DE2856579A1

DE2856579A1 - 5-Alpha-androstane-3-alpha, 17-beta-diol prodn. - from 4-androstene-di:one or testosterone by fermenting with Rhodotorula glutinis

Info

Publication number: DE2856579A1
Application number: DE19782856579
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Kieslich
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1978-12-22
Filing date: 1978-12-22
Publication date: 1980-08-07

Abstract

Prodn. of 5alpha-androstane-3alpha, 17beta-diol (I) comprises fermentation of 4-androsten-3,17-dione (II) or testosterone (III) with a culture of the yeast Rhodotorula glutinis (IFO 1099). Fermentation is carried out under aerobic, submerged culture conditions with the substrate added as soln. or dispersion, e.g. using methanol, ethanol, DMF as solvent, and alkylene oxide adducts or fatty acid polyglycol esters as emulsifiers. (I) is an intermediate for pharmaceutically useful steroids. The process is stereospecific for the 3alpha-isomer; known methods give mixts. of 3alpha and 3beta forms.

Description

Verfahren zur Herstellung vonProcess for the production of

5α-Androstan-3α,17ß-diol. 5α-androstane-3α, 17β-diol.

Die Erfindung betrifft das in dem Patentanspruch gekennzeichnete Verfahren.The invention relates to the method characterized in the claim.

5a-Androstan-3a1I7ß-diol ist bekanntlich ein wichtiges Zwischenprodukt zur Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide. Seine Synthese aus 4-Androsten-3,17-dion oder 17ß-Hydroxy-4-androsten-3-on ist recht aufwendig, da die direkte chemische Hydrierung zu Gemischen von 5α-Androstan-3ß,17ß-diol und 5ß-Androstan-3ß,17ß-diol führt.5a-Androstane-3a1I7ß-diol is known to be an important intermediate for the synthesis of pharmacologically active steroids. Its synthesis from 4-androstene-3,17-dione or 17ß-Hydroxy-4-androsten-3-one is quite expensive because the direct chemical Hydrogenation to form mixtures of 5α-androstane-3β, 17β-diol and 5β-androstane-3β, 17β-diol leads.

Es wurde bereits versucht, 17ß-Xydroxy-4-androsten-3-on mittels Hefen der Gattung Rhodotorula zu fermentieren. Diese mikrobiologische Umsetzung führte aber ebenfalls zu Gemischen von 40 % 5a-Androstan-3ß, 1 7ß-diol und 30% 5a-Androstan-3a, 1 7ß-diol (Endocrinologie 59-, 1972, 99).Attempts have already been made to yeast 17ß-xydroxy-4-androsten-3-one of the genus Rhodotorula to ferment. This microbiological implementation resulted but also to mixtures of 40% 5a-androstane-3ß, 17ß-diol and 30% 5a-androstane-3a, 17β-diol (Endocrinologie 59-, 1972, 99).

Gegenüber diesen vorbekannten Verfahren hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorzug, daß es weitgehend stereospezifisch zum gewünschten 5a-Andros*an-3a717ß-diol führt, Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter den Bedingungen durchgeführt, die man üblicherweise bei der mikrobiologischen Fermentation mit Hefekulturen anwendet.Compared to these previously known methods, the method according to the invention has the advantage that it is largely stereospecific to the desired 5a-andros * an-3a717ß-diol leads, The inventive method is carried out under the conditions carried out, which is usually carried out in microbiological fermentation with yeast cultures applies.

Unter den üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das 4-Androsten-3,17-dion (in einem Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.Under the commonly used culture conditions are in a suitable nutrient medium with aeration, submerged cultures. Then you bet the cultures the 4-androstene-3,17-dione (dissolved in a solvent or preferably in emulsified form) and fermented until a maximum substrate conversion is reached is.

Geeignete Substratldsungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Athanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindust. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Athylenoxyaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel (R) (R) (R) Tegin , Tween und Span beispielsmäßig genannt.Suitable substrate solvents are, for example, methanol, ethanol, Glycol monomethyl ether, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide. The emulsification of the Substrate can for example be effected by micronized Form or in a water-miscible solvent (such as methanol, ethanol, acetone, Glycol monomethyl ether, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide) dissolved under strong Turbulence in (preferably decalcified) water, which the usual emulsification aids contains, dust. Suitable emulsification aids are nonionic emulsifiers, such as for example ethyleneoxy adducts or fatty acid esters of polyglycols. As suitable Emulsifiers are the commercially available wetting agents (R) (R) (R) Tegin, Tween and Span named as an example.

Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von den angewendeten Fermentationsbedingungen abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.The optimal substrate concentration, substrate addition time and fermentation time depends on the fermentation conditions used. These sizes must as is generally required in microbiological steroid conversions, im Individual cases can be determined by preliminary tests, as they are familiar to the person skilled in the art.

Das nachfolgende Beispiel dient zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.The following example serves to explain the invention Procedure.

Beispiel Ein Erlenmeyerkolben mit 21 Fassungsvermögen wird mit 500 ml einer Nährlösung aus 3% Glucose, 0,2% Cornsteep liquor und 0,3% Hefeextrakt beschickt und bei 1200C 30 Minuten im Autoklaven sterilisiert. Der Kolben wird mit einer Abschwemmung von einer dreitägigen Schrägagarkultur von Rhodotorula glutinis (IFO 1099) beimpft und 48h auf einer Rotationsschüttelmaschine mit einer Frequenz von 145 Umdrehungen/ Minute bei 30°C geschüttelt. Mit dem Inhalt von zwei Kolben wird ein 201 Fermenter, der 151 eines sterilisierten Mediums gleicher Zusammensetzung enthält, beimpft und nach Zugabe einiger Tropfen Antischaummittel (Polyol 2000) bei 29°C unter Belüftung 1 Liter Ruft/ pro 1 Fermenterbrühe/pro Minute und Rühren 220 U/Min. fermentiert. Example An Erlenmeyer flask with 21 capacity becomes 500 ml of a nutrient solution of 3% glucose, 0.2% Cornsteep liquor and 0.3% yeast extract charged and sterilized at 1200C for 30 minutes in an autoclave. The piston comes with a wash-off inoculated from a three day agar slant culture of Rhodotorula glutinis (IFO 1099) and 48h on a rotary shaker with a frequency of 145 revolutions / Shaken minute at 30 ° C. With the contents of two flasks a 201 fermenter, which contains 151 a sterilized medium of the same composition, inoculates and after adding a few drops of antifoam agent (Polyol 2000) at 29 ° C with ventilation 1 liter calls / per 1 fermenter broth / per minute and stirring 220 rpm. fermented.

Nach einer Laufzeit von 12 h wird eine sterilfiltrierte Lösl1ng von 3,75 g 4-Androsten-3,17-dion in 75 ml Dimethylformamid zugesetzt und unter gleichen Bedingungen weiterfermentiert.After a running time of 12 h, a sterile-filtered solution of 3.75 g of 4-androstene-3,17-dione in 75 ml of dimethylformamide were added and the same Conditions further fermented.

Der Veilauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben überprüft, die mit Methylisobutylketon extrahiert werden. Die Extrakte werden dünnschichtchromatographisch analys;ert.The progress of the fermentation is checked by taking samples, which are extracted with methyl isobutyl ketone. The extracts are thin-layer chromatographed analyzed

(System Chloroform Methanol 9:1) Dabei wird zunächst eine Umwandlung des Substrates (RF 0,80) in Testosteron (RF 0,62) beobachtet. Nach ca. 72 h ist neben geringen Anteilen an Testosteron das gewünschte 5a-Androstan-3a,17ß-diol entstanden. Die Kulturbrühe wird dann dreimal mit je 4 1 Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit etwas EIexan vom Antischaummittel frei gewaschen und man erhält DCanalytisch reines 5a-Androst m-3a,17ß-diol vom Schmelzpunkt 215/217-2190C, (Ausbeute 2,8 g)(System chloroform methanol 9: 1) First there is a conversion of the substrate (RF 0.80) in testosterone (RF 0.62) was observed. After about 72 hours In addition to small amounts of testosterone, the desired 5a-androstane-3a, 17ß-diol was formed. The culture broth is then extracted three times with 4 liters of methyl isobutyl ketone each time. the combined extracts are evaporated to dryness in vacuo. The residue will Washed free of the antifoam with a little EIexan and obtained by analysis pure 5a-androst m-3a, 17ß-diol with melting point 215 / 217-2190C, (yield 2.8 g)

Claims

Claim: Process for the production of 5a-androstane-3a, 17ß-diol, characterized in that 4-androsten-3,17-dione or 17ß-hydroxy-4-androsten-3-one fermented with a yeast culture of the species Rhodotorula glutinis (IFO 1099).