionen verwenden, die gegebenenfalls radioaktiv sind; zur Bildung von roten Metallcorrinoiden mit verschiedenen Metallionen vgl. man z.B. die folgenden Veröffentlichungen: DE-OS 1 642 749; DE-OS 2 520 722; Koppenhaben & Pfiffner, J. Biol. Chem., 246 (1971) 3075-3077; Koppenhagen et al,, J. Biol. Chem., 248 (1973) 7999-8002; Koppenhagen et al., J, Biol. Chem., H9
(1974) 6532-6540,
030038/0103
BAD ORIGINAL
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man die alkalische Behandlung der gelben metallhaltigen Corrinoide mit einem im flüssigen Medium löslichen Cyanid vornehmen, z.B. mit einem Alkalimetallcyauid oder mit Ammoniumcyanid. Da Cyanide alkalisch reagieren,
kann aus ihrer Einwirkung die Umwandlung der gelten in die roten Metallcorrinoide und gleichzeitig eine Cyanidanlagerung an das komplexierte Metallion resultieren.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man z.B. von dem gelben metallfreien Gorrinoid ausgehen, das aus dem metallfreien Analogon des Cobalamins erhalten werden kann, wenn man es z.B. alkalisch behandelt. In diesem Pail führt das erfindungogemäßö Verfahren also zum Cobalamin bzw. zu analogen Metallcorrinoiden, die sich hinsichtlich des komplexierten Metallions vom Cobalamin unterscheiden.
Nach Römpp, Chemie-Lexikon, 7. Aufl., Stuttgart 1972, Seite 690 (mit weiterer Literatur) weisen Corrinoide bzw. "rote Corrinoide" das Strukturmerkmal auf, daß vier partiell hydrierte Pyrrolringe so miteinander verknüpft sind, daß ein sechsfach ungesättigter 15-gliedriger Ring entsteht.
Es wird angenommen, daß bei den gelben metallfreien und metallhaltigen Corrinoiden der Chromophor der roten metallf re ie«, und metallhaltigen Corrinoide durch Bildung eines c-Lactams am B-Eing unter Einbeziehung der Stellungen 5 und 6 unterbrochen ist. Die erfindungsgemäße alkalische Behandlung führt vermutlich zur Protonabspaltung in 5-Stellung und zur Spaltung des Lactamringes am Ring B, wie man dem folgenden Reaktionsschema 'entnehmen kann:
030038/0103 .0OPY.
ORIGINAL INSf=EQTH)
Zur Nomenklatur vergleiche man JOPAC, J. Biol. Chem., 24-1 (1966) 2999 und Biochem., 13 (1972J-) 1555-
Nachstehend wird die Erfindung durch ein Beispiel näher er läutert.
Beispiel
Es wurden 55 ®3- entgastes Äthanol 15 min lang mit Argon bei Raumtemperatur gespült und mit 4,79 mg gelbem Vitamin B 12 versetzt (das dem metallfreien Analogon des Cobalamins mit der Ausnahme entsprach, daß der B-Ring gemäß der vorstehenden Figur einen Lactamring trug). Danach wurden 2,8 mg CoClp-öEUO in 2,5 ml entsprechend behandelten Äthanol und 12 ml 0,25 proz. wäßriger Ammoniak zugegeben. Danach wurde im siedenden Wasserbad erwärmt, bis die stark gelbe Ausgangsfluoreszenz in eine schwach gelbgrüne Fluoreszenz übergegangen war. Nach, dem Abkühlen gab man 80 ml 0,2 m wäßriges EON zu. Der Alkohol wurde abgezogen. Das Entsalzen wurde mit Amberlite durchgeführt, wobei das Harz zur Adsorption des Vitamin B 12 diente. Nach der Desorption wurde das Rohprodukt papierchromatographisch gereinigt; Vitamin B 12 fiel als Hauptprodukt an.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man also von metallfreien gelben Corrinoiden ausgehen, die bei einem Verfahren zur Gewinnung metallfreier Corrinoide gegebenenfalls neben metallfreien roten Corrinoiden anfallen, bei dem man eine Rhodopseudomonas-Art unter Belichten kultiviert und den Mikroorganismus vom Kultur-
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COPY ,
medium abtrennt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist daß man die gebildeten metallfreien Corrinoide aus dem Kulturmedium in an sich bekannter Weise isoliert.
Der Fachmann ist in der Lage, jederzeit aus natürlichen Quellen Rhodopseudomomas-Stämme zu isolieren, zu identifizieren und zu kultivieren; dazu sei auf die folgenden Arbeiten hingewiesen Weaver et al., Arch. Mikrobiol., 105 (1975) 215; Biebl & Drews, ZBl. Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr. Hygiene, Abt. 2, 123 (1969) 452;
Pfennig & !Drüper in: Bergey's Manual of Determinativ Bacteriology, 8. Aufl., Baitimor (1974) 25-65;
Dresow, Dissertation, Braunschweig 1978; und DE-OS 1 642 749.
Der Fachmann ist auch mit der Isolierung metallfreier Corrinoid« aus flüssigen Medien vertraut; vgl- z.B.:
Koppenhagen & Pfiffner, J. Biol. Chem., 24-5 (197Ό) .5865-5867; Koppenhagen & Pfiffner, J. Biol. Chem., 246 (1971) 3075-3O??; Koppenhagen et al., J.'Biol. Chem.j 248 (1973) 7999-8002; Dresow, Dissertation, Braunschweig 1978; und DE-OS 1 642 749.
Beispiele für Rhodopseudomonas-Arten sind' Rhodopseudomonas sphaeroides, capsulata und pallustris. Pur die Hinterlegung der im folgenden speziell benannten Stämme können folgende Angaben gemacht werden:
Stamm Hinterlegungsstelle Hinterlegungs-
——— --——-_————________ be zeichnung
Rhodopseudomonas .". DSM Göttingen 158
sphaeroides
Rhodopseudomonas DSM Göttingen 155
capsulata
Bei der erfindungsgemäßen Gewinnung von metallfreien Corrinoiden kommt es darauf an, im Produktionsmedium bei einer möglichst gerii gen Fe-Konzentration und unter weitgehendem Co-Ausschluß zu arbeiten. So* sieht eine Ausfuhrungsform eine spezielle Pe- und Co-Ver— armung vor, bei der man ausgehend von einer Kultur der StammführunS (Ausgangskultur) aufeinanderfolgend mehrere (z.B. 4 bis 9) Voj
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ORIGINAL INSPECTED
kulturen (Folgekulturen) und schließlich die Produktionskultur (letzte Folgekultur) jeweils durch Überimpfen eines Teils (z.B. 5 bis 25 %t insbesondere 10 %) der vorhergehenden Kultur in ein Nährmedium herstellt, dem insbesondere keine Verbindung von Metallen der Gruppe VIII des Periodensystems zugesetzt worden ist· Bei einer speziellen'Ausführungsform wählt man schließlich als Produktionskultur oder als Impfkultur für die Produktionskultur die Folgekultur, in der sich eine extrazelluläre Mindestkonzentration an metallfreien Corrinoiden von 0,1, vorzugsweise 0,5 und insbesondere 1 mg/Liter erzielen läßt.
Demgegenüber kann man die Ausgangskultur, von der man bei dieser stufenweisen Verarmung an Fe- und Co-Ionen ausgeht, als Stammkultu: in einem Nährmedium halten, dem man auch Ionen bzw. Verbindungen von Metallen der Gruppe VIII des Periodensystens zugesetzt hat (z.B. Eisenionen), wie dem von Pfennig in Arch. Mikrobiol., 100 (1974) 197-206 angegebenen Medium oder entsprechenden ergänzten oder abgew a ndelten Medien.
Nach der DE-OS 1 642 74-9 soll man bei der Isolierung der metallfreien Corrinoide eine Lichtintensität von 107 *6 Lux nicht überschreiten. Da nun das erfindungsgemäße Verfahren auf extrazellulär' metallfreie Corrinoide gerichtet ist, die dem Licht ausgesetzt sind kann man bei diesem Verfahren mit einer Lichtintensität belichten, die gegenüber der bei der Kultivierung von fototrophen Mikroorganismen zur Gewinnung intrazellulärer metallfreier Corrinoide üblichen Lichtintensität von z.B. 2000 bis 4000, insbesondere 3000 Lux reduziert ist; zum bekannten Stand der Technik vgl. man z.B.: Koppenhagen & Pfiffner, J. Biol. Chem., 245 (1970) 5865-5867; Koppenhagen & Pfiffner, J. Biol. Chem., 246 (197D 3075-3077; Koppenhagen, Dechema Grundkursus Biotechnologie, (1977) 75-92; Toohey, Proc. Nat. Sei., 54 (1965) 934-942; und Toohey, Fed. Proc, (1966) 1628-1632.
überraschenderweise kann man beim erfindungsgemä—
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Sen Verfahren !zuerst jedoch auch mit der bei der Kultivierung von fototrojäieaKikroorganismen zur Gewinnung intrazellulärer metallfreier Corrinoide üblichen Lichtintensität von z.B. 2000 bis 4000, insbesondere 3000 Iux} und erst danach mit einer demgegenüber reduzierten Lichtintensität belichten. Diese Ausführungsform macht sich den Umstand zu nutze, daß zu Beginn der Wachsturasphase kaum metallfreie Corrinoide in das Kulturmedium abgegeben werden. Man kann eine um 50 bis 90 %, insbesondere bis SO fo reduzierte Lichtintensität anwenden, z.B. eine Lichtintensität von 1500 oder weniger, 1000 oder weniger oder 500 Lux oder weniger.
Wenn man die Reduktion der Lichtintensität erst während der Kultivierung vornehmen will, kann man die Lichtintensität
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zweckmäßigerweise dann reduzieren, wenn die optische Dichte bei 660 nm einen Wert im Bereich von 2 bis 4, insbesondere im Bereich von 2,5 bis 3 erreicht hat.
Nach der BE-OS 1 642 749 soll man bei der Isolierung von metallfreien Oorrinoiden einen pH von mehr als 7 vermeiden. Obgleich nun das erfindungsgemäße Verfahren auf die Gewinnung extrazellulärer metallfreier Corrinoide gerichtet ist, wurde überraschenderweise festgestellt, daß man bei den Vor- und Produktionskul* türen sehr wohl im neutralen oder schwach alkalischen Bereich arbeiten kann. Gemäß einer Ausführungsform werden daher pH-Veränderungen nicht nachgeregelt und gemäß einer anderen Ausführungsform kann man den pH im Bereich von 7,5 bis 9,0, insbesondere 7,5 bis 8,5 regeln.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich die Ausbeute an metallfreien Corrinoiden auf das 60-fache steigern; so wurden beispielsweise für Rhodopseudoraonas sphaeroiäes bereits mehr als 5 und für fthoäopseudomonas capsulata mehr als 1,5 mg/Llter erzielt.
Nachstehend wifd die Erfindung durch ein Beispiel noch nähör erläutert.
Kulturmedium und Wachstumsbedingungen
Die Stammkulturen wurden als Flüssigkultur in einem· chemiiöh definierten Mineralmedium gemäß Pfennig (Arch. Mlterobiol.* 100 (1974), 197-206) gehalten, dem Hefeextrakt (von Difco; 0,1 °ß> Gewicht/Volumen) und Dinatriumsuccinat (0,1 $> Gewicht/Volumen) zugesetzt wurden, latriumthiosulfat wurde weggelassen. Von den Starnmkulturen wurden monatlich Folgekulturen hergestellt und 48 h lang am Licht bei 27 0G inkubiert; sie wurden bei 4 0O aufbewahrt.
I1Ur die Herstellung extra zellulärer Oorrinoide wurde ein modifiziertes Lascelles-Medium angewendet, das je Liter Endvolumen folgende Bestandteile enthielt: 5,38 g DL-Apfelsäure; 500 mg Kaiiumdihydrogenphosphat; 500 mg Dikaliumhydrogenphosphat; 800 mg Diammoniutnhydrogenphosphat; 200 mg Magnesiumsulfat χ
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7H2O; 40 mg Calciumchlorid; 2,86 mg Borsäure; 1,81 mg Mangändichlorid χ 4H2O; 0,079 mg Kupfersulfat χ 5H2O; 0,176 mg HaMoO4 χ 5H2O; 0,Q23 mg NH4VO5; 1 ag Nikotinsäure; 1 mg Thiaminhydrochlorid; 10 /ig Biotin. Der pH war mit 2 η NaOH auf 6,8 eingestellt worden*
Uo die Stammkulturen anlTeundCbzu verarmen, wurden 4— bis 9nial auf dem genannten Medium Vorkulturen(bzw. Folgekulturen) hergestellt. Das Kultivieren wurde in 1-1-Flaschen (Pyrex) mit Schraubverschluß durchgeführt, die vollständig gefüllt waren, um Luft auszuschließen. Die Flaschen wurden in ein Wasserbad gegeben, das bei einer Temperatur von 27 0C gehalten wurdiht Das Belichten wurde mit drei "Reflektorlampen (100 W) vorgenommen, die so eingestellt waren, daß sie eine gleichmäßige Lichtintensität von 3000 Lux am Eintrittsfenster des Wasserbades lieferten. Bei ;)eder Flasche betrug das Inokulat 10 $. Die letzte Stufe der Verarmungsreihe diente als Inokulat für 10-1-Produktionskulturen, die bei kontinuierlicher Belichtung bei 22 0O ohne pH-Kontrolle wuchsen. Nachdem die Kulturen eine optische Dichte von 3*0 bei 660 nm erreicht hatten, wurde die Ausgangslichtintensität von 3000 auf 1000 bzw. 600 Lux herabgesetzt; Man ließ die Kulturen insgesamt 300 h wachsen. Nach dieser Zeit hatten beide Stämme (DSM 155 bzw. 153) die stationäre Phase erreicht (optische Dichte 6,2 bis 6,6), wobei keine weitere Anreicherung von extrazellulären Corrinoiden beobachtet wurde. Dex pH war auf einen Wert im Bereich von 8,2 bis 8,6 angestiegen.
Weitere Produktion skulturen ließ man in einem 350-1-Röhrenphotoreaktor wachsen, der speziell für die Massenkultivierung iOtotropher Mikroorganismen ausgebildet war; vgl. Koppenhagen, Dechema Grundkursus Biotechnologie, (1977) 75-92.
Isolierung bei Rhodopseudomonas sphaeroides
Nach dem Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren wurde die" rötlich-braune überstehende Flüssigkeit (die eine starke rötlichorange Fluoreszenz unter UV-Licht zeigte) auf einen pH von 3 eingestellt. E3 wurden metallfreie Corrinoide zusammen mit großen Mengen an Porphyrinen und anderen hydrophoben Verbin-
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QBlGiNAL INSPECTED
düngen an Ämberlit (XÄD-2; 100 bis 200 pm) adsorbiert. Das Harz wurde neutral gewaschen; die Corrinoide und die teilweise mitgeschleppten Porphyrins wurden mit tert.-Butylalkohol (20 f>) eluiert. Das Butanol wurde unter reduzierte'm Druck entfernt; der wässerige Hückstand wurde in eine Säule eingeführt, die mit DEAE-Zellulose in der Acetatform beschickt war. Riboflavine und andere gelbe Produkte, die nicht weiter charakterisiert wurden, wurden rasch mit Wasser eluiert, wobei die Porphyrine und die metallfreien Corrinoiäe quantitativ am Kopf der S'iule zurückgehalten wurden. Die Corrinoide wurden von der Masse der Porphyrine durch Üluieren mit 0,5 ti Essigsäure abgetrennt. Das saure Eluat wurde auf ein kleines XAD-2-Bett (50 bis 100,um) überführt, aus dem die Corrinoiäe mit tert.-Butylalkohol (10 '/*) eluiert wurden. Der konzentrierte Durchlauf wurde danach erneut an D2A£~2ellulose in der Acetatform chromatographiert. Das EIuieren mit wässeriger Essigsäure (1 #) lieferte vier Fraktionen metallfreier Corrinoide bei einer Gesamtausbeute von 3,5 Big/ Liter Kulturfiltrat.
Im einzelnen wurden folgende Fraktionen erhalten: Fraktion 1! rote Pentacarbonsäure; Fraktion 2: gelbe Pentacarbonsäure; Fraktion 3: rote Hexacarbonsäure; und Fraktion 4: gelbe Hexstcarbonsäure. Die beiden roten Carbonsäuren wurden aus wässeriger Lösung als orange dünne Fädeln kristallisiert; Hauptbanden lambdamev:524, 498 und 329 nm; epsilon χ 10~5: 20,14» 13,64 und 48,37. Die Absorptionsspektren der gelben Fraktionen entsprachen sehr stark denen, die für die gelben Umwandlungsprodukte der roten Descobaltocorrinoide nach Behandlung mit Alkali gefunden wurden (Toohey in Proc. Hat. Sei., 54 (1965) 934-942 und Ted. Proc, 25 (1966) 1628-1632); Hauptabsorption lambdam : 480, 462 (Schalter) und 290 nm; epsilon χ 10"°: 24*68, 23,58 und 39,72.
Isolierung bei Rhoäopseuäomonas capsulata
Die Arbeitsweise der Isolierung extrazellulärer metallfreter Corrinoide entsprach der bei Rhodopseudomonas sphaeroides. Zusätzlich zu den Hexa- und Pentacarbonsäuren lieferte dieser
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BAD ORIGINAL
Mikroorganismus auch Tetra-, Tri-, Di- und Monocarbonsäuren und mehrere neutrale und- basische Produkte. Hach der Adsorption an einer XAD-2-Säule und dem Eluieren wurden die sauren Corrinoide an DEÄE-Zellulose in der Acetatform zurückgehalten und durch Eluieren mit wässeriger Essigsäure (1 $£)■ fraktioniert. Der v?ässerige Durchlauf enthielt die neutralen und basischen Corriiloide, die abgetrennt wurden. Die Gesastausbeute an extrazellulären Corrinoiden betrug 0,4 rag/Iiter Kulturfiltrat.
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ORIGINAL INSPECTED

Claims (5)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur Herstellung von Metalleorrinoiden,
    dadurch gekennze ichnet , daß man gelbe metallfreie Corrinoide mit Eauptabsorptionen lambdamov von 430 und 290 nm in flüssigem Medium
    (a) mit komplexbildenden Ketallionen zu Metalleorrinoiden um~ setzt und
    (b) die gebildeten Metallcorrinoide alkalisch behandelt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von gelben metallfreien Corrinoiden ausgeht, die
    (a) bei mikrobiologischen Verfahren gebildet wurden oder
    (b) durch Umwandlung von bei mikrobiologischen Verfahren gebildeten roten metallfreien Corrinoiäen mit Hauptabsorptionen laabäamax von 524, 493 und 329 nm mit Hilfe von Alkali hergestellt werden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als komplexbildende Metallionen
    Cobalt- oder Ehodiumionen verwendet, die gegebenenfalla radioaktiv sind.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die alkalische Behandlung der gelben taetallhal^en Corrinoide mit einem im flüssigen Kediuta löslichen Cyanid vornimmt, z.B. mit einem Alkalimetallcyanid oder mit Ammoniumcyanid.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man von dem gelben metallfreiett
    Corrinoid ausgeht, das aus dem metallfreien Analogon des Cobalamine durch Alkalibehandlung gemäß Anspruch 2 (Variante (b)) erhalten werden kann.
    ORIGINAL INSPECTED
    030038/0103
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