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Verfahren zum Aufbau von Peptidkettez
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Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zum Aufbau
von Peptidketten durch Umsetzung eines Aminosäurevorläuferkomplexes, der eine geschützte
alpha-Amino- oder Carboxylgruppe und ein Polynukleotid enthält, mit einem Aminosäurebruchstück
in wäßriger Lösung, Abtrennung des umgesetzten Komplexes von nichtumgesetzter Säure
durch reversible Verknüpfung des Polynukleotids des Komplexes an ein komplementäres
Polynukleotidadsorbens, das auf einem unlöslichen Träger immobilisiert Rist, und
Eluieren des Komplexes in Form einer wäßrigen Lösung von dem Träger. Der Komplex
wird vorzugsweise enzymatisch entblockiert und als der Vorläufer bei der Wiederholung
der Umsetzung mit einer weiteren Säure verwendet. Während des Verfahrens werden
vorzugsweise die Ketten, die mit einer gegebenen Säure nicht reagiert haben, durch
enzymatischen Abbau entfernt.
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Das Gebiet der Peptidsynthesen hat in den letzten Jahren beträchtliche
Bedeutung erlangt. Es bestehen erhebliche Schwierigkeiten bei der synthetischen
Herstellung von hochmolekularen reinen Polypeptiden, deren Aminosäuresequenz tatsächlich
der angestrebten entspricht. Die praktische Durchführung der Synthese bis zu der
gewünschten Reinheit ist sehr mühsehlig.
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Die synthetische Herstellung eines Polypeptids ist ein mehrstufiges
Verfahren, durch welches ein angestrebtes Produkt durch aufeinanderfolgende chemische
Reaktionen eines Vor läufers und einer zugesetzten Verbindung aufgebaut wird, wobei
der Vorläufer in jeder gegebenen Stufe der chemisch umgesetzte reagierende Vorläufer
der vorangegangenen Stufe ist. Das Verfahren ist somit ein sich wiederholendes.
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Bei diesem Verfahren wird eine erste Aminosäure mit einer zweiten
zu einem Dipeptid umgesetzt, das schematisch durch die Formel I wiedergegeben werden
kann.
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Das so gebildete Peptid wird von den nichtumgesetzten Säuren abgetrennt,
worauf eine dritte Aminosäure mit dem Dipeptid zu einem Tripeptid umgesetzt wird.
Diese Maßnahmen werden wiederholt, bis ein Polypeptid mit der gewünschten Aminosäuresequenz,
das im allgemeinen als das Zielpeptid bezeichnet wird, erhalten wird. Sequenzfehler,
aufgrund welcher ein Teil der langen Polypeptidketten eine falsche Aminosäuresequenz
aufweist, können mehrere Ursachen haben. Eine dieser Ursachen kann darin bestehen,
daß zurückbleibende freie Aminosäure vor der Umsetzung mit einer nachfolgenden Aminosäure
nicht aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden kann. Aufgrund der Gegenwart einer
solchen nichtumgesetzten Säure besteht die Möglichkeit, daß ein Teil der Ketten
mit der restlichen Säure anstatt mit der bei dieser Stufe der Sequenz beabsichtigten
Säure verlängert wird.
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Eine weitere und vielleicht schwerer wiegende Ursache von Sequenz
fehlern besteht darin, daß sich nicht alle vorhandenen Ketten mit der in jeder einzelnen
Stufe der Synthese zugesetzen Aminosäure umsetzen. Bei der Herstellung von Polypeptiden
mit niedrigem Molekulargewicht kann das Vorliegen von Ketten mit unterschiedlicher
Säurezahl analytisch festgestellt, und die angestrebten Peptidketten können isoliert
werden. Die üblichen Analysenmethoden ermöglichen dies jedoch im Fall von Polypeptiden
mit höherem Molekulargewicht nicht, weil die Molekulargewichtsunterschiede zwischen
richtig und falsch aufgebauten Ketten viel zu gering sind, um nachweisbar zu sein.
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Die oben beschriebene Peptidsynthese ist als eine Folge von Umsetzungen
von Aminosäuren mit einer Polypeptidkette dargestellt worden. Hierfür stehen zwei
Wege zur Verfügung: einmal das Wachstum des Peptids vom C-Ende aus (das Ende der
Kette mit der 0 -C-OH-Gruppe) und zum anderen Wachstum von dem N-Ende (dem Ende
mit der NH2-Gruppe). Es ist allgemein bekannt, daß bei der Synthese entweder die
alpha-Aminogruppe (N-Endenweg) oder die Carboxylgruppe (C-Endenweg) der zugesetzten
Säure geschützt sein muß, so daß die zugesetzte Säure mit der Polypeptidkette reagiert
und eine Umsetzung zwischen den Molekülen der zugesetzten Säure nicht stattfinden
kann. Deshalb muß die geschützte Gruppe der zugesetzten Säure nach der Umsetzung
mit der Kette für die folgende Säurezusatzstufe entfernt werden. Eine mangelhafte
Schutzgruppenentfernung in einer bliebigen Stufe der Synthese kann zur Einführung
eines Sequenzfehlers führen. Darüber hinaus muß die Schutzgruppenentfernung derart
bewirkt werden, daß dabei das zu synthetisierende Peptid nicht beeinträchtigt wird.
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Zum Löslichmachen werden die üblichen Methoden der Peptidsynthese
gewöhnlich in einem nichtwäßrigen Medium durchgeführt, insbesondere im Fall von
Peptiden mit hohem Molekulargewicht
und geschützten Aminosäureseitenketten.
Dies hat die Anwendung rauher Verknüpfungsreaktionen zur Ausbildung der Peptidbindung
erforderlich gemacht, wodurch Kettenverletzungen, zum Beispiel Racemisierung und
Brechen begünstigt wurden. Außerdem kann es insbesondere bei Peptiden von höherem
Molekulargewicht in nichtwäßrigen Reaktionslösungen unmöglich sein, daß das Peptid
seine natürlich vorkommende Konfiguration anzunehmen vermag. In der Natur werden
die Peptide selbstverständlich in einem wäßrigen Medium aufgebaut.
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Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung
eines praktisch reinen Polypeptids mit vorher bestimmbarer Aminosäuresequenz, das
sich an eine Automatisierung anpassen läßt und zuverlässig zur Herstellung von reinen
Zielpeptiden mit hohem Molekulargewicht angewandt werden kann.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Isolierung eines
längeren Polypeptids aus seinem Reaktionsgemisch, damit bei der weiteren Umsetzung
die richtige Sequenz erhalten werden kann. Dieses Verfahren läßt sich mit ganz geringem
Zeitaufwand leicht durchführen, und die Verluste an Peptid werden dabei bei einem
Minimum gehalten.
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Die Erfindung schafft ein einfaches Verfahren zur weitgehenden Behebung
der Schwierigkeiten, die mit der reiterativen Herstellung von Polymeren verbunden
sind und sich aus Sequenzfehlern infolge unvollständiger Umsetzung ergeben, durch
die wirksame Ausscheidung verfehlter Sequenzen aus der wachsenden Kettenpopulation,
so daß die Gewinnung eines angestrebten reinen Polypeptids leicht bewirkt werden
kann.
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Die Erfindung schafft ferner ein neues Verfahren zur Entblockierung
eines Peptids oder zur Schutzgruppenentfernung aus einem
Peptid,
das leicht durchführbar ist und nicht zu Verletzungen der aufzubauenden Kette führt.
Außerdem erfolgt die Schutzgruppenentfernung in einer Weise, die die optische Reinheit
des auszubildenden Peptids gewährleistet.
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Die Erfindung schafft ferner ein Verfahren zum Aufbau von Peptiden,
wobei die reiterative Verlängerung der wachsenden Kette in einem wäßrigen Medium
ohne Verletzung der Polymerkette rasch bewirkt werden kann. Die erfindungsgemäße
Peptidbildungsarbeitsweise macht ein umständliches Schützen der Aminosäureseitenketten
nicht erforderlich, die gewöhnlich die Löslichkeit des herzustelllenden Polymeren
in wäßrigen Medien beeinträchtigen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Aufbau einer Peptidkette mit einer
bestimmten Sequenz von Aminosäurebruchstücken ist dadurch gekennzeichnet, daß 1)
ein reiner Vorläuferkomplex, in dem ein erstes Aminosäurebruchstück der herzustellenden
Peptidkette an ein Polynukleotid als Verknüpfungshandhabe kovalent gebunden ist
und das Bruchstück eine freie endständige Carboxylgruppe oder eine freie endständige
Aminogruppe enthält, mit einem zweiten Aminosäurebruchstück, das eine freie NalPha-Aminogruppe
und eine geschützten Carboxylgruppe enthält, wenn der Vorläufer eine freie endständige
Carboxylgruppe enthält, oder aber eine freie Carboxylgruppe und eine geschützte
Nalpha-Aminogruppe enthält, wenn der Vorläufer eine freie endständige Aminogruppe
enthält, in einem wäßrigen Medium umgesetzt wird, 2) gegebenenfalls der nichtumgesetzte
Vorläuferkomplex entfernt wird,
3) die Polynukleotidverknüpfungshandhabe
des umgesetzten Komplexes an ein komplementäres Polynukleotidadsorbens, das auf
einem unlöslichen Träger immobilisiert ist, reversibel geknüpft wird, 4) der umgesetzte
Komplex von nichtumgesetztem zweiten Aminosäurebruchstück abgetrennt wird, 5) die
Polynukleotidverknüpfungshandhabe von dem Adsorbens befreit wird, 6) gegebenenfalls
die Carboxylgruppe oder die Aminogruppe an dem umgesetzten Komplex entblockiert
wird, 7) gegebenenfalls die Stufen 1 bis 6 wiederholt werden, bis die angestrebte
Zahl von Aminosäurebruchstücken an den Vorläufer angefügt ist, 8) gegebenenfalls
die Peptidkette von der Verknüpfungshandhabe abgelöst und das Produkt gewonnen wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Aufbau einer Peptidkette mit einer
bestimmten Sequenz von Aminosäurebruchstücken ist dadurch gekennzeichnet, daß ein
reiner Vorläufer, der ein erstes Aminosäurebruchstück der herzustellenden Peptidkette
mit einer freien endständigen Carboxylgruppe oder einer freien endständigen Aminogruppe
enthält, mit einem zweiten Aminosäuresegment, das eine freie Nalpha-Aminogruppe
und eine geschützte Carboxylgruppe, die der enzymatischen Hydrolyse zugänglich ist,
enthält, wenn der Vorläufer eine freie endständige Carboxylgruppe enthält, oder
eine freie Carboxylgrupe und eine geschützte Nalpha-Ainogruppe, die der enzymatischen
Hydrolyse zugänglich ist, enthält, wenn der Vorläufer eine freie endständige Aminogruppe
enthält, in einem wäßrigen Medium umgesetzt und das gebildete Peptid enzymatisch
entblockiert wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Peptidkette mit
einer bestimmten Sequenz von Aminosäuresegmenten ist dadurch gekennzeichnet, daß
ein reiner Vorläufer, der ein erstes Aminosäurebruchstück der herzustellenden Peptidkette
mit einer freien endständigen Carboxylgruppe oder einer freien endständigen Aminogruppe
enthält, mit einem zweiten Aminosäurebruchstück mit einer freien NalPha-Aminogruppe
und einer blockierten Carboxygruppe, wenn der Vorläufer eine freie endständige Carboxylgruppe
enthält, oder einer freien Carboxylgruppe und einer geschützten Nalpha~AminoqrupFe,
wenn der Vorläufer eine freie endständige Aminogruppe enthält, in einem wäßrigen
Medium umgesetzt und nichtumgesetzter Vorläufer durch enzymatischen Abbau oder durch
Abfangen entfernt wird Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Kettenverlängerung
in Lösung dadurch erreicht werden, daß ein Vorläuferkomplex mit dem gewählten, die
Sequenz fortsetzenden Bruchstück umgesetzt wird, das in einer bestimmten Stufe der
Polymersynthese angefügt werden soll. Der Vorläuferkomplex kann selbstverständlich
das Anfangsbruchstück der Kette oder eine bereits bestehende Kette von Bruchstücken
enthalten, woran die weiteren Bruchstücke angefügt werden sollen. Im Rahmen der
Beschreibung der Erfindung bezieht sich die Bezeichnung "Bruchstück" oder "Aminosäurebruchstück"
auch auf Derivate des Bruchstücks, die in der schließlich erhaltenen Kette, die
aufgebaut wird, vorliegen. Die Bezeichnung "Bruchstück" oder "Aminosäurebruchstück"
kann sich auf eine einzige Aminosäure oder auf eine Reihe von Aminosäuren beziehen.
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Bei Polypeptidsynthesen ist das angefügte Bruchstück ein Aminosäurerest,
und der Vorläufer ist eine verlängerbare Peptidkette mit einer freien endständigen
Aminogruppe oder einer freien endständigen Carboxylgruppe. Die Bildung der Peptidbindung
und die Kettenverlängerung wird somit entweder durch Acylierung der Aminogruppe
an der Kette mit der Carboxylgruppe der Säure, die angefügt wird (N-Endenweg) oder
durch Acylierung der Aminogruppe der angefügten Säure durch die Carboxylgruppe an
der wachsenden Kette (C-Endenweg) bewirkt.
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Vorzugsweise bildet der Vorläufer Teil eines größeren wasserlöslichen
Komplexes, der eine wasserlösliche Verknüpfungshandhabe enthält, die an das nicht
verlängerbare Ende des Vorläufers gebunden ist; d. h. für das C-terminale Kettenwachstum
wird die Kette mit der N lp -Gruppe des ersten Aminosäurerests der Seqenz an der
Verknüpfungshandhabe verankert. Für ein N-terminales Wachstum wird die Kette mit
der Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerests der Sequenz an der Verknüpfungshandhabe
verankert. Eine Kettenverlängerung wird daher durchgeführt, während der Vorläufer
Teil des Komplexes ist. Zur Stabilisierung des Komplexes in wäßrigem Medium ist
die Bindung zwischen der Verknüpfungshandhabe und dem Vorläufer vorzugsweise kovalent
und wird in einer Art und Weise bewirkt, die eine nachfolgende Freisetzung ermöglicht,
so daß schließlich die Gewinnung des aufgebauten reinen Zielfragments vorgenommen
werden kann. Da die wachsende Kette kovalent an die wasserlösliche Verknüpfungshandhabe
komplex gebunden ist, wird die Löslichkeit der Kette während der Anknüpfungsreaktion
in wäßrigen Medien stark begünstigt, selbst dann, wenn die Kette bereits ziemlich
lang ist.
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Eine Klasse von Substanzen, die als Verknüpfungshandhaben verwendet
werden können, sind wasserlösliche synthetische Polymere.
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Beispiele für diese Klasse von Substanzen sind Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon,
Poly(acrylamid-acrylsäure) oder Polyethylenmaleinsäureanhydrid. Polyamide, zum Beispiel
solche Aminosäurepolymeren, die ein Glutaminsäure- oder Asparaginsäurebruchstück
enthalten, sind gleichfalls zur Verwendung als Verknüpfungshandhaben geeignet. Ein
weiterer Stoff, der als Verknüpfungshandhabe verwendet werden kann, ist Polyethylenglykol.
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Auch wasserlösliche Polynukleotide stellen eine als Verknüpfungshandhabe
brauchbare Stoffklasse dar. Beispiele für brauchbare Polynukleotide, die als Säuren
bezeichnet werden, sind Polyadenylsäure, Polyuridylsäure, Polythymidylsäure, Polycytidylsäure
und Polyguanylsäure. Vorzugsweise haben die Säuren wenigstens zehn sich wiederholende
Ribosephosphatgruppen und sind im Handel erhältlich.
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Die Art der Erzielung der Bindung der ersten Aminosäure oder eines
kurzkettigen Peptids an eine Verknüpfungshandhabe soll so gewählt werden, daß das
Zielpeptid anschließend unter milden Bedingungen entfernt werden kann. Zur Erreichung
dieses Ziels besteht ein weiteres Merkmal der Erfindung darin, daß als Teil der
Verknüpfungshandhabe ein endopeptidase-spezifischer Abstandshalter aufgenommen wird,
an den das erste geschützte Aminosäurebruchstück des Zielpeptids angefügt wird.
Die Konfiguration dieses Abstandshalters richtet sich nach dem anzuwendenden Syntheseweg,
d. h. C- oder N-terminal. Die Verwendung eines endopeptidase-spezifischen Abstandshalters
hat den Vorteil, daß zur Entfernung des Zielpeptids milde pH- und Temperaturbedingungen
angewandt werden können. Beispielsweise kann zwar bei einem N-terminalen Weg eine
Verseifung angewandt werden, wenn die erste Aminosäure des Peptids direkt an eine
Polynukleotidverknüpfungshandhabe gebunden ist, doch sind Verseifungen rauhe Methoden,
die zur Racemisierung führen können.
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So wird bei genauerer Betrachtung der Anlagerung die Ribose des 3'-Endes
eines Polynukleotids für die Synthese über den C-terminalen Weg zu einem Dialdehyd
oxidiert, worauf eine Verknüpfung an einem endopeptidase-spezifischen Abstandshalter
durch reduktive Alkylierung erfolgt, wobei ein Amin- Dialdehyd-Addukt gebildet wird,
woran sich eine Reduktion dieses Addukts in wäßriger Lösung mit beispielsweise Natriumborhydrid
anschließt. Der Halter hat somit an einem Ende eine primäre Aminogruppe, die mit
der oxidierten Ribosegruppe des Nukleotids reagieren kann.
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Das andere Ende des Halters enthält eine Carboxylgruppe, die, nachdem
sie eine NalPha-Aminogruppe einer zugesetzten Säure acyliert hat, durch die Wirkung
einer Endopeptidase hydrolysiert werden kann. Polypeptide selbst, die einen Arginin-oder
Lysinrest mit Carboxylende enthalten, stellen eine brauchbare Klasse solcher Abstandshalter
dar, insbesondere dort, wo der N-terminale Rest oder ein anderer Rest von einer
hydrophoben
Säure stammt, die keines Schutzes bedarf, wie Glycin,
Alanin und Valin. Das Dipeptid Glycyl-L-arginin ist ein brauchbarer Abstandshalter,
der durch reduktive Alkylierung nach der Methode von Royer, et al., BBRC, Bd 64,
S. 478 (1975) an ein Polynukleotid geknüpft werden kann. Der Dipeptidabstandshalter,
der über eine tertiäre Aminbindung an das Nukleotid gebunden ist, hat somit eine
freie Carboxylgruppe, die für den Anbau einer ersten Aminosäure mit geschützter
Carboxylgruppe oder eines Bruchstücks aus mehreren Säuren für die Herstellung eines
Zielpeptids auf dem C-terminalen Weg zur Verfügung steht.
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Ist beabsichtigt, Polyethylenglycol oder Polyvinylalkohol als Verknüpfungshandhabe
zu verwenden, wird die Alkoholgruppe beispielsweise durch Umsetzung mit Kalium-t-butoxid
in ein Alkoxidderivat übergeführt, und dieses Derivat wird mit Ethylbromacetat zu
dem Carboxymethylderivat umgesetzt. Letzteres wird zur freien Säure hydrolysiert,
die an den endopeptidase-spezifischen Abstandshalters unter Verwendung eines wasserlöslichen
Carbodiimidaktivators angeknüpft wird.
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Polyvinylpyrrolidon, Poly (acrylamid-acrylsäure) und Polyethylenmaleinsäureanhydrid
erfahren eine basische Hydrolyse zu Derivaten mit freien Carboxylgruppen. Die Polyamide
werden aus solchen ausgewählt, die eine freie Carboxylgruppe aufweisen.
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Die Substanzen werden ebenfalls wie oben angegeben mit dem Abstandshalter
verknüpft.
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Nach seiner Herstellung kann das Zielpeptid mit Hilfe einer hochspezifischen
Endopeptidase, beispielsweise Trypsin, die nur diese Peptidbindungen spaltet, deren
Carbonyl das von Arginin (oder Lysin) ist, aus seinem Komplex mit der Verknüpfungshandhabe
abgespalten werden. Für diese Spaltung kann das Enzym an einen Träger gebunden oder
frei in Lösung bei milden alkalischen pH-Werten eingesetzt werden.
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Für die N-terminale Peptidsynthese erfordert die Herstellung der Polynukleotidhandhabe
wiederum die Oxidation des Riboseanteils, wobei ein Abstandshalter über eine sekundäre
Aminbindung durch reduktive Alkylierung daran gebunden ist. In diesem Fall muß jedoch
das Ende des Abstandshalters für die kovalente Anknüpfung an die erste anzufügende
Aminosäure eine freie Aminogruppe enthalten, so daß das Wachstum der Kette am N-terminalen
Ende erfolgen kann. Der Abstandshalter enthält somit eine primäre Aminogruppe in
beiden Endstellungen, von denen die eine mit dem Nukleotid und die andere unter
Komplexbildung mit dem ersten Säurerest der Sequenz reagieren kann.
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Damit die erforderliche Endopeptidaseaktivität gegeben ist, die für
die schließliche Ablösung des Zielpeptids von der Verknüpfungshandhabe benötigt
wird, wird die für die kovalente Bindung an den ersten Säurerest der angestrebten
Sequenz verwendete Aminogruppe durch die apha-Aminogruppe von Arginin oder Lysin
oder einem Derivat davon zur Verfügung gestellt.
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Eine zweckmäßige Art der Herstellung der Verknüpfungshandhabe für
das Kettenwachstum vom N-terminalen Ende besteht darin, daß zuerst ein kurzkettiges
Diamin reduktiv an das aldehydhaltige Nukeotid geknüpft wird (Royer et al., loc.
cit.). Danach wird das Nalpha-aminogeschützte Arginin oder Lysin durch die Carboxylgruppe
an das freie Amin des Diamins gebunden, beispielsweise unter Verwendung eines wasserlöslichen
Carbodiimidaktivators, und die Schutzgruppe wird entfernt, beispielsweise unter
Verwendung des Enzyms L-Pyrrolidoncarboxylpeptidase, wodurch die angestrebte Verknüpfungshandhabe
mit einer freien Aminogruppe gebildet wird, die für die Peptidsynthese auf dem N-terminalen
Weg zur Verfügung steht.
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Soll ein Vinylpolymeres oder ein Polyamid als Handhabe verwendet werden,
dann werden Derivate, die eine freie Carboxylgruppe enthalten, wie oben beschrieben
hergestellt. Das Caboxylderivat wird mit einem Diamin, zum Beispiel Ethylendiamin,
unter Verwendung eines Carbodiimids verknüpft. Der
Arginin- oder
Lysin-Abstandshalber wird wie oben in Verbindung mit der Polynukleotidverknüpfungshandhabe
beschrieben an das Diamin gebunden.
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Die anschließende Gewinnung des Zielpeptids.von der Verknüpfungshandhabe
kann, wie bereits erörtert, durch die zweistufige Verwendung einer arginin- oder
lysin-spezifischen Endepeptidase und anschließend einer arginin- oder lysin-spezifischen
Exopeptidase, zum Beispiel Carboxypeptidase B, bewirkt werden. Das erste Enzym löst
das mit Arginin oder Lysin endende Zielpeptid von dem übrigen Teil der Verknüpfungshandhabe
ab, wohingegen das zweite den C-terminalen Arginin- oder Lysinrest entfernt und
gleichzeitig das Zielpeptid freisetzt. Wie bereits erwähnt, können beide Enzyme
gebunden oder in Lösung bei milden alkalischen pH-Werten eingesetzt werden.
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Wenn Lysin oder Arginin in dem Zielpeptid vorliegen soll, dann müssen
die Seitenketten dieser Aminosäurebruchstücke geschützt sein. Sind diese Seitenketten
nicht geschützt, dann wird das Zielpeptid selbst durch die zur Ablösung von der
Verknüpfungshandhabe verwendete Endopeptidase aufgebrochen.
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Beispielhafte Schutzgruppen sind Trifluoracetyl für die epsilon-Aminogruppe
von Lysin und die Nitrogruppe für die Guanidiniumseitenkette von Arginin. Die Entfernung
der Schutzgruppen von diesen Resten kann durch übliche allgemein bekannte Arbeitsweisen
erreicht werden.
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Damit die zugesetzte Aminosäure während der Kettenverlängerung nicht
mit sich selbst reagiert, müssen die primäre alpha-Aminogruppe oder, je nach den
Verhältnissen, die Carboxylgruppe dieser Aminosäure sowie andere reaktionsfähige
Gruppen mit Ausnahme derjenigen, die reagieren soll, blockiert oder geschützt werden.
Wie später noch weiter erläutert, ist eine bevorzugte blockierende oder Schutzgruppe
für eine alpha-Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe eine solche, die enzymatisch
entfernt werden kann.
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Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung besteht insbesondere hinsichtlich
der Peptidsynthese auf dem C-terminalen Weg in der Verwendung von nichtaktivierten
Aminosäureesterderivaten mit einer freien Nalpha-Aminogruppe zur Umsetzung mit dem
Vorläufer. Zu Verbindungen dieser Klasse gehören solche, die aus einer einzigen
Aminosäure oder anderen Verbindungen hergestellt worden sind, zum Beispiel solchen,
die eine oder mehrere Peptidbindungen enthalten und aus der gleichen oder einer
anderen Aminosäure hergestellt wurden. Diese Aminosäurederivate mit einer durch
Veresterung geschützten Carboxylgruppe können durch folgende Formel wiedergegeben
werden
Hierin steht n für null oder eine höhere ganze Zahl, A bedeutet eine Aminosäureseitenkette,
die, wenn n größer als null ist, in jeder sich wiederholenden Einheit eine andere
sein kann, und R bedeutet eine blockierende Gruppe, die eine Acylierung eines Moleküls
mit einer freien Aminogruppe durch das Derivat verhindert. R ist vorzugsweise eine
kurzkettige gerade oder verzweigte Alkylgruppe mit weniger als etwa 10 Kohlenstoffatomen,
die, wie noch erläutert, enzymatisch entfernt werden kann. Weitere geeignete Estergruppen
sind die Benzyl- und Nitrobenzylgruppe.
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Die Derivate der obigen Formel II werden nach bekannten Veresterungsverfahren
hergestellt, zum Beispiel durch säurekatalysierte Umsetzung einer Aminosäure mit
einem Alkohol. Unter Verwendung dieser Derivate kann die Umsetzung mit einem Vorläufer,
der eine freie Carboxylgruppe enthält, in Wasser bei saurem pH-Wert und einer Temperatur
von etwa 0 °C unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids als Verknüpfungsmittel
erzielt werden.
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Auch bei Anwendung eines N-terminalen Wegs ist das herkömmliche Mittel
der Verknüpfung einer NalPha-blockierten Säure an dem freien Aminovorläufer unter
Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids eine praktisch gut durchführbare Arbeitsweise.
Vorzugsweise ist die NalPha-blockierende Gruppe enzymatisch entfernbar, wie dies
noch näher erläutert wird. Eine andere Art der Verknüpfung ist die Verwendung von
aktiven ten Aminosäurederivaten für die Umsetzung mit dem Vorläufer. Ein Beispiel
für derartige Derivate sind aktive Aminosäureester. Bekanntlich bilden diese aktiven
Ester in Lösung bei Zimmertemperatur spontan Peptidbindungen, wobei die Racemisierung
bei einem Minimum gehalten wird (Bodanszky und Klausner, The Chemistry of Polypeptides,
Herausg. Katsoyannis, S. 21, Plenum, 1973).
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Die aktiven Ester können durch Umsetzung der Säuregruppe einer NalPha-geschützten
Aminosäure mit einem Alkohol hergestellt werden, der Substituenten enthält, aufgrund
welcher er durch eine Aminogruppe an der Kette des Vorläufers leicht ersetzt werden
kann. Die Vorbereitungsumsetzung kann in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart
eines Carbodiimids erfolgen.
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Aliphatische Alkohole mit einer oder mehreren Elektronen entziehenden
Gruppen, Phenol- und Thiophenolderivate sowie Hydroxylaminderivate sind geeignete
Alkohole. Einzelbeispiele für brauchbare aktive Ester sind solche mit den folgenden
verdrängba!--en austretenden Gruppen: Cyanmethyl, Carbethoxymethyl, Propargyl, N-Hydroxysuccinimid,
N-Hydroxyphthalimid, p-Nitrophenyl, 2,4,5-Trichlorphenyl und andere in der oben
angegebenen Literaturstelle genannte. Die aktiven Ester sind zwar bevorzugt, doch
können auch Aminosäurederivate mit anderen leicht verdrängbaren Gruppen am Carboxylteil
eingesetzt werden. Zu diesen Gruppen gehören beispielsweise auch Azido, Imidazol,
Halogen, Acyl und Phosphoryl.
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Mit enzymatisch freisetzbaren NalPha-Gruppe stellen die aktiven Aminosäurederivate
und insbesondere die Ester eine brauchbare Klasse von Verbindungen für die Peptidsynthese
auf dem N-terminalen Weg dar. Sowohl die Acylierungsreaktion mit der Kette als
auch
die Freisetzung zur weiteren Verlängerung können unter sehr milden Bedingungen in
Lösung vorgenommen werden, wodurch etwa mögliche nachteilige Wirkungen auf das zu
synthetisierende Polymere bei einem Minimum gehalten werden. Durch die Verwendung
der aktiven Ester kann, wie noch weiter erläutert, eine Blockierung anderer Seitenketten
bestimmter Aminosäuren umgangen werden, die gewöhnlich eines entsprechenden Schutzes
bedürfen.
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Die Verbindungen der oben beschriebenen Klasse von aktiven Estern
sind im wesentliche solche, die ein Aminosäurederivat mit einer aktivierten terminalen
Carboxylgruppe und einer N-Schutzgruppe enthalten, die durch ein entsprechendes
und spezifisches Enzym entfernbar ist. In einer Ausführungsform können diese Verbindungen
folgendermaßen wiedergegeben werden:
Hierin bedeutet Bez eine enzymatisch entfernbare gruppe, X eine ohne weiteres durch
eine Aminogruppe verdrängbare Gruppe und n und A haben die in Verbindung mit Formel
II angegebenen Bedeutungen. Die L-Pyrrolidoncarboxyl-(Pyroglutamyl-)-gruppe ist
eine gut geeignete NalPha-Acylschutzgruppe. Kurath und Thomas, Helv. Chim. Acta,
Bd. 56, S. 1658 (1973) und Doolittle, Methods in Enzymol., Bd. 19, S. 558 (1970)
beschreiben die Verwendung von L-Pyrrolidoncarbonsäure zur Herstellung der Nalpha-L-Pyrrolidoncarboxylderivate
von Aminosäuren.
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Zur Erzielung eines hohen Grades der Umwandlung kann die Verlängerungsreaktion
mit einem großen Überschuß des zugesetzten folgenden Segments durchgeführt werden,
der sich auf ein Äquivalentverhältnis von wenigstens 2 : 1 und vorzugsweise von
wenigstens
5 : 1 beläuft. Trotzdem kann jedoch die Lösung nach der Umsetzung nichtumgesetzten
veränderbaren Vorläufer enthalten. Bei einer sich wiederholenden Arbeitsweise kann
die Gegenwart von solchem nichtumgesetzten Vorläufer einen Sequenz fehler verursachen.
Der nichtumgesetzte Vorläufer könnte zwar vor der nächsten Umsetzung blockiert werden,
doch wird dadurch seine Molekularstruktur nicht verändert, und die Möglichkeit eines
Sequenzfehlers besteht weiter, wenn nachher eine Entblockierung erfolgen soll.
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Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist daher auf das "Ausputzen" gerichtet.
Unter Ausputzen wird die selektive und chemische Entfernung von nichtumgesetztem
Vorläufer nach der Bildung des Reaktionsprodukts verstanden, wodurch eine in richtiger
Weise umgesetzte Verbindung hinterbleibt, die von Stoffen frei ist, die die grundlegende
Molekül struktur des nichtumgesetzten Vorläufers aufweisen. Das Ausputzen ist für
die Erzielung der schließlichen Abtrennung und Gewinnung eines reinen Zielpeptids
unerläßlich.
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Insbesondere bei der Synthese von Polypeptiden, die durch Acylierung
einer endständigen Aminogruppe an dem Vorläufer unter Verwendung von NalPha-blockierten
freien Carboxylbruchstücken oder durch Acylierung einer freien ,,alpha -Aminogruppe
eines Bruchstücks mit geschützter C-terminaler Carboxylgruppe durch eine freie Carboxylgruppe
des Vorläufers aufgebaut werden, kann das Ausputzen durch enzymatische Hydrolyse
derjenigen Vorläuferketten bewirkt werden, die keine Verlängerung erfahren haben,
wodurch sie nachteilig sind. Die nichtumgesetzten Ketten enthalten selbstverständlich
noch eine freie Aminogruppe im Fall des Wachstums vom N-terminalen Ende oder eine
Carboxylgruppe im C-terminalen Fall und können somit durch Verwendung eines entsprechenden
Enzyms enzymatisch angegriffen werden. Diejenigen Ketten andererseits, die die beabsichtigte
Verlängerung erfahren haben, enthalten geschützte endständige reaktive Gruppen (Amino-
oder Carboxylgruppen) und erleiden keine Hydrolyse.
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Eine bevorzugte Methode des enzymatischen Ausputzens besteht im Durchleiten
einer Reaktionslösung durch eine Säule, die einen wasserunlöslichen Träger enthält,
auf dessen Oberfläche ein Enzym immobilisiert ist, das Substanzen von ihrem N-Ende
oder ihrem C-Ende selektiv hydrolysiert. Für die Hydrolyse an dem N-Ende eignet
sich eine Aminopeptidase, wie Aminopeptidase M oder Leucinaminopeptidase (Royer
und Andrews, 1973, J. Biol. Chem, 248, 1807). Die Hydrolyse wird bei einer Temperatur
zwischen 0 und 50 OC und bei einem pH-Wert von.6,5 bis 7,5 durchgeführt. Für die
Hydrolyse am C-Ende wird eine Carboxypeptidase, wie Carboxypeptidase A, B, C oder
Y verwendet. Von diesen Y- und C-Enzymen konnte gezeigt werden, daß sie bei einem
pH-Wert von 4 bis 6 eine nicht-spezifische C-Enden-Exopeptidaseaktivität haben (Hayashi
et al., J Biol.
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Chem., Bd. 248, S 2296 (1973) und Kuhn et al., Biochemistry, Bd. 13,
S. 3871 (1974)). Es wird eine Temperatur von 0 bis 60 OC angewandt. Alle diese Enzyme
sind für L-Aminosäurereste spezifisch, und, wie noch erläutert wird, liegen nichtumgesetzte
Vorläufer nur in Form der L-Isomeren vor.
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Bei einer anderseitigen Methode des Ausputzens wird der nichtumgesetzte
Vorläufer aus der Reaktionslösung durch Abfangen entfernt, zum Beispiel durch Bindung
an einen wasserunlöslichen Träger, von dem dann die Lösung abgetrennt wird. Im Fall
eines Vorläufers mit einem freien Aminoende besteht eine Art, in der dies bewirkt
werden kann, darin, auf einem Träger ein elektrophiles Reagens zu immobilisieren,
das für die freie endständige Aminogruppe des nichtumgesetzten Vorläufers eine spezifische
kovalente Reaktivität aufweist, und dann die Reaktionslösung mit dem Träger in innige
Berührung zu bringen, um so den nichtumgesetzten Vorläufer daran zu binden.
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Ein- geeignetes elektrophiles Reagens ist das durch Umsetzung eines
Thiolderivats mit Mercaptobernsteinsäureanhydrid gebildete gemischte Disulfid. Für
eine C-terminale Reinigung kann ein Träger mit freien primären Aminogruppen in Verbindung
mit einem wasserlöslichen Carbodiimid verwendet werden.
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Nach dem Ausputzen des nichtumgesetzten Vorläufers werden die richtig
verlängerten Ketten von dem Überschuß an nichtumgesetzter Aminosäure abgetrennt
und gewonnen. Vorzugsweise wird diese Trennung bewirkt, während der verlängerte
Komplex reversibel an einen unlöslichen Träger geknüpft ist. Für die vorliegenden
Zwecke ist eine reversible Verknüpfung als Bindung zwischen zwei Substanzen über
eine nichtkovalente und nichtionische Anlagerung anzusehen, die in einem wäßrigen
Medium eine spezifische Affinität füreinander zeigen, die ohne chemische Reaktion
aufgehoben werden kann. Eine reversible Verknüpfung ermöglicht somit eine Bindung
an den und eine Ablösung von dem Träger ohne Anwendung rauher Bedingungen, die die
umgewandelte Verbindung nachteilig beeinflussen könnten.
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Zur Erzielung einer-reversiblen Verknüpfung mit dem Träger kann der
Vorläufer Teil eines größeren wasserlöslichen Komplexes sein, der eine Polyonukleotidverknüpfungshandhabe
enthält, die über sein nicht verlängerbares Ende an den Vorläufer gebunden ist.
Der unlösliche Träger befindet sich zweckmäßigerweise in einer Säule, und an seiner
Oberfläche ist kovalent ein Polynukleotidadsorbens gebunden, das eine spezifische
Affinität für die komplex an den umgesetzten Vorläufer gebundene Polynukleotidverknüpfungshandhabe
aufweist. Während die den Komplex enthaltende Lösung durch die Säule geleitet wird,
wird der verlängerte Vorläufer reversibel durch Affinitätswechselwirkungen zwischen
der Verknüpfungshandhabe und dem Adsorbens an den unlöslichen Träger gebunden. Dadurch
wird eine Abtrennung der verlängerten Ketten in Komplexform von chemisch nichtverwandten
Substanzen, zum Beispiel der nichtumgesetzten Aminosäure, die die kovalent gebundene
Verknüpfungshandhabe nicht enthält, bewirkt. Die Verknüpfung kann durch Wärme, die
Ausbildung einer Konkurrenzanlagerung oder eine Änderung des pH-Werts in einfacher
Weise aufgehoben werden.
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Zur Erzielung einer reversiblen Verknüpfung soll das als Verknüpfungshandhabe
gewählte Polynukleotid eine Base aufweisen, die bezüglich der räumlichen Anordnung
und der affinitiven
Wechselwirkung der Base des Polyonukleotidadsorbens
komplementär ist. Beispiele für in Betracht kommende komplementäre Basenpaare sind
Adenin und Uracil oder Thymin sowie Cytosin und Guanin.
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Wie ersichtlich können Polynukleotide des "Copolymeren"-Typs gleichfalls
verwendet werden, insbesondere wenn sie der "Block"-Form angehören, die in abwechselnder
Reihenfolge sich wiederholende Bruchstücke von komplementären Basenpaaren enthalten.
In diesem Fall kann das gleiche Polynukleotid selbstverständlich sowohl als die
Verknüpfungshandhabe als auch als das Adsorbens verwendet werden.
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Bei Durchführung der Verlängerungsreaktion unter Verwendung eines
Vorläufers, der ein Polyethylenglykol, Vinylpolymerisat oder Polyamid als Verknüpfungshandhabe
enthält, wird die Abtrennung des nichtumgesetzten zugesetzten Amlnosäurebruchstücks
nach üblichen Methoden bewirkt.
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Ein weiteres bevorzugtes Merkmal der Erfindung ist ein Verfahren zum
enzymatischen Entblockieren des verlängerten Komplexes vor dessen Verwendung als
weiterer Vorläufer in nachfolgenden Stufen. Es ist selbstverständlich erforderlich,
daß die Schutz gruppe an dem verlängerten Komplex durch enzymatische Einwirkung
abbaubar ist.
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Bei der Ausführungsform der Erfindung, wobei die Kettenverlängerung
am C-terminalen Ende einer wachsenden Kette durch Umsetzung mit einem Aminosäurebruchstück
der Formel II bewirkt wird, ist die Schutzgruppe am Säureteil vorzugsweise eine
kurzkettige Alkylgruppe oder eine Benzylgruppe, die über eine Esterbindung mit der
Säure verknüpft ist. Ein Grund hierfür ist der, daß die Schutzgruppenentfernung
nach der Umsetzung mit dem Vorläufer enzymatisch unter Verwendung einer Esterase
bewirkt werden kann, wodurch die Estergruppe abhydrolysiert wird und die freie C-terminale
Carboxylgruppe zur nachfolgenden Verlängerung der Kette zur Verfügung steht. Für
diesen Zweck eignet sich eine Carboxypeptidase, zum Beispiel Carboxypeptidase Y,
sofern
der pH-Wert im Bereich von 8 bis 9, vorzugsweise bei 8,5, gehalten wird. Bei einem
pH-Wert von 8,5 zeigt dieses Enzym optimale Esteraseaktivität unter Ausschluß einer
Peptidaseaktivität, wohingegen es, wie bereits erwähnt, bei einem niedrigeren pH
ausschließlich eine Exopeptidase ist. Die Hydrolyse wird bei einer Temperatur von
0 bis 60 °C durchgeführt.
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Ein weiterer erheblicher Vorteil, der mit der Verwendung dieses Enzyms
zur Schutzgruppenentfernung verbunden ist, besteht darin, daß damit nur eine Hydrolyse
der Ester von L-Aminosäuren bewirkt wird. Ketten, die blockierte Ester von D-Aminosäuren
enthalten, werden somit von dem Enzym nicht hydrolysiert und stehen für das weitere
Wachstum nicht zur Verfügung. Infolgedessen kann ein hohes Maß an optischer Reinheit
in Bezug auf das Zielpeptid erreicht werden.
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Wenn das Wachstum von dem N-terminalen Ende beginnen soll, dann stellt
die L-Pyrrolidoncarboxylgruppe ein brauchbares Mittel für den Schutz der alpha-Aminogruppe
der zugesetzten Säure dar. Der diese Schutzgruppe enthaltende verlängerte Komplex
wird dann einem Enzym, wie L-Pyrrolidoncarboxylpeptidase ausgesetzt, die bei einer
Temperatur zwischen 0 und 60 OC und einem pH-Wert von 7 bis 8 die erforderliche
Spezifizität aufweist.
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Dieses Enzym ist nur zur Schutzgruppenentfernung von Derivaten von
L-Aminosäuren wirksam. Deshalb bleiben Ketten mit D-isomerem Ende blockiert und
stehen für das weitere Wachstum nicht mehr zur Verfügung.
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In jedem der beiden Fälle soll zwischen der Schutzgruppe an den Ketten
und dem Enzym eine innige Berührung erreicht werden, damit eine praktisch vollständige
Entblockierung der L-terminierten Ketten erzielt wird. Deshalb wird es bevorzugt,
daß die Berührung bewirkt wird, während sich der verlängerte Vorläufer in Lösung
in einem wäßrigen Medium befindet. Zur leichten Abtrennung der entblockierten Verbindung
von dem Enzym und zur möglichst weitgehenden Ausschaltung von Enzymverlusten ist
das Enzym außerdem vorzugsweise auf einem wasserunlöslichen
Träger
immobilisiert. Deshalb besteht eine bevorzugte Arbeitsweise zur Schutzgruppenentfernung
darin, die wäßrige Lösung des blockierten verlängerten Komplexes durch eine Säule
zu leiten, die einen unlöslichen Träger enthält, auf dem das Enzym immobilisiert
ist. Wie in Bezug auf die C-terminale Synthese offensichtlich, kann eine Säule,
die auf einem wasserunlöslichen Träger immobilisierte Carboxypeptidase Y enthält,
sowohl für das Ausputzen von nichtumgesetztem Vorläufer als auch zum Entblockieren
der terminalen Carboxylgruppe des blockierten elongierten Komplexes lediglich durch
Einstellung des pH-Werts zur Erzielung der angestrebten Exopeptidase- oder Esteraseaktivität
verwendet werden.
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Im folgenden wird die kombinierte Anwendung der obigen Merkmale in
einer bevorzugten mehrstufigen Polypeptidsynthese beschrieben. Die Anfangsstufe
ist die Umsetzung eines ersten Aminosäurederivats mit einer Verknüpfungshandhabe
unter Bildung eines wasserlöslichen kovalenten Komplexes, der den ersten Aminosäurerest
der beabsichtigten Sequenz enthält. Die zugesetzte Säure enthält eine enzymatisch
entfernbare N P -Amino-oder C-Carboxyschutzgruppe, je nach gewähltem Weg. Nichtumgesetztes
Aminosäurederivat wird aus der den Anfangskomplex enthaltenden Reaktionslösung durch
Durchleitung derselben durch eine Säule entfernt, die einen wasserunlöslichen Träger
enthält, auf dessen Oberfläche ein Adsorbens immobilisiert ist, das mit der Verknüpfungshandhabe
in affinitive Wechselwirkung zu treten vermag. Sind sowohl die Verknüpfungshandhabe
als auch das Adsorbens Polynukleotide, wird die Lösung vorzugsweise bei etwa 4 OC
gehalten. Der Träger wird dann mehrere Male bei dieser Temperatur mit Phosphatpuffer
von pH 7,5 gewaschen. Danach wird der Komplex von dem Träger als wäßrige Lösung
eluiert, die von dem zugesetzten Säurederivat frei ist, indem einfach bei erhöhter
Temperatur, vorzugsweise bei 40 bis 60 OC Puffer durch die Säule geleitet wird.
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Die so erhaltene Lösung wird dann durch eine andere Säule geleitet,
um die Schutzgruppe an dem terminalen Säurebruchstück des Komplexes zu entfernen.
Diese Säule enthält deshalb einen unlöslichen Träger, auf dessen Oberfläche ein
Enzym mit Spezifizität für die Schutzgruppe immobilisiert ist. Anschließend wird
die Lösung wieder in ein sauberes Reaktionsgefäß eingebracht, und, da nun die Schutzgruppe
fehlt, kann Kettenverlängerung mit der zweiten Aminosäure der beabsichtigten Sequenz
bewirkt werden. Wie im Fall der ersten Säure ist auch die zweite Säure entsprechend
Alpha oder C-geschützt.
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Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wird dann wiederholt, um
nacheinander die gewünschten Säuren an den die wachsende Polypeptidkette enthaltenden
Komplex anzureihen, bis ein kurzes Polypeptid, zum Beispiel ein Hexapeptid, erhalten
wird. Es sei darauf hingewiesen, daß bis zu diesem Punkt ein Ausputzen der Ketten,
die mit zugesetzter Säure nicht reagiert haben, nicht vorgenommen worden ist. Wie
noch ersichtlich wird, ist mit der Aufnahme dieser Stufe in die frühen Stufen der
Synthese kein besonderer Vorteil verbunden, wenn sie auch ohne nachteilige Folgen,
wenn dies erwünscht ist, angewandt werden kann.
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Die nach der Abtrennung der nichtumgesetzten Säure von dem kurzkettigen
Peptid erhaltene Lösung wird nun zur Ablösung der verlängerten Ketten von der Verknüpfungshandhabe
enzymatisch behandelt. Die Lösung wird über den Träger zurückgeleitet, der das immobilisierte
Adsorbens enthält, um die abgetrennte Verknüpfungshandhabe zu entfernen, und das
an der terminalen Amino-- oder Carboxylgruppe geschützte kurzkettige Zielpeptid
wird dann aus der Lösung gewonnen. Da das Auftreten von Sequenzfehlern in einer
der vorigen Stufen zum Vorliegen von Ketten mit weniger als zum Beispiel 6 Aminosäureresten
führt, läßt sich die Abtrennung und Isolierung des angestrebten kurzkettigen Peptids
in herkömmlicher Weise,
zum Beispiel durch Ionenaustausch oder
Gelfiltrationschromatographie, leicht erreichen.
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Bei der Herstellung von langkettigen Polypeptiden nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren bedient man sich eines kurzkettigen Polypeptids als Vorläufer. Der kurzkettige
Polypeptidvorläufer kann, wie oben beschrieben, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
oder nach anderen Synthesemethoden hergestellt werden. Außerdem können natürlich
vorkommende kurzkettige Polypeptide als Vorläufer verwendet werden. In jedem Fall
wird das reine kurzkettige Polypeptid an die biospezifische Verknüpfungshandhabe
geknüpft, und nach enzymatischer Entblockierung wird der kurzkettige Peptidkomplex
als Vorläufer zur Kettenverlängerung mit dem nächsten Aminosäurederivat verwendet.
Bei diesem Punkt wird vorzugsweise mit dem oben beschriebenen Ausputzen von nichtumgesetzen
Ketten begonnen. Zu diesem Zweck wird die Reaktionslösung, die den Komplex des verlängerten
Polypeptids, nichtumgesetzte überschüssige blockierte Säure und nichtumgesetzten
Komplex des kurzkettigen Polypeptidvorläufers enthält, durch eine andere Säule geleitet,
die einen unlöslichen Träger mit einer auf seiner Oberfläche immobilisierten Exopeptidase
enthält, die für alpha-Aminogruppen oder terminale Carboxylgruppen spezifisch ist.
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Beim Durchgang durch diese Säule werden die nichtumgesetzten Vorläuferketten,
die eine ungeschützte terminale Amino- oder Carboxylgruppe enthalten, enzymatisch
abgebaut und damit aus der angestrebten Kettenpopulation ausgeputzt. Danach wird
diese Stufe in die oben beschriebene sich wiederholende Sequenzaufbauarbeitsweise
eingebaut, wobei die Kette mit weiteren Aminosäurederivaten verlängert wird.
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Nach dem Aufbau des angestrebten Zielpolypeptids werden schließlich
die Polypeptidketten von der biospezifischen Verknüpfungshandhabe abgelöst, und
das Zielpeptid wird abgetrennt und
gereinigt. Infolge der Anwendung
der enzymatischen Abbaustufe bei jeder Sequenz nach der Herstellung des kurzkettigen
Polypeptidvorläufers enthält die schließlich erhaltene Reaktionslösung, wie ohne
weiteres verständlich, nur sehr wenige, vorzugsweise praktisch keine, Polypeptidketten,
die sich von dem Zielpeptid durch eine geringere Anzahl von Aminosäureresten als
in dem Vorläufer unterscheiden. Deshalb können herkömmliche Maßnahmen zur Abtrennung
angewandt werden.
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Außerdem ist ohne weiteres erkennbar, daß die vorstehend ganz allgemein
beschriebene reiterative Arbeitsweise oder sich wiederholende Stufenfolge sowohl
für die am C-Ende als auch für die am N-Ende beginnende Peptidsynthese brauchbar
ist. Die hauptsächlichen Unterschiede zwischen den beiden Wegen bestehen in der
Art, in welcher die wachsende Kette an die Verknüpfungshandhabe gebunden ist, und
in der Wahl der Schutzgruppen und der Enzyme. Außerdem kann ein Unterschied in der
Art und Weise bestehen, in der die Aktivierung für die Kettenverlängerung bewirkt
wird, beispielsweise der Verwendung von aktiven Estern für N-terminales Wachstum
gegenüber einer mit Carbodiimid bewirkten Verknüpfung. Letztere, die sowohl in Verbindung
mit C- als auch mit N-terminalem Wachstum brauchbar ist, ist bevorzugt. Am stärksten
bevorzugt ist der C-terminale Weg zur Kettenverlängerung.
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Aufgrund der vorstehenden Erörterung ist zu erkennen, daß die mit
einem Sequenzfehler in jeder beliebigen Stufe auftretenden Schwierigkeiten praktisch
vermieden werden können, solange (1) in einer Zwischenstufe des Verfahrens ein reiner
umwandelbarer Vorläufer für die Reaktion verwendet und (2) in allen späteren Stufen
ein Abbau von nichtumgesetztem Vorläufer bewirkt wird. Die Lage des Punktes, bei
welchem die Verwendung eines reinen Polypeptidvorläufers erforderlich ist, hängt
von dem Molekulargewicht des herzustellenden Polypeptids ab. Das Molekulargewicht
des reinen Polypeptidvorläufers kann als die untere Grenze der Molekulargewichtsdifferenz
angesehen
werden, die in der schließlich erhaltenen Polymerlösung
zwischen dem angestrebten Polypeptid und den verunreinigenden Polymerketten vorliegt.
Die Mindestdifferenz zwischen dem Gewicht der reinen und unreinen Ketten wird deshalb
mit zunehmendem Molekulargewicht des Polypeptids für jeden gegebenen reinen Polypeptidvorläufer
kleiner, und die Schwierigkeit der schließlichen Reinigung nimmt zu.
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Während ein reiner Hexapeptidvorläufer für die Herstellung eines Polypeptids
mit 20 bis 35 Aminosäureresten genügen kann, ist somit ohne weiteres ersichtlich,
daß für die Herstellung von reinen Polymeren mit höherem Molekulargewicht von entsprechend
größeren reinen Polypeptidvorläufern ausgegangen werden soll.
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Die erläuterte Arbeitsweise selbst kann somit zur Herstellung von
reinen Vorläufern von hohem Molekulargewicht angewandt werden, die dann für die
Herstellung von Verbindungen mit noch höherem Molekulargewicht verwendet werden.
Beispielsweise kann ein wie oben beschrieben hergestelltes Polypeptid mit 35 Säureresten
als der reine Vorläufer für die Herstellung eines Polymeren mit bis zu 100 Aminosäureresten
verwendet werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei der Synthese von Peptiden
wie Glucagon, Enkephalin, ACTH, Calcitonin, Vasopresin, Pentagastrin und Endorphin
angewandt werden.
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Wie bereits erwähnt, müssen andere reaktionsfähige Gruppen als die
alpha-Amino- oder Carboxylgruppe bei manchen Aminosäuren während der Kettenverlängerung
blockiert oder geschützt sein. Wie allgemein bekannt, handelt es sich dabei um die
epsilon-Aminogruppe von Lysin, die Imidazolgruppe von Histidin, die phenolische
Hydroxylgruppe von Tyrosin, die Carboxylgruppen von Glutamin- und Asparaginsäure,
die Thiolgruppe von Cystein und die Guanidiniumgruppe von Arginin. Die Entfernung
dieser Schutzgruppen ist in der Regel die Endstufe der ganzen Synthese. In der folgenden
Tabelle sind Beispiele für allgemein bekannte Schutzgruppen zusammengestellt, vergleiche
auch Solid Phase Peptide Synthesis, Stewart und Young, Freeman and Co., 1969, S.
13 bis 23, mit Bezug auf Schutzgruppen und die Bedingungen, unter welchen sie entfernt
werden können.
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Tabelle Säure -Schutzgruppe Entfernung Lysin Acetamido oder Trifluor-
pH 9, 1,2m Hydrazin acetyl oder 1m Piperidin bei OOC Histidin Ethoxyformyl pH 9,
1,2 m Hydrazin Tyrosin Acetyl pH 9, 1m Hydrazin Cystein Acetamidomethyl (Veber Mercuriacetat
und et al., 1972, J. Am . dann H2S (als letztes Chem. Soc., Bd. 94, zu entfernen)
s. 5456) Arginin Nitro katalytische Hydrogenolyse
Ein besonderes
Merkmal der Erfindung liegt darin, daß nur ein bestimmter Mindestschutz der Seitengruppen
erforderlich ist.
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Diese Tatsache ist in Verbindung mit der Verwendung einer biospezifischen
Verknüpfungshandhabe von hohem Molekulargewicht von Vorteil bei der Erzielung der
Wasserlöslichkeit des wachsenden Polypeptids.
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So braucht bei der Verwendung der oben beschriebenen aktiven Ester
von Aminosäuren zur Kettenverlängerung (N-terminales Wachstum) nur die epsilon-Aminogruppe
von Lysin und die Thiolgruppe von Cystein geschützt werden. Dies führt zu Vorteilen
in Verbindung mit der anfänglichen Aminosäureherstellung sowie zur Vermeidung der
Notwendigkeit der schließlichen Schutzgruppenentfernung und der möglichen nachteiligen
Wirkungen auf das hergestellte Polypeptid. Für ein C-terminales Wachstum müssen
die Carboxylatseitengruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure geschützt werden.
Auch im Hinblick auf die oben beschriebene Arbeitsweise für die Abtrennung des Peptids
von der Verknüpfungshandhabe müssen bei beiden Wegen die epsilon-Aminogruppe von
Lysin und die Guanidiniumgruppe von Arginin geschützt werden, wenn eine dieser Seitenketten
in Verknüpfungshandhabe und Zielpeptid zugegen ist.
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Wie bereits erwähnt, wird ein wasserunlöslicher Träger für das immobilisierte
Adsorbens und Enzym verwendet. Hierfür kommt eine große Vielfalt von bekannten organischen
oder anorganischen wasserunlöslichen Stoffen in Betracht, solange sie die wachsende
Polymerkette oder Komplexe davon nicht nachteilig beeinflussen; der Träger ist vorzugsweise
starr und dimensionsstabil beim Wechsel der Lösung, so daß er unterschiedliche Reaktionsbedingungen
zu tolerieren vermag. Poröse Glaskugeln sind eine besonders bevorzugte Klasse von
starren Trägern. Wie noch weiter erläutert, können diese Kugeln in geeigneter Weise
in Derivate übergeführt und aktiviert werden,
damit sie Immobilisierung
von Enzymen und Adsorbentien dafür bewirken. Bei der Anmelderin sind solche von
Corning Works hergestellte Kugeln oder Körner handelsmäßig erhältlich.
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Ein besonders gut geeigneter Träger sind "Glycophase" G poröse Glaskörner.
Diese Körner sind das 2,3-Dihydroxypropyloxypropyltrimethoxysilanderivat von porösem
Glas.
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Ferner sei darauf hingewiesen, daß die hierin erwähnten wäßrigen Lösungen
organische Lösungsmittel oder andere Bestandteile enthalten können, die sich bei
der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht nachteilig auswirken. Die
Verwendung von organischen Lösungsmitteln, zum Beispiel von Dimethylformamid oder
Methanol, wird sogar mit Bezug auf die Herstellung von Polypeptiden mit hohem Molekulargewicht
als zur Sicherung der Löslichkeit günstig angesehen. Ihre Art und Menge sind jedoch
so zu wählen, daß sie die reversible Verknüpfung bei der Abtrennstufe nicht stören.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
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Beispiel 1 A. Herstellung von immobilisierten Enzymen Es werden fünf
Säulen vorbereitet, von denen jede ein bestimmtes an 10 g Glycophase G porösen Glaskörnern
(74 bis 126 Mikron, Porendurchmesser etwa 550 A) der Pierce Chemical Company, oder
im Fall von Carboxypeptidase Y an CL-Sepharose von Pharmacia immobilisiertes Enzym
enthält. Je nach dem verwendetem Enzym wird das Glas durch eine von drei Maßnahmen
zur Förderung der Enzymanlagerung aktiviert. Bei der Maßnahme (a) werden 10 g der
Körner in einem Wasser enthaltenden Becher mit 10 g Cyanbromid versetzt, wobei die
Temperatur der Lösung bei 20 OC und ihr pH-Wert durch ständige Zugabe von kaltem
6n Natriumhydroxid konstant bei 11 gehalten wird. Wenn die Aufnahme von Natriumhydroxid
beendet ist, was sich durch eine pH-Wertänderung zu erkennen gibt und etwa 15 Minuten
benötigt, ist die Aktivierung als vollständig anzusehen. Zu diesem Zeitpunkt werden
die Körner von der Lösung abfiltriert und mit einer 0,1m Natriumbicarbonatlösung
mit einem pH-Wert von 9,5 gewaschen. Bei der Maßnahme (b) werden 10 g der Körner
mit 0,5 g p-Nitrobenzylbromid in 50 ml Dioxan 24 Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt,
woran sich ein Erwärmen in einer 10-prozentigen wäßrigen Lösung von Dithionit auf
100 OC anschließt. Die arylaminierten "Glycophase" G-Körner werden mit destilliertem
Wasser gewaschen und durch Diazotieren in 30 ml 0,5 n HCl bei 0 OC mit überschüssigem
NaN02 aktiviert, worauf die aktivierten Körner mit 3 1 3-prozentiger Sulfaminsäure
und 20 1 destilliertem Wasser gewaschen werden. Bei der Maßnahme (c) wird eine Umsetzung
mit NaJ04, Royer et al., loc.
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cit. durchgeführt. Die Säulen und die Maßnahmen zur Enzymanlagerung
(200 mg Enzym) sind in der folgenden Aufstellung wiedergegeben.
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Aktivierungs-Säule Enzym maßnahme 1 L-Pyrrolidoncarboxylpeptidase
(a) 6 Stunden bei pH 8, 4°C, in 0,1 m 2-Pyrrolidon (wäßrig) enthaltend Bicarbonatpuffer
2 Aminopeptidase M (b) bei pH 7,6 in Tris enthaltend MnCl (1 mMol), Royer et al.,
J. Bio.
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Chem., 248 (5), 1807 (1973).
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3 Carboxypeptidase Y Überführung von Sepharose in Hexamethylendiaminderivat
durch reduktive Alkylierung anschließend Enzymverknüpfung mit wasserlöslichem Carbodiimid
bei pH 4,75, 12 Stunden, 0 - 4 °C 4 Trypsin (c) Reduktive Alkylierung 5 Carboxypeptidase
B (c) Reduktive Alkylierung
B. Herstellung von immobilisiertem
Polynukleotidadsorbens Das Arylaminderivat von "Glycophase" G porösen Glaskörnern
wird durch die Maßnahme (b) aktiviert. Die Körner werden bei O oC 3 Stunden mit
100 mg im Handel erhältlicher Polyadenylsäure (Poly A) (Molekulargewicht über 1000)
in Puffer bei einem pH-Wert von 8 umgesetzt. Nach dem Waschen enthalten die Körner
etwa 1 Gewichtsprozent der Säure.
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Beispiel 2 (N-terminaler Weg) A. Herstellung von aktiven Estern von
boxyl-L-aminosäuren Proben der folgenen L-pyr.rol idoncarboxylblockierten Aminosäuren
werden nach der Methode von Kurath und Thomas loc. cit. in praktisch reiner Form
erhalten: L-Alanin, L-Arginin, Glycin, L-Leucin, S-ACM-L-Cystein, L-Serin, L-Phenylalanin,
L-Tyrosin, -TFA-L-Lysin, L-Valin.
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0,1 Mol einer im Handel erhältlichen geschützten Pyrrolidoncarbonsäure
(Z-PC-OH) und 0,11 Mol N-Hydroxysuccinimid (NHS) werden in 100 ml 1,2-Dimethoxyethan
auf 0 "C abgekühlt. Nach Zugabe von 0,11 Mol Dicyclohexylcarbodiimid wird das Reaktionsgemisch
2 Stunden bei 0 bis 40 OC und dann über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der
Dicyclohexylharnstoff wird
abfiltriert und mit 1,2-Dimethoxyethan
gewaschen. Die Filtrate werden im Vakuum bei 40 "C eingeengt. Der N-geschützte Pyrrolidoncarboxyl-N-hydroxysuccinimid
(Z-PC-NHS) -ester wird aus 2-Propanol umkristallisiert. Dann werden 6,0 mMol Z-PC-NHS
in 20 ml Dioxan gelöst. 10 ml einer Lösung, die NaC03.H20 (7,6 mMol) und die gewünschte
Aminosäure (7,6 mMol) enthält, wird zugegeben und es wird 4 Stunden bei Zimmertemperatur
gerührt. Das Volumen wird auf 4 ml vermindert. Nach Neutralisieren mit 1 n HCl bildet
sich ein Niederschlag, der zweimal mit je 2 ml Wasser gewaschen wird. Die Substanz
(Z-PC-Säure) wird aus 2-Propanol umkristallisiert. Etwa 1 g Z-PC-Säure, 1 g Palladiumschwarz
und 200 ml 50-prozentiges wäßriges Methanol werden in einen Dreihalskolben gegeben,
und gasförmiger Wasserstoff wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden durch die Suspension
geleitet. Nach der Entfernung von Methanol und Wasser wird die L-pyrrolidoncarboxylblockierte
Aminosäure aus Methanol/Ether umkristallisiert.
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Der aktive N-Hydroxysuccinimidester der so erhaltenen geschützten
Aminosäure wird durch Zugabe von je einem Äquivalent der geschützten Säure zu einzelnen
Reaktionsgefäßen hergestellt, die Ethylacetat, ein Äquivalent N-Hydroxysuccinimid
und 1,1 Äquivalente Dicyclohexylcarbodiimid enthalten. Die Veresterung der freien
Carboxylgruppe erfolgt durch 4-stündiges Rühren bei Zimmertemperatur. Die Reaktionslösungen
werden dann zur Entfernung von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff filtriert, und
die aktiven Ester werden durch Umkristallisieren aus Ethylacetat/Petrolether gereinigt.
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B. Herstellung des Komplexes aus Polynukelotid und erster Säure 10
mg Polyuridylsäure (Poly U) werden 18 Stunden mit 0,01 m NaJ04 oxidiert. Das erhaltene
aldehydhaltige Produkt wird nach der Methode von Royer, et al., Biochem. Biophys.-Research
Commun., Bd. 64, S. 478 (1975) mit Hexamethylendiamin reduktiv alkyliert. Die Lösung
von 4 OC wird durch die nach Beispiel 1B
hergestellte Säule geleitet,
die immobilisiertes Poly A enthält und das Diaminderivat von Poly U selektiv adsorbiert.
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Nach Waschen der Säule und Erhöhen ihrer Temperatur auf 55 "C wird
das Diaminderivat von Poly U mit Phosphatpuffer (pH 7,5) daraus eluiert. PC-L-arg-OH
wird dann an das Diamin der Poly U unter Verwendung von wasserlöslichen 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid
bei pH 4,75 gebunden, worauf die PC-Schutzgruppe durch Durchleiten der Lösung durch'Säule
1, deren Herstellung in Beipsiel 1A beschrieben wurde, entfernt wird. Anschließend
wird zu der Lösung ein großer Überschuß des wie in Beispiel 2A beschrieben hergestellten
aktivierten Esters der Valinsäuue gegeben, und die Lösung wird 2 Stunden gerührt.
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C. Die Arbeitsweise 200 ml der nach 2B erhaltenen Lösung, die den
Valyl-Handhabe-Komplex enthält und eine Temperatur von 4 OC hat, wird unter Saugen
mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute durch die nach Beispiel iB hergestellte
Säule geleitet, die die Körner mit immobilisierter Polyadenylsäure enthält. Die
Säule wird dann bei 4 OC und einer Geschwindigkeit von 15 ml/Minute mit Anteilen
von 1 1 Wasser zur Entfernung von nichtumgesetzter Säure gewaschen. Danach wird
die Temperatur der Säule auf 55 OC erhöht, und ein Anteil von 200 ml Phosphatpuffer
(pH 7,5) von der gleichen Temperatur wird mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute
zum Eluieren des Polynucleotid-Valin-Komplexes geleitet.
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Die komplexenthaltende Lösung von pH7,5 und 25 OC wird dann bei einer
Geschwindigkeit von 5 ml/Minute durch die gefüllte Säule 1 geleitet, die die immobilisierte
Pyrrolidoncarboxylpeptidase enthält, um die Pyrrolidoncarboxylschutzgruppe zu entfernen,
wodurch 200 ml Lösung erhalten werden, die den Komplex aus Verknüpfungshandhabe
und Valin mit einer freien alpha-Aminogruppe enthält.
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Diese Lösung wird dann wieder in ein sauberes Reaktionsgefäß gegeben,
und die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wird unter aufeinanderfolgender Zugabe
von Proben wiederholt, die das aktivierte und geschützte Lysin, Phenylalanin, Cystein,
Glycin bzw. Alanin enthalten.
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Die so hergestellte Hexapeptidlösung, die von nichtumgesetztem Alaninderivat
frei ist, wird vor der Entfernung der Schutzgruppe durch die Säule 4 geleitet, die
immobilisiertes Trypsin enthält, um die Ketten von der Verknüpfungshandhabe abzulösen.
Die Abtrennung des reinen geschützten Hexapeptids wird dann durch Durchleiten der
Lösung durch die Säule, die immobilisierte Polyadenylsäure enthält, zur Entfernung
der Verknüpfungshandhabe bewirkt, woran sich eine Gelfiltrationschromatographie
anschließt.
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Anschließend wird die Carboxylgruppe des Hexapeptids durch Veresterung
reaktiviert und, wie in Beispiel 2A und 2B beschrieben, wieder komplex an die Verknüpfungshandhabe
gebunden, entblockiert (Säule 1) und mit der wie in 2A beschrieben hergestellten
Probe von Arginin umgesetzt Die erhaltene Lösung wird in einer Geschwindigkeit von
5 ml/Minute bei 35 OC durch die immobilisierte Aminopeptidase M enthaltende Säule
(Säule 2) geleitet, um etwa vorhandene Peptidketten, die sich mit Arginin nicht
umgesetzt haben, abzubauen. Diese Stufe wird auch in die Arbeitsweise eingebaut,
die zur Anfügung von Leucin, Tyrosin und Serin angewandt wird.
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Nach der Anknüpfung des Serins an die wachsende Kette und der Abtrennung
des Komplexes aus der Reaktionsmischung wird die den Komplex enthaltende Lösung
zur Entfernung der Verknüpfungshandhabe durch Säule 4 geleitet und zur Entfernung
der Trifluoracetylschutzgruppe an dem Lysinrest 1 Stunde mit 1 m Piperin von 0 OC
behandelt. Die erhaltene Lösung wird dann mit 5 ml/
Minute durch
die gepackte Säule aus immobilisierter Pyrrolidoncarboxylpeptidase (Säule 1) geleitet,
um die terminale Pyrrolidoncarboxylgruppe an dem Serinrest zu entfernen, worauf
die Lösung bei pH 4 mit Mercuriacetat 1 Stunde bei 25 OC gerührt wird, um die Acetamidomethylchutzgruppe
an dem Cysteinrest zu entfernen. Die Thioverbindung wird durch Einleiten von H2S
in die Lösung erhalten. Schließlich wird das so hergestellte reine Decapeptid, wie
oben beschrieben, von dem zurückbleibenden Poly U und anderen Bestandteilen abgetrennt.
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Beispiel 3 Es wird eine weitere Säule aus gepackten porösen Glaskörnern
hergestellt. Es werden "Glycophase" G-Körner verwendet und zunächst bei 40 OC in
Dimethylformamid mit 10 Gewichtsprozent Tosylchlorid, bezogen auf die Körner, und
bezogen auf das Chlorid und einem Äquivalent Triethylamin umgesetzt. Danach werden
die Glaskörner abfiltriert und gewaschen und zur Verdrängung von Tosyl auf den Körneroberflächen
mit überschüssiger Thioessigsäure umgesetzt. Nach Abtrennen von dem Reaktionsmedium
werden die Körner in ein Wasser enthaltendes Gefäß gegeben, um die Säure unter Bildung
des Thiolderivats zu hydrolysieren. Danach werden die Körner in Wasser von 25 OC
mit Mercaptobernsteinsäureanhydrid umgesetzt, wodurch Körner erhalten werden, die
das gemische Disulfid an ihrer Oberfläche immobilisiert tragen.
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Das gemischte Disulfid ist ein elektrophiles Reagens, das für terminale
primäre Aminogruppen eine spezifische kovalente Reaktivität aufweist.
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Die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wird wiederum wiederholt
mit der Ausnahme, daß die das immobilisierte Disulfid enthaltende Säule an die Stelle
der Säule 2 tritt, die die immobilisierte Aminopeptidase M enthält. Das Durchleiten
durch diese Säule dient anstatt zum Abbau von nichtumgesetzten Ketten zum Abfangen
solcher Ketten durch die kovalente Reaktion zwischen dem Disulfid und der freien
terminalen Aminogruppe an nichtumgesetzten
Ketten. Deshalb ist
die aus der Säule gewonnene Reaktionslösung von den nichtumgesetzten Polypeptidketten
frei.
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Nach jedem Abfangvorgang wird eine wäßrige Lösung (pH 8) von Natriumborhydrid
(0,5 m) bei 25 OC durch die Säule geleitet, um die kovalent gebundenen Ketten daraus
zu entfernen. Die Säule wird dann durch Behandlung mit Mercaptobernsteinsäureanhydrid
unter Wiederherstellung der Disulfidbrücke erneut aktiviert.
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Beispiel 4 (C-terminaler Weg) A. Herstellung von als Ethylester geschützten
Aminosäuren Die in Beispiel 2A angegebenen Aminosäuren werden durch Umsetzung mit
Ethanol beim Sieden unter Rückfluß in Gegenwart einer katalytischen Menge wasserfreier
HCl verestert. Das Reaktionsvolumen wird eingeengt, und nach dem Abkühlen kristallisieren
die Aminosäureester als Hydrochloride aus. Diese geschützten Säuren sind auch im
Handel erhältlich.
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B. Herstellung des Komplexes aus Verknüpfungshandhabe und erster Aminosäure
10 ml Poly U werden mit 0,01 m NaJ04 18 Stunden behandelt. Der gebildete Dialdehyd
wird durch reduktive Alkylierung nach Royer, et al., Biochem. and Biophys. Research
Commun., Bd. 64, S. 478 (1975) an gly-L-arg geknüpft.
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Der wie in 5A beschrieben hergestellte Ethylester von Valin wird durch
Reaktion in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids bei pH 4,75 und 0 bis 4
OC in 12 Stunden angeknüpft.
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C. Die Arbeitsweise Die grundlegende sich wiederholende Arbeitsweise
ist die gleiche wie bei dem N-terminalen Weg mit der Ausnahme, daß die Schutzgruppenentfernung
und das Ausputzen von nichtumgesetzten Ketten unter Verwendung von Säule 3 bewirkt
wird, die immobilisierte Carboxypeptidase Y enthält. Für das Ausputzen beträgt der
pH-Wert 5,5 in einem Phosphatpuffer. Zur Schutzgruppenentfernung beträgt der pH-Wert
der Lösung vor dem Durchleiten durch die Säule nach Einstellen mit NaOH 8,5. In
beiden Fällen wird eine Temperatur von Säule und Lösung von 35 OC angewandt. Zur
Ablösung des Peptids von der Verknüpfungshandhabe wird nacheinander durch Säule
4, die Säule von Beispiel 1B und Säule 5 geleitet, wobei sich die Lösungen bei einem
pH-Wert von 8 (unter Verwendung von Tris) befinden und Lösungs- und Säulentemperaturen
von 35 OC angewandt werden.
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Beispiel 5 Synthese von H-Leu-Phe-Leu-OH A. Herstellung von Handhabe-PEG-CH2CO-Gly-Arg(N02)
14 g Polyethylenglykol (PEG) (Molekulargewicht 6000 bis 7000) und 10 g Kalium-t-butoxid
werden durch Erwärmen auf 40 OC in 150 ml t-Butanol.gelöst. Nach Zugabe von 5 ml
Ethylbromacetat in 10 Minuten und 2-stündigem Rühren bei 40 OC wird das Lösungsmittel
durch einen Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird in 100 ml 2 n NaOH
gelöst und 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der pH-Wert der Mischung
wird dann auf 2,0 eingestellt. Das PEG wird zweimal mit 200 ml CHCl3 extrahiert.
Der organische Extrakt wird mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Durch Verdampfen des Lösungsmittels werden 12 g Carboxymethyl-PEG erhalten.
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An das Carboxymethyl-PEG wird Glycin mit einem wasserlöslichen Carbodiimid
folgendermaßen angereiht-. 1,4 g Gly-OEt-HCl und 3,4 g Carboxymethyl-PEG werden
in 25 ml H20 gelöst. Der pH-Wert wird mit Triethylamin auf 6,0 eingestellt. 2 g
Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid.HCl (EDC) werden zugegeben, und der pH-Wert
wird mit einem pH-Stat bei 6,0 gehalten. Nach 3 Stunden bei Zimmertemperatur wird
die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert, und das Produkt wird
mit CHCl3 extrahiert.
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Die organische Schicht wird mit 1 n HCl und Wasser gewaschen.
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Nach dem Trocknen über Na2 SO4 wird das Lösungsmittel unter vermindertem
Druck verdampft. 3,2 g PEG-CH2CO-Gly-OEt werden in 20 ml Wasser gelöst, und der
pH-Wert wird auf 10,5 eingestellt.
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Die Verseifung wird bei diesem pH unter Verwendung eines pH-Stat fortgesetzt.
Das Titrationsmittel ist 0,1 n NaOH. Während der Reaktionsdauer von 1 Stunde werden
etwa 4 ml Base verbraucht.
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Durch Ansäuern und Extraktion mit CHCl3 werden 3,3 g Produkt erhalten.
Die Aminosäureanalyse ergibt 100 mMol Glycin/mg Polymeres.
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Analog der Anknüpfung des Glycinethylesters wird Arg(N02)0Me.HCl umgesetzt.
3,30 g PEG-Gly-Arg(N02)OMe werden bei pH 8,5 mit 25 Einheiten CPY behandelt, das
an CL-Sepharose (Liberatore, et al., (1976) FEBS Letters 68, 45) immobilisiert ist.
Der pH-Wert wird bei Zimmertemperatur mit 0,1 n NaOH 5 Stunden aufrechterhalten.
Das gebundene Enzym wird durch Filtrieren entfernt.
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B. Herstellung von PEG-CH2COGlyArg(N02)Leu-Phe-Leu-OH Leu-OEt, Phe-OEt
und Leu-OET werden nacheinander wie oben beschrieben angereiht. Die Geschwindigkeit
der Schutzgruppenentfernung steigt mit der Zunahme der Kettenlänge rasch an.
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Die Aminosäureanalyse des schließlich erhaltenen Peptids stimmt mit
der Theorie überein.
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C. Freisetzung des Peptids 1 g Endprodukt werden in 20 ml MeOH/Cyclohexen
(1:1) gelöst.
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250 mg frisch hergestelltes Palladiumschwarz wird zugegeben, und das
Reaktionsgemisch wird 1 Stunde unter Rühren zum Sieden unter Rückfluß erwärmt. Der
Katalysator wird abfiltriert, und das Produkt wird im Vakuum getrocknet; Ausbeute
0,9 g.
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Das Produkt wird in 0,lm N-Ethylmorpholinacetat-Puffer vom pH 8,0
gelöst, und 1 g gebundenes Trypsin (hergestellt nach Royer et al., Methods in Enzymol,
(1977) 47, 40 wird zugegeben.
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Die Suspension wird 6 Stunden geschüttelt. Die Ablösung des Peptids
wird durch TLC unter Verwendung von authentischem H-Leu-Phe-Leu-OH als Standard
verfolgt Die Produktausbeute beträgt 80 %, bezogen auf die Zahl der auf dem PEG
zur Verfügung stehenden Initiierungsstellen.
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Die in den vorstehenden Beispielen veranschaulichten Arbeitsweisen
lassen sich leicht durchführen, sind ohne weiteres einer Automatisierung zugänglich
und auf die synthetische Herstellung von Polypeptiden in wäßrigem Medium aus. Aminosäuren
mit einer primären Aminogruppe in alpha-Stellung anwendbar.
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Wie ohne weiteres ersichtlich, gilt dies für alle Aminosäuren mit
Ausnahme von Prolin und Analoga davon. Im Fall von Prolin ist die acylierbare Aminogruppe
eine sekundäre Aminogruppe, die mit der Pyrrolidoncarboxylgruppe nicht geschützt
und wieder freigesetzt werden kann.
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Daher ist es, wenn das aufzubauende Polypeptid den Prolinrest enthalten
soll und der N-terminale Weg angewandt wird, notwendig, diese Säure durch übliche
Maßnahmen zu schützen, z.B.
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mit der Carbobenzoxygruppe (Z) und danach die Schutzgruppenentfernung
mit z.B. HBr-Eisessig zu bewirken. Deshalb wird bei dem Aufbau eines prolinhaltigen
Polypeptids vom N-terminalen Ende die oben beschriebene Arbeitsweise nach der Anfügung
des
geschützten Prolins an die Kette unterbrochen. Die Kette kann
dann von der Verknüpfungshandhabe abgelöst und isoliert und die Schutzgruppe kann
entfernt werden. Danach wird die Kette erneut an die Verknüpfungshandhabe gebunden,
und die hierin beschriebene Arbeitsweise wird zur Anreihung der nachfolgenden Säuren
an die Kette entsprechend oft wiederholt.
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In den obigen Beispielen ist insbesondere ein Verfahren zur Herstellung
von Polypeptiden unter Anwendung der bevorzugten Merkmale der Erfindung in ihrer
Kombination veranschaulicht worden, doch sei darauf hingewiesen, daß selbstverständlich
viele der angewandten Merkmale außerhalb der besonderen veranschaulichten Arbeitsweisen
allgemein anwendbar sind, und zwar im Hinblick sowohl auf die Polymersynthese als
auch auf andere mehrstufige Molekularumwandlungen mit aufeinanderfolgenden chemischen
Reaktionen. So ist beispielsweise der Ausschluß von Schwierigkeiten, die mit einer
unvollständigen Vorläuferreaktion verbunden sind, durch Ausputzen auf jede mehrstufige
Molekularumwandlung anwendbar, wobei der nichtumgesetzte Vorläufer enzymatisch abgebaut
oder abgefangen werden kann. Das gleiche gilt für die enzymatische Schutzgruppenentfernung,
wie sie hierin beschrieben ist, so lange dabei eine entfernbare Schutzgruppe eine
Rolle spielt.
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Bezüglich der herkömmlichen Festphasenpeptidherstellung, wobei die
Kettenverlängerung mit der an einen unlöslichen Träger kovalent gebundenen Kette
bewirkt wird, dürfte klar sein, daß die entsprechenden enzymatischen Lösungen nacheinander
über den Träger zur Entfernung von nichtumgesetzten Ketten und zur Schutzgruppenentfernung
in jeder einzelnen Stufe der sich wiederholenden Arbeitsweise geleitet werden können.
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Im Hinblick auf die herkömmlichen Lösungsmethoden in organischen Lösungsmitteln
kann die Verwendung der hierin veranschaulichten immobilisierten Enzyme in zweckmäßiger
Weise angewandt werden,
beispielsweise durch einfaches Isolieren
der Peptidkettenpopulation nach jeder Umsetzung mit einer nachfolgenden Säure und
Lösen derselben in einem wäßrigen Medium.
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Auch das Merkmal der hierin beschriebenen reversiblen Verknüpfung
ist, wie ohne weiteres ersichtlich, auch auf andere Arbeitsweisen anwendbar als
die hierin veranschaulichten. Es ist allgemein auf mehrstufige Molekularumwandlungen
anwendbar, wobei nach der chemischen Reaktion eines umwandelbaren Vorläufers das
umgewandelte Produkt von nichtumgesetzter zugesetzter Verbindung abgetrennt werden
muß. Die reversible Verknüpfung ist zwar besonders gut, genauso wie die anderen
Merkmale bei der reiterativen Polymersynthese anwendbar, doch kann sie auch bei
anderen mehrstufigen Molekularumwandlungen angewandt werden, die darauf ausgerichtet
sind, Verbindungen durch aufeinanderfolgende chemische Reaktionen aufzubauen.
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Was nun die Polymersynthese betrifft, so kann die Verknüpfungshandhabe
an der wachsenden Kette zur Verknüpfung der Kette während der Reaktion mit dem gewünschten
zugesetzten Bruchstück und während der Abtrennung zur Anknüpfung der Kette an einen
unlöslichen Träger dienen. Somit kann eine Festphasenarbeitsweise für die Kettenverlängerung
angewandt werden. Die damit verbundenen besonderen Vorteile sind darin zu sehen,
daß die Reaktion in einem wäßrigen Medium bewirkt und die Kette nach ihrer Vollendung
oder bei jeder Zwischenstufe leicht von dem Träger abgetrennt werden kann, ohne
daß rauhe Bedingungen angewandt werden müssen.