DE2717979B2 - Kulturbriihe zur Bestimmung von Staphylococcus aureus - Google Patents
Kulturbriihe zur Bestimmung von Staphylococcus aureusInfo
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Description
in genügender Menge enthält, so daß das Medium in Gegenwart von Staphylococcus eine bläuliche Farbe
annimmt.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein Mikroorganismus, der im Urin und in Abszessen vorkommt. Das
Vorliegen dieses Mikroorganismus im Urin ist ein zuverlässiges Anzeichen für eine Infektion des Harntrakts.
Wenn S. aureus in einer bestimmten Urinprobe vorhanden ist, können außerdem auch E. coli, Streptococcus
und andere ähnliche Organismen vorliegen.
Aufgabe der Erfindung ist es. ein verbessertes Kulturmedium zur Bestimmung von Staphylococcus
aureus bereitzustellen, das diesen Mikroorganismus selektiv zu einem polymikroben Medium in verhältnismäßig
kurzer Zeit nachzuweisen gestattet und das zur Verwendung in einem optischen Bestimmungssystem
zur Probenanalyse auf spezielle Mikroorganismen geeignet ist. Dieses System verwendet einen Kunststoffbehälter
oder eine -karte, die eine Reihe von jeweils für einen einzigen Mikroorganismus spezifischen Trockenkulturen
in gesonderten, aber miteinander verbundenen Zellen enthalten. Wenn die zu untersuchende Probe in
die Karte eingeführt, mit dem Kulturmedien in den Zeilen vermischt und in einer Vorrichtung bebrütet
wird, reagieren die in der Probe vorhandenen Mikroorganismen mit dem für sie spezifischen Kulturmedium
und führen zu einer Änderung im Medium, die von der Vorrichtung abgelesen wird und den Organismus
anzeigt. Eine Änderung des Kulturmediums kann eine Änderung der Lichtdurchlässigkeit, d. h. Farbänderung
oder Änderung der Trübung, sein. Die Änderung kann durch metabolische Aktivitäten des Mikroorganismus
bewirkt werden, die beispielsweise zur Bildung von Säure und einer Änderung des pH-Wertes führen
können und von einem pH-empfindlichen Farbindikator im Kulturmedium angezeigt werden. Die Änderung der
Lichtdurchlässigkeit kann auch durch ein Präzipitat bewirkt werden, das sich durch metabolische Aktivitäten
des Organismus bildet, oder durch ein Wachstum des Organismus bedingt sein.
Zur Lösung der gestellten Aufgabe wird erfindungsgemäß die im Patentanspruch angegebene Kulturbrühe
vorgeschlagen.
Die zur Verwendung in den oben erläuterten Karten geeignete spezifische Kulturbrühe fördert das Wachstum
von S. aureus und hemmt das Wachstum anderer Organismen; sie kann gefriergetrocknet werden und ist
unter den Bedingungen einer niedrigen Sauerstoff-Konzentration in den Behältern der Karte voll funktionsfähig.
Positive Ergebnisse werden durch Farbänderung einer in dem Kulturmedium enthaltenen biologischen
Indikatorlösung angezeigt, die von einem optischen System abgelesen wird. Der gesamte Test ist bereits
innerhalb von 12 bis 18 Stunden abgeschlossen, während
derzeitige und nicht selektiv nachweisende Bestimmungsmethoden 36 bis 48 Stunden benötigen.
Die Kulturbrühe enthält zweckmäßigerweise 7,0 bis 39,0% Nährstoffe, 0,055 bis O,17«/o des biologischen
Ό Indikators, der das positive Wachstum von Staphylococcus
aureus anzeigt, 1,0 bis 3,0 ml/1 Kaliumtellurit (einer
1%igen Stammlösung), das als biologischer Inhibitor das Wachstum gramnegativer Organismen hemmt, 3 bis
40 μg/l Amphothericin B, das als biologischer Inhibitor
ι5 das Wachstum von Hefe hemmt, 75 bis 95g/l
Natriumchlorid, das die Selektivität für Staphylococcus aureus erhöht. Natriumchlorid hemmt außerdem das
Wachstum von Styphylococcus epidermis und Streptococcus faecalis.
Der Nährstoffanteil des Kulturmediums enthält neben im Anspruch angegebenen Komponenten zweckmäßigerweise
0,2 bis 1,5 g/l Uracil; 5,0 bis 30,0 g/l Mannit; 2,0 bis 7,5 g/l eines Peptons aus dem Handel (im
folgenden »Handelspepton« bezeichnet); 2,0 bis 10,0 g/l Hefeextrakt; 5,0 bis 40,0 ml/1 einer 1 %igen Lösung eines
sterilen Hefekonzentrats mit Wachstumsfaktoren, das im Handel als Supplement zur Züchtung von Mikroorganismen
erhältlich ist (mit »B« bezeichnet), 30,0 bis 150,0 ml/1 kaliumoxaliertes Kaninchenplasma und 30,0
bis 150,0 ml/l Kaninchenserum.
Eine Kulturbrühe mit der vorstehend angegebenen zweckmäßigen Zusammensetzung des Nährstoffanteils
enthält neben Natriumchlorid, Kaliumtellurit und Amphotericin B in den anspruchsgemäßen Mengen pro
Liter Medium das DNA-Methylgrün in einer Menge von 200 bis 400 mg, das Vitamin B 12 in einer Menge von 0,2
bis 0,8 g sowie 0,15 bis 0,5 g eines sterilen lyophilierten
Konzentrats wesentlicher Wachstumsfaktoren, das im Handel als Medien-Supplement für die Züchtung von
Mikroorganismen erhältlich ist (im folgenden mit »A« abgekürzt) und weist ein pH von etwa 7,5 auf.
Statt des obigen Handelspeptons können andere Peptone, die in herkömmlichen Nährbrühen verwendet
werden, oder geeignete Stickstoffquellen eingesetzt werden.
Zweck des Uracils ist es, das Wachstum von Styphylococcus aureus unter den Bedingungen geringer
Sauerstoffkonzentration zu fördern, die in den Kartenvertiefungen herrschen. Zweck des Mannits ist es, eine
r>o Kohlenstoffquelle für Staphylococcus aureus zur Verfugung
zu stellen. Es ist von Bedeutung, daß das Kulturmedium reich an Nährstoffen ist und hierdurch
ein schnelles Wachstum von S. aureus ermöglicht.
Ein bedeutender Aspekt besteht in der Wirkung der chemischen Inhibitoren Kaliumtellurit, Natriumchlorid und Amphotericin B. Diese Inhibitoren wirken in der
Ein bedeutender Aspekt besteht in der Wirkung der chemischen Inhibitoren Kaliumtellurit, Natriumchlorid und Amphotericin B. Diese Inhibitoren wirken in der
men, Hefen, Staphylococcus epidermis, Streptococcus faecalis und anderer Organismen, die zu einem hohen
Wert positiver Ergebnisse bei herkömmlichen Bestimmungsmethoden führen, wird durch das Vorhandensein
dieser Inhibitoren gehemmt
Die wirksamste Konzentration des Kaliumtellurits (als l%ige Stammlösung) liegt bei 2,0 ml/l, die des
Amphotericins B bei 5000 μg/l und die des Natriumchlorids bei 80 g/I.
Wenn die Konzentration eines Inhibitors zu gering ist, werden höhere Werte unerwünschter Falschpositivergebnisse
erhalten, wenn die Konzentration zu hoch ist, werden niedrigere Werte an positiven Ergebnissen
erhalten.
Als Teil des biologischen Indikators wird in der Kulturbrühe DNA-Methylgrün benutzt, um in Gegenwart
von Staphylococcus aureus eine bläuliche Farbe zu erhalten, die von der automatischen mikrobiologischen
Analysenvorrichtung abgelesen wird.
Das DNA-Methylgrün wird durch nachfolgende Zugabe einer Lösung, die das oben genannte »A« und
Vitamin B 12 enthält, in ein rötliches Purpur umgewandelt
Bei Zugabe von »A« findet eine Aufhellung der grünen Farbe statt, was vermutlich durch ein
reduzierendes Material bewirkt wird, und bei Zugabe des roten Vitamins B12 ändert sich die Farbe des
Kulturmediums in ein rötliches Purpur. Wenn Staphylococcus aureus zu diesem rötlich-purpurfarbenen Kulturmedium
gegeben wird, greift dieser Mikroorganismus das DNA-Methylgrün an und es wird ein bläuliches
Purpur erhalten, wahrscheinlich auf Grund einer Reaktion von methylgrün mit einem Protein oder einem
anderen großen Molekül. Ansonsten ändert sich die Farbe des Kulturmediums in einem Staphylococcus und
DNA-Methylgrün enthaltenden Reaktionsgemisch von grün nach farblos.
Zur Herstellung eines 2X-Kulturmediums in einer Menge von 100 ml wird eine Staphylococcus-aureus-Kulturbrühe
wie folgt zusammengestellt.
47 ml destilliertes Wasser werden in einen meßzylinder eingetragen. Die Hälfte des Wassers wird zum
Sieden erhitzt, 0,1 g Uracil werden darin gelöst. Das restliche Wasser wird zur Uracillösung gegeben. 4 ml
»B«, 1,0 ml einer lOOC^g/ml-Stammlösung von Amphotericin
B und 16 g Natriumchlorid werden zu dieser Lösung gegeben. Die Lösung wird bei 40° C gerührt bis
das Natriumchlorid gelöst ist. 2,0 g Mannit, 1,0 g des obigen Handelspeptons, 1,0 g Hefeextrakt 0,4 ml einer
l°/oigen Stammlösung von Kaliumtellurit werden zur Lösung gegeben, und der pH-Wert wird auf 7,7
ίο eingestellt. Die Lösung wird filtersterilisiert und in
einem bedeckten Behälter 24 Stunden in einem kalten Raum (2° C) aufbewahrt.
50 mg DNA-Methylgrün werden zu 20 ml destilliertem Wasser gegeben und in einem bedeckten Behälter
24 Stunden in einem kalten Raum (2° C) gerührt.
Die DNA-Methylgrün-Lösung wird mit der Nährstoff/Inhibitor-Lösung in einem bedeckten Behälter
vereinigt. 10,0 ml kaliumoxaliertes Kaninchenplasma, 10,0 ml Kaninchenserum und 0,05 g »A« werden zu dem
8,0 ml einer l°/oigen Stammlösung von Vitamin B 12
werden zur Lösung gegeben. (Die l%ige Stammlösung wird durch Mischen von 0,1 g Vitamin B 12, 9,2 ml
destilliertem Wasser und 0,6 ml IN Natriumhydroxid hergestellt Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt Der
pH-Wert der Stammlösung wird auf 8,0 eingestellt). Das Vitamin B12 muß zuletzt zugesetzt werden. Der
pH-Wert der Kulturbrühe wird dann auf 7,5 eingestellt, danach wird die Brühe zentrifugiert Die überstehende
Flüssigkeit wird in einen sterilen Behälter gegossen. Das Kulturmedium hat die doppelte (2X) der üblichen
Konzentration zur Verwendung in den Behältern und Karten für die automatische mikrobiologische Analysenvorrichtung.
Claims (1)
- Patentanspruch:Kulturbrühe zur Bestimmung von Staphylococcus aureus, mit biologischen Nährstoffquellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie neben den biologischen Nährstoffquellen(a) die Stickstoffquelle Uracil(b) die Kohlenstoffquelle Mannit(c) 75 bis 95 g/l Natriumchlorid(d) 0,1 bis 0,3 g/l Kaliumtellurit(e) 2500 bis 20 000 μg/l Amphotericin B und(f) einen biologischen Indikator, enthaltend DNA-Methylgrün und Vitamin B 12,
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