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DE2643871A1 - Verfahren zur untersuchung enzymatischer und anderer biochemischer reaktionen - Google Patents

Verfahren zur untersuchung enzymatischer und anderer biochemischer reaktionen

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Publication number
DE2643871A1
DE2643871A1 DE19762643871 DE2643871A DE2643871A1 DE 2643871 A1 DE2643871 A1 DE 2643871A1 DE 19762643871 DE19762643871 DE 19762643871 DE 2643871 A DE2643871 A DE 2643871A DE 2643871 A1 DE2643871 A1 DE 2643871A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
substrate
group
molecules
substance
adsorbed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19762643871
Other languages
English (en)
Inventor
Hans Rune Arwin
Kurt Ingemar Lundstroem
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Phadia AB
Original Assignee
Kabi AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi AB filed Critical Kabi AB
Publication of DE2643871A1 publication Critical patent/DE2643871A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/806—Electrical property or magnetic property
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures

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  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Zoology (AREA)
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  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

GLAWE, DELFS, MOLL & PARTNER PATENTANWÄLTE
DR.-ING. RICHARD GLAWE, MÖNCHEN DIPL.-ING. KLAUS DELFS. HAMBURG DIPL.-PHYS. DR. WALTER MOLL, MÖNCHEN AU Kabi , Lindhagensgatan 133, DIPL-CHEM-DR-ULRICHMENGDEHl1HAMBURG
104 25 Stockholm, Schweden
8 MÖNCHEN 26 2 HAMBURG
POSTFACH 37 POSTFACH 2570
LIEBHERRSTR 20 ROTHENBAUM-
LIEBHERRSTR. 20 CHAUSSEE 58
TEL. (089) 22 65 48 TEL. {040) 4 10 20
TELEX 52 25 05 TELEX 21 29 21
HAMBURG
M/Li/ad
ρ 8159/76
Veriahreii zur untersuchung, en/.ymatischer und anderer biochemischer Ko ο Ic t ionen. _
Die Erl inJuiig oetriil t ein Veriahren zur Untersuchung enzymatischer und anderer biochemischer Reaktionen, bei denen die bubstanz, deren Aktivität oder Konzentration bestimmt werden soli, au. ein Tür die Liocheiiiische Reaktion sye/ii isches SubaLrat einwirkt.
Das Verlahren der Eri indLirif, soli u. a. dazu dienen, eiizymatische Aktivitäten zu bestininien, insbesondere von Enzymen vom Typ der berinproLeasen (Thrombin, Plasmin, Trypsin und der^l „ ) . liini^e dieser Enzyme regulieren die IjIu t koagulation und Flbrinolyse, und Störungen, bei den normalen Enzynunen^en verursachen pathologische Veränderungen, beispielsweise ilaeniorrha^ien oder Thrombosen.
Das Veriahren der 1Ori"indunfc Kann auch zur Untersuchung von immunologischen Reaktionen, ζ. i>. Antigen-Ant ikörper-Koppiun^en, verwendet werden. Andere Systeme, die ebenialls untei"suclit werden können, sind beispielsweise Inhibitor-Knzym-iiüpplungen, Rezeptor-liorrnon-Kopplungen und liezeptor-Steroid-lvupplungen.
709815/1QS3
Es ist bekannt, daß man enzymatisch^ Reaktionen mittels "Enzymelectroden" untersuchen kann, bei denen die Potentialdifferenz über für die Abfallprodukte der Reaktion spezifischen Membranen gemessen wird, el". Gough D,A„ und Andrade J.D0, Enzyme Electrodes, Science VoI9IOO9 S. 380-384,
Für die Untersuchung immunologischer Reaktionen ist es bekannt, daß man mit Nickel metallisierte Glasplatten verwenden kann, auf denen eine Oberflächenschicht von Antigenen adsorbiert ist. ^enn die Glasplatte "in eine Antikörper enthaltende Lösung getaucht wird, findet eine Kopplung zwischen den Antigenen und den Antikörpern statt, so daß sich die Schichtdicke vergrößert. Die Kopplung1 wird bestimmt, indem man die Sciiichtdicke auf optischem Wege mittels eines Ellipsometers mißt, cf„ Rothen A00 Immunologie and enzymatic reactions carried out at a solid-liquid interface, Physiol „Chenioa Physics 5s 1973°
Es ist auch bekannt, die enzymatisch^ Aktivität mittels einer Konductometrischen Methode zu bestimmen, of, 4, Lawrence A.J0 und Moores G0R0, Coductometry in Enzyme Studies, Eur. J.. -JiIo ehem. 24 (1972), S „ 538-546„
Es ist weiterhin bekannt, daß organische Molekül© auf Electrodenoberflächen adsorbiert werden können und di© elektrischen Eigenschaften der Electroden veräKü.d©5ras cf. Bockris Jo0'M„ und Keddy A.KJ., Modem Electro= chemistryj Plenum Press, Vol. 2, Kap« 7«
Ss sind auch spezielle Substrate mit hoher Empfindlich= keit. gegenüber den fraglichen Enzymen entwickelt t'/ordaxij, insbesondere vom 'i'yp der Amidsubstrate „ Diese h©±s©is di©
109815/10
Eigenschaft auf, dal.i sie in Gegenwart des Eiiayms unter Bildung von ahroiiioijhoren Produkten hydrolysiert werden können. Die auftretende Farbänderung kann in leicliter Iseise spektraxjhotonie krisch bestimmt werden, beispielsweise mittels eines optischen Absorp tionsspektronieters. Ein Substrat, das für die optische bestimmung von enzymatisciien Aktivitäten verwendbar ist und klinische Untersuchungen, beispielsweise bezüglich der Antithrombin und Prothrombinmengen erI eichtert, ist in der US-PS 3 88A-beschrieben.
Ein Nachteil der optischen t-ie;.'iiüethode ist dadurch begründet, daß eine ziemlich komplizierte und teure apparative Vorrichtung und eine erhebliche Substratmenge Tür das Meßverlahren erforderlich ist. Weiterhin ist es nicht möglich, die enzymatiscne Aktivität im Blut infolge der Trübung desselben direkt zu bestimmen, Statt dessen muß mit A1IaSrHa (bei entfernten roten Blutkörperchen) oder Serum (bei ebenfalls entfernten Fibrinogen.) gearbeitet werden.
Die Erfindung ist auf ein einfaches Verfahren gerichtet, durch das die oben genannten Nachteile vermieden werden. Das Verfahren, der Erfindung ist im xiresentliciien dadurch gekennzeichnett daß man zunächst die Kapazität zwischen zwei Elektroden in Gegenwart lediglich des Substrats und anschließend die Kapazität in Anwesenheit der Substanz, deren Aktivität oder Konzt-ntration bestimmt werden soll, mißts wobei die Kapazitätsänderung pro Zeiteinheit oder die Gesanitkapazitätsünderung ein Maß für die Aktivität oder Konzentration der Substanz darstellt»
Im folgenden wird das Verfahren der Erfindung näSiez" erläutex*t5 wobei auf die Zeichnungen Bezug genoiBHien wird.
Es zeigens
Figur 1 eine elektrische Meßvorrichtung zur Meßung der Kapazität zwischen den Ele^troden^
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264387 ϊ
-ir- >
Figur 2 ein vereiiiraciites äquivalentes Schaltdiagramm für die Meßeinrichtung,,
Figur 3 eine Kurve der gemessenen Kapazität in Abhängigkeit von der Zeit bei zugegebenem Suustrat,
Figur- h eine scliematische Darstellung des Verfahrens zur Bestimmung der enzymatisehen Aktivität,
Figur 5 eine Kurve der Bedeckung der adsorbierten Substratmoleküle (-\-1/C ) als Funktion der Substratkonzentration xn der Lösungs
Figur 6 eine schematische Darstellung des Verfahrens
bei der Untersuchung immunologische!* Reaktionen und
Figur 7 eine schematische Ansicht des Verfahrens bei
der Untersucimiig einer biochemischen Reaktion.t bei der das Substrat in der umgebenden Lösung 1 beeinflusst wird.
Eine erste Ausfuhrungsi'orm des Veriahrens der Erfindung ■wird im Zusanirneniiang mit de j Bestimmung der enzpaatischen Aktivität von Serinpro teasen beschrieben» Das Veri'alxren beruht aui der Tatsache, daL das verwendete Substrat die Eigenschaft zeigt, au! einer metallischen Oberfläche adsorbiert und in Gegenwart der fraglichen Enzyme desorbiert zu werden« In Figur 1 ist eine i-iel.ivorrichfri.ing gezeigt, durch die die ¥echse1spannungs-Impedanz zwischen zwei in eine Lösung eintauchenden Platin-Elektroden 2, '.. gemessen vird, Di© Meßvorrichtung umfaßt eine Impedanzbrücke 1, einen Signal= generator j und einen Verstärker mit einem NuI!detektor* Zu Beginn enthält die Meßvorrichtung lediglich eins Puffer= lösung mit einem pH-Wert von 8P2 und einer lonenkonsentration von 0,15· hei diesem pll-toert und dieser Ionenstärke weisen die hier untersuchten Enzyme eine optimale Aktivität auf.
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Eine hohe loneiikün/ejitration führt zu Auswirkungen au! die Elektrodenpol arisierunt;, wenn die Messung bei relativ niedrigen Frequenzen (1 Ui > kiiz in diesem Falle) ausgewertet wird. Der Keihenwj· rstand R wird durch die Leitfähigkeit aes Elektrolyts und die Kapazität C hauptsächlich durch die Elektroderipolarisierung und eine ggf. adsorbierte jMolekülschiclit be s ti nun i .
Wie aus Figur 1 ersichtlich ist die Kerbvorrichtung so eingeschlossen, daß sie einen der Abzweigungen der Impedanzbrücke darstellt.
kenn nun eine kleine Menge des Polypeptidsubstrats des in der US-PS '_, öoh byo genannten Typs zu der Pufferlösung zugegeben wird, ändert sicli die gemessene Kapazität C in Abhängigkeit von der Zeit gemäß Figur 3·
Die Kapazität C verringert sich in Abhängigkeit von der Zeit, wie aus Kurve a in Figur 'j ersichtlich ist, und zwar in Abhängigkeit von dem Umstand, daß Polypeptidmoleküle aul den iiMektroüeuoberilächen adsorbiert werden. Allmählich bildet sich ein Gleichgewicht zwischen den Polypeptidmoleküleri In der Lösung und den aul' den Klektroderioberflächen adsorbierten Molekülen. Vermutlich wird dabei eine morioniolekulare Schicht von Substratmolekülen aui UBn. Elektrodenoberflachen adsorbiert.
Wenn nun eine Enzym!ösurig, die das Polypeptid abspalten kann, am Punkt A der Figur '3 zugesetzt wird, ändert sich die gemessene Kapazität C erneut. Die Kapazität C steigt
S S
und erreicht erneut ihren ursprünglichen Ivert, wie aus Kurve b der Figur 3 ersichtlich ist. Die Kapazitätsänderung hängt im wesentlichen von der Tatsache ab, daß das zugesetzte Enzym auf das adsorbierte Polypeptid einwirkt. ■
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Das zugesetzte Enzym kann beispielsweise Thrombin, Trypsin oder Plasmin (Serinproteasen) sein, die das Polypeptide substrat hydrolysieren, wobei die adsorbierten Moleküle vollständig oder teilweise gelöst oder "verbraucht" werden, so daß sich die Kapazität der Meßvorrichtung ändert. Die Änderung· der Kapazität pro Zeiteinheit, d. h. die AnfangsSteigung der Kurve b der Figur 3» ist ein Maß für die enzymatisch© Aktivität.
Die Meßvorrichtung kann mittels einer bekannten Enzynimenge geeicht werden. Die Eichkurve kann dann bei der Messung einer Lösung mit einem unbekannten Gehalt an Enzym verwendet werden. Bei der Messung in Blutplasma ist dann die Menge an Antienzym von Interesse. Die genannte Mengs kann bestimmt werfen, indem man eine bekannte Enzymmeng® zu dem Blutplasma hinzufügt. Nach einigen Minuten, wenn das Antienzym inhibiert \\rorden ist, kann die verbleibende Enzymmenge bestimmt werden. Venn man dieses Verfahren für zwei verschiedene Enzyme oder Plasmamengen auswertet, kaiin die ursprüngliche Antienzymmenge extrapoliert werden.
Das im folgenden beschriebene Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität wird schematisch in Figur h erläutert, wobei Figur h a die Meßeinrichtung mit den in die Substratlösung· eintauchenden Elektroden zeigt, und wobei die Substratmoleküle S zwischen Molekülen ±n der Lösung und auf den Elektrodenoberflächen adsorbierten Molekülen verteilt sind. Bei niedrigen Konzentrationen wird das Verhältnis zwischen diesen konstant gehalten» Wenn die Konzentration ansteigt, werden die Elektrodenoberflächen allmählich aufgelullt und ein immer kleiner werdender Teil der zugesetzten Moleküle werden adsorbiert werden. In Figur 5 zeigt ein Diagramm die Dicke des* Schicht bei verschiedenen Konzentrationen des Polypeptide Substrats (die Menge an Polypeptid einer Konzentration von T mM in 0,5 ml Pufferlösung). Das Diagramm zeigt, daß bei hohen Peptidkonzentrationen vermutlich eine
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Monoschicht von Peptidmolekülen adsorbiert wird. Eine weitere Zugabe von Substrat steigert dann lediglich, die Anzahl der Moleküle in der Lösung.
Wenn nun:.gemäß Figur h b ein Enzym zugesetzt wird, beeinflussen die Enzymnioleküle E die Moleküle in der Lösung sowie die adsorbierten Moleküle. In Figur h c ist gezeigt, wie sich die Reihenkapazität C in Abhängigkeit von der Zeit ändert, wenn Substratmoleküle S und anschließend Enzymmoleküle E zugegeben werden. Da die Meßeinrichtung lediglich Änderungen in der Anzahl der adsorbierten Moleküle mißt, ist es erwünscht, daß die Auswirkungen aui" die adsorbierten Moleküle so groß wie möglich sind. Ein Empfindlichkeitsoptimum ist daher in Gegenwart einer bestimmten Menge des zugegebenen Peptids zu erwarten. Bei einer niedrigen Peptidkonzentration liegt ein Empfindlxchkeitsverlust vor, da die EIeJstrodenoberflachen einen geringen Füllungswirkungsgrad aufweisen, und bei hohen Konzentrationen beeinflusst der grüßte Teil des zugesetzten Enzyms die Moleküle in der Lösung.
Die Messungen zeigen ebenfalls, daß eine derartiges Optimum existiert.
In dem soeben beschriebenen .Beispiel besteht das Substrat aus einem l'olypeptid des in der US-PS 3 884 896 beschriebenen Typs, d. h. mit einer Empfindlichkeit gegenüber Thrombin und anderen proteolytischen Enzymen vom Typ der Peptid-peptidolr> drolasen. Das verwendete Substrat wird in Gegenwart des hier vorliegenden Enzyms hydrolysiert und bildet ein Produkt, das spectiophotometrisch gemessen werden kann. Das verwendete Substrat ist keinesfalls für die hier beschriebene elektrische Bestimmung optimal, die Hauptsache ist, daß das Substrat fest bzw. gründlich an den Elektroden haftet und das ein signifikanter Teil bei der enzymatrischen Hydrolyse gelöst wird, wodurch, eine signifikante Änderung der Kapazität der Metallelektroden
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erzielt wird. Das Suustrat soll daher in einer solchen \veise halten, d.aü die "sensitive" Bindung Tür das Enzym zugänglich ist. Experimente haben gezeigt, daß das Substrat die Oberfläche nicht vollständig absättigen soll, luu einen optiualen Avirkurigsgrad der Messung zu erreichen. In dem beschriebenen Beispiel ist das Substrat ebenfalls zu der Pufferlösung in der Mei3vorrichtung gegeben worden, wonach das Substrat an Metallelektroden adsorbiert wurde. Gemäß einer Alternative kann man die EIe kfcroden vor der Messung mit einer Substratschicht ausrüsten, d. h. vorbereitete Elektroden \'erwendeji, und die resultierende Änderung der Kapazität beim Eintauchen dieser EIeKroden in die fragliche Enzymlösung untersuchen. Dementsprechend ist es nicht erforderlich, daß das Substrat an der Metallelektrode adsorbiert wird; das Subsfcat kann beispielsweise chemisch an der Elektrodenoberfläche gebunden sein, vorausgesetzt, daß die Substratmoleküle derartige Eigenschaften aufweisen, dass die "sensitive11 Bindung dem Enzym zugänglich ist und dass ein Teil oder die Gesamtheit der Substrcitnioleküle abgelöst werden j wenn das Enzym auf das Molekül einwirkt.
Figur 6 zeigt ein Beispiel, in dem die Meßeinrichtung zur Untersuchung einer immunologischen Reaktion vom Typ der Antigen-Antikörper-Lirulung verwendet wird.
In Übereinstimmung mit dem soeben beschriebenen Beispiel wird die Kapazität zwischen 2 Elektroden, 3 mittels einer Iiiipedanzbrücke 1 , die die gleichen konstruktiven Merkmale wie die der Figur 1 aufweist„ gemessen. Die Elektrodenoberflächen werden entweder von- Anfang an mit Antigenen ausgerüstet oder die Elektroden sind in eine Lösung mit Antigenen eingetaucht worden,
• β · y
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- r- to
\iobei Antigene auf den Elektrodenoberflächen adsorbiert wurden Lind die Kapazität Tür diesen Fall bestimmt wurde. Dann werden die Elektroden in die Antikörper enthaltende Lösung eingetaucht, wodurch die Antikörper an die adsorbierten Antigene gebunden werden, so dai3 die Schicht auf den Elektrouenober!'lachen dicker wird, d. h. die Kapazität C sich verringert, Figur 0 a zeigt die in eine Pufferlösung 'l eintauchenden Elektroden. Wenn Antigemuüleküle ·( mit b be/uiclmet) zugesetzt werden, tritt eine Adsorption von Antigeniriolekülen auf der Elektrodenoberriäche aal', bis schließlich ein Gleichgewicht zwischen Antigenen in der Lösung und aui der Elektrodenoberfläche adsorbierten Antigenen gehalten wird, wie aus Figur 6 b ersichtlich ist. In Figur ο c \>ird schließlich das Ver-Xaiii - ι zur Zugabe von Antikörpern E zu der Lösung illustrier t. Einige der Antikörper werden an Antigene in der Lösung und einige an Antigene aiu uen EIe ktrodenoberflächen gebunden, selbst hier tritt schließlich ein Gleichgewicht ein, vie aus Kurve ύ d ersichtlich ist, welche die lieihenkapazi tat C zwischen den Elektrodenoberflächen als funktion der Zeit bei der Zugabe von Antigenen (b) und Antikörpern (e) erläutert. Die Anfangsteigung uer Kur\e nach der Zugabe der Antikörper (e) wird durch die Konzentration der Antikörper bestimmt, wodurch ein quantitatives WaJl hierfür erhalten wird. Eine quantitative I-iesoun;; der Antikörperkonzeiitration kann auch aus der Ge.\>am^kapazitätsänderung bei der Antikörperzugabe augeleitet werden.
In dem folgenuen Uej spiel bestehe das sx>ezifische Substrat aus Antigenen, deren Moleküle die Eigenschaft zeigen müssen, an den Elektroden so anzuhaften, daß die Antikörpermoleküle an die Aatigemuoleküle gebunden' werden können. Weiterhin soll die gebildete Antigen-Antikürper-Schiclit ah der Elektrode ausreichend festgehalten werden, i'.enn der An ti gen-An Lxkürper-Komplex von
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der Elektrodenoberfläche gelöst wird, arbeitet dieses Verfahren gemäß dem zuvor erläuterten Beispiel.
Selbst für die Antikörper-Messung existiert eine optimale Antigen-Konzentration in Abhängigkeit von dem Gleichgewicht, das sich zwischen Antigenen in der Lösung und Antigenen auf der Elektrodenoberfläche ausbildet. Es bildet sich sogar ein Gleichgewicht zwischen freien und gebundenen Antigen- bzw. Antikörper-Molekülen aus.
Falls die zu untersuchende Substanz lediglich auf das Substrat in der Lösung wirkt, wird das Verfahren in der folgenden Weise durchgerührt.
Wenn man zu der Lösung in der Meßeinrichtung eine Substanz gibt, die lediglich auf das Substrat in der Lösung wirkt, sj-iikt die Konzentration der Substratmoleküle. Um das Gleichgewicht zwischen Substrat in der Lösung und-adsorbiertem Substrat wiederherzustellen, wird adsorbiertes Substrat von der Elektrodenoberfläche gelöst. Dies führt zu einer Verringerung der Schicht auf der Elektrodenoberflache und zu einer Zunahme der Kapazität C , wie aus Figur '}'d ersichtlich ist. Die Kapazitätsänderung pro Zeiteinheit, der Anstieg der Kurve bei Zugabe der hier in Hede stehenden Substanz, wird durch die Substanzkonzentration bestimmt, wodurch eine diesbezügliche quantitative Messung erhalten wird* Das gleiche gilt für die Gesamtkapazitätsänderung (nach einem längeren Zeitraum), die dementsprechend als Maß für die Konzentration oder Aktivität der fraglichen Substanz verwendet werden kann.
In vielen Fällen wirkt die zugegebene Substanz sowohl auf das Substrat in der Lösung und das Substrat auf den Elektroden. Die Kapazitätsänderung hängt dann von zwei Verfahren ab, ist jedoch immer noch ein quantitatives Maß Tür die Konzentration oder Aktivität der zugesetzten
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Substanz.
In den vorstehend beschriebenen Beispielen wurden Platinelektroden verwendet. Als Elektrodenmaterialien können jedoch auch andere Metalle verwendet werden. Metalle wie Kupfer, Silber, Molybdän,Titan, Gold, Palladium und Nickel/Chrom haben sich als ebenso gute Elektrodenmaterialien erwiesen. Es künn%!jedoch auch andere Elektrodenarten, z.B. ilalbleiterelektroden, verwendet werden. Für die Beispiele gilt weiterhin, daß die Impedanzbrücke vorzugsweise mit Ableitungen ausgerüstet werden kann, die die Kapazitätsänderung pro Zeiteinheit ("momentane Enzymaktivität") und Gesamtkapazitätsänderung ("integrierte Enzymaktivität11) Tür die .Fragliche Probe erkennen lassen.
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Claims (10)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung enzymatischer und anderer biochemischer Reaktionen, bei denen eine Substanz, deren Aktivität und/oder Konzentration bestimmt
werden soll, auf ein für die Reaktion spezifisches Substrat einwirkt, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer mit dem Substrat beschichtete Elektrode
enthaltenden Meßvorrichtung die Kapazität als Kontrollwert bestimmt und danach die Substanz in die
Meßvorrichtung einbringt sowie die Kapazitätsänderung mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratschicht auf den Elektrodenoberflächen durch Eintauchen derselben in eine das auf den Oberflächen adsorbierbare Substrat enthaltende Lösung gebildet is t; .
3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Zugabe der Substanz die auf den Elektrodenoberflächen adsorbierten Substratmoleküle vollständig oder teilweise dissoziieren.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierten Substratmoleküle bei Zugabe der Substanz die zugegebenen Moleküle binden und die Schichtdicke auf den Elektrodenoberflächen vergrößern.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kapazität zwischen den Elektroden mit
einer elektrischen Impedanzbrücke mißt.
. . .13
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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Serinproteasen bestimmt, wobei das Substrat aus synthetischen, spaltbaren, für Serinproteasen spezifischen Polypeptiden bestellt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch ein Substrat einschließlich seiner Salze der folgenden allgemeinen Formel
O O O
R1-NH-CH-C-NH- CH- C-NH- CH-C-NH-R
R2 R3 «jH2>n
NH
in der Il Wasserstoff, eine Alkyl carbonyl gruppe mit 1-12 Kohleiist of !atomen, eine (J -Aminoalkylcarbonylgruppe mit 1-12 Kohlenstoffatomen in gerader Kette, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine
Cu -Cyclohexylcarbonylgruppe mit 1-6 Kohlenstof1-atomen in gerader Kette, eine 4-Aininoethylcyclohexylcarbonylgruppe, eine üenzoylgruppe, die ggf. mit einem Halogenatom, einar Me thyl-, einer Amino- oder einer Phenylgruppe oder mehreren dieser Substituenten substituiert sein kann, eine (J -Phenylalkylcarbonylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen in gerader Kette, eine Bensο!sulfonylgruppe, eine 4-Toiuylsulfonylgruppe oder eine N0* -Benzoylplienylalanylgruppe; R eine Phenyl-, Benzyl-, 4-Hydroxybenzyl-, h-Methoxybenzyl- oder k-Methylbenzylgruppe; R„ eine geradkettige, verzweigte, oder cyclische AlJcylgruppe mit 3-ö Kohlenstoffatomen oder eine Phenyl- oder Benzylgruppe;
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η die Zahlen 3 oder 4; R. Wasserstoff oder eine Guanylgruppe und R eine Phenyl-, Nitrophenyl-, Meth.ylnitroph.enyl-, Dinitropheriyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolylgruppe bedeuten.
8. Verfahren nach Anspruch k, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierten Substratmoleküle die Moleküle, deren Aktivität oder Konzentration bestimmt werden soll, inhibieren.
9. Verfahren nach Anspruch k, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierten Substratmoleküle aus Rezeptoren für Hormone, deren Aktivität und/oder Konzentration bestimmt werden soll, bestehen.
10. Elektroden, beschichtet mit einem biochemisch
... spezifischen Substrat, zur Bestimmung von enzymatischen, immunologischen oder anderen biochemischen Aktivitäten, wobei das Substrat durch die zu bestimmende Substanz beeinflusst wird, so daß sich die Kapazität eines Meßgefäßes mit den beschichteten Elektroden im Vergleich zu Kontrollwerten, bestimmt in der Meßeinrichtung in Abwesenheit der das Substrat beeinflussenden Substanz, ändert.
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DE19762643871 1975-10-06 1976-09-29 Verfahren zur untersuchung enzymatischer und anderer biochemischer reaktionen Withdrawn DE2643871A1 (de)

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