DE2604283C2

DE2604283C2 - Verfahren zur Herstellung von 1,2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholinen

Info

Publication number: DE2604283C2
Application number: DE2604283A
Authority: DE
Inventors: Kenichi Fujiidera Osaka Kashima; Haruyoshi Ibaraki Osaka Kudoh; Akira Nishinomya Hyogo Miyamoto; Tadashi Takatsuki Osaka Nakajima; Yasuji Kobe Hyogo Soda
Original assignee: Nippon Shoji Kaisha Ltd
Current assignee: Azwell Inc
Priority date: 1975-02-04
Filing date: 1976-02-04
Publication date: 1984-04-19
Also published as: JPS54892B2; JPS5191213A; CA1068291A; DE2604283A1; US4130571A

Description

Derivat (Ausbeute 54,7%) durch ein Säurechloridverfahren, d. h. durch Umsetzung von Cadmiumchloridsalz von GPC mit einem Fettsäurechlorid bei Raumtemperatur während drei Stunden (E. Bear et al.; Can. J. Biochem. Physiol. Vol. 37, S. 953, 1959) erhalten werden können. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht, die Ausbeute des Produktes dieses Verfahrens durch Erhöhung der Reaktionszeit zu vergrößern, was jedoch zu einer Zunahme der Nebenprodukte führte (Bear et al. führten an, daß die Nebenprodukte cyclische Verbindungen darstellen könnten). Ober die Herstellung eines hoch ungesättigten Fettsäurederivates durch dieses Verfahren finden sich keine Hinweise.

Jedoch auch Cubero Robles et al. haben eine Säureanhydridmethodik zum Vorschlag gebracht, um die Erzeugung des Nebenproduktes bei dem Säurechloridverfahren zu verhindern (E. Cubero Robles et al.; Biochem.Diophys.Acta, Vol.187, S. 520, 1969). Nach diesem Verfahren wurden das Dipalmitoyl-Derivat (Ausbeute 90%), das Distearoyl-Derivat (Ausbeute 81%) und das Dioleoyl-Derivat (Ausbeute 70%) durch Umsetzung von Cadmiumchloridsalz von GPC mit einem Fettsäureanhydrid und Fettsäuretetraäthylammoniumsalz erhalten. Dieses Verfahren kann die gewünschten Diacylderivate in vergleichsweise hoher Ausbeute im Fall der stabilen, gesättigten Fettsäurederivate liefern. Es ist jedoch nicht notwendigerweise auch für die Herstellung der ungesättigten Fettsäurederivate geeignet. Lediglich ein Beispiel der Herstellung von ölsäurederivaten, welches einen Ungesättigkeitsgrad von 1 aufweist, ist mitgeteilt worden, und es ist angenommen worden, daß dieses Verfahren auf die Herstellung hoch ungesättigter Fettsäurederivate, wie von Linolsäure, nicht anwendbar sei. Kürzlich hat Gordon mitgeteilt, daß das Dioleoyl-Derivat durch ein Säureanhydridverfahren erhalten werden konnte (G. T. Gordon; Lipid, Vol. 7, S. 261,1972), worin die gewünschte Verbindung (Ausbeute 67%) durch Umsetzung eines Gemisches von GPC, Linolsäureanhydrid und Kaliumlinolat (1:2:2 in Gewichten) bei 44°C während 60 Stunden erhalten wurde. Jedoch müssen in diesem Verfahren das Linolsäureanhydrid und das Alkalimetallsalz der Linolsäure separat erzeugt werden, und es ist sehr schwierig, die Ausgangsmaterialien mit Isotopenmarkierung zu erzeugen, die in Spurenmengen erzeugt werden sollten. Darüber hinaus ist die Ausgangsfettsäure in der zweifachen theoretischen Menge erforderlich. Daher kann auch dieses Verfahren aus wirtschaftlicher Sicht nicht befriedigen.

Darüber hinaus ist kürzlich mitgeteilt worden, daß markierte Lecithine durch direkte Umsetzung eines Lysolecithins mit einem Aeylimidazol-Zwischenprodukt (W. F. Boss et al.; Analytical Biochemistry. Vol. 64, S. 289 —292, 1975) erzeugt werden konnten. Jedoch sogar bei diesem Verfahren konnten die gewünschten Diacylderivate nicht in hoher Ausbeute erhalten werden, und es ist auch unmöglich, ein Derivat hoch ungesättigter Fettsäuren darzustellen.
CH₂-O-COR

CH — O —COR

Il

CH₂-O- P-O-CII_;CII;N*(CH,I,

Unter diesen Umstanden wurden seitens der Erfindung intensive Studien mit dem Ziel durchgeführt, ein verbessertes Verfahren zur Hersteilung von 1,2-Diacyl-3-glycerylphophorylcholinen aufzufinden, welche insbesondere pinen hoch ungesättigten Fettsäurerest aufweisen, und noch bevorzugter, verschiedene Arten von Fettsäureresten in den 1- und 2-Stellungen besitzen. Hierbei ist gefunden worden, daß die gewünschten Verbindungen in hoher Ausbeute und hoher Reinheit

ίο durch Acylierung von Glyceryl-phosphorylcholin (GPC) oder von dessen Monoacylderivat oder von dessen Salz mit einem spezifischen Acylierungsmittel in Gegenwart eines spezifischen Katalysators erzeugt werden können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein

verbessertes Verfahren zur Herstellung von 1,2-Diacyl-3-glycerylphosphoryl-cholinen zu schaffen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung wird in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung hoch ungesättigter Fettsäurederivate von Lecithin gesehen.

2ü Der Erfindung liegt weiter die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Herstellung von Lecithinen des »gemischten Säuretypus« gestattet.

Eine weiter*: Aufgabenstellung der Erfindung liegt

schließlich in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung markierter Lecithine.

Diese und andere Aufgabenstellungen der Erfindung werden durch die nachfolgende Beschreibung veranschaulicht.
Gemäß der Erfindung werden die gewünschten

3» i^-Diacyl-S-gylcerylphosphorylcholine durch Acylierung von GPC oder dessen Monoacyl-Derivat oder dessen Salz mit einem Acylierungsmittel, das unter 1-Acylimidazol und 4-AcyI-3-phenyl-1,2,4-oxadiazol-5-on ausgewählt ist, in Gegenwart eines Katalysators

J-) erzeugt, der aus der Gruppe, die aus einem Alkalisalz einer stickstoffhaltigen 5gliedrigen heterocyclischen Verbindung und Natriumoxid besteht, ausgewählt ist.

Das Ausgangs GPC kann in Form der freien Base oder seines Salzes, beispielsweise Cadmiumchloridsalzes oder Bariumchloridsalzes, eingesetzt werden. Diese Salze werden üblicherweise als Komplexverbindung angesehen. Das GPC und ein Verfahren zu dessen Herstellung sind beispielsweise in H. Brockerhoff et al.; Can. J. Biolchem., Vol. 43. S. 1777 (1965) und J. S.

<·'· Chadha; Chem. Phys. Lipids. Vol. 4, S. 104 (1970) beschrieben.

Die Monoacyl-Derivate von GPC, d. h. iVlonoacyl-3-glyceryl-phosphorylcholine, die alternativ auch als Lysolecithine des 1 (oder 2)-Acyltypus bezeichnet

"'" werden,umfassen 1-Monoacylderivateund 2-Monoacylderivate, die auch in Form der freien Base oder dessen Salze mit Cadmiumchlorid oder Bariumchlorid verwendet werden können. Die i-Monoacyl-3-glyceryl-phosphorylcholine werden üblicherweise durch Hydrolyse

" eines natürlichen oder synthetischen Lecithins mit Phospholipase A2 oder einem analogen Enzym hiervon, wie es in dem nachfolgenden Schema gezeigt ist. hergestellt:

CH₂-O-COR

CH-OH

Phospholipase A_:

CH₂-O - P-O- ni_:CH:N'(CH;h

(II.

«HD

R bedeutet einen Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure.

Das Enzym Phospholipase A₂ oder das analoge Enzym wird üblicherweise aus Schlangengiften (z. B. Crotalus admanteus-Gift, Naja naja-Giit oder Trimeresurus fiavoviridis-Gift), Bienengift (z. B. Apis mellifera-Gift), GiIa monster-Giften (z. B. Heloderma horidum-Gift), Skorpiongiflen (z. B. Leurusquinques triatus-Gift) oder verschiedenen Tierorganen (z. B. Schweir.e-pancreas oder Rattenleber) gewonnen. Die Hydrolyse sollte zur Verhinderung der unerwünschten Umlagerung der Acylgruppe vorsichtig durchgeführt werden, wobei dies normalerweise durch Behandlung des Lecithins mit dem Enzym in einem geeigneten Lösungsmittel (ζ. Β. Äthyläther) in Gegenwart einer Pufferlösung (pH: 7,0 bis 7,2, z. B. 0,2 m Borsäure-Natriumcarbonat-Pufferlösung, 0,2 m Tris-Pufferlösung) und einem Aktivierungsmittel '.z. B. Calciumchlorid) bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

Die 2-Monoacyl-3-glycerylphosphorylcholine werden gleicherweise durch Hydrolyse eines natürlichen oder synthetischen Lecithins mit Phospholipase Ai oder einem analogen Enzym hiervon, welches aus verschiedenen Bakterien (z. B. Escherichia coli, Mycobacterium phlei, Bacillus megaterium oder Bacillus subtilis) oder verschiedenen Tierorganen (z. B. Rinder pancreas, oder Ratten-thymus.-niere.-pancreas oder -lunge) erhalten wird, erzeugt.

Darüber hinaus kann die Reinheit der Monoacylderivate, wie des 1 -Monoacy!derivates oder des 2-Monoacylderivates, durch enzymatische Hydrolyse des Monoacyl-3-glycerylphosphoryl-cholins mit Phospholipase C bestimmt werden, wodurch der Phosphorylcholinrest unter Erhalt eines Monoglycerides abgespalten wird, und sodann das resultierende Monoglycerid analysiert wird.

Das Acylierungsmittel 1-Acylimidazo! kann leicht durch Umsetzung von N.N'-Carbonyldiimidazol mit einer Fettsäure durch ein herkömmliches Verfahren erzeugt werden. In alternativer Weise können die 1-Acylimidazole durch Umsetzung von Imidazo! mit einem Fettsäurechlorid hergestellt werden [H. A. Staab; Chem. Ber, Vol. 89, S. 1940 (1956)]. Die 4-Acyl-3-phenyll,2,4-oxadiazol-5-one können ebenso leicht durch Umsetzung von 3-Phenyl-l,2,4-oxadiazol-5-on mit einer Fettsäure durch ein herkömmliches Verfahren erzeugt werden. Diese Acylierungsmittel können nach Isolierung aus dem Reaktionsgemisch oder in Form des Reaktionsgemisches so wie es ist, verwendet werden. Das Acylierungsmittel kann in einer äquimolaren oder geringfügig darüber liegenden Menge (üblicherweise ίο etwa 1- bis 3fache stöchiometrische Menge), bezogen auf das Ausgangs-GPC odci dessen Monoacylderivate, verwendet werden.

Die Fettsäuren umfassen gesättigte Fettsäuren mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen (ζ. V. Carpinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Behensäure, etc.) und ungesättigte Fettsäuren mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen (ζ. B. Myristoleinsäure, Palmitoleinsäure, ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, etc.). Bevorzugte Fettsäuren sind die hoch ungesättigten Fettsäuren mit zwei oder mehr Doppelbindungen, wie beispielsweise Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure. Diese Fettsäuren können mit einem Isotop (z. B. ¹⁴C oder ³H) markiert werden.

Der Katalysator kann ein Alkalisalz einer stickstoffhaltigen, 5gliedrigen, heterocyclischen Verbindung, wie beispielsweise Imidazolnatriumsalz, Triazolnatriumsalz. Benzimidazolnatriumsalz, oder andere Alkalimetallsalze (z. B. Kaliumsalz) dieser heterocyclischen Verbindungen darstellen. Auch Natriumoxid kann als Katalysator jo verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen ein

asymmetrisches Kohlenstoffatom in dem Molekül und können deshalb als D- oder L-optisches-Isomeres oder als racemische Substanz vorliegen. Sofern es in der

3-, Beschreibung und den Ansprüchen nicht anders angegeben ist, sollen alle Isomeren, entweder in getrennter Form oder deren Gemische, umfaßt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Fall der

Verwendung von 1-Acylimidazol als Acylierungsmittel durch das folgende Reaktionsschema veranschaulicht werden:

CH₂-O-R" CH-O —R" O

Il

CH₂-O-P-O-CH₂CH₂N⁺(CH₃),

(IV)

worin R und R' die vorstehende Bedeutung besitzen und R" Wasserstoff oder das gleiche wie R bedeutet, und R'" Wasserstoff oder das gleiche wie R' bedeutet, vorausgesetzt, daß beide Gruppen R" und R'" gleichzeitig nicht eine Gruppe bedeuten, die von Wasserstoff verschieden ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nachstehend für den Fall der Verwendung von 1-Acylimidazol als Acylierungsmittel im Detail beschrieben.

N.N'-Carbonyldiimidazol wird in wasserfreiem Tetrahydrofuran (nachstehend als »THF« bezeichnet) suspendiert, und der Suspension wird eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure hinzugegeben. Das Gemisch

R(oderR')—CO —N

(0

Na—

wird sodann mehrere bis zu mehreren 10 Stunden in einem Inertgas (ζ. B. Stickstoffgas) unter Erhalt von 1-Acylimidazol gerührt. Diese Verbindung wird für die Acylierung nach Isolierung oder in Form des Reaktionsgemisches, so wie es ist, eingesetzt.

Zu einem Gemisch von GPC (sowohl R" und R'" in Formel (IV) bedeuten Wasserstoff) oder dessen Monoacylderivat (eine der R"- und R'"-Gruppen der Formel (IV) stellt Wasserstoff und die andere eine von

hi Wasserstoff verschiedene Gruppe dar) oder dessen Salz und 1-Acylimidazol, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, in wasserfreiem THF wird Imidazolnatriumsalz (als Katalysator) hinzugegeben, welches durch

Umsetzung eines Gemisches von Imidazol und metallischem Natrium in wasserfreiem THF während 30 bis 60 Minuten am Rückfluß erhalten worden war. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während mehreren bis zu mehreren 10 Stunden unter Erhalt der gewünschten Diacylverbindung gerührt.

Die markierten Verbindungen, d. h. die 1.2-Diacyl-3-glyceryl-phosphorylcholine, in denen eine oder beide der Diacylgruppen einen mit einem Isotop markierten Fettsäurerest darstellen, können unter Verwendung eines Acylierungsmittels, worin die Acylgruppe einen Fettsäurerest bedeutet, der mit einem Isotop (z. B. ¹⁴C oder ³H) markiert wurde, in gleicher Weise wie im Fall der nicht markierten Verbindungen hergestellt werden. In alternativer Weise kann bei Verwendung von MonoacylO-glycerylphosphorylcholinen als Ausgangssubstanz deren Acylgruppe mit einem Isotop markiert werden.

D! .ewinnung der aus dem Reaktionsgemisch gernali vorstehender Vorschrift erhaltenen gewünschten Verbindungen kann wie folgt durchgeführt werden:

Zu dem Reaktionsgemisch wird Chloroform hinzugegeben, und das Gemisch wird mit 1 η HCI-Methanol neutralisiert. Nach Zugabe einer geeigneten Menge an verdünntem Methanol wird das Gemisch in einem Scheidetrichter in zwei Schichten getrennt. Die untere Schicht wird herausgenommen und unter verringertem Druck kondensiert. Der Rückstand wird in Äthanol-Chloroform-Wasser (7:1 :3 Volumenteile) aufgelöst, und die resultierende Lösung wird durch eine mit Harz des Amberlite MB-3-Typus gefüllte Säule geführt, und sodann wird die Säule mit Äthanol-Chloroform-Wasser (7:1 :3 Volumenteile) gewaschen. Die durchgeführte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und kondensiert. Das resultierende Kondensat wird beispielsweise einer Silicagel-Säulenchromatografie unterworfen, welches ein herkömmliches Reinigungsverfahren darstellt, um das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute und hoher Reinheit herzustellen.

Gemäß der Erfindung können sowohl die gesättigten als auch ungesättigten Fettsäuren unter milden Bedingungen verwendet werden, d. h. ohne daß harte Reaktionsbedingungen zu deren Umwandlung in ein Säurechlorid oder Säureanhydrid nach üblichen Verfahren erforderlich wären, und die Fettsäuren können in 1 -Acyl-imidazol unter milden Bedingungen (z. B. bei Raumtemperatur) übergeführt werden, das für die Reaktion mit GPC oder dessen Monoacylderivat oder dessen Salz, so wie es ist, verwendet werden kann. Da die Acylierungsreaktion gemäß der Erfindung in Gegenwart eines spezifischen Katalysators durchgeführt wird, erfolgt die Reaktion darüber hinaus unter milden Bedingungen (z. B. bei Raumtemperatur) wobei die gewünschte Verbindung in hoher Ausbeute und hoher Reinheit erhalten wird. Somit ist die Erfindung insbesondere für die Einführung eines unstabilen, hoch ungesättigten Fettsäurerestes und insbesondere für die Herstellung von Lecithinen des gemischten Säuretypus geeinget (gemäß der Erfindung umfassen die Lecithine des gemischten Säuretypus solche Verbindungen, worin eine der Acylgruppen mit einem Isotop markiert ist).

Hiermit können gemäß der Erfindung die gewünschten l,2-Diacyl-3-g!ycerylphGsphory!chc!ir.e, insbesondere die Lecithine des gemischten Säuretypus, und ganz besonders die markierten Lecithine in hoher Ausbeute und hoher Reinheit erzeugt werden.

Die Erfindung wird nachstehend durch folgende, nicht einschränkende Beispiele veranschaulicht

Beispiel 1

In einem 100-ml-Dreihalskolben wird N.N'-Carbonyldiimidazol (1,62g, 1 ■ 10² Mol) in trockenem THF (10 ml) suspendiert und hierzu eine Lösung von Linsolsäure (2,1g, 7,5-10-iMol) in THF (15 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird mit einem Magnetriihrer unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur während 28 Stunden gerührt (unter bestmöglichem Feuchtigkeitsausschluß).

Zu dem hierdurch erhaltenen Reaktionsprodukt wird eine Suspension des Cadmiumchloridsalzes von GPC (1,1 g, 2,5 · ΙΟ-³ Mol) in THF (20 ml) und eine Lösung eines Imidazolnatriumsalzes [welches durch Rück-

i^r) flußerhitzung von Imidazol (1 g) und metallischem Natrium (0.1 g) in THF (10 ml) während einer Stunde erzeugt worden war] in THF (2,5 ml) hinzugefügt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 43 Stunden gerührt.

-<> Zu dem Reaktionsgemisch wird Chloroform (200 ml) hinzugegeben, und das Gemisch wird weiter mit 1 η HCI-Methanol (12 ml) neutralisiert. Zu dem Gemisch werden Wasser (60 ml) und Methanol (100 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird in einem Scheidetrichter in zwei Schichten aufgetrennt und die untere Schicht wird herausgenommen und sodann kondensiert. Der resultierende Rückstand wird in Äthanol-Chloroform-Wasser (7:1:3 Volumenteile, 40 ml) aufgelöst, und die Lösung wird durch eine Säule geführt, die mit Harz vom

3" Amberlite MB-3-Typus gefüllt ist (40 ml, welches mit dem vorstehend angegebenen gleichen Lösungsmittel aktiviert worden war), und sodann wird die Säule mit dem vorstehend angegebenen gleichen Lösungsmittel gewaschen. Die durchgeführte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und unter verringertem Druck kondensiert. Das Kondensat wird in Chloroform-Methanol (98 : 2 Volumenteile) aufgelöst und durch eine Säule geführt, die mit Silicagel gefüllt ist (60 g, welches mit dem gleichen obigen Lösungsmittel (Chloroform-Me-

thanol) behandelt wurde). Die auf der Säule adsorbierten Substanzen werden mit Chloroform-Methanol (98 :2 Volumenteile, 100 ml), Chloroform-Methanol (6 :4 Volumenteile, 1200 ml) und Chloroform-Methanol (2:8 Volumenteile, 1000 ml) unter Erhalt von Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III jeweils eluiert Die Fraktion II wird unter verringertem Druck kondensiert, wobei das gewünschte l^-DiIinoleoyl-L-3-glyceryIphosphorylcholin (IJSO g, 90%) erhalten wurde.

Dieses Produkt stellt eine farblose, klebrige Substanz

so dar und zeigt in der Dünnschicht-Chromatografie einen einzigen Fleck bei Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme (als Entwickler):

1. CHCl₃-CH₃OH-H₂O (65:25:4 Volumenteile) (für Phospholipide)

2. CHCI₃-CH₃OH-CH₃COOh-H₂O

(25 :15 :4 :2 Volumenteile) (für Phospholipide)

3. Petroläther—Äthyläther—CH₃COOH (90 :10:1 Volumenteile) (für Fettsäure)

Dies bedeutet, daß das Produkt keine freie Fettsäure, Imidazol oder Lysolecithin enthält Darüber hinaus stimmt der Rf-Wert dieses Flecks mit dem des gereinigten Lecithins (in Eigelb) überein. Darüber hinaus zeigt die Substanz die folgenden optischen Rotations- und Elementaranalysenwerte:

Optische Rotation
[<x]'· = +7,3°
[»]>' = +7,4°

(CHCIjICH₃OH =
(CHCI₃: CHjOH =

Elementaranalyse für C«Hk₂O(,NP:
berechnet:(%):
N 1,68; P 3,89; P/Ester 1/2
gefunden (%):
N 1,75; P 3,99,3,99 P/Ester, 1/2,20,1/2,02

Durch diese Werte wird bewiesen, daß das vorstehend angeführte Produkt rein ist.

Beispiel 2

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wird Palmitinsäure (1,0g, 3,8· 10-³MoI) in THF (20ml) aufgelöst, und hierzu wird Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol (810 mg, 5 · 10-³ Mol) hinzugefügt. Das Gemisch wird unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur während drei Stunden gerührt. Nach Zugabe von Imidazolnatriumsalz (100 mg) wird das Gemisch zusätzlich während 30 Minuten gerührt, und hierzu wird GPC-Cadmiumsalz (550 mg) hinzugegeben, und das Gemisch wird erneut bei Raumtemperatur während 96 h gerührt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben unter Erhalt des gewünschten l^-Dipalmitoyl-L-S-glyceryl-phosphorylcholin (873 mg, 93%) in Form farbloser Kristalle behandelt. Schmelzpunkt: 235-236°C

[a]f = +8,1° (CHCl₃: CH₃OH = 1 : 1,C= 6,3)

Elementaranalyse für C₄₀He₂Oq
(Molekulargewicht 752):

berechnet(%): C 63,89; H 11,00; N 1,86
gefunden(%): C64.24; H 11,09; N 1,93

Beispiel 3

In einen trockenen 50-ml-Zweihalskolben, der mit einem Stickstoffeinlaßrohr und einem Rückflußkühler mit Calciumchlorid-Trockenrohr versehen ist. werden eine geeignete Menge Glasperlen und ein Rotator für einen Magnetrührer eingebracht, und hierein wird Stickstoffgas eingeblasen. In dem Kolben werden eine Lösung von N,N'-Carbonyl-diimidazol (407 mg) und Palmitinsäure (470 mg) in einer kleinen Menge THF eingebracht. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird ohne Isolierung des erzeugten 1-Palmitoylimidazols GPC (205 mg) und weiter eine Lösung (3 ml) von Imidazolnatriumsalz in THF hinzugegeben, welche durch Umsetzung von Natriumhydrid (130 mg) und Imidazol (500 mg) in THF (10 ml) während 30 Minuten erzeugt worden war.

Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 65 Stunden umgesetzt Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben unter Erhalt des gewünschten 1,2-Dipalmitoyl-L-3-glycerylphosphoryIcholin (485 mg, 81%) behandelt Schmelzpunkt 235—236° C.

Dieses Produkt stellt eine farblose, kristalline Verbindung dar und zeigt in der Dünnschicht-Chromatografie einen einzigen Fleck.

Beispiel 4

In das gleiche Reaktionsgefäß wie es in Beispiel 3 verwendet wurde, wird eine Lösung von 4-Linoleoly-3-phenyI-U,4-oxadiazol-5-on (330 g, 1 · 10~² Mol) in

einer kleinen Menge THF eingegeben, und hierzu wird 1: 1,C= 4,4) GPC-Cadmiumehloridsalz (550 mg, 1,25-10-³MoI)

1 : 1,C= 4,2) hinzugegeben. Zu dem Gemisch wird weiterhin das

Natriumsalz von 3-Phenyl-l,2,4-oxadiazol-5-on(100 mg) hinzugefügt, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 48 Stunden umgesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben unter Erhalt des gewünschten i^-Dilinoleoyl-L-S-glyceryl-phosphorylcholin (747 mg, ic 75%)behandelt.

Dieses Produkt stellt eine farblose, klebrige Verbindung dar und zeigt in der Dünnschicht-Chromatografie einen einzigen Fleck. Auch das Infrarotspektrum ist mit jenem einer Bezugsstandardverbindung identisch.

Be is pie! 5

Synthetisches, reines 1 ^-Distearoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin (50 mg) wird in Äthyläther (1 ml) aufgelöst, und hierzu werden eine Lösung von Phospholipase A₂

-» (0,5 mg), die aus Crotalus admanteus-Gift erhalten wurde, in 0,2 m Borsäure-Natriumcarbonat-Puffer (pH 7,0, 0,5 ml) und mehrere Tropfen einer wäßrigen, 2,5 m Calciumchloridlösung (als Aktivierungsmittel) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur

2"> während einer Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter verringertem Druck kondensiert, und hierzu wird eine kleine Menge Benzol hinzugefügt und das Gemisch wird erneut zur vollständigen Entfernung der Feuchtigkeit kondensiert. Das resultierende, farblose,

μ feste Material wird in absolutem Äthanol aufgelöst und die Lösung wird zur Entfernung der unlöslichen Materialien filtriert, wonach zu dem Filtrat Äthyläther hinzugefügt und das feste Material bei -2O⁰C umkristallisiert wird. Die Umkristaiiisierung wird

J5 zweimal wiederholt. Das resultierende kristalline Produkt(25 mg,77%)stellt l-Stearoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin dar. Dieses Produkt zeigt einen einzigen Flecken bei der Dünnschicht-Chromatografie [Entwickler: CHCl₃-CH₃OH-H₂O (65:25:4 Volumenteile)],

ίο welcher mit jenem eines Bezugsstandards identisch ist. Darüber hinaus weist die Analyse des Monoglycerides nach, welches durch Hydrolyse des Produktes mit Phospholipase C erhalten wurde, daß das Produkt eine Reinheit von 95,5% als Verbindung des 1-Acyltypus

4i aufweist.

In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Hanahan et al. [D. J. Hanahan et al.; J. Biol. Chem., Vol. 235, S. 1918 (1969)1 wird das vorstehend erhaltene i-Stearoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (500 mg) in

Äthanol (10 ml) aufgelöst und zu der Lösung wird eine Lösung von Cadmiumchlorid (CdCl₂ · 2,5 H₂O, 700 mg) in Wasser (0,5 mi) und Äthanol (8 rnl hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während zwei Stunden stehen gelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden durch Filtration abgetrennt und mit Äthanol und Äthyläther gut unter Erhalt von Cacmiumchloridsalz von l-Stearoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin (650 mg, 64%) gewaschen.

Das Cadmiumchioridsalz (300 mg, 3,6 · 10-« MoI), das hiermit erhalten wurde, wird in trockenem THF (10 ml) suspendiert, und hierzu werden 1-Palmitoylimidazol (660 mg) und Imidazolnatriumsalz (10 mg) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 16 Stunden gerührt Nach Zugabe von Chloroform (50 m!) wird das Reaktionsgemisch mit 1 η HCl-Methanol (3 ml) neutralisiert, und hierzu werden Wasser (15 ml) und Methanol (25 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird in einem Scheidetrichter getrennt Die

untere Schicht wird herausgenommen und kondensiert. Der resultierende Rückstand wird in Äthanol-Chloroform-Wasser (7:1 :3 Volumenteile, 10 ml) aufgelöst und die Lösung durch eine Säule geführt, die mit Harz des Amberlite MB-3Typus gefüllt ist (10 ml, welches mit dem obigen gleichen Lösungsmittel aktiviert worden war) und die Säule wird sodann mit dem gleichen vorstehend angeführten Lösungsmittel gewaschen. Die durchgeführte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und unter verringertem Druck kondensiert. Das Kondensat wird in Chloroform-Methanol (98 :2 Volumenteile) aufgelöst und durch eine Säule geführt, die mit Silicagel (30 g, welches mit dem gleichen Lösungsmittel (Chloroform-Methanol) behandelt wurde) gefüllt ist. Die auf der Säule adsorbierten Substanzen werden mit Chioroform-Methanoi (98 : 2 Voiumenteiie, 250 ml), Chloroform-Methanol (6 :4, 300 ml) und Chloroform-Methanol (2 : 8 Volumenteile, 250 ml) unter Erhil; jeweils Fraktion I, Fraktion II und Fraktion III eluiert. Fraktion II wird unter verringertem Druck unter F.rhalt des gewünschten l-Stearoyl-2-Palmitoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (260 mg, 80%) in Form farbloser Kristalle kondensiert.

Schmelzpunkt 233 - 235° C, [«]g> = + 6,0° ± 0,5° (CHCb₁C= 10,0)

Elementaranalyse für C42H86O9NP

(Molekulargewicht 780,1):

berechnet (%): C 64,66; H 11,11; N 1,80
gefunden(%): C 64,30; H 11,23; N 1,93

Das in dem vorstehenden Beispiel verwendete 1-Palmitoylimidazoi wird wie folgt hergestellt:

In einem 100-mI-Dreihalskolbcn wird N.N'-Carbonyldiimidazol (810 mg, 5 · 10-'Mol) in trockenem THF (10 ml) suspendiert, und hierzu wird eine Lösung von Palmitinsäure (1.0g, 3,8-10-³MoI) in THF (20 ml) gegeben. Das Gemisch wird mit einem Magnetrührer unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur während 3 Stunden gerührt (und die Feuchtigkeit wird bestmöglich ausgeschlossen). Nach der Reaktion wird das Reaktiongsgemisch filtriert. Das Filtrat wird unter verringertem Druck konzentriert und der resultierende Rückstand aus Äthylacetat unter Erhalt der gewünschten Verbindung (1,0 g) umkristallisiert. Schmelzpunkt: 81-83°C.

Beispiel 6

Synthetisches, reines l^-Dipalmitoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin (1.234 mg) wird in Äthyläther (70 ml) aufgelöst, und hierzu werden eine Lösung von Phosphoüpase A₂ (4 mg, welche aus Naja r.aja-Gifl erhalten wurde) ::) Wasser (4 ml), 0,2 m Tris-Puffer (pH 72, 2 ml) und 0,1 m wäßrige Calciumchloridlösung (0,5 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 4 Stunden angesetzt Das resultierende Reaktionsgemisch wird unter verringertem Druck kondensiert und sodann in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt Das resultierende feste Material wird aus Äthyläther bei -2O⁰C unter Erhalt von l-Palmitoyl-L-3-glycerylphosphorylcholin (674 mg, 80%) umkristallisiert Nach der Analyse des Monogrycerides, welches durch Hydrolyse des Produktes mit Phospholipase C erhalten wurde, weist das Produkt eine Reinheit von 97,9% als Verbindung des I-Acyltypusauf.

Das 1 -Palmitoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin

(266 mg, 5,17 ■ 10^⁴MoI), welches hierdurch erhalten .- wurde, wird in trockenem THF (10 ml), suspendiert, und hierzu werden 1-Linoleoylimidazol (510 mg, 1,55 ■ 10 ³ Mol) und Imidazol-Natriumsaiz (10 mg) hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 70 Stunden gerührt. Das resultierende Reaktionsge-

Hi misch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt und wird schließlich einer Silicagel-Säulenchromatografie unter Erhalt des gewünschten l-Palmitoyl^-linoleoyl-LO-glycerylphosphorylcholin (342.3 mg, 84%) als farblose, klebrige

ii Verbindung unterworfen.

[x]? = +6,5° ± 0,5° (CHCl₃ :CH₃OH = 1 : 1.C= 5,0)

Elementaranalyse für C42H82O0NP
(Molekulargewicht 776,1):
χ; berechnet(%): N 1,80; P 3,99
gefunden (%): N 2,11: P 3,66

Dieses Produkt zeigt einen einzigen Flecken in der

Dünnschicht-Chromatografie, welcher mit dem eines

2-, Bezugsstandards identisch ist. Darüber hinaus ist auch das Infrarotspektrum des Produktes mit jenem einer Bezugsstandardverbindung identisch.

Das in dem vorstehenden Beispiel verwendete 1-Linoleoylimidazol wird aus Ν,Ν'-Carbonyldimidazol jo (1620 mg) und Linolsäure (2100 mg) in gleicher Weise wie es in Beispiel 5 beschrieben ist erzeugt.

Beispiel 7

In gleicher Weise wie in Beispie! 5 oder 6 beschrieben

si wird l-Linoleoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin aus reinem l^-Dilinoleoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin unter Anwendung von Phospholipase Aj, welche aus Crotalus admanteus-Gift oder Naja naja-Gift erhalten wurde, hergestellt.

Das l-Linoleoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin

(352,2 mg, 6.54-10-⁴MoI), 1-Palmitoylimidazol (594,8 mg. 196- 10-³MoI) und imidazoinairiumsaiz (10 mg) werden zu trockenem TH F (15 ml) gegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 70 Stunden umgesetzt Das resultierende Reaktionsgemisch wird in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt und schließlich einer Silicagel-Säulenchromatografie unterworfen, wobei das gewünschte 1 -Linoleoyl^-Palmitoyl-L-S-glycerylphosphorylcholin (302,6 mg, 58.9%) als farblose, klebrige Verbindung erhalten wird.

[λ]? = +6,5° ± 0,5° (CHCI3 : CH₃OH = 1 : 1. C = 5,0)

Elementaranalyse für C42H82O9NP (Molekulargewicht 776,1):

berechnet (%): N 1,80; P 339 gefunden (%): N 1,78; P 3,80

Dieses Produkt zeigt einen einzigen Recken bei der Dünnschicht-Chromatografie, welcher mit jenem eines Bezugsstandards identisch ist Darüber hinaus ist auch

das Infrarotspektrum des Produktes mit jenem einer

Bezugstandardverbindung identisch.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines l,2-Diacyl-3-glycerylphosphorylcholins der Formel

CH₁-O-COR

CH — O — COR'
0

CH₃

CH₂-O-P-O-CH₂CH₂NACH₃
O ^CHj

IO

15 worin R und R' verschieden oder gleich sind und jeweils einen Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure darstellen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glyceryl-pbosphorylcholin oder Monoacrylderivat hiervon oder das Salz hiervon mit einem Acylierungsmittel, das unter 1-Acylimidazo! und 4-Acyl-3-phenyl-l,2,4-oxadiazol-5-on ausgewählt ist, in Gegenwart eines Katalysators acyliert, der unter Alkalisalzen einer Stickstoff enthaltenden 5gliedrigen, heterocyclischen Verbindung und Natriumoxid ausgewählt ist.

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von i^-Diacyl-ß-glycerylphosphorylcholinen und hierbei insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von l.i-Diacyl-S-glycerylphosphorylcholinender Formel

CH₂-O-COR
CH-Ο —COR'

0
CH₂-O-P-O-CH₂CH₂

(D

CH₃
CH₃

worin R und R' unterschiedlich oder gleich sind und jeweils einen Rest einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure darstellen.

Die Verbindung der Formel (I) stellt das sogenannte Lecithin dar, welches eines der GlycerylphoFpho-lipide ist und 50 oder mehr °/o der Phospholipide ausmacht, die in verschiedenen Tieren oder Pflanzen enthalten sind. Das natürliche Lecithin enthält hauptsächlich einen Rest einer gesättigten Fettsäure (z. B. Myristinsäure, Palmitinsäure oder Stearinsäure) und/oder einen Rest einer ungesättigten Fettsäure (z. B. ölsäure, Linolsäure,

H₂C-O-COR

RCO-O —CH + C₆H₅-O-PCl₂

H,C—OH

Linolensäure) als Acylgruppe (RCO-). Unter diesen ist

2« das Lecithin, das einen hohen Anteil an hoch ungesättigter Fettsäure, wie Linolsäure oder Linolensäure enthält, welches eine essentielle Fettsäure darstellt, in letzter Zeit als Medikament wegen seiner ausgezeichneten biologischen Wirkungen eingesetzt worden. Darüber hinaus hat seit etwa 1960, als gefunden worden war, daß das Lecithin eine der Grundkomponenten verschiedener Biomembranen darstellt, die Bedeutung des Lecithins im medizinischen und pharmazeutischen Bereich ständig zugenommen.

w Es ist jedoch sehr schwierig, ein Lecithin zu erzeugen, das einen spezifischen Fettsäurerest oder einen mit einem Isotop markierten Fettsäurerest bzw. insbesondere verschiedene Arten von Fettsäureresten in der 1- und 2-Stellung aufweist (sogenanntes Lecithin des »gemischten Säuretypus«).

Es sind bislang verschiedenartige Verfahren zur Herstellung von Diacylglycerylphosphorylcholinen beschrieben worden. Beispielsweise haben Bear et. al mitgeteilt, daß die Verbindung dadurch hergestellt werden kann, daß man den Phosphatrest in ein Diglycerid oder ein Diacylglyceryl-lodhydrin einführt und nachfolgend hiermit den Cholinrest kombiniert, wie es durch das nachfolgende Reaktionsschema gezeigt ist (E. Bear & M. Kastens; J. Am. Chem. Soc, Vol. 72, S. 942,

45 1950): H₂C-O-COR

Cholinchlorid

RCO-O —CH

RCO-O —CH

H₃C-O-COR H₂C-O-P-OC₆H₅

Cl

H_?/Pd

H₂C-O-P-OCH₂CH₂N⁺(CH₃)J Cl" OC₆H₅

l^-Diacyl-L-.Vglycerylphosphorylcholin.

Nach diesem Verfahren wird die gewünschte Verbindung nur in sehr niedriger Ausbeute erhalten, weshalb dieses nicht wirtschaftlich ist.

F.s sind auch Verfahren zur Einführung eines spezifischen Fettsäurerestes in Glyceryl-phosphorylcholin (nachstehend als »GPC« bezeichnet) durch ein Säurechlorid- oder ein Säureanhydrid-Verfahren bekannt. So ist beispielsweise durch Bear et al. berichtet worden, daß das Dimyristoyl-Derivat (Ausbeute 51,0%), Distearoyl-Derivat (Ausbeute 38,4%) und das Dioleoyl-