DE2711684A1

DE2711684A1 - Pruefmittel zum nachweis und zur bestimmung einer komponente in einer probe

Info

Publication number: DE2711684A1
Application number: DE19772711684
Authority: DE
Inventors: Jerome Greyson; Katharine Gentry Johnston
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-03-18
Filing date: 1977-03-17
Publication date: 1977-09-22
Also published as: JPS5819220B2; NL172788C; AU2225877A; ES463418A1; NL7702607A; JPS52125397A; CH640059A5; AR213631A1; GB1529413A; IN145596B; AU509319B2; NL172788B; ES456935A1; IT1143564B; DE2711684B2; DK156524C; FR2344839A1; FR2344839B1; DK117377A; DK156524B

Description

Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente in einer Probe

Die Erfindung betrifft den Nachweis und die Bestimmung einer Komponente in einer Probe.

Die Gebiete der Diagnose in der Medizin, Physik und Chemie haben sich in den letzten fünfundzwanzig Jahren stark ausgeweitet, sodaß speziell im medizinischen Bereich viele Parameter unglaublich leicht und schnell bestimmt werden können.

Ein derartiges Gebiet, das sich besonders stark ausgedehnt hat, ist das der medizinischen Diagnose, wo viele Körperfunktionen untersucht werden können, indem man lediglich einen reagenshaltigen Streifen in ein Probe der Körperflüssigkeit wie Urin eintaucht und das Ansprechen, z.B. das Auftreten oder die Änderung einer Farbe oder eine Änderung des reflektierten Lichtes an dem Streifen, beobachtet.

Im Zusammenhang mit diesen "dip-and-read"-Verfahren sind zahlreiche chemische Bestimmungen zum Nachweis von Komponenten in Körperflüssigkeiten möglich. Bei den meisten dieser Bestimmungen tritt eine nachweisbare Reaktion auf, die quantitativ oder zumindest semiquantitativ ist. So kann der Analytiker,

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wenn er die Reaktion nach einer vorher bestimmten Zeit mißt, nicht nur einen positiven Nachweis für das Vorhandensein eines bestimmten Bestandteiles in einer Körperflüssigkeit erhalten, sondern auch abschätzen, wieviel dieses Bestandteils vorhanden ist. Dadurch liefern diese Streifen dem Mediziner ein leichtes diagnostisches Mittel sowie die Möglichkeit, das Ausmaß einer Erkrankung oder Fehlfunktion des Körpers zu bestimmen. Beispiele für derartige Teststreifen, wie sie zur Zeit im Handel sind, sind CLINISTIX® MULTISTIX® KETOSTIX® N-MULTISTIX® DIASTIX® PHENISTIX®und DEXTROSTIX® der Arnes Company Division of Miles Laboratories, Inc. und andere. Prüfmittel wie diese umfassen üblicherweise eine oder mehrere Trägermatrices, wie absorbierendes Papier, in denen jeweils ein spezielles Reagenssystem absorbiert ist, das in Gegenwart einer bestimmten Komponente in der zu untersuchenden Probe eine Farbänderung oder ein Auftreten einer Färbung ergibt. Je nach dem spezifischen in eine bestimmte Matrix eingebauten Reaktionssystem, kann man mit Hilfe dieser Prüfmittel das Vorhandensein von Glucose, Albumin, Ketonen, Bilirubin ,okkultem Blut, Nitrit, Urobilinogen, die Wasserstoffionenkonzentration (pH-Wert) oder ähnliches bestimmen. Das spezifische Auftreten einer Farbe und deren Intensität, wie sie innerhalb eines bestimmten Zeitraumes nach der Berührung des Streifens mit der Probe auftritt, ist ein Zeichen für das Vorhandensein einer bestimmten Komponente und deren Konzentration in der Probe. Einige dieser Prüfmittel und Reaktionssysteme sind in den US-PS 3 123 443 (CLINISTIX^, 3 212 855 (KETOSTOX^, 3 814 668, 3 164 534 und 2 981 606 (DIASTIX^, und 3 092 465, 3 298 789, 3 164 534 und 2 981 606 (DEXTROSTIX^ angegeben.

Typischerweise kommen diagnostische Reagentien oder Prüfmittel, wie "dip-and-read"-Reagensstreifen, mit detailierten, gedruckten Anweisungen in den Verkehr, die sorgfältig befolgt werden müssen, um eine entsprechende Genauigkeit zu erreichen. Wenn das Ansprechen in einer Farbänderung besteht, ist

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besondere Vorsicht erforderlich. Eine Karte mit unterschiedlichen Färbungen ist zum Vergleich mit dem Streifen vorgesehen, und da in den meisten Fällen die Genauigkeit der quantitativen Bestimmung der Vorrichtung von der Bestimmung der Farbbildung in Beziehung auf die Zeit abhängt, ist es unbedingt erforderlich, daß die Farbänderung innerhalb eines vorbestimmten Zeitraums nach dem Eintauchen in die Probe mit der Farbkarte verglichen wird. Die Reaktionszeiten müssen genau eingehalten werden - eine zu frühe Ablesung führt zu einer zu geringen Farbbildung und eine zu späte Ablesung zu einer zu intensiven Farbbildung oder sogar zum Auftreten einer zusätzlichen störenden Farbe. Daher kann, wenn die Farbentwicklung zu früh oder zu spät mit der Farbkarte verglichen wird, ein ungenaues Ergebnis erhalten werden, und das ist häufig der Fall.

Um dieNotwendigkeit der genauen Zeiteinhaltung für die Ablesung auszuschalten, die sowohl unbequem ist als auch möglicherweise zu ungenauen Ergebnissen führt, wurde ein umfangreiches Forschungsprogramm durchgeführt, um einen Weg zu finden, dieses Erfordernis der genauen Zeitbestimmung für die Ablesung bei bekannten Prüfmitteln zu umgehen, In erster Linie wurde nach einer Möglichkeit gesucht, wobei das nachweisbare Ansprechen 'automatisch nach einer vorbestimmten Zeit

*) abgebrochen würde und wobei die wahrnehmbare Reaktion über verhältnismäßig lange Zeiträume konstant bliebe. Dadurch könnte der Vergleich mit der Farbkarte zu einem für den Anwender günstigen Zeitpunkt oder zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden, der von dem Zusammenbringen des Prüfmittels mit der Probe einige Zeit entfernt ist. Es besteht in der Fachwelt Übereinstimmung darüber _f daß dadurch die bekannten Prüfmittel ganz entscheidend verbessert werden könnten. Bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Anmeldung ist die Entwicklung derartiger Prüfmittel jedoch noch nicht gelungen.

*) (response)

..Λ

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Die Erfindung betrifft kurzgesagt ein Prüfmittel, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu deren Herstellung sowie ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Komponente in einer Probe. Das Mittel enthält ein Reagenssystem, das bei Berührung mit der Komponente mit dieser unter Bildung einer nachweisbaren Reaktion in Wechselwirkungen tritt, und ein Hemmsystem, das nach Berührung mit der Probe das Reagenssystem davor bewahrt, nachdem eine bestimmte Zeit vergangen ist, weiter mit der nachzuv/eisenden Komponente zu reagieren. Die Vorrichtung umfaßt eine Trägerraatrix, in die das Prüfmittel eingebaut ist. Das Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Komponente in einer Probe besteht darin, daß man die Probe, in der die Komponente vermutet wird, mit einem Prüfmittel bzw. einer Vorrichtung zusammenbringt, in denen das Testsystem enthalten ist,und die^Probe enthaltende Matrix eine vorbestimmte Zeit inkubiert und das Ansprechen beobachtet.

Das erfindungsgemäße Prüfmittel ist anwendbar für viele diagnostische Bestimmungen und umfaßt auch bekannte Reagenssysteme, die zur Zeit im Gebrauch sind, wie Indikatoren für den pH-Wert und andere Ionenkonzentrationen und kompliziertere Reagenssysteme, wie solche, die angewandt werden zur Bestimmung von Bestandteilen von Körperflüssigkeiten. Derartige Prüfmittel können besonders günstig erfindungsgemäß verbessert v/erden. Bekannte Prüfmittel und Prüfvorrichtungen zum Nachweis und zur Bestimmung von okkultem Blut, Glucose, Bilirubin, Harnstoffstickstoff im Blut, Bakteriurie, Urobilinogen, Cholesterin, Protein und anderen Bestandteilen können erfindungsgemäß modifiziert werden.

Erfindungsgemäß können bekannte oder neue Reagenssysteme angewandt werden, wobei die Wechselwirkung zwischen der Komponente in der Probe und dem Reagenssystem nach Ablauf einer bestimmten Zeit abgebrochen wird. Dadurch ist

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das Ausmaß der nachweisbaren Reaktion für ein bestimmtes Reagenssystem festgelegt: Ein« bei der Wechselwirkung
auftretende Farbe wird weder stärker noch schwächer; die Menge an ultraviolett-empfindlichem Produkt, das gebildet oder verbraucht wird bei der Wechselwirkung, bleibt
konstant.

Diese beschriebenen Wirkungen können auf verschiedene Weise erreicht werden. Ein bevorzugter Weg besteht
darin, ein Hemmsystem zuzusetzen, das eine weitere Wechselwirkung physikalisch verhindert durch Bildung eines
Gels, eines Polymers oder einer gehärteten Oberfläche,
wodurch die physikalische Berührung zwischen dem Reaktionssystem und der nachzuweisenden Komponente nach Ablauf eines bestimmten Zeitraumes unterbrochen wird.

Ein anderer Weg besteht darin, dem Mittel ein Hemmsystem zuzusetzen, das das Reagenssystem inaktiviert. So kann, wenn ein wärmoempfindliches Enzym für das Funktionieren des Reagenssystemes wichtig ist, das Hemmsystem
ein wärmeerzeugendes Mittel sein, das die Temperatur des Prüfmittels bis zu dem Punkt erhöht, wo das Enzym inaktiviert wird nach Ablauf eines bestimmten Zeitraumes.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, ein Hemmsystem anzuwenden, das eine oder mehrere Komponenten des Reagenssystems vergiftet oder chemisch stört und dadurch die Wechselwirkung mit der Komponente in der Probe nach
einem vorbestimmten Zeitraum unterdrückt. Die Erfindung
betrifft diese und andere Hemmsysteme, wobei der entscheidende Faktor die Fähigkeit des Hemmsystems ist, daß es eine Wechselwirkung zwischen dem Reagenssystem und der zu bestimmenden Komponente während der Zeit der Berührung zwischen der Probe und dem Prüfmittel erlaubt, aber eine solche Wechselwirkung zu einem späteren vorher festgesetzten Zeitpunkt unterdrückt.

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Für ein Heminsystem, das die Wechselwirkung zwischen dem Reagenssystem und der Komponente physikalisch verhindert, d.h. ein Hemmsystem, das härtet oder ein Gel bildet, bestehen verschiedene Möglichkeiten. Zu den gelbildenden oder härtenden Substanzen, die anwendbar sind, gehören solche, die bei Raumtemperatur schnell reagieren und deren Reaktion beginnt oder eingeleitet wird bei Berührung mit der zu untersuchenden Probe. Diese Hemm-Mittel müssen mit einer ausreichenden Geschwindigkeit erhärten oder ein Gel bilden, das eine nachweisbare Reaktion nach einer verhältnismäßig kurzen Zeit hemmt. Gleichermaßen günstig ist es, wenn das gehärtete oder zu einem Gel umgeformte Hemmsystem eine weitere Farbänderung verhindert oder die nachweisbare Reaktion auf andere Weise beendet wird.

Typisch für derartige Hemmsysteme sind polymerisierbare oder vernetzbare wasserlösliche Polymere, Epoxid-Polyamin-Gemische, mit Wasser reagierende Polyisocyanate, durch Hydroxylionen polymerisierbar Acrylat- und substituierte Acrylatester, Gemische von Polyvinylalkohol mit verschiedenen Metallverbindungen (z.B. Boraten, Vanadaten, Cr (III) und Ti (IV)), Natriumcarboxymethylcellulose und Al (III), Gemische von Polyvinylalkohol mit mehrwertigen Phenolen (polyphenolischen Verbindungen)(z.B. Resorcin, Brenzcatechin, Phloroglucin und Farbstoffen und Diazoniumsalzen), ein Gemisch von Polyvinylalkohol und Dimethylolharnstoff mit einem Ammoniumchloridkatalysator, Gemische von Dimethylolharnstoff mit Hydroxyalkylcellulose und hydrolysieren Maleinsäureanhydridcopolymeren oder Polyacrylsäure, Gemische von Polyvinylalkohol und Polyaldehydhaltigen Verbindungen, Polyvinylpyrrolidonkomplexe (d.h. mit Substanzen wie Polycarbonsäuren, einem Methylvinyläther/ Maleinsäureanhydrid-Copolymer (GAF Corporation) oder einer Polyacrylsäure), Gemische von saurem Copolymer und PoIyäthylenglykol sowie Gemische von Polyvinylalkohol mit Ausfällmitteln (z.B. Na₂CO₃, Na₂SO₄ oder K₂SO₄).

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Eine Verzögerung der Polymerisation oder Vernetzung des wasserlöslichen Polymers kann erreicht werden, indem man die Initiatoren von dem wasserlöslichen Polymer isoliert bis das Prüfmittel mit der zu untersuchenden Probe in Berührung gebracht worden ist. Eine Möglichkeit,eine solche Trennung von Polymer und Initiator zu erreichen, besteht darin, den Initiator in wasserlösliche Mikrokapseln einzuschließen oder

aufbrechen, in Mikrokapseln, die beim Benetzen So würden sich Gelatinemikrokapseln, die den Initiator enthalten, bei Berührung mit einer wäßrigen Probe lösen und dadurch den Initiator freisetzen, wodurch das wasserlösliche Polymer polymerisieren könnte.

Mikrokapseln, die beim Benetzen aufbrechen, umfassen osmotisch zerbrechliche semipermeable membranartige Wände, in denen eine wäßrige Phase eingeschlossen ist, die den Initiator enthält. Die wäßrige Phase besitzt ein relativ hohes spezifisches Gewbht, bezogen auf die zu untersuchende Probe. Wenn die Kapseln mit der Probe in Berührung kommen, tritt über die Membran ein osmotischer Gradient auf, der zu einer Zunahme des Druckes innerhalb der Kapsel führt, die ausreicht, um die Wände aufzubrechen und dadurch den Initiator freizusetzen.

Eine physikalische Hemmung durch Trennung des Reagenssystems von der zu bestimmenden Komponente kann auch mit einem Hemmsystem erreicht v/erden, umfassend ein Epoxid und eine desaktivierte Polyaminquelle, die bei Berührung mit Wasser verfügbare Polyamine ergibt. Typische derartige PoIyaminquellen sind Ketimine und Molekularsiebe, die mit PoIyamin imprägniert sind. Im ersten Fall reagiert das Ketimin mit Wasser unter Bildung von Polyamin und einem Keton, im letzten Falle kann Wasser in die Struktur des Molekularsiebes eindringen und das Polyamin daraus verdrängen.

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Wahlweise kann das Prüfmittel ein Polyisocyanat enthalten, das mit V/asser einen Schaum bildet (z.B. Hypol , der Dewey and Almy Chemical Division of W.R. Grace & Co.).

Von den Basen-oder ilydroxylionen-katalysierten Acry-Iathemmsysteine sind 2-Cyanoacrylatester erfindungsgemäß besonders geeignet. Diese Ester sind wesentliche Bestandteile von Klebemitteln (Eastman Kodak Company) und können in Gegenwart von Wasser leicht zu harten Polymeren polymerisieren. Die Methyl- und Äthylester sind hauptsächlich in kommerziellen Klebemitteln erhältlich (z.B. von Kodak), und die Klebemittel enthalten Stabilisatoren und Verdickungsmittel neben den Estern. Methyl-2-cyanoacrylat ist enthalten in Eastman 910 und Äthyl-2-cyanoacrylat ist der hauptsächliche Ester in Eastman 910 EM.

Polyvinylalkohol bildet in Gegenwart von Alkali, wie Natriumhydroxid, wenn er mit Borsäure vermischt wird, schnell ein Gel und ist daher als Hammsystem geeignet. Ein bevorzugtes Verfahren zur Ausnutzung dieser Alternative besteht darin, das Alkali in Form von wasserlöslichen oder osmotisch zerbrechlichen Mikrokapseln dem Prüfmittel zuzusetzen. So kommen, wenn das Prüfmittel mit der Probe in Berührung kommt, alle Reagentien des Hemmsystems zusammen, und durch die Bildung eines Gels wird die Analyse abgebrochen.

Außer mit Borax (Borsäure und Alkali) bildet Polyvinylalkohol auch mit einer Vielzahl anderer Metallionen und Salze, wie Vanadaten, dreiwertigem Chrom und vierwertigem Titan, Gele. Zum Beispiel machen Kaliumtitanoxalat (TiO(CpO-K)₂.2HpO) und andere organische Titanate Polyvinyldkohol bei Raumtemperatur bei einem pH-Wert oberhalb von ungefähr 7 schnell unlöslich. Außerdem bildet Polyvinylalkohol mit mehrwertigen Phenolen, wie Resorcin, Brenzcatechin, Phloroglucin und bestimmten Farbstoffen und Diazoniumsalzen thermisch reversible Gele.

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Polyvinylalkohol ist erfindungsgemäß auch geeignet durch seine Fähigkeit über eine Acetalbildung mit 1,3-Bishydroxymethylharnstoff (Dimethylolharnstoff) und ähnlichen Verbindungen in Gegenwart von Ammoniumchlorid zu vernetzen. Wie bei vielen der vorhergehenden Systeme kann der Katalysator oder Initiator (Nh,Cl) durch Einschluß in Mikrokapseln isoliert werden.

Mehrwertige Aldehyde reagieren ebenfalls mit Polyvinylalkohol unter Bildung von vernetzenden Acetalgruppen. Bei diesem Verfahren wird ein saurer Katalysator, wie Oxalsäure oder eine andere Säure, die mit dem Reagenssystem verträglich ist, dem Prüfmittel zugesetzt, und der Aldehyd wird von dem Polyvinylalkohol, z.B. durch Einschluß in Mikrokapseln getrennt. Natürlich kann anstelle des Aldehyds auch die Säure abgetrennt werden, vorausgesetzt, daß der Aldehyd gegenüber dem Polyvinylalkohol in Abwesenheit eines Katalysators ausreichend inaktiv ist.

Polymere Präzipitate (Niederschläge) haben sich ebenfalls als erfindungsgemäßes Hemmsystem als geeignet erwiesen. Beispiele hierfür sind die Ausfällung von Polyvinylalkohol aus einer Lösung durch Salze, wie Na₂CO,, Na₂SO^ und K₂SO^. Darüberhinaus können polymere Säuren, wie Polyacrylsäure, aus einer Lösung ausgefällt oder geliert werden durch Acetatsalze von Schwermetallen und andere wasserlösliche Quellen zweiwertiger Ionen sowie durch Polyäthylenglykol.

Hydroxypropylcellulose (KLUCEI)^ der Hercules, Inc.) ist ein weiteres Polymer, das geeignet ist als Heinmsystem für die erfindungsgemäßen Prüfmittel. Diese Substanz kann mit sauren Polymeren, wie hydrolysierten Maleinsäureanhydridcopolymeren oder Polyacrylsäure unter Verwendung vnn Verbindungen, wie Dimethylolharnstoff, vorzugsweise bei einem niedrigen pH-Wert vernetzt werden.

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Ein weiteres System, das ein Gel bildet und das erfindungsgemäß geeignet ist, ist Natriuracarboxymethylcellulose und Al (Ill)-Ionen.

Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid-Copolymer (GANTREZ^AiM der GAi' Corporation) ist auf verschiedene Weise für die erfindungsgemäßen Prüfmittel anwendbar. Es bildet einen unlöslichen Komplex mit Polyvinylpyrrolidon bei pH-Werten unter ungefähr 5. Polyacrylsäure verhält sich ähnlich wie GANTREZ^Αίί mit Polyvinylpyrrolidon. GANTREZ®AN bildet auch einen unlöslichen Komplex mit Gelatine in saurer Lösung. Ähnlich werden GANTREZ^AN und andere Säurepolymere und Copolymere durch Verbindungen, wie Glykole, Polyvinylalkohol, Hydroxyalkylcellulose und Diamine ausgefällt.

Wie oben angegeben können erfindungsgemäß auch andere Hemmsysteme angewandt v/erden. So kann ein anderes Hemmsystem angewandt werden als diejenigen, die das Reagenssystem physikalisch von der zu analysierenden Komponente trennen. Zum Beispiel wirkt ein wärmeempfindliches Enzym nicht in einem Reagenssystem, wenn die Temperatur des Systems ausreichend hoch wird, um es zu decaktivieren. Folglich kann ein Prüfmittel, das ein derartiges Enzym enthält, daran gehindert werden nach einer vorbestimmten Zeit noch eine nachweisbare Reaktion zu ergeben durch Anwendung eines wärmeentwickelten Heramsystems.

Ähnlich kann das Hemmsystem ein Gift für das Reagenssystem enthalten. Zum Beispiel werden Enzyme, die Mercaptogruppen (-SH) enthalten, durch Hg(II) desaktiviert, und Enzyme werden im allgemeinen in Gegenwart starker Säuren und Basen wie HCl und NaOH inaktiviert. Beispiele für Enzyme, die durch Hg(II) gehemmt werden, sind Glutamatdecarboxylase, Lactatdehydrogenase, I⁷IaIatdehydrogenase, Myokinase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase (pH 5,2), Aldehydoxidase,

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Diaminosäureoxidase, ß-Amylase, Kohlensäureanhydratase, Cholinesterase, iV-Glucosidase, ß-Glucuronidase, Homogentisatoxidase, 3-Hydroxyanthranilatoxidase und Invertase. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch den Einbau derartiger Hemmsysteme in das Prüfmittel.

Wärmelabile Enzyme, wie Salicylathydroxylase, können ebenfalls angewandt werden. Substanzen, die bei Berührung mit einer wäßrigen Probe Wärme entwickeln, sind z.B. NaOH, AlCl,, TiCl,, Aluminiumalkyle und andere.

Eine Möglichkeit, die Denaturierung oder Vergiftung eines Enzyms hinauszuzögern, besteht darin, das wärmeerzeugende oder das Enzym vergiftende System durch Einschluß in Mikrokapseln abzutrennen. Derartige wasserlösliche Kapselmaterialien können so ausgewählt v/erden, daß die wärraeerzeugenden Substanzen nicht mit der Probe in Berührung kommen bis das Kapselmaterial gelöst ist. Wasserlösliche Materialien, wie Gelatine, Acrylamide, Styrol/Maleinsäure-Copolymere und Hydroxypropylcellulose sowie Gemische wie ein Coacervat aus Gelatine und natürlichen oder synthetischen Polymeren, haben sich für die Einkapselung als geeignet erwiesen.

Wie oben gesagt, sind Mikrokapseln verschiedener Art besonders geeignet für die erfindungsgemäßen Zwecke, wenn Bestandteile zeitweilig getrennt werden müssen. Sie können nach verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein Beispiel hierfür ist das Verfahren, das beschrieben ist, in Angewandte Chemie, International Edition, 14, 539 (1975) und der dort angegebenen Literatur. Verfahren, wie Grenzschichtpolykondensation, Coacervation und ähnliches, führen zur Bildung von Mikrokapseln. Andere Verfahren, wie Zentrifugieren, Sprühtrocknen und andere physikalisch-mechanische Verfahren,finden ebenfalls Anwendung zur Herstellung von Mikrokapseln.

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Die Grenzschichtpolykondensation ist das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Mikrokapseln, da sie verhältnismäßig einfach ist. Bei diesem Verfahren werden zwei reaktionsfähige Substanzen (Comonomere oder Oligomere) dazu gebracht, an der Grenzschicht eines Mehrphasensystems miteinander zu reagieren. Dort tritt eine Polykondensation auf und bildet einen dünnen polymeren Film, der in den die Monomere enthaltenden Medien unlöslich ist. Geeignete osmotisch zerbrechliche Mikrokapseln wurden hergestellt durch Lösen einer ersten Comonomerkomponente, wie eines mehrwertigen Amins, in einer wäßrigen Phase, enthaltend die zu isolierende Substanz. Diese wäßrige Phase ist vorzugsweise eine solche mit einer hohen spezifischen Dichte oder Osmolalität in Bezug auf den zu erwartenden Osmolalitatsbereich der zu analysierenden Probe. Diese wäßrige Phase wird dann in einer mit Wasser nicht mischbaren Phase, wie einem Mineralöl,dispergiert oder ernulgiert. Ein zweites Comonomer, wie ein polyfunktionelles Acylhalogenid, wird dann zu der Suspension oder Emulsion zugegeben. Wenn die Comonomere mehrwertige (polyfunktionelle) Amine und Acylhalogenide sind, werden Polyamidmikrokapseln gebildet, von denen jede einen Teil der v/äßrigen Phase, d.h. der isolierten Substanz enthält.

Geeignete polymere Substanzen zur Bildung osmotisch zerbrechlicher semipermeabler Membranwände für die Mikrokapseln sind neben Polyamid, Polyester, Polyurethan, PoIyharnstoff und ähnliches.

Eine andere Möglichkeit, die Bestandteile des Hemmsystems zu trennen, wenn einer der Bestandteile in Wasser und der andere in organischen Lösungsmitteln löslich ist, besteht in einem zweifachen Eintauchverfahren ("two-dip"-process). Dabei wird die Trägermatrix des Prüfmittels zunächst mit einer wäßrigen Lösung eines Bestandteils

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imprägniert, getrocknet und anschließend mit einer zweiten Lösung des anderen Bestandteiles in einem organischen Lösungsmittel imprägniert.

Bei einigen der oben beschriebenen Hemrasysteme, bei denen keine Trennung bzw. Isolierung der Bestandteile erforderlich ist, wie denjenigen, bei denen 2-Cyanoacrylate, mit Wasser schäumbare Isocyanate und Epoxidreagentien angewandt werden, muß sorgfältig darauf geachtet werden, Feuchtigkeit auszuschließen, sowohl während der Herstellung des Prüfmittels und der Vorrichtung als auch bei der Lagerung vor der ündanwendung. Dadurch wird eine Polymerisation des Hemrasystems vermieden bis zur Berührung mit der zu untersuchenden Probe.

Gelbildende oder härtende Hemmsysteme, von denen einige typische oben angegeben sind, und das gewünschte Reagenssystem können auf irgendeine geeignete V/eise zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung in eine Trägermatrix eingebaut werden. So kann eine Trägermatrix in eine einzige Lösung aller Bestandteile des Reagenssystems und Hemmsystems getaucht werden. V/ahlweise wird, wenn ein zweistufiges Eintauchverfahren zur Isolierung der Bestandteile erforderlich ist, die Matrix nacheinander eingetaucht, getrocknet und erneut eingetaucht, wie oben beschrieben. Y/enn Mikrokapseln angewandt werden, können diese mit Hilfe von Bindemitteln an der Matrix fixiert werden. Dabei haben sich als besonders geeignet erwiesen Celluloseacetat, Celluloseacetatbutyrat, Hydroxypropylcellulose und Polyvinylpyrrolidon. Bindemittel sollten mit der zu untersuchenden Probe unmischbar sein und eine Absorption der Probe in der Trägerrnatrix nicht hindern.

Geeignete Substanzen, die als Trägermatrix für die erfindungsgemäße Vorrichtung geeignet sind, umfassen Papier,

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Cellulose, Holz, Vliese aus synthetischen Harzen, Glasfaserund andere synthetische Papiere, Polypropylenfilz, Vliesstoffe und Gewebe und ähnliches. Die Matrix v/ird günstigerweise an einem üblichen Träger, wie einem polymeren Streifen, befestigt, um die Anwendung zu erleichtern.

Bei der Anwendung der Vorrichtung wird die Matrix, die das Reagenssystem und Hemmsystem enthält in die zu untersuchende Probe eingetaucht. Man läßt die vorherbestimmte Zeit, die der Vorrichtung entspricht, verstreichen und die Vorrichtung wird dann auf eine nachweisbare Reaktion untersucht. Wenn die Reaktion eine Farbbildung oder-änderung ist, kann die Vorrichtung mit einer Standardfarbkarte verglichen werden. Sollte bei der Reaktion eine Änderung der Lichtreflexion auftreten, wird die Vorrichtung mit einem geeigneten Lichtraeßgerät, v/ie es bekannt ist, untersucht.

Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Eine Lösung von 10 Gew.-% Eastman 910-Klebemittel, enthaltend Methyl-2-cyanoacrylat (Eastman Chemical Products, Inc., Kingsport, Tennessee, a subsidiary of Eastman Kodak Company) wurde hergestellt und in einem dicht verschlossenen Glasgefäß aufbewahrt. Ein Prüfmittel zum Nachweis von Glucose in Urin (ähnlich wie CLINISTIX^) wurde auf die folgende Weise hergestellt. Filterpapiere (Whatman 3MM) wurden mit einer Lösung eines Testreagenses wie in den US-PS 2 981 606 und 3 154 534 imprägniert und getrocknet. Speziell wurde die folgende Rezeptur angewandt:

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7 0 9 8 3 8 10 9 4 U

CLINISTIX^-Re zeptur

Destilliertes Wasser	758,1 ml
Äthanol (95 %)	205,0 ml
Carageenan Viscarin	2,5 g
(Marine Colloids, Inc.)
Polyvinylpyrollidon	25,0 g
Farbstoffe (FD&C 3&4)	0,29 g
o-Tolidin«2HCl	5,0 g
Citronensäure (v/asserfrei)	15,42 g
Natriumeitrat	67,92 g
GAWTRE2® AN-139	7,5 g
Oberflächenaktives Mittel	2,5 g
Glucoseoxidase	76,0 ml
Peroxidase	0,5 g

Teile dieses imprägnierten Papiers wurden dann weiter mit den oben beschriebenen Lösungen imprägniert. Andere wurden als Vergleich nur mit Chloroform behandelt. Der Imprägnierbehälter erlaubte den Ein- und Austritt des Papiers, war jedoch abgedeckt, um eine Verdampfung des Chloroforms zu verhindern, während ein Überschuß an Imprägnierlösung von dem Papier in einer lösungsmittelreichen Atmosphäre innerhalb des Gefäßes ablaufen konnte. Nach Entfernung des Papiers aus dem Bad konnte das Lösungsmittel 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Atmosphäre geregelter niedriger Feuchtigkeit (^10%RIi) trocknen. Das mit dem Monomer imprägnierte Papier wurde in dunkler trockner Atmosphäre gelagert und anschließend auf einer Kunststoffunterlage befestigt und in die üblichen Reagensstreifen geschnitten. Diese Streifen wurden dann in dunklen Glasflaschen in Gegenwart von Silicagel als Feuchtigkeitsadsorbens gelagert.

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7 0 9 8 3 8 ro 9 U k

Die so hergestellten Streifen wurden untersucht, indem sie einzeln 3s in Urinproben mit bekannter Glucosekonzentration (0, 50, 100, 200 und 500 mg/dl) getaucht wurden, ein Überschuß der Probe wurde entfernt und die Streifen wurden in eine Vorrichtung zur Reflexionsmessung gegeben. Die Ablesung der Reflexion bei680 nm wurde als Funktion der Zeit von t = 15 s einschließlich der Eintauchzeit über 3,5 min notiert. In Tabelle I sind die Änderungen der Reflexionswerte in Intervallen und die Endreflexionswerte für das Glucose-spezifische Papier, das mit 10 % L'astman 910 imprägniert war, für verschiedene Glucosekonzentrationen angegeben. Die Änderung der Reflexion bei 15 s ist die Differenz gegenüber dem Reflexionswert, wenn keine Glucose vorhanden ist.

Aus diesen Werten geht hervor, daß nach 2 min keine Änderung des Reflexionswertes mehr auftritt. Diese Endfärbungen können klar visuell unterschieden werden und bleiben über Zeiträume von einigen Tagen bis zu mehreren Wochen, je nach den Lagerbedingungen stabil.

Die Teststreifen, die nur mit Chloroform imprägniert waren(Veigladü ,entwickelten sehr intensive farben 10 s nach dem Eintauchen, aber die Farbentwicklung schritt rasch voran, und nach zv/ei Minuten waren die Streifen schv/arz, und es konnte keine Differenzierung mehr vorgenommen werden.

Tabelle I

Änderung eier Reflexion mit der Zeit nach Berührung mit der Probe

Glucose	15	40	65	90	115	140	165	215	Ende
Konzen	S	S	S	S	S	S	S	S
tration	ä%	Δ %			ft %	*Δ %*		Δ%	% R
(mg %)	R*	R+	R+	R+	R+	R+	R+	R+
50	6,8	3,5	3,5	0,1	0	0	0	0	59
100	13,8	13,8	5,6	2,0	0,1	0	0	0	43
200	22,6	15,3	6,2	2,7	0,7	0	0	0	31
500	30,8	15,7	6,5	2,7	0,7	0	0	0	22

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* SlR bei t = 15 s = %R ' -%r

(O mg%(Glucose) (n mg% Glucose)

+ %R bei t = t s = 56K -%R

(vorherige t)

Beispiel 2

Vorher hergestelltes glucoseempfindliches Reagenspapier wurde wie in Beispiel 1 mit einer Chloroforralösung, enthaltend 10 % Eastman 910 EM (Äthyl-2-cyanoacrylat), 1 % (Gew./Vol.) festes nichtionisches Detergens und 0,01 % (Gew./Vol.) feste Dicarbonsäure, imprägniert. Die aus diesem imprägnierten Papier hergestellten Streifen zeigten Eigenschaften ähnlich denjenigen nach Beispiel 1, und die gefärbten Streifen waren besonderes gleichmäßig.

Beispiel 5

Es wurde ein ketonempfindliches Reagenspapier entsprechend der US-PS 3 202 855 hergestellt durch Eintauchen von Whatman 3HM-Filterpapier in das folgende erste Eintauchgemisch, Trocknen und anschließendes Eintauchen in das zweite Gemisch.

Erstes Gemisch

H₂O 722 ml

dreibasisches Natriumphosphat 202,2 g zweibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) 86,7 g

Aminoessigsäure 180,6 g

Zweites Gemisch

Oberflächenaktive Mittel 1,64 g Polyvinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolyraer E-535 67 ml

Natriumnitroferricyanid 8,24 g

Dimethylsulfoxid 401 ml

Chloroform 350 ml

Äthanol (wasserfrei) · 200 ml

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So hergestellte Streifen wurden dann mit einer Chloroformlösung, enthaltend 10 Gew.-% Eastman 910 EM,wie in Beispiel 1, imprägniert. Aus diesem imprägnierten Papier hergestellte Streifen, die mit Urinproben, enthaltend verschiedene Konzentrationen an Acetessigsäure untersucht wurden, zeigten ausgezeichnete Eigenschaften bezüglich der Farbentwicklung und FärbIntensitäten, die typisch waren für die Acetoessigsäurekonzentration in dem untersuchten Urin und blieben stabil.

Beispiel 4

Glucoseempfindliches Reagenspapier wurde mit einer Benzollösung von 10 % Eastman 910, enthaltend Methyl-2-cyanoacrylat, imprägniert. Diese Streifen zeigten bei der Untersuchung die gleichen ausgezeichneten Eigenschaften wie die Streifen der vorherigen Beispiele.

Beispiel 5

Ein "one-dip"-System wurde mit der folgenden Rezeptur hergestellt.

Reagens A

3-basisches Natriumphosphat 2,02 g

2-basisches wasserfreies Natriumphosphat 0,87 g

Aminoessigsäure (Glycin) 1,81 g

Natriumnitroferricyanid

(gemahlen und getrocknet) 82,4mg

Reagens B

Dioctylnatriumsulfosuccinat 8,4 mg

GAFAC®oberflächenaktives Mittel RE-610

(der GAF Corporation) 8,0 mg

Chloroform 16,7 ml

Hypor^2000 (Polyurethanprepolymer)

0,9 g

mischen bis alles gelöst ist

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Alle Bestandteile des Reagens A wurden in einem Mörser zu einem feinen Pulver vermählen und in Reagens B suspendiert. Trockenes Whatman 3MM-FiIterpapier (erhältlich von 3M Co., St. Paul, Minn.) wurde mit dieser Suspension imprägniert und die aus diesem imprägnierten Papier hergestellten Streifen mit Urinproben, enthaltend verschiedene Konzentrationen an Acetoessigsäure, untersucht. Die Farbintensitäten der Streifen waren stabil und eine Funktion der Acetoessigsaurekonzentration in dem untersuchten Urin.

Beispiel 6

Mn Glucoseindikatorreagens und eine Enzymlösung der folgenden Zusammensetzung wurden hergestellt:

Glucoseindikatorreagens

Destilliertes Wasser 16,6 ml

Polyvinylpyrrolidon (PVP) 9,5 ml

Kaliumiodid 1,5 g

FD&C blau Nr. 1 5,3 mg

Citronensäure 0,497 g

Trinatriumcitrat 2,182 g

(Äthylendinitrilo)-tetraessigsäuretetranatriumsalz 1,67 g

GANTREZ^AN, 10-&Lge Lösung 5 ml

Enzymlösung 16,7 ml

Enzvmlösung

225 ml Glucoseoxidase
0,842 g Peroxidase

Alle oben angegebenen Reagentien wurden vermischt bis sie in Lösung waren. Gleiche Volumina dieser Reagensindikatorlösung, glucosehaltiger Urin und Hypol^2000 wurden in die Aushöhlung einer Tüpfelplatte gegebenund mit einem Spa · tel vermischt bis das/zu schäumen begann (ungefähr 1 min).

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Das Prepolymer bildete einen gefärbten festen Schaum in 3 bis 5 rain.

Das System entwickelte, v/enn es mit Urin, enthaltend 0, 100, 250, 500, 1000 und 2000 mg Glucose/dl, untersucht wurde, nach einer kurzen Zeit eine stabile farbe, und die Farbintensitäten waren ein Haß für die Konzentration an Glucose. Die Endfarben variierten von blau bis grün bis braun, je nach der Glucosekonzentration, und wurden mit Farbstandards verglichen.

Da ein Tropfen Hypol®2000 ausreichend Schaum bildet, um die Vertiefung in der Tüpfelplatte auszufüllen, kann der Versuch mit einem Tropfen einer Urinprobe durchgeführt und noch visuell ausgewertet werden.

Beispiel 7

Ketonspezifisches Reagenspapier wurde gernäß der US-PS 3 212 855 hergestellt und mit einer 10-%igen Chloroformlösung von Hypol^2000, einem mit Wasser schäumbaren Urethanprepolymer (Dev/ey and Almy Chemical Division of" W.R. Grace Co.)imprägniert. Diese Lösung kann zusätzlich irgendeines von verschiedenen ionischen Detergentien in einer Konzentration zwischen 1 und 5 %, bezogen auf das Gewicht des Prepolymers,enthalten. Streifen, die aus diesem imprägnierten Papier hergestellt worden waren, wurden mit Urinproben, enthaltend unterschiedliche Mengen Acetoessigsäure, untersucht und zeigten Entfärbungen innerhalb von 2 bis 4 min. Diese Farbintensitäten waren stabil und waren klar visuell unterscheidbar und eine Funktion der Acetoessigsäurekonzentration.

Aus dem oben Gesagten geht deutlich hervor, daß die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Herstellung von Teststreifen oder Prüfvorrichtungen vom "dip-and-read"-Typ anwendbar ist, sondern auch auf andere Tests, einschließlich flüssiger Systeme.

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Beispiel 8

Ein Prüfmittel zur Bestimmung von Urobilinogen in Urin wurde hergestellt, indem man zunächst Whatman 3MM-Filterpapier mit dem folgenden Gemisch imprägnierte:

Destilliertes Wasser	70,5 g
GANTREZ^AN-139	5,6 g
Sulfosalicylsäure	9,16 g
Coffein	7,05 g
Sulfaminsäure	1,41 g
p-Dimethylaminobenzaldehyd	0,53 g
(Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure-
tetranatriumsalz	0,14 g
Ascorbinsäure	3,52 g
Natriumlaurylsulfat	0,70 g

Das Papier wurde dann getrocknet und v/eiter mit einer Lösung von 4 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon in Chloroform imprägniert. Das entstehende Papier wurde dann getrocknet und auf Polystyrolstreifen zur Untersuchung befestigt. Die Reagensstreifen wurden untersucht durch 3 s langes Eintauchen in Urinproben mit bekannten Urobilinogenkonzentrationen (0, 4,8 und 12 Ehrlich-Einheiten). Die Färbungen entwickelten sich innerhalb 2 min und waren typisch für die Urobilinogenkonzentration. Dieser die Zeit ausschaltende Effekt wird erreicht durch schnelle Bildung eines Komplexes von hydrolysiertem Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid-Copolymer mit Polyvinylpyrrolidon bei niedrigem pH-Wert.

Beispiel 9

Ein Streifen, der angewandt wird zum Nachweis von okkultem Blut in Urin, wurde hergestellt durch Imprägnieren von Whatman 3MM-Filterpapier mit der folgenden Lösung: *) (time ingredient effect)

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Natriumlaurylsulfat 0,84 g

Kumolhydroperoxid 1,67 g

6-Methoxychinolin 0,39 g

Natriuracitrat.2H₂O 1,79 g

Citronensäure 2,32 g

3,3',5,5'-Tetraraethylbenzidin 0,45 g

Triäthanolaminborat 5 »58 g

(Äthylendinitrilo)tetraessigsäuretetranatriumsalz 0,06 g

Dimethylsulfon 5,58 g

Wasser 40,67 g

Dimethylformamid 40,67 g

Nach dem Trocknen wurde das Papier weiter imprägnier mit einer Lösung von 1 Gew.-','ί Eastman 910EM in Chloroform. Die aus diesem Papier hergestellten Streuen bildeten, wenn sie in Urinproben, enthaltend bekannte Mengen Hämoglobin (0, 0,016, 0,064, 0,16, 0,80 mg/dl), untersucht wurden, innerhalb von 2 min deutlich stabile Färbungen, deren Intensität eine Funktion der Hämoglobinkonzentration war.

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Claims

Patentansprüche

i_v 1 J Prüfmittel zum Nachweis und zur Bestimmung einer !komponente in einer Probe mit Hilfe eines Reagenssystems, das bei Berührung mit der Probe mit dieser Komponente in Wechselwirkung tritt und zu einer feststellbaren Reaktion führt, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich ein Hemmsystem enthält, das bei Berührung mit der Probe dazu führt, daß das Reagenssystem nach Ablauf einer vorher bestimmten Zeit nicht mehr mit der Komponente in Wechselwirkung tritt.
2.

Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekenn

zeichnet, Farbänderung ist.

daß die feststellbare Reaktion eine
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Hemmsystem eine Substanz umfaßt, die bei Berührung mit der Probe härtet oder ein Gel bildet.
4. Mittel nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet , daß die Härtung oder Gelbildung mit einer ausreichenden Geschwindigkeit abläuft, um eine v/eitere Wechselwirkung zwischen dem Reagenssystem und der Komponente zu verhindern.
5. Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Hemmsystem einen Ester von 2-Cyanoacrylsäure umfaßt.

7 O 9 8 3 8 /O 9

ORIGINAL INSPECTED
6. Hitte1 nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Hemmsystern Polyvinylalkohol umfaßt.
7. Mittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß es ein Reagenssystem enthält, das zur Bestimmung von Glucose, Keton, okkultem Blut, Bilirubin, Urobilinogen, Cholesterin, Wasserstoffionen, Protein oder Nitrit geeignet ist.
8. Mittel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Ausmaß der feststellbaren Reaktion abhängt von der Menge der Komponente in der Probe.
9. Mittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Hemmsystem das Auftreten der nachweisbaren Reaktion beendet durch Auftreten einer Härtungsoder Gelbildungsreaktion in Konkurrenz mit dem Auftreten der nachweisbaren Reaktion.
10. Mittel nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß das Hemmsystem eine Substanz umfaßt, die bei Berührung mit der Probe Wärme erzeugt.
11. Mittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Hemmsystem ein Gift für das Reagenssystem ist oder bildet.
12. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Härtung oder Gelbildung durch Berührung mit Wasser eingeleitet wird.
13. Mittel nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß es in einer Trägermatrix enthalten ist.

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