DE2723451C2

DE2723451C2 -

Info

Publication number: DE2723451C2
Application number: DE2723451A
Authority: DE
Inventors: Mirko Paris Fr Beljanski
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-06-03
Filing date: 1977-05-24
Publication date: 1989-09-07
Also published as: JPS52148613A; SE7706425L; GB1546322A; CA1093000A; US4335239A; FR2353293A1; NO145540B; IE45285L; IE45285B1; NO145540C; JPS6326088B2; LU77460A1; US4190649A; DK243877A; DK169766B1; NO771884L; FR2353293B1; NL7705658A; CH620691A5; SE441679B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyribonucleotiden sowie die Verwendung von Polyribonucleotiden zur Behandlung von Leukozyten- und Blutplättchenmangelzuständen.

Vor kurzem wurde ein Verfahren zur Herstellung von Polyribonucleotiden, auch als "RNA-Bruchstücke" bezeichnet, durch Einwirkung von Ribonucleasen, welche die Sequenzen G-A intakt lassen, insbesondere Pankreas-Ribonuclease, auf Ribosomen-Ribonucleinsäuren, die reich an den Nucleotiden G und A sind, die aus Bakterien oder Zellen von Tierorganen extrahiert wurden, beschrieben (vgl. die FR-A 22 92 481 und "C. R. Acad. Sci. Paris", Serie D, T. 280 [20. Januar 1975], Seiten 363 bis 366). Die dabei erhaltenen Polyribonucleotide bestehen aus einfachen Ketten, die etwa 20 bis etwa 80 Ribonucleotid-Einheiten aufweisen und in denen die Purinbasen im Überschuß gegenüber den Pyrimidinbasen vorliegen und in denen die aufeinanderfolgenden G-A-Einheiten vorherrschen.

Die Polyribonucleotide wurden anschließend in verschiedene Fraktionen aufgeteilt, indem man sie auf eine mit einem Molekularsieb, das im Handel unter der Bezeichnung Sephadex® erhältlich ist, gefüllte Kolonne in einem Tris-Puffer 0,01 mol/l, pH 7,4, aufgab und mit dem gleichen Puffer eluierte. Die so voneinander getrennten Fraktionen werden in der Reihenfolge ihrer Elution mit P₁, P₂, P₃, P₄ und P₅ bezeichnet, und sie entsprechen den Maxima der in der Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung dargestellten Kurve, in der die Eluatvolumina auf der Ordinate und die bei 260 nm gemessene Absorption (Extinktion) auf der Abszisse aufgetragen sind.

Die verschiedenen Familien der dabei erhaltenen Polyribonucleotide wurden spektrophotometrisch analysiert, und ihre Gehalte an Purinbasen, wie Guanin (G) und Adenin (A), und Pyrimidinbasen, wie Cytosin (C) und Uracil (U), wurden bestimmt; sie unterscheiden sich voneinander durch die Art und das Verhältnis der Basen, wobei die Produkte P₁ und P₂ die an den Purinbasen G und A reichsten Produkte darstellen.

Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß die mit P₁ und P₂ bezeichneten Produkte, hergestellt aus Ribosomen-RNA von Escherichia coli M 500, eine antivirale Aktivität, insbesondere gegenüber dem Virus des Shope-Fibroms, dem Vakzine-Virus und dem Herpes-Virus, aufweisen.

Es wurde nun gefunden, daß die an den Purinbasen G und A ärmsten Produkte und insbesondere die Produkte, in denen das Gesamtverhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen [(G+A)/(C+U)] zwischen 1,0 und 2,3 liegt, eine interessante (vorteilhafte) Aktivität bei der Bildung der Leukozyten und der Blutplättchen aufweisen und als oder in Arzneimitteln verwendet werden können, die für die Aktivierung der Leukopoese unter Bildung von Blutplättchen bestimmt sind, wenn ein Mangel daran vorliegt.

Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren und eine Verwendung, wie sie in den Ansprüchen näher bezeichnet sind.

Insbesondere weisen die mit P₃ und P₄ bezeichneten Produkte, die aus Ribosomen-RNA von Escherichia coli M 500 Sho-R mittels Pankreas-Ribonuclease hergestellt worden sind, beide ein Verhältnis (G+A)/(C+U) auf, das zwischen 1,0 und 2,3 liegt, und sie stellen infolgedessen erfindungsgemäße Arzneimittel dar, die für den "Wiederanstieg" der Leukozyten und Blutplättchen verwendet werden können.

Die erfindungsgemäß verwandten Polyribonucleotide können nach dem Verfahren hergestellt werden, wie es in der FR-A 22 92 481 beschrieben ist, bei dem man von verschiedenen Quellen (Hefen, Bakterien, Tierorganen) ausgeht, wobei man, insbesondere beim Ausgehen von E. coli M 500 Sho-R, die Fraktionen oder RNA-Bruchstücke, deren Verhältnis (G+A)/(C+U) zwischen 1,0 und 2,3 liegt, durch Passieren durch ein Molekularsieb trennt.

Die Erfindung betrifft ferner ein verbessertes Verfahren zur Herstellung dieser Polyribonucleotide, mit dessen Hilfe es möglich ist, diese auf einfachere Weise und in einer wesentlich höheren Ausbeute zu erhalten. Bei diesem verbesserten Verfahren sind die Methoden zur Kultivierung der Bakterien, zur Isolierung der Ribosomen-Ribonukleinsäuren (r-RNA) und ihrer Konservierung (Aufbewahrung) identisch mit denjenigen, wie sie in der FR-A 22 92 481 beschrieben sind. Die Verbesserung bezieht sich auf drei Punkte:

- auf die Auswahl des Bakterienstammes oder eines anderen Ausgangsmaterials (Pilze, Hefen oder Tierorgane);
- auf das für die Auftrennung der r-RNA in RNA-Bruchstücke verwendete Abbau-Agens;
- auf die Unterdrückung der Trennphase der RNA-Bruchstücke in einer Kolonne.

Was den ersten Punkt anbetrifft, so verwendet man vorzugsweise einen wilden Stamm von E. coli T 3000 (K 12), der nicht pathogen ist und zu den Arten gehört, die üblicherweise Wirte der Intestinalflora sind; bei diesem Stamm ist das Verhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen kleiner als das entsprechende Verhältnis des Stammes E. coli M 500 Sho-R, und es liegt in der Nähe von 1,0.

Man kann aber auch r-RNA verwenden, die aus anderen Bakterienstämmen, Pilzen, Hefen oder Tierorganen isoliert worden sind, deren Verhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen geeignet ist.

Bei den für die r-RNA verwendeten Abbaumitteln kann es sich nicht nur um Ribonucleasen, wie Pankreas-Ribonuclease oder eine aus Neurospora crassa extrahierte Ribonuclease, sondern, erfindungsgemäß, auch um Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, mit einer Endkonzentration von 0,1 mol/l in der Reaktionslösung, handeln. Die auf diese Weise aus einem geeigneten Ausgangsmaterial erhaltenen ARN-Bruchstücke weisen ein Gesamtverhältnis (G+A)/(C+U) zwischen 1,0 und 2,3 auf, und es braucht keine Fraktionierung auf einer Kolonne durchgeführt zu werden.

In dem nachfolgenden Beispiel wird die Herstellung von P₃ und P₄ aus einem Stamm von E. coli beschrieben, der gegen Showdomycin resistent gemacht worden ist, wie von M. Beljanski et al., "C. R. Acad. Sci. Paris", Serie D, 272, 1971, Seiten 2107-2110, beschrieben, der in dem Centraal Bureau Voor Schimmelcultures unter der Nr. CBS 615-74 registriert ist und nachfolgend als E. coli M 500-Sho-R bezeichnet wird. Die Hinterlegungsnr. in der Sammlung des Institut Pasteur ist 7428.

Der Stamm E. coli T 3000, auch als E. coli K12 bezeichnet, ist in der Sammlung des Institut Pasteur in Paris sowie im Centraal Bureau Voor Schimmelcultures registriert. Die Registrierungsnr. in der Sammlung des Institut Pasteur ist 54117.

Die in den Beispielen und in der Beschreibung verwandte Abkürzung "Tris" steht für Tris(hydroxymethyl)aminomethan, "Sephadex®" bezeichnet ein Epichlorhydrin-vernetztes Gel.

Herstellungsbeispiel 1 Herstellung von P₃ und P₄ aus E. coli M 500-Sho-R

Die Bakterien dieses Stammes werden bei 37°C in einem gut durchlüfteten Milieu kultiviert entweder auf einem Nährmedium, das pro Liter Medium enthält:

10 g Bacto-Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g Natriumchlorid und
Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,3 zu bringen,

oder, wenn man die antiviralen Produkte P₁ und P₂ und die Produkte P₃ und P₄ gleichzeitig isolieren will, in einem synthetischen Milieu, das pro Liter Milieu enthält:

100 ml Monokaliumphosphat (136 g/l)
10 ml 20%iges Ammoniumsulfat
  1 ml 0,05%iges Eisensulfat
  1 ml Magnesiumsulfat (20 g/100 ml)
  2 ml Vitamin B₁ (0,5 pro 1000) und
Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,2 zu bringen,

wobei man zu diesem Milieu nach dem Sterilisieren 4 oder 5 g sterilisierte Glukose (20%ige Lösung) auf 1000 g zugibt.

Nach Beendigung der Kultivierung werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gesammelt und sie können durch Tiefgefrieren aufbewahrt werden. Sie werden anschließend in der Kälte in einem Puffer A (2 mol/l Tris-HCl: 5 ml, 2 mol/l KCl: 30 ml, Magnesiumacetatlösung [30 g/100 ml]: 10 ml) homogenisiert, dann zerkleinert, und ihre Zerstörung wird durch Ultraschallbehandlung vervollständigt.

Nach dem Verdünnen mit einem Puffer B (analog zu dem Puffer A, der jedoch nur 0,1 ml Magnesiumacetat und 0,1 ml Mercaptoethanol enthält) zentrifugiert man 20 min (25 000 bis 30 000 g), dann gibt man zu der überstehenden Flüssigkeit 10 bis 20 µg Desoxyribunuclease pro ml zu. Man läßt 15 min lang bei 30 bis 37°C einwirken, dann zentrifugiert man 20 min lang (bei 25 000 bis 30 000 g). Die überstehende Flüssigkeit wird anschließend erneut 2 h lang bei 40 000 U/min in einer Ultrazentrifuge filtriert, um die Ribosomen zu gewinnen und die Gesamtmenge der unbrauchbaren RNA 4 S zu eleminieren.

Die Ribosomen (der Bodensatz) werden in Gegenwart des Puffers B in einem Behälter homogenisiert. Man gibt 2 bis 3 Tropfen 20%igen Laurylsulfat zu und unterwirft einer guten mechanischen Rührung. Die Ribosomen-RNA wird nach dem klassischen Verfahren mit Phenol in Gegenwart des Puffers B extrahiert. Es sind mehrere Extraktionen erforderlich. Eine Schlußextraktion mit Chloroform ist erforderlich, um das Phenol und die noch vorhandenen Proteine zu entfernen.

Die wäßrigen Phasen werden miteinander vereinigt und mit kaltem 96%igem Alkohol versetzt, der etwas KCl enthält, um die Ausfällung der RNA zu begünstigen. Durch 5minütiges Zentrifugieren bei 5000 g ist es möglich, die RNA zu sammeln, die anschließend eine Nacht lang gegen destilliertes Wasser, das 0,1 mol/l KCl enthält, dialysiert wird.

Am Morgen setzt man die Dialyse 1 h lang nur gegen destilliertes Wasser fort. Man bestimmt die RNA bei 260 nm (UV) mit Hilfe eines Spektrophotometers. Das Verhältnis 260/280 erlaubt die Steuerung der Eigenschaften bei der Herstellung der RNA. Dieses Verhältnis muß sehr nahe bei 2 liegen.

Die RNA wird im eingefrorenen Zustand oder in Form eines lyophilisierten Pulvers aufbewahrt. Die Auftrennung der RNA in die Polyribonucleotide (RNA-Bruchstücke) wird wie folgt durchgeführt: 70 mg Ribosomen-RNA (etwa 10 ml) werden mit 0,2 ml einer kristallisierten Pankreas-Ribonuclease versetzt (die Pankreas-Ribonucleaselösung mit 5 mg/ml) wurde vorher 10 min lang zum Kochen gebracht und dann abgekühlt). Man inkubiert die RNA 30 min lang bei 36°C (Wasserbad) mit der Ribonuclease. Der Abbau wird durch Zugabe eines gleichen Volumens Chloroform und mehrminütiges starkes Rühren gestoppt. Man zentrifugiert 5 min lang bei 5000 g. Die wäßrige Phase (die obere Phase) wird entnommen und ein zweites Mal mit einem gleichen Volumen Chloroform versetzt, gerührt und zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird sofort auf eine Sephadex®-Kolonne, die mit einem Puffer H₂O-0,1 mol/l Tris-HCl, pH 7,4, fein äquilibriert worden ist, aufgegeben.

Die RNA-Bruchstücke werden mit dem gleichen Puffer eluiert. Unter diesen Bedingungen sind 5 Absorptionsmaxima bei 260 nm nachweisbar, die regelmäßig aussehen, wie durch die Elutionskurve dargestellt. Sie werden in der Reihenfolge ihrer Elution aus der Kolonne mit 1 bis 5 bezeichnet. Die RNA-Bruchstücke, welche die Maxima 1 und 2 darstellen, weisen eine Antivirus-Aktivität auf. Die RNA-Bruchstücke, welche die Maxima 3 und 4 darstellen, weisen immer eine sehr spektakuläre Aktivität auf wie "angestiegene" Leukozyten und Blutplättchen, und sie stellen die erfindungsgemäßen Arzneimittel dar. Die RNA-Bruchstücke, welche das Maximum 5 darstellen, werden nicht aufbewahrt.

Die jedes der Maxima darstellenden Fraktionen werden miteinander vereinigt und lyophilisiert. Auf diese Weise erhält man die Produkte P₁, P₂, P₃ und P₄, nachdem man den trockenen Rückstand in der minimalen Menge an destilliertem Wasser aufgenommen, einmal mit dem gleichen Volumen Chloroform kräftig behandelt und zentrifugiert hat, wobei die überstehende Flüssigkeit 24 h lang (unter axenischen Bedingungen) gegen steriles destilliertes Wasser dialysiert und trocken loyphilisiert worden ist. Die Produkte P₃ und P₄ stellen erfindungsgemäß verwendbare Produkte dar ebenso wie ihre Mischungen in allen Mengenverhältnissen.

Die Konstitution der RNA-Bruchstücke P₃ und P₄, die aus einfachen Ketten gebildet werden, die 25 bis 50 Nucleotide enthalten, wurden nach dem in der FR-A 22 92 489 beschriebenen Verfahren untersucht, um ihre Gehalte an Purinbasen und Pyrimidinbasen zu ermitteln.

Man hydrolysiert 1 h lang bei 100°C (siedendes Wasserbad) 150 µg RNA-Bruchstücke. Nach dem Eindampfen in einem Exsikkator nimmt man den Rückstand in 0,02 ml destilliertem Wasser wieder auf und führt eine Dünnschichtchromatographie (Cellulose) unter Anwendung des von G. R. Björk und L. Svensson in "Biochim. Biophys. acta", 1967, 138, Seiten 430-432, beschriebenen Verfahrens durch. Bei der Hydrolyse werden die Purinbasen freigesetzt, und die Pyrimidinbasen verbleiben in Form der Nucleotide.

Die Bestandteile der RNA-Bruchstücke P₃ und P₄ werden durch Chromatographie in einem geschlossenen Behälter voneinander getrennt und nach dem oben für die RNA-Bruchstücke P₁ und P₂ angegebenen Verfahren identifiziert.

Das RNA-Bruchstück P₃ besteht aus:

A: 29,0
G: 41,1
C: 15,2 (G+A/C+U=2,3)
U: 15,0

Das RNA-Bruchstück P₄ besteht aus:

A: 25,6
G: 26,3
C: 21,0 (G+A/C+U=1,06)
U: 27,1

Die oben angegebenen Zahlen sind ausgedrückt in Mol pro 100 Mol der analysierten Nucleotide unter Verwendung der folgenden Streckungskoeffizienten A=13; G=12,8; C=11,5; U=10, die dem Absorptionsmaximum entsprechen (vgl. "Methods in Enzymology", XII, Nucleic Acids, Teil A, Ed. Grossman und K. Moldave, Academic Press [1967], Seite 386).

Die RNA-Bruchstücke P₃ und P₄ enthalten keine Spur DNA. Dies wurde streng kontrolliert durch Colorimetrie (mit Diphenylamin) und durch Enzymologie (Aktivität in Gegenwart von DNA-Polymerase).

In den nachfolgenden Beispielen wird das Verfahren zur Herstellung von RNA-Bruchstücken aus r-RNA von E. coli T 3000 mit verschiedenen Ribonucleasen und mit einer alkalischen Base beschrieben.

Herstellungsbeispiel 2 Abbau der r-RNA von E. coli T 3000 durch die Pankreas-Ribonuclease A

Die r-RNA werden erhalten aus einer Kultur von E. coli T 3000 nach einem Verfahren, das identisch ist mit demjenigen, wie es in Herstellungsbeispiel 1 für die r-RNA von E. coli M 500 Sho-R beschrieben worden ist. Der Abbau der erhaltenen RNA wird in bekannter Weise durchgeführt mit einer Pankreas-Ribonuclease-Lösung (Sorte A, 5 mg/ml), die vorher 10 min lang auf 100°C (in einem siedenden Wasserbad) gebracht und dann schnell abgekühlt worden ist.

Man inkubiert eine Mischung aus r-RNA und Ribonuclease der gleichen Konzentration an Ribonuclease wie in Beispiel 1 bei 36°C, jedoch für eine kürzere Zeitspanne von 20 min (anstelle von 30 min). (Wenn man eine andere Probe von mehr oder weniger kristallisierter Pankreas-Ribonuclease verwendet, muß die Konzentration an Ribonuclease oder die Inkubationszeit angepaßt werden.)

Die Reaktion wird durch Zugabe einer 10% destilliertes Wasser enthaltenden Phenollösung (1 Vol.-Teil dieser Lösung auf 1 Vol.-Teil Reaktionsmischung) gestoppt, und die Mischung wird stark gerührt, um die Ribonuclease zu entfernen. Nach 5minütigem Zentrifugieren bei 10 000 U/min wird die wäßrige Phase (die obere Phase) anschließend mit einem gleichen Volumenanteil Phenol versetzt, die Mischung gerührt und dann zentrifugiert. Der Arbeitsgang wird erneut begonnen mit Chloroform (1 Volumenteil auf 1 Volumenteil). Nach der Phasentrennung und nach zweimaliger oder dreimaliger Wiederholung des Arbeitsganges wird die wäßrige Phase unter axenischen Bedingungen 16 h lang gegen steriles destilliertes Wasser bei 4°C dialysiert.

Die Menge an nicht dialysierbaren RNA-Bruchstücken wird durch Ultraviolett-Absorption bei 260 nm bestimmt. Die Ausbeute an aktiven RNA-Bruchstücken, bezogen auf die Anfangsmenge der Ribosomen-RNA, variiert von 50 bis 60%. Die RNA-Bruchstücke werden nach dem Lyophilisieren aufbewahrt.

Die Elektrophorese der RNA-Bruchstücke auf Acrylamidgel zeigt die Anwesenheit eines einzigen Maximums von RNA-Bruchstücken einer geringeren Höhe als der RNA-Übergang 4 S, wie die beigefügte Fig. 1 zeigt, in der auf der Ordinate die Absorption (Extinktion) bei 260 nm und auf der Abszisse die innerhalb von 1½ h durchlaufene Strecke aufgetragen sind (vgl. das Verfahren von M. Beljanski, P. Bourgarel und Madame M. Beljanski in "Ann. Inst. Pasteur", 1970, 118, Seite 253).

Herstellungsbeispiel 3 Abbau der r-RNA von E. coli T 3000 durch die Ribonuclease N₁

Die aus Neurospora crassa stammende Ribonuclease N₁, die nach K. Kasei et al., "J. Bio. Chem.", 1969, 66, Seite 389, gereinigt und einmal kristallisiert worden ist, baut die Polyribonucleotidketten auf dem Niveau der Base G ab, und ihre Wirkung auf die r-RNA in bekannter Weise erlaubt die Herstellung von RNA-Bruchstücken, die aktiv sind in bezug auf die Leukopoese und in bezug auf die Bildung von Blutplättchen. Es wurden die folgenden Bedingungen angewendet: 100 mg r-RNA von E. coli T 3000, gelöst in destilliertem Wasser, werden in Gegenwart von 0,73 ml Ribonuclease N₁ (Anfangslösung 1000 Einheiten/2 ml) 30 min lang bei 36°C inkubiert. Die Ribonuclease wird sofort mit Phenol und Chloroform wie im Falle der Ribonuclease A beschrieben eliminiert; die Bruchstücke werden gegen steriles destilliertes Wasser dialysiert. Das dabei erhaltene Produkt wird lyophilisiert.

Beispiel 4 Abbau der r-RNA von E. coli T 3000 durch Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid

Eine Lösung von 7 bis 10 mg r-RNA/ml wird mit einer NaOH- oder KOH-Lösung versetzt, bis die Endkonzentration der letzteren 0,1 mol/l beträgt.

Es wird 30 min lang bei 36°C inkubiert. Man neutralisiert sofort mit einer gleichen Volumenmenge 0,1 mol/l HCl. Man dialysiert die Lösung 16 h lang bei 4°C gegen destilliertes Wasser. Das dabei erhaltene nicht-dialysierbare Produkt wird lyophilisiert. Nach der Hydrolyse der verschiedenen RNA-Bruchstücke der Beispiele 2, 3 und 4 bestimmt man das Verhältnis zwischen den Purinbasen und den Pyrimidinbasen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, wobei sie durch die Mole auf 100 Mole der analysierten Nucleotide ausgedrückt sind.

Tabelle

Zwischen den mit den verschiedenen oben genannten Abbauagentien und unter Anwendung der oben genannten Bedingungen erhaltenen RNA-Bruchstücken sind keine signifikanten Unterschiede erkennbar: ihre Größen sind praktisch identisch und immer unterhalb derjenigen der RNA 4 S (vgl. Fig. 2).

Pharmakologische Eigenschaften

Es wurde die Verteilung der RNA-Bruchstücke P₃ und P₄ des Herstellungsbeispiels 1, die mit ¹⁴C markiert waren, im Organismus nach der Injektion in Mäuse oder Kaninchen auf intravenösem Wege untersucht.

Das mit ¹⁴C markierte RNA-Bruchstück P₄ wird im wesentlichen in der Milz eingelagert, weniger in der Leber und findet sich auch in dem Knochenmark. Das mit ¹⁴C markierte RNA-Bruchstück P₃ wird in gleichem Maße und im wesentlichen in den gleichen Organen, jedoch in einer geringeren Menge gespeichert. Nach dem Töten der mit diesen Produkten behandelten Mäuse stellt man eine Zunahme des Volumens und des Gewichtes der Milz (dargestellt in den Fig. 3 und 4) nur bei den mit P₄ behandelten Tieren fest. In der Fig. 3 ist auf der Ordinate das Gewicht der Milz (in mg) angegeben, und in der Fig. 4 ist das Gewicht der Leber (in g) als Funktion der Anzahl der Tage (auf der Abszisse) angegeben, die verstrichen sind, nachdem dem Tier eine Dosis von 0,3 mg des Produkts P₃ (Kurven 3) oder P₄ (Kurven 4) auf 20 g Körpergewicht der Maus auf intravenösem oder intraperitonealem Wege verarbeicht worden sind. Die beiden Organe nehmen nach 5 bis 6 Wochen ihr Normalgewicht wieder an, und es ist keine Radioaktivität mehr festzustellen, die auf natürliche Weise ausgeschieden worden ist.

Die Wirkung bei der Entstehung der Leukozyten und Blutplättchen wurde bei mit Methotrexat behandelten Kaninchen untersucht. Bei den Tieren, denen Methotrexat (35 mg auf intramuskulärem Wege pro Kaninchen) verabreicht worden ist, ist 48 Stunden nach der Verabreichung des Antimitotikums eine Verringerung der Anzahl der Leukozyten um etwa 30% festzustellen. Bei drei Versuchskaninchen wird einem Kaninchen 2 mg des Gemisches aus P₃+P₄ (in dem Gewichtsverhältnis 1 : 1) subkutan verabreicht, einem Kaninchen wird die gleiche Dosis intraperitoneal verabreicht, einem dritten Kaninchen wird nur Methotrexat (zum Vergleich) verabreicht. Die beiden mit P₃+P₄ behandelten Kaninchen erreichen nach 5 bis 7 d wieder einen praktisch normalen Gehalt an Leukozyten, während das Vergleichskaninchen erst nach etwa 15 d den Normalwert wieder erreicht hat.

Den gleichen Kaninchen wird danach eine zweite Dosis Methotrexat (55 mg i.v. pro Kaninchen) verabreicht, Tag 0 in der Fig. 5. Zwei Tage danach verabreicht man einem Kaninchen 5 mg P₃+P₄ (Gewichtsverhältnis 1 : 1,5) auf intraperitonealem Wege, einem Kaninchen verabreicht man die gleiche Dosis auf subkutanem Wege, und dem dritten Kaninchen (dem gleichen Vergleichskaninchen wie in dem vorausgegangenen Versuch) verabreicht man nur das Methotrexat. Die Ergebnisse der Analyse des Gehaltes an Leukozyten in dem alle zwei Tage 20 d lang entnommenen Blut sind in der Fig. 5 dargestellt.

Aus der Fig. 5, in der auf der Ordinate die Gehalte an Leukozyten als Funktion der Anzahl der nach der Injektion von Methotrexat verstrichenen Tage (auf der Abszisse) angegeben sind, sieht man, daß die Wirkung des Methotrexats sich bei den drei Kaninchen in einer sehr starken Verringerung des Gehaltes an Leukozyten (Vergleichstiere: Kurve 1) äußert, die jedoch weniger stark ist bei den beiden Kaninchen, die vorher mit P₃+P₄ auf subkutanem Wege (Kurve 2) oder auf intraperitonealem Wege behandelt worden sind, als bei dem Vergleichskaninchen.

Bei dem Kaninchen, dem zum zweiten Mal P₃+P₄ auf intravenösem Wege (Kurve 3) verabreicht worden ist, wird der Gehalt an Leukozyten innerhalb von 48 h normal, steigt in 24 oder 48 h an, bevor er sich schnell stabilisiert. Bei dem Kaninchen, dem P₃+P₄ auf subkutanem Wege verabreicht worden ist, erreicht die Kurve 2, welche die Zunahme des Gehaltes an Leukozyten darstellt, ihr Maximum am 6. Tage und stabilisiert sich danach (Fig. 5). Dagegen bleibt bei dem Vergleichskaninchen (das nicht mit P₃+P₄ behandelt worden ist) der Gehalt an Leukozyten auf dem niedrigen Niveau, und das Tier erreicht während der Beobachtungszeit den Normalwert nicht mehr. Der Gehalt an roten Blutkörperchen variiert bei den so behandelten Kaninchen nicht.

Die mit den mit verschiedenen Abbauagentien gemäß den Herstellungsbeispielen 2 und 3 und Beispiel 1 erhaltenen RNA-Bruchstücken durchgeführten pharmakologischen Untersuchungen haben gezeigt, daß kein signifikanter Unterschied besteht in bezug auf die Aktivität bei der Leukopoese und bei der Bildung von Blutplättchen zwischen den Produkten P₃ und P₄ des Beispiels 1, die einzeln oder in Form einer Mischung in beliebigen Mengenverhältnissen verabreicht worden sind, und jedem der Produkte der Beispiele 2 bis 4.

Eine einzige Dosis jedes der Produkte der Beispiele 2 bis 4 (2 bis 5 mg), verabreicht auf intravenösem Wege an Kaninchen mit starker und ständiger Immununterdrückung (mit um 60 bis 70% verringertem Leukozytengehalt) erlaubt die Wiedereinstellung eines normalen Gehaltes an Leukozyten innerhalb von 24 bis 48 h. Die Anzahl der Blutplättchen kann durch diese RNA-Bruchstücke von 50 auf 100%, bezogen auf die Anzahl der Blutplättchen der Vergleichstiere, erhöht werden. Die Fig. 6 erläutert die während der Dauer eines Versuchs (20 bis 30 d) bei durchgehend mit Endoxan (65 mg/d) und periodisch mit den RNA-Bruchstücken, die nach dem einen oder anderen der Beispiele 1 bis 4 hergestellt worden sind, behandelten Kaninchen erhaltenen Ergebnisse.

In der Fig. 6 ist auf der Abszisse die Anzahl der Tage des Versuchs angegeben, während der den Kaninchen 65 mg Endoxan pro Tag verabreicht wurden. Zu dem durch den Pfeil A angegebenen Zeitpunkt wurden den Kaninchen auf intravenösem Wege 2 mg RNA-Bruchstücke verabreicht. Eine der Kurven der Fig. 6 wurde erhalten durch Auftragen der Anzahl der Leukozyten auf der Ordinate, und die andere Kurve wurde erhalten durch Auftragen der Anzahl der Blutplättchen auf der Ordinate.

Für die Injektion der aktiven RNA-Bruchstücke können alle Verabreichungsarten angewendet werden: intramuskulär (i.m.), intravenös (i.v.), subcutan (s.c.), intradermal (i.d.) und per os (p.o.). Die Dauer bis zum "Ansprechen" variiert mit der gewählten Verabreichungsart und ist eine Funktion der Dosis des Produkts. Bei den nicht mit Endoxan behandelten Kaninchen, deren Blutzusammensetzung normal ist, verändert die Verabreichung von RNA-Bruchstücken auf intravenösem Wege des Gehalt an weißen Blutkörperchen nicht. Wenn die Dosis des Produktes hoch ist, stellt man eine Erhöhung fest, innerhalb von 24 h wird der Gehalt an weißen Blutkörperchen jedoch wieder normal.

Die Wirkung von verschiedenen chemischen und physikalischen Agentien (Endoxan, Methotrexat, Thiotepa, Strahlung) und selbst eine genetische Schwäche, die eine leukopoetische Verminderung oder eine Abnahme der Blutplättchen mit sich bringt, kann von diesem Gesichtspunkt aus betrachtet durch diejenige der verschiedenen oben genannten RNA-Bruchstücke ausgeglichen werden. Die Wirkung auf die Bildung der Blutplättchen ist weniger schnell als diejenige auf die weißen Blutkörperchen, sie ermöglicht jedoch einen bedeutenden allmählichen Wiederanstieg. Klinische Versuche haben diese Ergebnisse bestätigt. Die Verlängerung der Chemotherapie macht eine erneute Verabreichung der RNA-Bruchstücke erforderlich, ohne daß das Phämonen dadurch erschöpft wird.

Toxikologie

Die Produkte P₃ und P₄ des Beispiels 1 und diejenigen der Beispiele 2 bis 4, gelöst in physiologisch sterilem Wasser, wurden auf intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subcutanem und oralem Wege an Mäuse und Kaninchen verabreicht. Dosen von 1 bis 5 mg in einer einzigen Injektion bei der Maus und von 4 bis 25 mg beim Kaninchen, die mehrere Tage lang und bis zu 15 d hintereinander wiederholt wurden, zeigten keinerlei toxische Wirkung der Produkte. Auch deutlich höhere Dosen, die auf oralem Wege verabreicht wurden, zeigten keine toxische Wirkung. Teratologische Untersuchungen haben gezeigt, daß die Injektion der erfindungsgemäßen Produkte in trächtige weibliche Mäuse keine nachteilige Wirkung weder für die erste Generation noch für die folgenden Generationen hatte. Die erfindungsgemäßen Produkte sind somit für das Tier völlig unschädlich.

Therapeutische Anwendung

Klinische Versuche haben gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Produkte auch an Menschen verabreicht werden können, jedesmal, wenn eine Leukopenie oder ein Mangel an Blutplättchen vorliegt, um den normalen Gehalt an Leukozyten und Blutplättchen wiederherzustellen, ohne daß die übrige Blutzusammensetzung geändert wird. Zwischen den verschiedenen Typen von weißen Blutkörperchen stellt sich wieder ein Gleichgewicht ein.

Da die Produkte in Wasser löslich sind, können sie auf jedem parenteralen Wege in Form von physiologischen Lösungen oder auf oralem Wege in allen klassischen galenischen Formen (trinkbaren Lösungen, Tabletten, Kapseln und dgl.) verabreicht werden. Die zu verabreichende Dosis kann von 10 bis 20 mg, je nach Art der zu behandelnden Krankheit, variieren, und die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel bzw. Zubereitungen enthalten als aktiven Bestandteil mindestens eines der erfindungsgemäßen Produkte in einer Einheitsdosis von 2 bis 100 mg, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Polyribonucleotiden, die aus einfachen Ketten (RNA-Bruchstücken) mit 20 bis 80 Ribonucleotid-Einheiten bestehen und ein Gewichtsverhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen [(G+A)/(C+U)] zwischen 1,0 und 2,3 aufweisen, durch Abbau von Ribosomen-Ribonucleinsäuren, die aus Mikroorganismen oder Tierorganen extrahiert worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß der Abbau der Ribosomen-Ribonucleinsäuren durchgeführt wird, indem man Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid in einer Endkonzentration von 0,1 mol/l 30 min lang bei 36°C einwirken läßt, dann sofort mit einem gleichen Volumen 0,1 mol/l Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, die erhaltene Lösung 16 h lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und danach die nicht-dialysierte Fraktion lyophilisiert.

2. Verwendung von Polyribonucleotiden, hergestellt durch Abbau von Ribosomen-Ribonucleinsäuren, die aus Mikroorganismen oder tierischen Organen extrahiert worden sind, die aus einfachen Ketten (RNA-Bruchstücken) mit 20 bis 80 Ribonucleotid-Einheiten bestehen und ein Gesamtverhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen [(G+A)/(C+U)] zwischen 1,0 und 2,3 aufweisen, zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung von Leukozyten- und Blutplättchenmangelzuständen.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel mindestens ein Polyribonucleotid in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger enthält.