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DE2600526A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von mit sauerstoff unter oxidaseeinwirkung h tief 2 o tief 2 bildenden substanzen und reagens zu seiner durchfuehrung - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung von mit sauerstoff unter oxidaseeinwirkung h tief 2 o tief 2 bildenden substanzen und reagens zu seiner durchfuehrung

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DE2600526A1
DE2600526A1 DE19762600526 DE2600526A DE2600526A1 DE 2600526 A1 DE2600526 A1 DE 2600526A1 DE 19762600526 DE19762600526 DE 19762600526 DE 2600526 A DE2600526 A DE 2600526A DE 2600526 A1 DE2600526 A1 DE 2600526A1
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buffer
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catalase
methanol
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Erich Haid
Sigmar Dr Phil Klose
Guenter Dr Rer Nat Weimann
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Boehringer Mannheim GmbH
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Description

Patentanwälte Dipl.-Inc. f·. "Wkickmann," 260Ö526
Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.¥eickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH 860 820 HT
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
BOEHEINGER MANNHEIM GMBH, 68 Mannheim 31, Sandhofer Straße 112-132
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung HpOp bildenden Substanzen und Reagens zu seiner Durchführung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H H2O2 bildenden Substanzen durch Überführung des gebildeten HpOp in Gegenwart von Methanol und Katalase in Formaldehyd, Umsetzung des Formaldehyde mit einem Hydrazon in Gegenwart von FeCl^ und photometrische Bestimmung des hierbei gebildeten Farbstoffs.
Aus der FR-PS 2 198 642 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure durch Umsetzung mit Uricase unter Bildung von H2Op, Umsetzung des H2Op mit Katalase und Methanol
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260Q526
unter Bildung von Formaldehyd und Reaktion des Formaldehyde mit 3-Methylbenzothiazolonhydrazon und FeCl.* unter Bildung eines Farbstoffs, der photometrisch bestimmt werden kann, bekannt. Ein entsprechendes Verfahren ist aus Chem.Pharm.Bull.r7, 1304-1305 (1969) für die Glucosebestimmung unter Verwendung von Glueöseoxidase bekannt. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die relativ geringe Störanfälligkeit gegenüber Medikamenten und sonstigen Fremdsubstanzen. Ein erheblicher Nachteil ist jedoch die geringe Stabilität von MBTH und die relativ schlechte Wasserlöslichkeit des bei der Farbreaktion gebildeten Farbstoffs. Dies führt zu relativ hohen Verschleppungen zwischen den einzelnen Bestimmungen, so daß sich das Verfahren insbesondere für die Durchführung an Analysenautomaten nur wenig eignet. Dieser Effekt wird noch verstärkt, da bei dem zur Färbentwicklung nötigen Oxidationsschritt Nebenreaktionen auftreten,bei denen ein unlösliches Produkt gebildet wird. In Analysenautomaten schlägt sich dieses in den Leitungen, z.B. den Schläuchen und Glasspiralen, nieder und erhöht damit die Verschleppung noch weiter. Außerdem führt dies zu einer instabilen, d.h. triftenden Basislinie.
TJm dieses bekannte Verfahren trotz dieser Nachteile anwenden zu können, mußte die Analysendauer erheblich verlängert werden und eine relativ häufige Spülung der Apparatur vorgenommen werden. Die Triftanfälligkeit der Basislinie schließlich mußte in Kauf genommen werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, bei einem Verfahren der eingangs erwähnten Art die oben beschriebenen Nachteile zu beseitigen.
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Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein "Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung HpO2 bildenden Substanzen im Serum durch Überführung des gebildeten HpOp in Gegenwart von Methanol und Katalase in Formaldehyd, Umsetzung des letzteren mit einem Hydrazon in Gegenwart eines Oxidationsmittels und photometrische Bestimmung des hierbei gebildeten Farbstoffes, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Hydrazon 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon verwendet wird.
Überraschenderweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren ein sehr gut löslicher Farbstoff gebildet, so daß die oben beschriebenen Schwierigkeiten, die auf die Unlöslichkeit des bei der Färbstoffbildung entstehenden Oxidationsproduktes zurückzuführen sind, nicht mehr auftreten. Dies ist überraschend, da MBIH selbst eine gute Löslichkeit in wäßrigem Medium aufweist (4,8 g/100 ml bei pH1) und in dieser Richtung nicht zu beanstanden ist, während das erfindungsgemäß verwendete MBTH-SuIfonat eine weit schlechtere Löslichkeit als MBTH aufweist, nämlich 0,6 g/100 ml bei pH1, so daß auch von dem gebildeten Oxidationsprodukt eine noch weiter verringerte Löslichkeit und entsprechend verschlechterte Brauchbarkeit im Rahmen eines derartigen Verfahrens zu erwarten war.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich grundsätzlich für alle Bestimmungen anwenden, bei welchen HpOp gebildet wird. Die HpO2-Bildung wird bei enzymatischer Katalyse durch Oxidasen bewirkt, so daß generell das Verfahren zur Bestimmung aller Substrate von Oxidasen geeignet ist. Unter Oxidasen werden dabei im Rahmen der Erfindung solche Enzyme verstanden, welche ihr Substrat mit molekularem Sauerstoff unter Bildung von H2Op zu oxidieren vermögen.
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Typische Beispiele für derartige Oxidasen sind Uricase, Glucoseoxidase und Cholesterinoxidase. Die zugehörigen Substrate sind Harnstoff, Glucose bzw. Cholesterin.
Die Durchführung des Verfahrens kann nach den aus den eingangs erwähnten Literaturstellen bekannten Bedingungen erfolgen. Die Umsetzung der zu bestimmenden Substanz mit der entsprechenden Oxidase, wie Uricase, Cholesterinoxidase oder Glueöseoxidase erfolgt in der dem Fachmann hierfür bekannten Weise. Das gebildete H2O2 wird mit Methanol und Katalase umgesetzt unter Bildung von Formaldehyd und Wasser. Diese Reaktion ist ebenfalls dem Fachmann geläufig und braucht hier nicht näher beschrieben zu werden. Der gebildete Formaldehyd wird nun in Gegenwart eines Oxidationsmittels mitMBTH-Sulfonat umgesetzt unter Bildung eines Farbstoffes mit X max bei und 670 nm S~ 60 000.
Die Reaktion der Farbstoffbildung wird durch folgende Formelgleichung wiedergegeben:
Beispiele für im Rahmen der Erfindung besonders geeignete Oxidationsmittel sind Kaliumcyanoferrat (III), FeCl, oder (NH.). Ce(SO.).. Vorzugsweise werden diese Oxidationsmittel als 0,2 bis 5%ige Lösung in verdünnter Säure,
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insbesondere in Schwefelsäure, eingesetzt. Bei der Wahl des Lösungsmittels ist zu beachten, daß der Extinktionskoeffizient des gebildeten Farbstoffes vom pH-Wert abhängt und am stärksten in saurem Milieu bei pH-Werten unter 3 ist. Vorzugsweise wird daher zwischen pH 0,5 und 3 gearbeitet. Zur Erzielung dieses pH-Wertes wird zweckmäßig in starken Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen gearbeitet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung HpO2 bildenden Substanzen im Serum, welches eine Oxidase, Katalase, Methanol, Puffer, ein Oxidationsmittel und Säure enthält und gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon.
Das Reagens kann in trockener Form oder als Lösung vorliegen. Die jeweils verwendete Puffersubstanz ist auf die verwendeten Enzyme abgestimmt und für den am besten geeigneten pH-Wert eingerichtet. Beides ist dem Fachmann bekannt. Beispielsweise eignen sich bei Verwendung von Uricase mit Katalase pH-Werte zwischen etwa 7 und 9, vorzugsweise zwischen 8,0 und 8,6. Boratpuffer wird bevorzugt. Bei Cholesterinoxidase und Katalase eignen sich pH-Werte zwischen 6,0 und 8,5» vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5. Hier wird Phosphatpuffer bevorzugt.
Die Methanolkonzentration soll etwa 2 bis 8 Vol.-# betragen. Es können jedoch auch höhere oder niedrigere Konzentrationen geeignet sein.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. A) Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Hydrazons
1 580 ml Schwefelsäure reinst (95-98$) werden unter Eiskühlung und Rühren langsam mit 1 000 ml rauchender Schwefelsäure mit mindestens 65$ S0,-Gehalt versetzt. Die erhaltene Mischung wird auf 0 bis 50C gekühlt und mit 500 g N-methylbenzthiazolonhydrazonhydrochlorid (MBTH · HCl) portionsweise versetzt. Es wird darauf geachtet, daß die Temperatur 10 bis 130C nicht überschreitet. Die Zugabe ist nach einer Stunde beendet. Danach wird noch 1,5 Stunden bei ca. plus 100C gerührt, bis die Lösung vollkommen klar und leicht gelb gefärbt ist.
Der Ansatz wird vorsichtig auf 20 1 Eis gegossen und die Temperatur durch weitere Eiszugabe auf 0° gebracht. Nach zweistündigem Stehen werden die gebildeten Kristalle abgesaugt, und mit kaltem, destillierten Wasser gewaschen und diese Waschung wiederholt, bis das Waschwasser sulfatfrei ist.
Zur Umkristallisation der gebildeten freien Säure wird die noch feuchte Substanz in ca. 4 1 destilliertem Wasser suspendiert und unter gutem Rühren mit ca. 400 ml frisch bereiteter 30$iger KOH auf pH 8,0 gebracht. Dabei geht der gesamte Niederschlag in Lösung. Dann wird über eine Mlterhilfe (Kristalltheorit) klarfiltriert und mit 10 η Schwefelsäure unter gutem Rühren auf pH 1,5 angesäuert. Der Niederschlag wird eine Stunde stehengelassen, abgesaugt und, wie oben beschrieben, säurefrei gewaschen. Anschließend wird im Vakuum bei 400C über CaCl2 getrocknet. Ausbeute: 500 bis 540 g.
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Zur Herstellung des Kaliumsalzes wird die so erhaltene Säure in 1,5 1 heißem Wasser suspendiert und mit ca. 400 ml frisch hergestellter 30%iger KOH auf pH 8 gebracht. Die Lösung wird auf 800C erhitzt und mit ca. 4 Isopropanol von Siedetemperatur unter Rühren versetzt, bis eine leichte Trübung auftritt. Dann wird die Mischung im Eisbad abgekühlt und bei minus 200C zur Kristallisation gebracht. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Methanol gewaschen und erneut im Vakuum bei erhöhter Temperatur über CaCl2 bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute: 500 bis 520 g Kaliumsalz (72-75$ der Theorie).
Beispiel 1
Die Reaktion verläuft gemäß nachfolgenden Gleichungen:
I. Harnsäure + O2 Urica3e) Allantoin + H2O2
II. H2O2 + CH3OH Katalase) HCH0 + 2 H Q
3OH a) HCH0 + 2 H III. HCHO + 2 SMBTH Farbstoff.
Reagenzien:
1. Enzymreagens:
Uricase > 0,12 TJ/ml
Katalase >900 ü/ml
0,05 M Boratpuffer pH 8,3
4$ (v/v) Methanol
0,04$ Hydroxypolyaethoxydodecan.
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2. Chromogenreagens:
0,1$>ige SMBIH-Losung in Wasser
3. Oxidationsreagens:
Kaliumcyanoferrat (IIl)-Lösung in 0,45 N Schwe
felsäure .
Die Bestimmung wird auf einem AutoAnalyzer*^ der Firma Technicon in folgender Weise durchgeführt. Mittels einer Schlauchpumpe wird 1 ml Enzymreagens/min in ein Fließsystem gepumpt. Dem Reagens werden mittels der gleichen Schlauchpumpe 0,1 ml/min an zu bestimmender Harnsäureprobe zugefügt. Das Gemisch, das mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung durch Luftblasen segmentiert wurde, strömt anschließend durch eine Glasspirale mit 20 Windungen. Hier laufen die Reaktionen I und II ab. Danach gelangt das Gemisch in einen Dialysator. Dieser kontinuierlich durchströmte Dialysator ist so beschaffen, daß ihn zwei Ströme, die nur durch eine semipermeable Membran getrennt sind, durchlaufen können. Moleküle mit einem Molekulargewicht unter ca. 600 dialysieren aus dem bereits beschriebenen Gemisch in eine Aufnähmelösung, die aus dem Chromogenreagens besteht, die wiederum mittels der gleichen Schlauchpumpe gefördert wird. Die Pumpgeschwindigkeit ist 1,0 ml/min. Auch dieser Fluß wird mit einer geeigneten Vorrichtung durch Luftblasen segmentiert.
Der in die Aufnahmelösung dialysierte Formaldehyd wird, nachdem das Oxidationsreagens mit einer Pumpgeschwindigkeit von 0,23 ml/min zugemischt worden ist, beim Durchfließen weiterer Glasspiralen zu dem bereits beschriebenen Farbstoff umgesetzt. Dessen Extinktion wird bei 620 oder
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670 run in einem geeigneten Photometer, das mit einer Durchflußküvette ausgestattet ist, (nach Entfernung der Luftblasen) gemessen. Nach Eichung mit einem Harnsäure-Standard "bekannter Konzentration lassen sich mit diesem Verfahren die Harnsäure-Konzentrationen in unbekannten Proben bestimmen. Verbindet man den Apparat mit einem Probengeber, so kann man 60 verschiedene Proben in der Stunde bestimmen.
Der Variationskoeffizient bei einer Vielfachbestimmung der gleichen Probe liegt bei 1$.
Es besteht eine lineare Beziehung zwischen der Extinktion und der Harnsäure-Konzentration bis zu 20 mg/1oo ml Probelösung, -womit der gesamte für die klinische Diagnostik interessante Bereich abgedeckt ist.
Führt man einen Methodenvergleich mit einer als störungsfrei anerkannten Harnsäure-Bestimmungsmethode im Serum (H. Kageyama, Glin. Chim. Acta j51 (1971) 421 und H. Mathies et. al., Med. Clin. 69 (1974) 607)durch, so erhält man eine Korrelationsgerade der Gleichung y = 0,98x + 0,3;mit einem Korrelationskoeffizienten 0,993.Die x-Werte repräsentieren die Vergleichsmethode, die y-Werte die der beschriebenen Methode. Das Ergebnis beweist eine sehr gute Übereinstimmung.
Beispiel 2
Die Bestimmung erfolgt, je nachdem, ob freies Cholesterin oder Cholesterinester bestimmt werden sollen, entsprechend den nachstehenden Gleichungen Ia uiid Ib in Verbindung mit den Gleichungen II und III von Beispiel I.
Ia Cholesterinester Cholesterin + Fettsäuren Ib Cholesterin + O2 4-Cholestenon +
"709828/0478 ^2 _ 10
~"~ 260052G
Reagenzien:
1. Enzymreagens: 0,07 U/ml
Cholesterinoxidase ) 0,07 U/ml
Cholesterinesterase > 900 U/ml
Katalase pH 7, ,0
0,4 M Phosphat-Puffer
A-% (v/v) Methanol 0»3$ Hydroxypolyaebhoxydodecan
2. Chromogenreagens:
0,1%ige SMBTH-Lösung in Wasser
3. Oxidationsreagens:
1$ige FeCl,-Lösung in 0,45 N Schwefelsäure.
Der apparative Aufbau gleicht dem in Beispiel 1 "beschriebenen weitgehend. Einziger Unterschied: nach Zusammenmischen der Probe und des Enzymreagens läuft die Lösung durch ein Heizbad von 37,50C Hier laufen die Reaktionen Ia, Ib, II ab. Die anschließenden Vorgänge sind denen bei der Harnsäure-Bestimmung von Beispiel 1 gleich. Bei der Durchführung der Analysen müssen die Proben 1:25 vorverdünnt werden, da andernfalls zu hohe Extinktionen erhalten würden.
Der Bereich linearer Abhängigkeit zwischen Extinktion und Cholesterin-Konzentration geht bis 600 mg Cholesterin in 100 ml Probe (Serum).
Der Variationskoeffizient bei Vielfachbestimmung der gleichen Probe liegt bei 1$.
Ein Methodenvergleich mit einer als richtig und störungsfrei angesehenen Referenzmethode (P. Roeschlau et. al.
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Z. Clin. Chem. Clin. Biochem. 12 (1974) 226) ergibt eine Korrelationsgerade der Gleichung y = 0,9öx + 5,4 mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,99. Die x-Werte repräsentieren die Vergleichsmethode und die y-Werte die beschriebene Methode. Die Korrelationsgerade beweist eine sehr gute Übereinstimmung zwischen beiden Methoden.
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Claims (10)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung HpOp bildenden Substanzen im Serum durch Überführung des gebildeten H2Op in Gegenwart von Methanol und Katalase in Formaldehyd, Umsetzung des letzteren mit einem Hydrazon in Gegenwart eines Oxidationsmittels und photome.trische Bestimmung des hierbei gebildeten Farbstoffes, dadurch gekennzeichnet , daß als Hydrazon 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon verwendet wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η τ-zeichnet, daß Harnstoff, Glucose bzw. Cholesterin bestimmt wird und als Oxidase Uricase bzw. GIucoseoxidase bzw. Cholesterinoxidase verwendet wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidationsmittel Kalium cyanoferrat (III), FeCl5 oder (IiH.), Oe(SO4). verwendet wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dä3die Oxidationsmittel als 0,2 bis 5$ige Lösung in verdünnter Säure eingesetzt werden.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Farbstoffbildung bei einem pH-Wert zwischen 0,5 und 3 durchgeführt wird.
  6. 6. Reagens zur quantitativen Bestimmung von mit Sauer-
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    ORIGINAL INSPECTED
    stoff unter Oxidaseeinwirkung HpO2 bildenden Substanzen im Serum, welches eine Oxidase, Katalase, Methanol* Puffer, ein Oxidationsmittel und Säure enthält, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 3-Methyl-2-(sulfonyl)-benzothiazolonhydrazon.
  7. 7. Reagens zur Bestimmung der Harnsäure, dadurch gekennzeichnet , daß es
    mehr als 0,1 U/ml Uricase, mehr als 800 U/ml Katalase, 0,02-0,1 M Puffer pH 7-9, 2-8 Vol.-$ Methanol, 0,01-0,1 $ eines nichtionischen oberflächenaktiven
    Mittels und getrennt davon 0,03-0,5$ SMBTH, 0,3-3$ Kaliumcyanoferrat III, in verdünnter Schwefelsäure enthält.
  8. 8. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß es
    mehr als 0,05 U/ml Cholesterinoxidase, mehr als 0,05 U/ml Cholesterinesterase, mehr als 800 U/ml Katalase, 0,2-1,0 M Puffer pH 6,0-8,5, 2-8 Vol.-$ Methanol, 0,1-0,8 $ nichtionisches oberflächenaktives Mittel
    und getrennt davon 0,03-0,5$ StIBTH, 0,5-3,0$ FeCl3
    in verdünnter Schwefelsäure enthält.
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    .3.
  9. 9. Reagens nach Anspruch 7, dadurch, gekennzeichnet , daß es als Puffer Boratpuffer pH 8,0 bis 8,6 enthält.
  10. 10. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß es als Puffer Phosphatpuffer pH 6,5 his 7,5 enthält.
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