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DE2646834A1 - Breitspektrum-antibiotika, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende arzneimittel - Google Patents

Breitspektrum-antibiotika, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende arzneimittel

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Publication number
DE2646834A1
DE2646834A1 DE19762646834 DE2646834A DE2646834A1 DE 2646834 A1 DE2646834 A1 DE 2646834A1 DE 19762646834 DE19762646834 DE 19762646834 DE 2646834 A DE2646834 A DE 2646834A DE 2646834 A1 DE2646834 A1 DE 2646834A1
Authority
DE
Germany
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factor
chcl
antibiotic
spectrum
extracellular
Prior art date
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Pending
Application number
DE19762646834
Other languages
English (en)
Inventor
David Perlman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wisconsin Alumni Research Foundation
Original Assignee
Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wisconsin Alumni Research Foundation filed Critical Wisconsin Alumni Research Foundation
Publication of DE2646834A1 publication Critical patent/DE2646834A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

17 080/H
WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION, Madison. Wisconsin 53705/USA
Breitspektrum-Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel
Die Erfindung betrifft Breitbandspektrum-Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel.
Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung neuer extracellulärer Antibiotika geschaffen, welches darin besteht, Kycoplasma sp.RP III in einem Kulturmedium zu kultivieren, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält.
Die erfindungsgemässen Antibiotika werden im folgenden als Faktor I und Faktor II bezeichnet. Es wurde gefunden, dass Faktor I wirksam grampositive und gramnegative Bakterien in vitro inhibiert und Mäuse vor Pseudomonas- und Staphylococcus-Infektionen schützt und dass Faktor II, der als ein Lipid identifiziert
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wurde, grampositive und gramnegative Bakterien, insbesondere Candida-Species »it hoher Cytotoxizität inhibiert.
Wie kürzlich von M.Sylvestre und D.Perlraan in "Antibiotics from Mycoplasma II. Characterisation of antibiotics produced by Mycoplasma sp.RP III11 J.Antibiotics 28:73-74, 1975, berichtet wurde, wurden aus Mycoplasma sp.RP III, das ursprünglich aus Hypophysenkulturen der Ratte isoliert wurde, drei Arten von Antibiotica isoliert; davon war eine extracellular, eine andere intracellulär und die dritte assoziiert an lebensfähige Zellen. Die Untersuchung der antibiotischen Wirksamkeit der extracellulären Antibiotika, die durch Fermentation von Mycoplasma sp.RP III erzeugt werden, führte nun zu den extracellulären Faktoren I und II.
Mycoplasma sp.RP III wird typischerweise in einem Medium gezüchtet, das auf Difco PPLO-Brühe (ohne Kristallviolett) basiert, das mit 0,5 Gew# Hefeextrakt und 1 VoIJi Kälberserum versetzt wurde. (Das Difco PPLO hat folgende Zusammensetzung: 50 g Rinderherzextrakt, 10 g Bactopepton, 5 g Natriumchlorid und Wasser auf einen Liter). Aliquote Teile können bis zum Gebrauch durch Frieren auf - 200C gelagert werden. Bisher scheint ein häufiger Transfer des Inokulums erforderlich zu sein, da sonst die überlebenden Zellen ihre Fähigkeit, Antibiotika zu produzieren, verlieren. Beste Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Kultur bei 35 - 36°C inkubiert und alle 24 Stunden transferiert wurde. Eine Hinterlegung von Mycoplasma sp.RP III wurde bei der American Type Culture Collection in Rockeville, Maryland, unter der ATCC-Nummer 31166 vorgenommen.
Eine Mycoplasma sp.RP III-Kultur kann auf Difco PPLO-Agar (ohne Kristallviolett), versetzt mit sterilem Rinderserum in einer Menge von 1 Vol# gehalten werden. Hat sich die Kultur einmal auf der Oberfläche des Agar festgesetzt, beispieleweise in Petri-Schalen, die 15 ml Medium pro 100 mm Schalendurchmesser enthalten, so können die Platten bis zu sechs Monaten bei 4°C
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gelagert werden. Die erste Inkubierung der Platten wird gewöhnlich bei 34-36°C während bis zu fünf Tagen vorgenommen.
Flüssigkulturen von Mycoplasma sp.RP III können typischerweise ausgehend von Agarplatten durch Transferieren einer Brühe des Agar, die Mycoplasma-Kolonien enthält, in Kolben mit Difco PPLO-Brühe (ohne Kristallviolett), versetzt mit 1 g/l Difco-Hefeextrakt und 1 Volj6 sterilem Rinderserum eingeleitet werden. Die inokulierten Kolben (200 ml Medium pro 250 ml Erlenmeyer-Kolben) werden bei 350C während bis zu vier Tagen inkubiert. Während dieses Inkubationszeitraums wächst der Zellgehalt auf etwa 1 χ 10 koloniebildende Einheiten pro ml an. Diese Zellen können zum Animpfen von Fermentationskolben verwendet werden oder können aliquote Teile der Kultur bei - 20 bis - 1700C für die weitere Verwendung als Inokulum oder zur Einleitung von Fermentationen eingefroren werden.
Das Fermentationsmedium besteht im allgemeinen aus Difco PPLO-Brühe (ohne Kristallviolett), ergänzt durch 1 % steriles Rinderserum und 1,5 Gew% Difco-Hefeextrakt. Das Medium kann hergestellt werden durch Auflösen der beiden Difco-Materialien in entionisiertem Wasser, Aufteilen der Lösung auf Erlenmeyer-Kolben (500 ml pro 2 1-Kolben oder 100 ml pro 250 ml-Kolben) und Verstöpseln der Kolben mit Baumwolle. Die Kolben werden anschliessend 30 Minuten bei 1210C im Autoklaven gehalten und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Das sterile Rinderserum wird anschliessend auf eine Endkonzentration von 1 Vol# zugefügt und der pH-Wert wird mit steriler In-NaOH auf den Wert von 7,7 eingestellt. Die Kolben mit dem Fermentationsmedium werden anschliessend mit aliquoten Teilen einer 24 Stunden alten Kultur angeimpft, derart, dass das Inokulum bis zu etwa 5 % des Volumens des Fermentationskolbens ausmacht. Die angeimpften Kolben werden in eine Schüttelvorrichtung (Gyrotary der New Brunswick Scientific Company) eingebracht, die mit 400 Upm bei einer Verschiebung von 2,54 cm (1 inch) arbeitet; dabei wird eine Temperatur von 350C eingehalten. Es wird weitere vier bis fünf Tage in-
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kubiert, wobei man periodisch durch direkte mikroskopische Beobachtung auf bakterielle Verunreinigungen untersucht. Am Ende der Inkubationszeit werden die Vermehrungskolben mit dem fermentierten Medium vereint.
Es versteht sich, dass auch Zusammensetzungen, die der Difco PPLO-Brühe ähnlich sind, anstelle dieser speziellen Brühe eingesetzt werden können.
Eine optimale antibiotische Aktivität wird im allgemeinen mittels eines Fermentationsmediums erzielt, das durch Zusatz von Rinder-Kalbsserum in einer Menge von 0,5 bis A Vol# und Hefeextrakt in einer Menge von 0,2 bis 2 Gew# zu der Difco PPLO-Brühe (ohne Kristallviolett) oder einer anderen geeigneten Brühe hergestellt wurde. Die Zugabe von Aminosäuren,wie z.B.solchen aus der Hydrolyse von Casein, in Kengen von 0,1 bis 2 % bezogen auf das Gewicht kann zumindest in frühen Stadien der Fermentationaperiode zu einer vermehrten Produktion an Antibiotika führen. Beste Ergebnisse wurden in Hinsicht auf die Stabilität der Fermentation und die Ausbeute an Antibiotika erzielt, wenn man die vorstehend beschriebene Schüttelkulturtechnik anstelle einer statischen Kultur für die Fermentationsphase anwendete.
Die Ausbeute an Antibiotika wird auch durch den pH-Wert der Fermentationsmedien beeinflusst, wobei beste Ergebnisse im allgemeinen im pH-Wertbereich von 7,2 bis 8,2, vorzugsweise 7,5 bis 8,0, erzielt werden, wo die antibiotische Aktivität erhöht wird. Zur Einstellung der Medien auf den gewünschten pH-Wertbereich kann eine alkalische Substanz wie Natriumhydroxid oder ein anderes Alkalimetallhydroxid verwendet werden.
Kurz beschrieben umfasst die Herstellung des extracellulären Faktors I aus dem Fermentationsprodukt die Stufen der Einstellung des pH-Wert des Fermentationsmediums auf etwa 4,5 und das Erwärmen während einer kurzen Zeit auf 25 bis 650C und vorzugsweise 50 bis 6O0C bzw. auf eine Temperatur von 25 bis 65 und
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vorzugsweise 50 bis 60°C über der Raumtemperatur, eine geeignete Behandlung mit Kohle bzw. Aktivkohle zur Entfernung von Verunreinigungen, die Extraktion aus wässrigem Medium mit einer Mischung von Äthylacetat-Methanol bei einem pH-Wert von etwa 4,5» worauf das extrahierte Produkt einer chromatographischen Trennung auf einem Kationenaustauscherharz, gefolgt von einem EIuieren des extracellulären Faktors I mit Ameisensäure, unterzogen wird.
Herstellung des Faktors I Beispiel I
30 1 des vereinten fermentierten Mediums der vorstehend beschriebenen Fermentierung wurden mit konzentrierter HCl auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und während drei Minuten in einem Wasserbad von 800C erwärmt. Nach dem Abkühlen des Materials auf Raumtemperatur (250C) wurde der gebildete Niederschlag durch Filtrieren durch ein Whatman Nr. 1-Filterpapier entfernt und verworfen. Entfärbungskohle (Darco G-60, Produkt der Fisher Scientific Company) wurde zu dem Filtrat bis zu einem Gehalt von 30 g pro Liter gefügt und die Suspension wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. 28,5 1 des Filtrats wurden im Vakuum auf 1,4 1 verdampft und das Konzentrat wurde dreimal mit 1,4 1 einer Mischung von Äthylacetat-Methanol im Verhältnis von 9 Volumina Äthylacetat pro 1 Volumen Methanol extrahiert. Die Lösungsmittelschichten wurden vereint und im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in einer minimalen Menge von destilliertem Wasser (75 ml) gelöst und der pH-Wert durch Vermischen mit Dowex 1 χ 4 - Harz (OH~-Zyklus) ansatzweise auf den Wert 6,5 eingestellt. Die das Antibiotikum enthaltende Lösung wurde anschliessend auf eine Kationenaustauscherharz-Säule (H+-Zyklus) (Amberlite CG-50 der Rohm & Haas,2,8 χ 45 cm) aufgebracht und das Antibiotikum wurde unter Anwendung einer 0,2n-Ameisensäurelösung eluiert. Fraktionen von 20 ml wurden gesammelt und die
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bioaktiven Fraktionen (Röhrchen 13-25) wurden vereint, wobei man ein Volumen von 250 ml erhielt. Diese Lösung wurde im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in einer minimalen Menge von Äthanol (50 ml) gelöst und es wurde ausreichend Äthyläther (50 ml) zugefügt, um eine 50#ige Mischung zu bilden; die gebildete Ausfällung wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Lösung wurde zur Trockne verdampft und der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst und erneut auf dem CG-50-Harz (H+-Zyklus, 2,8 χ 45 cm) chromatographiert. Das bioaktive Material wurde mit 0,2n-Ameisensäure eluiert und die bioaktiven Fraktionen (200 ml) wurden vereint und durch ein Ionenaustauscherharz (Dowex 1 χ 4-Säule - OH~-Zyklus) zur Entfernung von überschüssiger Säure und Einstellung des pH-Werts auf 6,5 geleitet. Die bioaktiven Fraktionen wurden anschliessend vereint und im Vakuum zur Trockne verdampft. Die Feststoffe wurden in einer minimalen Alkoholmenge (3 ml Methanol) gelöst und Äthyläther wurde zugesetzt, bis die Lösung trüb wurde. Die Ausfällung wurde abfiltriert und in einem Exsiccator getrocknet. Sie wurde anschliessend in einem kalten Raum 15 Tage bei A0C gelassen und man erhielt etwa 1 mg eines hygroskopischen semikristallinen Feststoffs. Das Material, extracellulärer Faktor I, stellte die Ausbeute aus 30 Litern fermentiertem Medium dar.
Chemische Charakterisierung des extracellulären Faktors I
Der extracelluläre Faktor I ist eine basische Substanz und bewegte sich bei der Papier-Ionophorese (Whatman-Papier Nr.1) bei einem pH-Wert von 1,9 (Essigsäure - Ameisensäure - Wasser in dem Verhältnis von 20:2:78 bezogen auf das Volumen) 3,3 cm gegen die Kathode bei 5 Volt/cm während 20 Minuten (der Wert R^8nJ1n betrug 0,16). Der Schmelzpunkt betrug 1200C und die Substanz zeigte keine bedeutende Absorption im Ultraviolettspektrum. Das Infrarotspektrum (KBr-Pressling) und das NMR-Spektrum in Deuteriumoxid (D2O) sind in den Figuren 1 (die die prozentuale Transmission angibt) und 2 angegeben.
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Die hauptsächlichen Infrarotbänder liegen bei 1660 bis 1600 cm , was CO- und Doppelbindungen vermuten lässt, bei 1635» 2850 und 2925 cm , woraus auf Alkan-Funktionen geschlossen werden kann, sowie bei 3300 bis 334-0 cm , was auf Amin- oder OH-Funktionen schliessen lässt, und die hauptsächlichen NMR-Spitzen sind bei 2,0; 2,2; 2,4·, 2,5; 2,6? 3,0; 3,8; 3,9; 4,1; 4,3; 4,6 und
5,3 ppm.
Die antibakterielle Wirksamkeit
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von Faktor I ging verloren, wenn die Lösungen bei alkalischem pH-Wert gelagert wurden, das Material in Aceton gelöst wurde oder wenn das Material lyophilisiert wurde. Saure wässrige Lösungen waren bei bis zu 50C einen Monat lang stabil. Spot-Untersuchungen zeigten positive Reaktionen mit folgenden Reagenzien: CeS(V; IpI Triphenyltetrazolium. Mit folgenden Reagenzien wurden negative Ergebnisse erzielt: Phosphorwolframsäure; Anilinphthalat; Ninhydrin; Resorzin-HCl; Orcin; und Anthron.
Die Mobilität des extracellulären Faktors I in Papierchromatophie- und Dünnschichtchromatographiesystemen ist in den Tabellen 1 und 2 summarisch aufgeführt.
Herstellung des extracellulären Faktors II
Kurz beschrieben verläuft die Herstellung des extracellulären Faktors II aus dem erhaltenen Fermentationsmedium gemäss der Herstellung des extracellulären Faktors I bis zur vollendeten Einstellung des pH-Werts auf etwa 4,5 und das Erwärmen auf die vorstehend genannte Umgebungstemperatur während einiger Minuten. Anschliessend wird das Produkt auf einen pH-Wert von etwa 3 eingestellt und mit beispielsweise Äthyläther extrahiert, worauf der Extrakt einer chromatographischen Auftrennung an Siliciumdioxidgel unterzogen wird.
Beispiel II
30 Liter des vereinten Fermentationsmediums aus der vorstehend beschriebenen Fermentation von Mycoplasma sp.RP III wurden mit konzentrierter HCl auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und während drei Minuten in einem Wasserbad auf 800C erwärmt. Nach dem Abkühlen der Probe auf Raumtemperatur (25°C) wurde die erhaltene Ausfällung abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde mit Kohle bzw. Aktivkohle (Darco G-60) auf einen Gehalt von 30 g pro Liter versetzt und die Suspension wurde eine Stunde bei Raumtemperatur
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gerührt. Die Aktivkohle wurde abfiltriert und verworfen. Die verbleibenden 28,5 1 des Filtrats wurden im Vakuum auf 1,4 1 verdampft und das Konzentrat wurde dreimal mit 1,4 1 einer Mischung von 9 Volumina Äthylacetat und 1 Volumen Methanol extrahiert.
Der extracellulare Faktor II, ein saures Antibiotikum, wurde aus der wässrigen Phase durch Einstellen der Lösung auf einen pH-Wert von 3,0 mit HCl und dreimalige Extraktion mit einem gleichen Volumen an Äthyläther entfernt. Die ätherischen Extrakte wurden vereint und im Vakuum verdampft. Der Rest wurde in einem Minimum von Äthyläther gelöst und weiter durch präparative Dünnschichtchromatographie mit Siliciumdioxidgel als Träger und dem folgenden Lösungsmittelsystem gereinigt: CHCl^-Aceton (1:1 VoI); CHCl^-Methylalkohol (4:1 VoI) und CHCl^-Äthylacetat (1:1 VoI). Die das Antibiotikum enthaltenden Flächen des Siliciumdioxidgel-Chromatogramms wurden mit CHCl^ eluiert und die Eluate wurden im Vakuum auf ein geringes Volumen konzentriert. Das als ein öl erhaltene Material betrug etwa 10 mg pro Liter fermentiertes Medium, das etwa 1Q# des extracellularen Faktors II enthielt.
Chemische Charakterisierung
Es zeigte sich, dass der extracelluläre Faktor stabil bei saurem pH-Wert, Jedoch labil bei alkalischem pH-Wert (pH 8) ist. Spot-Tests zeigen positive Reaktionen mit folgenden Reagenzien: CeSO^; I2; Phosphorwolframsäure% Triphenyltetrazolium. Mit folgenden Reagenzien erhielt man negative Ergebnisse: Anilinphthalatj Ninhydrinj Resorzin-HCl» Orcin; und Anthron. Die Mobilitäten des Faktors II bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 summarisch aufgeführt.
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Tabelle 1
Mobilität von Mycoplasraa sp.RP III-Antibiotika bei der Papier-Trennchromatographie
Lösungsmittelsystem Festgestellter R~-Wert
Faktor I Faktor II
Wasser, gesättigt mit n-BuOH 0,06 ,„ **
n.f.
NH4Cl, 3% (Gew/Vol) 0,56 n.f.
H-BuOH-MeOH-H2O (4:1:2) 0,44 n.f.
Wasser 0,53 n.f.
Benzol-MeOH (4:1) 0,02 0,63
* Die Lage des Antibiotikums auf den Papierchromatogrammen wurde bioautographisch unter Anwendung von Pseudomonas convtxa als Testorganismus bestimmt.
** Das Antibiotikum konnte nicht festgestellt werden, woraus geschlossen wurde, dass es durch das Lösungsmittelsystem, inaktiviert wurde.
n.f. « nicht festgestellt
Tabelle 2
Mobilität von Mycoplasma sp.RP III-Antibiotika bei der Dünnschichtchromatographie auf Siliciumdioxidgel
Lösungsmittelsystem Festgestellter R~-Wert
Faktor I Faktor II
CHCl3-MeOH (8:2) CHCl3-MeOH (1:1) CHCl3-ACeton (8:2) CHC1,-Aceton (1:1) CHCl3-n-Hexan (2:1) CHC13-Benzol (2:1 EtOAc-AcOH-H2O (6:2:1)
* Die Lage der Antibiotika in den DUnnschichtchromatogrammen wurde durch Bioautographie unter Verwendung von Pseudomonas convexa als Testorganismus bestimmt .
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0,44 0,88
0,49 0,25
inaktiviert 0,81
inaktiviert 0,42
0 0,31
0 0,47
0,52 __
Biologische Charakteristika der Faktoren I und II
Die antimikrobiellen Spektren der Faktoren I und II sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt, die auch eine Information über den Vergleich mit den Aktivitäten von Erythromycin, Tetracyclin, Kanamycin und Gentamycin (Komplex) beim Testorganismus enthält.
Tabelle 3
Vergleich der antibiotischen Wirksamkeiten von Präparaten von Mycoplasma sp.RP III mit anderen Antibiotika
Untersuchte Organismen Durchmesser der Inhibierungszone, mm*
Mycoplasma sp. Ery- Tetra- Kana- Genta-
Faktor Faktor mycin cyclin 9 mycin mycin
Bacillus subtilis
Marburg		 22 24,5 26 16 - 22 24
Bacillus cereus
ATCC 14579		 26 25 25,5 23 28 19 19
Staphylococcus aureus
209P		 14,5 25 10 10 19 18
Sarcina lutea 16,5 20 26 16 15,5 10
Corynebacterium
sepedonicum
ATCC 15391		 17 26 14 13,5 22 21,5
Escherichia coil B 20,5 20 13 15 15 24,5
Erwinia carotovora
ATCC 495		 24 23 k.Z.**16 21 22
Pseudomonas putida
ATCC 21812		 22 40 k.Z. 20 21
Pseudomonas convexa
NRRL B-21		 17 31 - - -
Pseudomonas aeruginosa
DIFO 3856		 25 26 - 26,5 26,5
* Anmerkung: Es wurden 6,25 mm Papierscheiben verwendet; Scheiben mit dem Faktor I enthielten 200 meg; Scheiben mit dem Faktor II enthielten 20 mcg/Scheibe; Scheiben mit Erythromycin, Kanamycin und Gentamycin enthielten Jeweils 5 mcg/Scheibe.
k.Z. = keine Zone
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Fortsetzung Tabelle 3
Untersuchte Organismen Durchmesser der Inhibierungszone, mm*
Mycoplasma sp. Ery- Tetra- Kana- Genta-
Faktor
I		 Faktor
II		 thro-
mycin		 cyclin mycin mycin
Pseudomonas chlorora-
phis
NRRL B-5O2		 25 32 k.Z.* * Spur 15 10
Pseudomonas syringae
NRRL B-865		 21 29 tr 21,5 27 25,5
Pseudomonas stutzeri
NRRL B-927		 22 >30 12,5 13,5 18,5 17
Pseudomonas aureofa-
ci ens
NRLL B-1543P		 20 27,5 k.Z. Spur 14 11
Candida utilis
Y-421		 n.z. 17,5 k.Z. k.Z. k.Z. k.Z.
Candida albicans
Ϊ- 4244		 n.z. 14 k.Z. k.Z. k.Z. k.Z.
* Anmerkung: Es wurden 6,25 mm Papierscheiben verwendet; Scheiben mit dem Faktor I enthielten 200 meg; Scheiben mit dem Faktor II enthielten 20 mcg/Scheibe; Scheiben mit Erythromycin, Kanamycin und Gentamycin enthielten Jeweils 5 mcg/Scheibe.
** k.Z. = keine Zone
Cytotoxizitätstests unter Ausnutzung der Inhibierung des Wachstums von KB-Zellen (nach den Protokollen des National Cancer Institute) zeigten, dass der gereinigte Faktor I einen ID50-Wert von 8 mcg/ml und der Faktor II einen IDcQ-V/ert von 5,7 ng/ml aufwiesen. Die Cytotoxizität des Faktors I war etwa gleich mit der von Tetracyclin oder Chloramphenicol, wohingegen die des Faktors II sich in diesem Testsystem in der Grössenordnung der Aktinomycine erwies.
In vivo-Untersuchungen unter Anwendung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus ( Gray) als Testorganismen an Mäusen zeigten, dass bei der subkutanen Injektion von rohem extracellu-
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lären Faktor I (wie vorstehend hz"iß stallt) in Dosierungen von 600 mg/kg zwei von drei Mäusen überlebten, wohingegen unbehandelte Mäuse verendeten.
Die antibiotische Aktivität des fermentierten Mediums wurde durch Einstellen des pH-Werts des fermentierten Mediums mit HCl auf den Wert 4,0 bestimmt. Die angesäuerte Lösung wurde drei Minuten auf 80°C erwärmt. Die Proben wurden zentrifugiert und 5 ml der überstehenden Lösung wurden mit Natriumhydroxid auf den pH-Wert 6,5 neutralisiert und anschliessend lyophilisiert. Die gewonnenen Feststoffe wurden in 0,25 ml Wasser gelöst. Die Konzentrate wurden auf ihre antibiotische Aktivität unter Anwendung eines Agar-Diffusionsversuchs mit 24 Stunden alten Zellen von Pseudomonas convexa NRRL B-21 in 10 ml Difco-Untersuchungsmedium in einer 100 mm Petrischale mit 8 mm Wänden untersucht, wobei das Agar als Reservoire diente. Die Inkubation erfolgte 18 Stunden bei 260C und eine Kanamycinlösung diente als interner Standard in der Versuchsplatte.
Das antimikrobielle Spektrum der antibiotischen Spektren der extracellulären Faktoren I und II wurde durch Aufzucht der in der Tabelle 3 aufgeführten Testorganismen in einer Nährbrühe (ausser bei den Candida-Kultüren, die in einem Sabouraud-Medium gezogen wurden) während 24 Stunden bestimmt und die zur Animpfung der Difco-Üntersuchungs-Agar-Papierscheiben Nr. 1 (6,25 mm) wurden als Reservoire verwendet. Die Inhibierungszonen wurden nach 18 Stunden bei 37°C gemessen.
Die analytische und präparative Dünnschichtchromatographie wurde unter Verwendung von vorbeschichteten Platten (0,25 mm Slliciumdioxidgelschicht), hergestellt von der Macheray-Nagel Company, durchgeführt.
Aus den in der Tabelle 3 aufgeführten Ergebnissen ist ersichtlich, dass der Faktor I in jedem Falle eine antibiotische Akti-
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vitat aufweist, die mit der von anderen Tetracyclinen und anderen Antibiotika vergleichbar ist, wobei sich jedoch eine grössere Aktivität gegenüber Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Erwinia carotovora, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas stutzeri und Pseudomonas aureofaciens zeigte und nur der Faktor I gegenüber Pseudomonas convexa und Pseudomonas aureofaciens wirksam war. Der Faktor II zeigt eine antibiotische Aktivität, die mit der von Tetracyclin und anderen in der Tabelle 3 aufgeführten Antibiotika vergleichbar ist, wobei sich jedoch eine grössere Aktivität zeigt gegenüber Staphylococcus aureus, Corynebacterium sepedonicum, Erwinia carotovora, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae und Pseudomonas stutzeri und lediglich der Faktor II eine Wirksamkeit aufwies gegenüber Pseudomonas putida, Pseudomonas convexa, Pseudomonas aureofaciens, Candida utilis und Candida albicans.
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Claims (13)

  1. P a t e η t a n ε ρ r ü c h e
    1/ Extracellular Breitbandspektrum-Antibiotika, Faktor I und Faktor II, erhältlich durch Fermentation von Mycoplasma sp, RP III.
  2. 2. Extracelluläres Breitbandspektrum-Antibiotikum Faktor I gemäss Anspruch 1, erhältlich durch Fermentation von Mycoplasma sp.RP III, gekennzeichnet durch folgenden Mobilitätsfaktor bei der Papierchromatographie, festgestellt durch Bioautographie unter Anwendung von Pseudomonas convexa als TestOrganismus:
    Lösungsmittelsystem festgestellter R--Wert
    mit Wasser gesättigtes
    n-BuOH 0,06
    NH4Cl, 3% (Gew/Vol) 0,56
    n-BuOH-MeOH-H2O (4:1:2) 0,44
    Wasser 0,53
    Benzol-MeOH (1:1) 0,02
  3. 3. Extracelluläres Breitspektrum-Antibiotikum Faktor I gemäss Anspruch 1, erhältlich durch Fermentation von Mycoplasma sp.RP III, gekennzeichnet durch folgende Charakteristika, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie, gemessen durch Bioautographie mit Pseudomonas convexa als Testorganismus:
    Lösungsmittelsystem festgestellter Rf-Wert
    CHCl3-MeOH (8:2) 0,44
    CHCl3-MeOH (1:1) 0,49
    CHCl3-Aceton (8:2) inaktiviert
    CHC13-Aceton (1:1) inaktiviert CHCl3-n-Hexan (2:1) 0
    CHC13-Benzol (2:1) 0
    EtOAc-AcOH-H2O (6:2:1) 0,52
    709816/1180
    ORIGINAL INSPECTED
  4. 4. Extracelluläres Breitspektrum-Antibiotikum Faktor I gemäss Anspruch. 1, erhältlich durch Fermentation von Mycoplasma sp. RP III, gekennzeichnet durch einen Schmelzpunkt von etwa 20°C, keine bemerkenswerte Absorption im Ultraviolettspektrum, eine Bewegung bei der Papierionophorese von etwa 3,3 cm gegen die Kathode beim pH-Wert 1,9 unter einem Potential von 5 Volt während 20 Minuten und ein Infrarotspektrum als KBr-Pressling, das im wesentlichen in der beigefügten Figur 1 dargestellt ist und Bänder bei 1660 bis 1600 cm"1, bei 1635, 2850 und 2925 cm"1 und bei 3300 bis 3340 cm"1 aufweist, sowie ein NMR-Spektrum in Deuteriumoxid, das im wesentlichen in der beigefügten Figur 2 dargestellt ist und Spitzen bei 2,0·, 2,2; 2,4; 2,5; 2,6·, 3,0; 3,8; 3,9; 4,1·, 4,3; 4,6 und 5»3 ppm besitzt.
  5. 5. Extracelluläres Breit spektrum-Antibiotikum Faktor II gemäss Anspruch 1, erhältlich durch Fermentation von Mycoplasma sp.RP III, gekennzeichnet durch eine Stabilität bei saurem pH-Wert und Labilität bei alkalischem pH-Wert, sowie einen Mobilitätsfaktor bei der Papierchromatographie, bestimmt durch Bioautographie mit Pseudomonas convexa als Testorganismus wie folgt:
    Lösungsmittelsystem festgestellter R»-Wert
    mit Wasser gesättigtes
    n-BuOH n.f.
    NH^Cl, 3% (Gew/Vol) n.f.
    n-BuOH-MeOH-H2O (4:1:2) n.f.
    Wasser n.f.
    Benzol-MeOH (4:1) 0,63
  6. 6. Extracelluläres Breitspektrum-Antibiotikum Faktor II gemäss Anspruch 1, erhältlich durch Fermentation von Mycoplasma sp. RP III,gekennzeichnet durch folgendes Dünnschichtchromatogramm,gemessen durch Pseudomonas convexa als TestOrganismus:
    709818/1 ISO
    - *er -
    Lösungsmittelsystem festgestellter Rf-Wert
    CHCl3-MeOH (8:2) 0,88
    CHCl3-MeOH (1:1) 0,25
    CHCl3-Aceton (8:2) 0,81
    CHC13-Aceton (1:1) 0,42
    CHCl3-n-Hexan (2:1) 0,31
    CHC13-Benzol (2:1) 0,47 EtOAc-AcOH-H2O (6:2:1)
  7. 7. Verfahren zur Herstellung eines extracellulären Breitspektrum-Antibiotikums gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycoplasma sp.RP III in einem Kulturmedium kultiviert, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält.
  8. 8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
    man ein Kulturmedium verwendet, das Rinderserum und Hefeextrakt enthält.
  9. 9* Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kulturmedium verwendet, das 0,5 bis 4 Vol% Rinder-Kälberserum und 0,2 bis 2 Gewji Hefeextrakt enthält.
  10. 10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem pH-Wert von 7,2 bis 8,2 kultiviert.
  11. 11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7 bis10 dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum durch Einstellen des pH-Werts auf etwa 4,5, Erwärmen auf eine Temperatur von 25 bis 650C über der Raumtemperatur und Entfernen des Antibiotikums aus dem wässrigen Medium mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol extrahiert.
  12. 12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7 bis 10 dadurch gekenn-
    709816/1180
    26A6834
    zeichnet, dass man das Antibiotikum durch Einstellen des pH-Werts auf etwa 4,5, Erwärmen auf eine Temperatur von 25 bis 65°C über der Raumtemperatur und Entfernen des Antibiotikums aus dem wässrigen Medium durch Extraktion nach Einstellen des pH-Werts auf etwa 3 extrahiert.
  13. 13. Arzneimittel, enthaltend zumindest eines der Antibiotika gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.
    16/1180
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