DE2811002A1 - IMMUNE PROCEDURE FOR DETERMINATION OF HUMAN BETA-LIPOTROPIN AND ANTIBODIES THEREFORE - Google Patents
IMMUNE PROCEDURE FOR DETERMINATION OF HUMAN BETA-LIPOTROPIN AND ANTIBODIES THEREFOREInfo
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Description
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Dipi.-hg. :?■■— /r/sr J H. März !978Dipi.-hg. :? ■■ - / r / sr J H. March! 978
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RAN 4Ο93/27RAN 4Ο93 / 27
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/SchweizF. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel / Switzerland
Xininunverfahren zur Bestimmung von menschlichem ß-Lipotropin und Antikörper hierzu Xininun method for the determination of human ß-lipotropin and antibodies to this
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunverfahren und insbesondere ein sehr empfindliches und spezifisches Radioimmunverfahren zur Bestimmung von ß,-Lipotropin (/3,-LPH) .The present invention relates to an immune method and in particular a very sensitive and specific radioimmune method for the determination of β, -lipotropin (/ 3, -LPH).
Ein empfindliches Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Rinder-/3-Lipotropin wird von Desrauleau et al, Endocrinology 91 y 1004 (1972) beschrieben. In diesem Verfahren werden für das Hormon spezifische Antisera aus Hasen verwendet.A sensitive radioimmune method for the determination of bovine / 3-lipotropin is described by Desrauleau et al, Endocrinology 91 y 1004 (1972). This procedure uses rabbit antisera specific to the hormone.
Vorher hatten immunologische Untersuchungen von ß-Lipotropin, welches aus Schafhypophysen isoliert wurde, gezeigt, dass das Hormon aus dieser Quelle in Hasen geringe antigene Eigenschaften zeigt [vergleiche Lohmar und Li, Endocrinology 82, 898 (1968)].Previously, immunological studies of ß-lipotropin, which was isolated from sheep pituitary, had shown that the hormone from this source shows low antigenic properties in rabbits [compare Lohmar and Li, Endocrinology 82, 898 (1968)].
Kürzlich wurde die vollständige Aminosäuresequenz von menschlichem 0-Lipotropin durch Li und Chung, in Nature 260,
(1976) publiziert. 809840/0717
Hen/19.1.1978Recently, the complete amino acid sequence of human O-lipotropin was published by Li and Chung, in Nature 260 , (1976). 809840/0717
Hen / January 19, 1978
Seitdem vor kurzem festeres teilt wurde, dass ß-Lipotropin ein Prohormon für verschiedene Morphin ähnliche Peptide ist, besteht grosses Interesse zu ermitteln, welche Rolle /3-Lipotropin in Patienten mit verschiedenen metabolischen und geistigen Störungen möglicherweise spielt. Um diese klinischen üntersuchungen durchführen zu können, ist es erwünscht, ein empfindliches und spezifisches Radioimmunverfahren zur Bestimmung von menschlichem ß-Lipotropin zu entwickeln.Since then it has recently been solidified that ß-lipotropin is a prohormone for various morphine-like peptides, there is great interest in determining which role / 3-lipotropin is may play in patients with various metabolic and mental disorders. To these clinical examinations To be able to carry out, it is desirable to have a sensitive and specific radioimmune method for the determination of to develop human ß-lipotropin.
ι Die vorliegende Erfindung betrifft ßh-LPH spezifische f Antisera, welche mit Rinder-j3-Lipotropin (j3o-LPH) leicht und mit /3-Melanotropin und menschlichem ß-Endorphin (ß,-EP) sehr leicht kreuzreagieren.The present invention relates to ß h -LPH-specific f antisera which easily cross-react with bovine j3 lipotropin (j3 o -LPH) and very easily cross-react with / 3-melanotropin and human ß-endorphin (ß, -EP).
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Immunverfahren zur Bestimmung von menschlichem /3-Lipotropin, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung aus der Probe, enthaltend eine unbekannte Menge an menschlichem ß-Lipotropin, aus markiertem menschlichem J3-Lipotropin und aus einem Antikörper, welcher menschliches /3-Lipotropin spezifisch bindet, inkubiert; das freie und das gebundene menschliche /3-Lipotropin trennt; die Menge an markiertem /3-Lipotropin in dem freien oder in dem gebundenen menschlichen /3-Lipotropin misst; und den Gehalt an /3-Lipotropin in der Probe durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt.The present invention further relates to an immune method for the determination of human / 3-lipotropin, characterized in that that you get a mixture of the sample, containing an unknown amount of human ß-lipotropin, from labeled human J3-lipotropin and from an antibody which specifically binds human / 3-lipotropin, incubated; the free and separating the bound human / 3-lipotropin; the amount of labeled / 3-lipotropin in the free or in the bound human / 3-lipotropin measures; and the content of / 3-lipotropin determined in the sample by comparison with a standard curve.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Immunverfahren ein Radioimmunverfahren und das markierte menschlicheIn a preferred embodiment, the immune method is a radioimmune method and the labeled human
125
/3, -liipotropin I-menschliches /3,-Lipotropin.125
/ 3, -liipotropin I-human / 3, -lipotropin.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird menschliches /3-Lipotropin aus frischen Hypophysen mit Hilfe der von Li et al, in Nature 208, 1093 (1965} beschriebenen Methode zur Gewinnung des Hormons aus Rindern, isoliert..For the purposes of the present invention, human / 3-lipotropin is isolated from fresh pituitary glands using the method described by Li et al, in Nature 208 , 1093 (1965} for obtaining the hormone from cattle.
Antisera enthaltend Antikörper, welche für menschliches /3-LPH spezifisch sind, werden aus erwachsenen weissen männlichen Hasen (Neuseeland) erhalten. Das Hormon wird in 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,-5} gelöst und mit der gleichen Menge an vollständigem Freund's Hilfsstoff (Bifco) emulgiert« Das HinterteilAntisera containing antibodies specific to human / 3-LPH are specific to adult white males Hare (New Zealand) received. The hormone is in 0.01 M phosphate buffer (pH value 7, -5} dissolved and emulsified with the same amount of complete Freund's auxiliary (Bifco) «The rear part
11011101
■j der Hasen wird sauber rasiert und die Emulsion wird an verschiedenen Stellen Währendeiner Periode von vier Wochen in wöchentlichen Zeitintervallen eingespritzt. Die insgesamt injizierte Dosis beträgt 3 mg. Eine Woche nach den letzten Beimpfungen wird den Tieren aus den Öhradern Blut entnommen und die Anwesenheit von Antikörpern im Serum durch den in Acta ?athol9MicrobioloScand„ 32, 231 (1953) beschriebenen Outcherlony-Gel-Doppeldiffusionstest undThe rabbit is shaved clean and the emulsion is injected at various points during a four week period at weekly time intervals. The total dose injected is 3 mg. One week after the last inoculations, blood is taken from the animals' veins and the presence of antibodies in the serum by the Outcherlony gel double diffusion test and described in Acta? Athol 9 MicrobioloScand 32, 231 (1953)
125 Ueberprüfung der Bindungsfähigkeit für I-/3.-LPH kontrolliert»125 Review of the ability to bind for I- / 3.-LPH checked »
Der Gel-Doppeldiffusionstest wird unter Verwendung von 1% Agar in 0,01 M Phosphatpuffer von pH-Wert 7,5 durchgeführt. Ein quantitativer Präzipitintest erfolgt im wesentlichen durch die von Kabat und Meyer in "Expt.Immunochemistry", zweite Ausgabe, Thomas Publishing (1961) beschriebenen Methode. Das gesamte Reaktionsvolumen beträgt 1 ml und die Inkubation wird während 72 Stunden beiThe gel double diffusion test is carried out using 1% agar in 0.01 M phosphate buffer of pH 7.5. A quantitative precipitin test is essentially carried out by that of Kabat and Meyer in "Expt.Immunochemistry", second edition, Thomas Publishing (1961) described method. The total reaction volume is 1 ml and the incubation is carried out for 72 hours at
-o-O
4 C mit 0,1 ml Antiserum pro Röhrchen durchgeführt. Das präzipitrierte Gesamt-Protein wird durch die Methode von Lowry et at bestimmt. Mikrokomplementfixierungstests werden mit der von Wasserman und Levine in J.Immunology 8_7, 290 (1961) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Fixierung des Komplements erfolgt während 14 Stun-Q 4 C carried out with 0.1 ml of antiserum per tube. The precipitated Total protein is determined by the method of Lowry et at. Microcomplement fixation tests are carried out using the method described by Wasserman and Levine in J. Immunology 8-7, 290 (1961) carried out. The fixation of the complement takes place during 14 Stun-Q
den bei 4 C in einem Milliliter. Das Volumen wird durch Zusatz von aktivierten Schaferythrocyten auf 7 ml erhöht und die Röhrchen werden während einer Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Abkühlung auf 0 C und Zentrifugieren zum Entfernen von nicht lysierten Zellen, wird die Absorption der überstehenden Flüssigkeit bei 413 ran gemessen. the one at 4 C in one milliliter. The volume is increased by adding activated sheep erythrocytes are increased to 7 ml and the tubes are incubated for one hour at 37 ° C. After cooling down 0 C and centrifugation to remove non-lysed cells, the absorption of the supernatant liquid is measured at 413 ran.
125125
I-markiertes /3,-LPH wird nach der von Greenwood et al hI-labeled / 3, -LPH is produced according to the method described by Greenwood et al H
in Biochem. J. J5£, 114 (1963 beschriebenen Methode hergestellt« Die Trennung des iodierten Hormons von freiem Iod wird durch Chromato-in Biochem. J. J5 £, 114 (method described in 1963 produced «The Separation of the iodinated hormone from free iodine is carried out by means of
graphie über eine mit 0,1 Essigsäure aequilibrierte Sephadex G-25 Kolonne erreicht. Die spezifische Aktivität des iodierten Hormons liegt zwischen 150-180 mci/mg.graph of a Sephadex G-25 equilibrated with 0.1 acetic acid Column reached. The specific activity of the iodinated hormone is between 150-180 mci / mg.
Im Radioimmunverfahren wird das markierte Hormon (etwa 7000-8000 Impulse/Minute) in 0,1 ml, mit unmarkiertem ß, -LPH, anderen verwandten Peptiden oder menschlichen Hypophysenextrakten und 0,1 ml verdünntem Antiserum (IsIO1OOO) in einem GesamtvolumenIn the radioimmune method, the labeled hormone (about 7000-8000 pulses / minute) in 0.1 ml, with unlabeled ß, -LPH, other related peptides or human pituitary extracts and 0.1 ml of diluted antiserum (IsIO 1 OOO) in a total volume
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von 0,3 ml während 16-24 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Inkubationen werden in Glasröhrchen (12 χ 75 mm) unter Verwendung eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7,5; 0,01 M) enthaltend 0,15 M NaCl, 0,33% EDTA und 1% Rinderserumalbumin (RIA-Puffer) als Verdünnungsflüssigkeit, durchgeführt. Die Trennung des gebundenen vom freien Hormon erfolgt durch Zusatz von 0,5 ml Puffer, beispielsweise Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 enthaltend 2% Aktivkohle, wie Norit und 1% Dextran T-7O. Die Teströhrchen werden während 30 Minuten bei 5000 UpM in einer gekühlten Sorval RC-2B Zentrifuge zentrifugiert\ 0,5 ml der klaren überstehenden Lösung werden mit 5 ml Szintillationsflüssigkeit (PCS-Amersham) \ gemischt und die Radioaktivität in einem Packard Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Das verwendete Verfahren zur Zählung einer Gammastrahlung in einem Betazähler ist im wesentliehen dasjenige, welches durch Herscowitz und Mc Killip, in J. Immunological Methods _4, 253 (1974) beschrieben wird. Es ist auch möglich, auf bekannte Weise die Radioaktivität des Niederschlages zu messen.of 0.3 ml incubated for 16-24 hours at 4 ° C. The incubations are carried out in glass tubes (12 75 mm) using a phosphate buffer (pH 7.5; 0.01 M) containing 0.15 M NaCl, 0.33% EDTA and 1% bovine serum albumin (RIA buffer) Dilution liquid. The bound hormone is separated from the free hormone by adding 0.5 ml of buffer, for example sodium phosphate buffer with a pH of 7.5 containing 2% activated carbon, such as Norit and 1% dextran T-70. The test tubes are for 30 minutes at 5000 rpm in a refrigerated Sorvall RC-2B centrifuged centrifuge \ 0.5 ml of the clear supernatant solution are mixed with 5 ml of scintillation fluid (PCS Amersham) \ and the radioactivity measured in a Packard liquid scintillation counter. The method used to count gamma radiation in a beta counter is essentially that described by Herscowitz and Mc Killip, in J. Immunological Methods _4, 253 (1974). It is also possible to measure the radioactivity of the precipitate in a known manner.
Einzelne menschliche Hypophysen werden in 5 ml entionisiertem Wasser homogenisiert und das Homogenisat wird mit acht Volumen einer kalten HCl-Aceton Mischung (1:40, V/V) extrahiert. Das im Extrakt vorhandene Protein wird durch Zusatz von 5 Volumen kaltem Aceton gefällt. Der Niederschlag wird getrocknet, in RIA-Puffer wieder aufgelöst und die Lösung auf die für die Tests geeignete Verdünnung gebracht.Individual human pituitary glands are homogenized in 5 ml of deionized water and the homogenate is mixed with eight volumes of a cold HCl-acetone mixture (1:40, V / V) extracted. The protein present in the extract is made by adding precipitated from 5 volumes of cold acetone. The precipitate is dried, redissolved in RIA buffer and the solution on the suitable dilution brought for the tests.
Die Fähigkeit des Antiserums, die biologische Aktivität von /3,-LPH zu neutralisieren, wird durch Ueberprüfung seiner Fähigkeit die lipolytische Aktivität des Hormons in isolierten Fettzellen von Hasen zu hemmen, festgestellt.The ability of the antiserum, biological activity of / 3, -LPH to neutralize, by examining its ability to isolate the lipolytic activity of the hormone Inhibiting rabbit fat cells was found.
Vor Einfügung in die Teströhrchen, welche die Fettzellen von Hasen enthalten, wird das Hormon mit normalem Hasenserum oder Antiserum (0,05 ml) während einer Stunde bei 37°C inkubiert. Einzelheiten über das Verfahren zur Isolierung der Fettzellen von Hasen und deren Verwendung zur Bestimmung der lipolytischenBefore insertion into the test tubes containing rabbit fat cells, the hormone is tested with normal rabbit serum or Antiserum (0.05 ml) incubated for one hour at 37 ° C. Details of the procedure for isolating the fat cells of rabbits and their use for determining lipolytic
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Aktivität von Peptidhormonen werden in der Literatur beschrieben. Peptide hormone activity is described in the literature.
Alle Hasen (drei) reagierten - wie durch Messung deren Bindungsfähigkeit an I-markiertes 0,-LPH festgestellt - auf die Immunisierung durch Erzeugung eines hohen Titers an Antikörpern. Die Antikörper von zwei Hasen waren nicht vom Präzipitationstyp, während diejenigen des dritten Hasen vom Präzipitationstyp waren. Die letzteren ergaben in einem Geldoppeldiffusionstest eine einzige scharfe Präzipitinlinie gegen 0,-LPH0 Es ist ebenfalls zu bemerken, dass nach Entwicklung der Platten nach 72 Stunden keine Linien gegen 0 -LPH, 0^-Endorphin, 0,-MSH und menschliches Serum ersichtlich waren.All rabbits (three) reacted - as determined by measuring their ability to bind to I-labeled 0, -LPH - to the immunization by generating a high titer of antibodies. The antibodies from two rabbits were not of the precipitation type, while those of the third rabbit were of the precipitation type. The latter gave a single sharp precipitin line against 0, -LPH, 0 in a double diffusion test. It should also be noted that no lines against 0, -LPH, 0 ^ -endorphin, 0, -MSH and human serum can be seen after development of the plates after 72 hours was.
Mit 0,-LPH-Antiserum wurde eine quantitative Präzipitinkurve erhalten. Das homologe Antigen präzipierte 150 \>q Protein bei einer Äntigenkonzentration von 5 μg. Das Präzipitinverhalten von 0,-LPH erfolgte nach einem klassischen Schema, nämlich in Ansteigen bis zu einem Maximum bei einer relativ niedrigen Äntigenkonzentration und eine Abnahme in der Zone eines Antigenüberschusses. A quantitative precipitin curve was obtained with 0, -LPH antiserum. The homologous antigen präzipierte 150 \> q protein at a Äntigenkonzentration of 5 micrograms. The precipitin behavior of 0, -LPH took place according to a classic scheme, namely in an increase up to a maximum at a relatively low antigen concentration and a decrease in the zone of an antigen excess.
Mit 0,-Antiserum und 0,-LPH scwie 0 -LPH und 0, -EP wurden η η s ηWith 0, -antiserum and 0, -LPH sc as were 0, -LPH and 0, -EP η η s η
Komplementfixierungskurven erhalten. Menschliches 0-LPH fixierte 80% des Komplements, während 0, -EP eine minimale Komplementfixierungsaktivität zeigte.Obtain complement fixation curves. Human 0-LPH fixed 80% of complement, while 0, -EP minimal complement fixation activity showed.
Die in der nachstehenden Tabelle I dargestellten Ergebnisse zeigen, dass 0,05 ml Antiserum in der Lage war, die lipolytisehe Aktivität von einem \xq 0,-LPH in isolierten Hasenfettzellen zu neutralisieren. Bei höheren Konzentrationen an Hormon reduzierte das Antiserum die lipolytische Aktivität von 5,0 auf 0,85 μΜοΙβ erzeugtes Glycerol pro Gram trockener Fettzellen„ Das Xfar zu erwarten,, da die Konzentration an Hormon das Weutralisierungsaequxvalent des Antiserums überstieg. Unter den gleichen Bedingungen hatten die Zusätze von normalem Hasenserum zum Hormon keinen Effekt auf seine lipolytische Aktivität.The results shown in Table I below that 0.05 ml of antiserum was capable of the activity of one lipolytisehe \ xq 0 to neutralize -LPH in isolated rabbit fat cells. At higher concentrations of hormone, the antiserum reduced the lipolytic activity from 5.0 to 0.85 μΜοΙβ glycerol produced per gram of dry fat cells. Under the same conditions, the addition of normal rabbit serum to the hormone had no effect on its lipolytic activity.
Wirkung von j3.-LPH Antiserup auf die lipolytische Aktivität von 0-LPH in isolierten Hasenfettzellen.Effect of j3.-LPH antiserup on the lipolytic activity of 0-LPH in isolated rabbit fat cells.
Hormonkonzentration (pg/ml)Hormone concentration (pg / ml)
Mole an erzeugtem Glycerin pro Gramm trockene Fettzellen pro StundeMoles of glycerin produced per gram of dry fat cells per hour
ßh-LPH A/Sß h -LPH A / S
0.12 0.37 1.10 3.300.12 0.37 1.10 3.30
0.17 + 0.03 1.02 + 0.21 3.68 + 0.25 4.45 + 0.14 5.00 + 0.070.17 + 0.03 1.02 + 0.21 3.68 + 0.25 4.45 + 0.14 5.00 + 0.07
0.14 + 0.02 0.16 + 0.04 0.15 + 0.03 0.85 + 0.140.14 + 0.02 0.16 + 0.04 0.15 + 0.03 0.85 + 0.14
NRS = normales HasenserumNRS = normal rabbit serum
A/S = AntiserumA / S = antiserum
In jedem Test werden 0.05 ml NRS und A/S verwendet.0.05 ml of NRS and A / S are used in each test.
09840/071? ■09840/071? ■
In den radioimmunologischen Tests ergab 0, -LPH mitIn the radioimmunological tests, 0, -LPH was found with
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homologem Antiserum und -1-0, -LPH eine typische Inhibitionskurve. Die Empfindlichkeit lag zwischen 0,1 ng und 10 ng. 0-LPH aus Schaf ergab eine Inhibitionskurve, welche nicht parallel war. Weiter wurde zum Erhalten einer 50-prozentigen Inhibition eine zehnfache Konzentration an homologem Antigen benötigt, was auf eine nur teilweise Identität schliessen lässt. Sowohl menschliches 0-Endorphin als 0-MSH ergaben eine sehr schwache Konzentration und nicht-parallele Kurven.homologous antiserum and -1-0, -LPH a typical inhibition curve. The sensitivity ranged from 0.1 ng to 10 ng. 0-LPH from sheep gave an inhibition curve which was not parallel. Next was to get 50 percent inhibition requires ten times the concentration of homologous antigen, which suggests only partial identity. As well as human O-endorphin as O-MSH gave very poor concentration and non-parallel curves.
Die nachstehende Tabelle 2 gibt den mittels demTable 2 below gives the by means of the
Radioimmunverfahren bestimmten Gehalt an 0-LPH in individuellen menschlichen Hypophysen wieder.Radioimmune tests determined the level of 0-LPH in individuals human pituitary again.
Gehalt an 0-LPH in menschlichen HypophysenContent of 0-LPH in human pituitary glands
(a) Nassgewicht(a) wet weight
(b) Mittels einem Radioimmunverfahren(b) Using a radioimmune method
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Es ist zu bemerken, dass die durchschnittliche Konzentran
trägt.It should be noted that the average concentrate
wearing.
tion an /3-LPH in einer einzelnen Hypophyse 47,4 _ 3,1 μg be-tion of / 3-LPH in a single pituitary gland 47.4 _ 3.1 μg
Im Falle von Rinder-0-LPH enthielt Hasenantiserum zum menschlichen Hormon neutralisierende präzipitierbare oder nicht präzipitierbare Antikörper. Offenbar sind ß-Lipotropine keine wirksamen Antigene. Trotzdem zeigten die Ergebnisse des Geldoppeldiffusionstests, des quantitativen Präzipitintests, des Mikrokomplementfixierungstests und des Radioimmunverfahrens die Spezifität für 0h~LPH-Antisera. Die reduzierte Affinität für das Schafhormon ist aufgrund der Unterschiede in der Grundstruktur der beiden Hormone nicht erstaunlich. In üebereinstimmung mit Desrauleau et al, supra, erweist sich 0-LPH aus dem Schaf als immunologisch verschieden vom menschlichen Hormon. Wie durch radioimmunologische Tests mit nicht parallelen Inhibitions kurven veranschaulicht, zeigte das Antiserum für 0,-LPH eine schwache Kreuzreaktion mit dem Schafhormon.In the case of bovine O-LPH, rabbit antiserum to human hormone contained precipitable or non-precipitable antibodies. Apparently, ß-lipotropins are not effective antigens. Nevertheless, the results of the double diffusion test, the quantitative precipitin test, the microcomplement fixation test and the radioimmune method showed the specificity for 0 h ~ LPH antisera. The reduced affinity for the sheep hormone is not surprising due to the differences in the basic structure of the two hormones. In agreement with Desrauleau et al, supra, O-LPH from sheep proves to be immunologically different from the human hormone. As illustrated by radioimmunological tests with non-parallel inhibition curves, the antiserum for 0, -LPH showed a weak cross-reaction with the sheep hormone.
Es ist interessant zu notieren, dass ß.-Endorphin in radioimmunologischen Testverfahren praktisch keine kompetitive Reaktion ergab, obwohl 0, -Endorphin die Aminosäuresequenz 61-91 der 0,-LPH Struktur besitzt. Mikrokomplementfixierungstests zeigten ebenfalls, dass ßj,-EP nicht mit 0,-LPH-Antiserum reagiert.It is interesting to note that ß.-endorphin is present in radioimmunological test method resulted in practically no competitive reaction, although 0, -endorphin the amino acid sequence 61-91 which has the 0, -LPH structure. Microcomplement fixation tests also showed that ßj, -EP did not interact with 0, -LPH antiserum reacted.
Die Feststellung, dass der durch Radioimmunverfahren geschätzte Gehalt von 0-LPH in einzelnen menschlichen Hypophysen nicht viel variiert, gibt Grund anzunehmen, dass im Moment der Einsammlung das Hormon in der Drüse noch nicht enzymatisch abgebaut wurde. In Wirklichkeit ist der geschätzte Gehalt von 47 μg pro Drüse nicht signifikant von der durch Isolierungsverfahren, über welche kürzlich berichtet wurde, erhaltenen Ausbeute von 33 μg, verschieden.The finding that the level of 0-LPH in individual human pituitary glands estimated by radioimmune methods does not vary much, gives reason to assume that at the moment of collection the hormone in the gland has not yet been enzymatically broken down. In reality, the estimated 47 µg per gland level is not significantly different from the 33 µg yield obtained by isolation procedures recently reported.
Obwohl im erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise radioaktiv markiertes 0-LPH verwendet wird, liegt es im VermögenAlthough radiolabeled O-LPH is preferably used in the method according to the invention, it is in the power
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des Fachmannes, auch ß-LPH mit anderen spezifischen und bestimmbaren Markierungssubstanzen, wie z.B. Elektronenspinresonanzgruppen, zu markieren. Die Verwendung von verschiedenen mit Elektronenspinresonanzgruppen markierten Molekülen in biologischen Tests wird beispielsweise in den US Patentschriften Nos 3'453'228, 31481"952 und 3'507'876 beschrieben. Als Markierungssubstanzen eignen sich auch Chromophore, Fluorophore, Enzyme, rote Blutzellen, Latexteilchen usw.of the person skilled in the art to mark also ß-LPH with other specific and determinable marker substances, such as electron spin resonance groups. The use of various labeled with electron spin resonance groups molecules in biological tests described for example in US Patents Nos 3'453'228, 3 1 481 "952 and 3'507'876. As labeling substances also chromophores, fluorophores, enzymes, red blood cells are , Latex particles, etc.
i717i717
Claims (8)
führt wird.4) immune method according to claim 3, characterized gekennzeichiss d:
will lead.
tropin I-ß-Lipotropin ist.125
tropin I-ß-lipotropin is.
net, dass I-menschliches β-:125
net that I-human β-:
net, dass I-menschliches ß-Lipotropin mit 7000 bis 8000125
net that I-human ß-lipotropin with 7000 to 8000
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