DE2548962C2

DE2548962C2 - Antikörper gegen die Untereinheit M von Creatinkinase-Isoenzymen

Info

Publication number: DE2548962C2
Application number: DE2548962A
Authority: DE
Inventors: Norbert Dr. 6100 Darmstadt Hennrich; Hermann Dr. 6100 Darmstadt Lang; Hans-Dieter Dr. 6101 Bickenbach Orth; Uwe Dr. 6101 Weiterstadt Würzburg
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1975-11-03
Filing date: 1975-11-03
Publication date: 1985-11-21
Also published as: US4237044A; DE2548962A1

Description

Die Erfindung betrifft Creatinklnase-MB-spezlfische Antikörper und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Bestimmung der Aktivität der Creatinkinase (ATP: Creatin-Phosphotransferase, E.C. 2.7.3.2; Abkürzung: CK) im Serum gilt als empfindlichste Labormethode bei der Diagnostik von Erkrankungen der Skelett- und Herzmuskulatur, speziell beim Myokardinfarkt. Die Unterscheidung von Traumatisierungen der Skelett- und Herzmuskulatur, speziell bei der Differentialdiagnose des Myokardinfarkts, ist aber schwierig. Durch die Bestimmung der CK-Gesamtaktivltät kann eine Differenzierung nicht mit Sicherheit erfolgen. Es ist deshalb versucht worden, die differentialdiagnostische Aussagekraft der Bestimmung der CK-Aktlvität zu erhöhen, Indem man die Aktivität weiterer Enzyme im Serum mißt und die Meßergebnisse miteinander korreliert, z. B. durch Bildung des Quotienten CK/Glutamat-oxalacetat-transaminase. Quotienten dieser Art erlauben jedoch eine Verwendung bei der Differenzierung zwischen Herz- und Lungeninfarkt oder zwischen Herzinfarkt und Schock-Folgen aus anderer Ursache nicht.

CK kommt im Körper In Form von drei Isoenzymen vor, nämlich CK-MM, z. B. im Muskel, CK-BB, z. B. Im Gehirn und als Hybrid CK-MB (bestehend aus einer Untereinheit M und einer Untereinheit B), z. B. im Herzmuskel. Die Im Blut (Serum) auftretende CK-Aktivltät 1st normalerweise auf das Isoenzym CK-MM zurückzuführen, da CK-BB nicht durch die Liquor-Blut-Schranke hindurchtritt und CK-MB auf bestimmte Organe (z. B. den Herzmuskel) beschränkt 1st. Bei Schädigungen des Herzmuskels (z. B. beim Herzinfarkt) wird CK-MB jedoch In das Blut (Serum) freigesetzt und läßt sich dort nachweisen.
Die quantitative Bestimmung dieses Isoenzyms neben CK-MM im Serum gilt als ampfindllchste und dlfferen- ä

tialdiagnostlsch aussagekräftigste Labormethode zum Nachwels des Herzinfarkte. Neben dem Herzmuskel

enthalten zwar noch einige weitere Organe CK-MB (z. B. Pankreas, Zwerchfell, Aorta, Lunge und Uterus), \

jedoch ist die Aktivität In diesen Organen um den Faktor 100 geringer als im Herzmuskel, so daß eventuell aus

den genannten Organen freigesetzte CK-MB-Aktivltäten unterhalb der Nachweisgrenze liegen.
Die bisher üblichen Aktivitätsbestimmungen von CK-MB gingen in erster Linie auf elektrophoretisch^ und chromatographische Verfahren sowie auf immunologische Bestimmungen mit präzlpltierenden Antikörpern zurück [Z. KlIn. Chem. Kiln. Blochem. 13, 85 (1975)]. Allen diesen Verfahren war gemeinsam, daß sie für eine diagnostische Schnellbestimmung der CK-MB-Aktlvität nicht geeignet waren. In Immunochemlstry 6, 681 (1969) ist die Herstellung von Antikörpern beschrieben, die die Creatinklnaseaktlvltät Im Skelettmuskel und Im Herz inhibieren. Die Autoren kommen jedoch zu dem Ergebnis, daß mit diesen Antikörpern keine signifikanten Unterschiede in der Hemmung zwischen CK-MM und der Mischung aus CK-MM und CK-MB festzustellen sind, d. h. eine quantitative Bestimmung der Aktivität von CK-MB mit diesen Antikörpern ist nicht möglich.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Antikörper zu entwickeln, mit deren Hilfe man eine quantitative bestimmung der Aktivität von CK-MB und insbesondere eine Schnellbestimmung der Aktivität dieses Isoenzyms in Körperflüssigkeiten durchführen kann.

6s Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bisher nicht bekannte Antikörper gegen die Untereinheit M von CK-MM und CK-MB mit einer sehr spezifischen Wirkung zur Verfügung gestellt werden.

Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend Antikörper gegen die Untereinheit M von CK-Isoenzymen mit einem Molekulargewicht zwischen 130 000 und 210 000, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die

enzymatische Aktivität der Untereinheit M auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren.

Gegenstand der Erfindung 1st ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper, das darin besteht, daß man Tiere mit aktivierter CK-MM impft und die Antiseren sowie die Antikörper in an sich bekannter Weise gewinnt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung dieser Antikörper zur Bestimmung der Aktivität von CK-MB neben CK-MM.

Ein solcher Test kann durchgeführt werden, Indem man eine Probe einer Körperflüssigkeit, gegebenenfalls In Gegenwart von CK-Substraten, mit den erfindungsgemäßen Antikörpern inkubiert und die Aktivität der CK-Untereinhelt B in bekannter Weise photometrisch bestimmt.

Unter einer Körperflüssigkeit wird in diesem Zusammenhang In erster Linie Humanserum verstanden, ferner jedoch auch Vollblut, Plasma, Harn, Sputum und Schweiß. CK-BB stört die mit den erfindungsgemäßen Antikörpern durchgeführte Testmethode; dieses isoenzym darf deshalb in den zu bestimmenden Körperflüssigkeiten nicht vorhanden sein.

Die Antikörper nach der Erfindung werden durch Impfung von Tieren mit CK-MM-Antigenen gewonnen. Als Antigen wird dafür vorzugsweise menschliche CK-MM herangezogen. Es ist aber auch möglich, CK-MM aus Tieren zu verwenden, wenn die damit he/gestellten Antiseren die enzymatisehe Aktivität der Untereinheit M in menschlicher CK-MM und CK-MB, gegebenenfalls auch in Gegenwart von CK-Substraten, vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Tierische Spender von CK-MM-Antlgenen sind In erster Linie die verschiedenen Affenarten, vorzugsweise Rhesusaffen und Schimpansen, ferner Haustiere wie Schwein, Pferd, Rind, Kaninchen, Meerschweinchen und andere Tiere wie Ratten, Mäuse und Vögel wie Gänse, Enten, Hühner.

Das zur Herstellung der Antikörper verwendete CK-MM-Antigen soll frei sein von den Aktivitäten von CK-MB und CK-BB. Ein empfindliches Kriterium für diese Reinheitsforderung ist die immunologische Analyse, die yorteilhafterweise mittels Diffusions- oder Elektrophoresetechnik durchgeführt wird. Daneben sind z. B. die Methoden der analytischen Dlsk-Elektrophorese und der Polyacrylamld-Gel-Elektrofokussierung nützlich. Bei Anwendung dieser Methoden hat der Nachweis der Reinheit gegenüber CK-MB und CK-BB Vorrang. Dagegen ist die absolute Reinheit gegenüber anderen Proteinen, die z. B. durch die beiden zuletzt genannten Methoden ermittelt werden kann, weniger wichtig. Die Mikroheterogenität vcn CK-Isoenzymtypen, die sich z. B. In geringen Unterschieden der Aminosäurezusammensetzung der einzelnen CK-Unterelnheiten äußern kann, spielt als ' Reinheitskriterium in der Regel keine Rolle.

Zur Gewinnung der Antikörper werden solche Tiere herangezogen, die nach Impfung mit aktivierter CK-MM Antikörper bilden, welche die enzymatische Aktivität der Untereinheit M In den Creatlnkinasen MM und MB vollständig zu hemmen vermögsn, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu Inaktivieren. Vorzugsweise eignen sich hierfür Ziegen. Es kommen jedoch auch andere Tiere, Insbesondere Wirbeltiere, als Antikörperspender in Frage, z. B. Affenarten, Pferd, Rind und rinderähnliche Tiere, Schaf, Hund, Schwein, Kaninchen, Vögel wie Hühner, Truthühner, Gänse und Enten, ferner Ratten, Mäuse und Meerschweinchen. Ziegen werden insbesondere zur Induktion solcher Antikörper bevorzugt, welche auch In Gegenwart von CK-Substraten vollständige Hemmungen der M-Untereinheit in CK-MB auszuüben vermögen.

Die Impfung der Tiere erfolgt nach geläufigen Methoden, jedoch wird nach der Erfindung mit aktivierter menschlicher oder tierischer CK-MM immunisiert. Die Aktivierung der eingesetzten CK-MM kann durch bekannte SH-Gruppen-stabllisierende und -aktivierende Reagenzien und/oder durch zweiwertige Metallionen, vorzugsweise durch eine Kombination der genannten Reagenzien und der Metallionen, erfolgen. Als SH-Gruppen-stabilisiercnde und -aktivierende Reagenzien werden vorzugsweise z. B. N-Acetylcystein, Mercaptoäthanol und Dithioerytrit verwendet, ferner Glutathlon, Cystein, Dlthiothreit, S-(2-Amino-äthyl)-isothiouron!umbromidhydrobromid (AET) und/oder Thioglykolsäure. Die zweiwertigen Metallionen entstammen entsprechenden wasserlöslichen Salzen (z. B. den Chloriden oder Acetaten), vorzugsweise des Magnesiums, ferner des Mangans, Calciums und/oder Kobalts. Derartige Aktivierungen sind grundsätzlich auf anderen Gebieten bekannt und dem Fachmann geläufig.

So kann man zur Aktivierung des Antigens als aktivierende Substanzen die SH-Gruppen-stabllisierenden und -aktivierenden Reagenzien und/oder zweiwertige Metallionen auf CK-MM einwirken lassen. Man benutzt hierfür vorzugsweise bekannte, dialytische Methoden. So ist es möglich, die verwendeten Antigene gegen eine gepufferte Lösung, welche die aktivierenden Substanzen enthält, während 1 bis 200 Stunden, vorzugsweise während etwa 12 Stunden, bei Temperaturen zwischen 1 und 30°C, vorzugsweise bei etwa 4° C, zu dialysieren. Zweckmäßig wird die Dialyselösung auf Basis einer physiologischen Kochsalzlösung zubereitet. Im Prinzip können alle Puffer herangezogen werden, mit denen ein pH von 6,5 bis 7,5, vorzugsweise von 6,8 bis 7,0 eingestellt werden kann. Neben Natriumphosphatpuffern eignen sich hierfür vorzugsweise Triäthanolamln (TRAM)-, Trls-(hydroxyäthyl)-amln (TRIS)- und Imidazolpuffer pH 6,8. Die das Antigen enthaltende Lösung soll etwa 10 bis 50OmH der SH-Gruppen-stabilisierenden und -aktivierenden Substanz und/oder etwa 50 bis 50OmH der zweiwertigen Metallionen pro mg CK-MM enthalten.

Die weitere Durchführung der Immunisierung und die Aufarbeitung zum Erhalt der Antiseren bzw. Antikörper erfolgt in bekannter Weise. Auch die Verarbeitung und Aufbewahrung der Antiseren bzw. Antikörper erfolgt nach In der Immunologie bekannten Methoden.

Die Antikörper nach der Erfindung sind vorzugsweise der IgG-Immunglobullnklasse (bivalente Antikörper) zuzurechnen. Ihr Molekulargewicht liegt zwischen etwa 130 000 und 210 000, vorzugsweise bei etwa 160 000; Ihre angenäherte Sedimentatlonskonstante liegt zwischen 6 S und 8 S, vorzugsweise bei etwa 7 S; Ihr Kohlenhydratanteil beträgt etwa 3% Ihres Gesamtgewichtes.

Die Antikörper der Erfindung sollen die Enzymaktivität der M-Untereinheit der Creatinklnase vollständig

hemmen. Unter »vollständiger Hemmung« wird hier eine Hemmung verstanden, bei der höchstens 5 U/l, vorzugsweise weniger als 3 U/l der Enzymaktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB in einer Probe erhalten bleiben.

Die Antikörper sollen ferner die tinzymatische Aktivität der B-Untereinheit der CK-MB nicht beeinflussen. Darunter soll hier verstanden sein, daß höchtens 10 U/l, vorzugsweise weniger als 5 U/l, Enzymaktivität der Untereinheit B der CK-MB in eir.er Probe gehemmt werden.

Zur Durchführung einer bevorzugten Verwendungsform des mit den erfindungsgemäßen Antikörpern durchgeführten Verfahrens, die darin besteht, daß die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von CK-Substraten mkubiert werden, sollen die Antikörper ferner die Eigenschaft haben, ihre hemconde Wirkung gegenüber der enzymatischen Akvitität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig entfalten zu können, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu beeinflussen. Diese Eigenschaft ist z. B. bei Antikörpern, die aus Ziegen durch Immunisierung mit vollaktivierter CK-MM gewonnen wurden, zusätzlich zu den oben gekennzeichneten Eigenschaften vorhanden. Sie ist für die normale Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens (zuerst Inkubation mit den Antikörpern, dann Zusatz der CK-Substrate und photometrische Messung) nicht unbedingt erforderlich.

Als CK-Substrate können alle üblicherweise verwendeten Substrate bzw. Effektoren eingesetzt werden. Im vorliegenden Zusammenhang sind in erster Linie Creatin, Creatinphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat und Magnesiumionen von Bedeutung.

Die Bestimmung der Restaktivität der CK und ihrer Isoenzyme kann /m Prinzip nach aiien Verfahren erfolgen, die schnell und präzis arbeiten. Geeignet sind z. B. bekannte Verfahren, die es erlauben, die CK-Aktivität nach Zusatz von CK-Substraten mittels einer an Hilfsreaktionen anschließenden photometrischen Bestimmung zu messen. Hierfür lassen sich kinetische Methoden, bei denen die Enzymaktivität durch Messung im UV bei 334, 340 oder 366 nm ermittelt werden, heranziehen. Bevorzugt ist z. B. eine Standardmethode, nach der CK unter Verwendung von Creatinphosphat und Adenosindiphosphat bestimmt wird [Z. Klin. Chem. Klin Biochem., Band 8, Seite 658 ff (1970) und Band 10, Seite 182 (1972)]. Testpackungen zur Bestimmung der CK-Aktivliät nach dieser Methode sind im Handel.

Nach einem anderen bekannten Bestimmungsverfahren kann CK auch fluorometrisch bestimmt werden. Durch CK läßt sich aus Creatinphosphat Creatin freisetzen, welches nach dem von R.B. Conn [Clin. Chem., Band 6, Seite 537 f (I960)] ausgearbeiteten Verfahren durch Reaktion mit Ninhydrin in stark alkalischer Lösung fluorometrisch gemessen werden kann [vgl. Sax ei al, ClIn. Chem., Band 11, Seite 951 f (1965)]. Eine typische Verwendungsmöglichkeit der Antikörper nach der Erfindung wird Im folgenden erläutert: Die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit, vorzugsweise eine Probe von Humanserum, wird mit einer Menge von CK-MM-Antikörpern versetzt, welche ausreicht, bis zu 2500 U/l der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB, vorzugsweise etwa 1000 U/l, vollständig zu hemmen. Man mischt und inkubiert während etwa 1 bis 30, vorzugsweise etwa 5 Minuten, bei Temperaturen zwischen +10 und +40⁰C, vorzugsweise etwa bei Raumtemperatur, speziell bei 25 oder 30⁰C. Danach wird die restliche Enzymaktivität des Reaktionsgemisches mit Hilfe eines bekannten Verfahrens, vorzugsweise mit der oben beschriebenen UV-Methode, ermittelt.

Dieses Verfahren kann dahingehend abgewandelt werden, daß die Probe der zu analysierenden Körperflüssig-

keit mit den Antikörpern und den CK-Substraten in Gegenwart eines Puffers und den für die Nachweisreaktion

erforderlichen Substanzen zusammen inkubiert wird (ohne VorInkubation der Probe mit den Antikörpern). Für

diese Ausführungsform ist eine weitere Eigenschaft der Antikörper der Erfindung Voraussetzung: Sie müssen

die enzymatische Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB auch in Gegenwart von CK-Substraten

vollständig hemmen. Diese Eigenschaft besitzen z. B. die Antikörper, die nach dem erfindungsgemäßen Verfah-

ren aus Ziegen gewonnen werden. Sie ermöglichen es, die Bestimmung der CK-MB-Aktlvität in einfacher und

schneller Art durchzuführen.

So kann man z. B. die Antikörper, die zuvor mit dem bekannten, für die Nachweisreaktion verwendeten Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch (z. B. einem Gemisch, welches als Coenzyme Adenosindiphosphat und Nlcotinamid-adenindlnucleotld-phosphat, als Enzyme Hexokinase und Glucose-o-phosphat-dehydrogenase und als Substrate Creatinphosphat und Glucose enthält) in eine lyophllisierte Form gebracht wurden, in einer bestimmten Menge einer Pufferlösung auflösen, die zu bestimmende Körperflüssigkeit (z. B. Serum) hinzugeben und die Aktivitäts-Bestimmung des B-Anteils von CK-MB durchführen. In einer Variante dieses Verfahrens kann man die Antikörper auch mit einem Gemisch, bestehend lediglich aus Coenzymen und Enzymen, In das Lyophillsat einarbeiten und die Substrate Jer Pufferlösung hinzufügen.

Nach einer weiteren Abwandlung können die erfindungsgemäßen Antikörper für eine Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivität und der CK-MB-Aktivität in einem einzigen Ansatz herangezogen werden. Man kann z. B. so vorgehen, daß man zunächst die CK-Gesamtaktivität der Probe nach einem bekannten photometrischen Verfahren bestimmt; anschließend gib', man zu demselben Ansatz ein in Wasser gelöstes Lyophüisat, bestehend aus den erfindungsgemäßen Antikörpern. Dann inkubiert man etwa 1 bis 10, vorzugsweise 5 Minuten, und M bestimmt die Restaktivität der Probe photometrisch. Die hierfür verwendeten Antikörper gegen CK-MM sollen die Eigenschaft haben, die enzymattsche Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig zu hemmen.

Man kann also die Antikörperkapazität der Antiseren be< dieser Verwendungsform so einstellen da» sie bis zu 2500 U/l, vorzugsweise etwa 1000 U/l, der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB vollständig zu hemmen <'^s vermögen.

Die durch die Antlköroer der Erfindung ermöglichte CK-MB-Bestimmungsmethode hat gegenüber dem Stand der Technik beträchtliche Vorteile. Dazu zählen die hohe Präzision der Ergebnisse und die Schnelligkeit sowie die Einfachheit der Durchführung.

•Die Präzision der Bestimmung ist darauf zurückzuführen, daß die Antikörper der Erfindung spezifisch auf die M-Untereinheit von CK-MM und CK-MB ansprechen und es deshalb erlauben, die CK-MB-Aktivltät in Körperflüsslgkeiten, wie dem Humanserum, in einer Direktbestimmung zu ermitteln.

Demgegenüber müssen bei dem in den deutschen Patentanmeldungen P 21 28 670 und P 22 58 822 beschriebenen Immunologischen Verfahren von Isoenzymen mindestens zwei verschiedene Testansätze durchgeführt werden, nämlich die Bestimmung der CK-Gesamtakiivität und die Bestimmung der CK-Restaktivität nach Präzlpltatlon. Die CK-MB-Aktlvltät kann also erst durch eine Differenzmessung ermittelt werden. Nach den Regeln der Fehlerrechnung ist das Ergebnis dementsprechend mit der Unsicherheit beider Messungen belastet. Die mit den Antikörpern der Erfindung durchgeführte Methode erlaubt es dagegen, die Fehleraddition zu vermeiden. ₎₀

Ein Nachteil des Präzipitationsverfahrens Ist auch, daß die Immun-Präzlpltation als Sekundärreaktion verhältnismäßig viel Zeit (ca. 60 Minuten bis mehrere Stunden) beansprucht, so daß sich das Verfahren nicht als Schnelltest eignet.

In Clin. ChIm. Acta, Band 58, Seiten 223-232 (1975) wurden auch bereits hemmende Antikörper gegen CK-Isoenzyme beschrieben. Diese^ Antikörper bewirken neben einer 100%igen Hemmung von CK-MM gleichzeitig eine 8O9i,ige Hemmung von uK-Mö. Über die M-Untereinheit von CK-MB hinaus wird also ein wesentlicher Anteil der B-Untereinhelt von den verwendeten Antikörpern gehemmt. (Die Aktivitäten der Untereinheit M und B In CK-MB verhalten sich zur Gesamtaktivität dieses Isoenzyms jeweils wie etwa 50: 100.) Selbst wenn die mit diesen Antikörpern gefundene Restaktivität von etwa 20% reproduzierbar wäre, so würden die erhaltenen Werte doch für eine präzise Messung von CK-MB zu niedrig liegen, um noch sicher erfaßbar zu sein, da die CK-Gesamtaktivltät im Serum an sich schon niedrig ist. Die in dieser Literaturstelle beschriebenen hemmenden Antikörper wurden entsprechend auch nicht für eine Bestimmung der CK-Isoenzyme nach dem Hemmprinzip angewendet. Nach dem mit den erfindungsgemäßen Antikörpern durchgeführten Verfahren bleiben dagegen noch etwa 50% der CK-MB-Aktivität, d. h. etwa die gesamte Aktivität der Untereinheit B, für die Messung zugänglich. Das bedeutet einen erheblichen Fortschritt.

Die schnelle Durchführbarkeit ist ein besonderer Vorteil der mit den erfindungsgemäßen Antikörpern durchführbaren Methode. Das gilt besonders für die Abwandlung der Methode, nach der die Hemmung des M-Anteils von CK-MM und CK-MB sowie die Bestimmung der Restaktivität gleichzeitig durchgeführt werden. Nach dieser Abwandlung kann in kürzester Zeit, z. B. innerhalb von 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise zwischen 5 und 15 Minuten, ein exaktes Testergebnis für die Diagnosestellung zur Verfügung stehen.

Ein beachtenswerter Vorteil der mit den Antikörpern der Erfindung durchführbaren Methode ist ihre Einfachheit. Die Testmethode kann in größeren Instituten bzw. Kliniken (z. B. mit Hilfe von üblichen mechanischen Geräten zur Bestimmung von Enzymaktivitäten) durchgeführt werden, ist aber auch in kleineren Instituten bzw. im Arztlabor mit Hilfe eines Photometers durchführbar.

Für die Einzelbestimmungen eignen sich Testpackungen, die alle zur Durchführung der CK-Bestimmungsmethode notwendigen Reagenzien enthalten, so z. B. ein übliches Gemisch aus Coenzym, Enzym und Substrat, erfindungsgemäßen CK-MM-Antikörpern und eine Puffer-Lösung. Eine Testpackung dieser oder ähnlicher Art ermöglicht die Bestimmung von CK-MB mit geringstmöglichem Aufwand.

Es war nicht zu erwarten, daß spezifische Antiseren hergestellt werden können, welche zwar die enzymatische Aktivitäi der Untereinheit M in CK-MM und -MB vollständig hemmen, aber die enzymatische Aktivität der Untereinheit B von CK-MB nicht beeinflussen. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Antikörper mit diesen bisher nicht bekannten Eigenschaften ermöglicht es aber erst, die beschriebene einfache Methode zur Bestimmung der CK-MB durchzuführen.

Überraschend ist auch, daß die erfindungsgemäßen Antikörper auch in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkraft beibehalten. Das ist nicht selbstverständlich. So wurden in der Literatur [Ann. N.Y. Acad. Sei., Band 103, Seilen 858-889 (1963)] Antikörper beschrieben, die in Gegenwart von CK-Substraten CK-MM nicht mehr zu 100*. inaktivierten. Antikörper mit derartigen Eigenschaften wären für die abgewandelte Ausführungsform der mit den erfindungsgemäßen Antikörpern durchführbaren Bestimmungsmethode, nach der Antikörperhemmung und Zusatz von CK-Substraten gleichzeitig erfolgen, völlig unbrauchbar. Die nicht gehemmten Anteile der M-Aktivitäten würden den Meßwert von CK-MB fälschlicherweise erhöhen (der Anteil von CK-MB an der CK-Gesamtaktivität beträgt nur in Ausnahmefällen mehr als 2096), eventuell gar nicht vorhandene C'K-MB-Aktivitäten vortäuschen und auf diese Weise falsche Labordaten für die Diagnose liefern.

Die überraschende Eigenschaft der erfindungsgemäßen Antikörper, die enzymatische Aktivität der Untereinheit M von CK-MM und -MB vollständig zu hemmen, ohne die enzymatische Akvitität der Untereinheit B von CK-MB zu beeinflussen und zugleich in Gegenwart von Substraten ihre volle Hemmkraft gegenüber der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB zu entfalten, ermöglichen eine bisher mit immunologischen Methoden unerreichbare Schnelligkeit und Präzision der CK-MB-Aktivitätsbestimmung. Dadurch eröffnet sich für die Praxis ein Weg, die CK-MB-Aktivität mit einem Schnelltest zu bestimmen.

Es wird möglich, den Laborbefund einer Erhöhung der CK-Aktivität beim Patienten dahingehend zu differenzieren, ob eine Erkrankung bzw. Traumatisierung von Skelett- oder Heizmuskulatur vorliegt. Dadurch erhält man wichtige zusätzliche Daten für die Differentialdiagnose des Herzinfarkts (z. B. vom Lungeninfarkt und/oder von Schockfolgen) und anderer Erkrankungen bzw. Schädigungen des Herzens.

Darüber hinaus erhält man durch die spezifische und exakte Bestimmung der Aktivität von CK-MB Aussagen über die Beteiligung bzw. Schädigung des Herzmuskels bei anderen Krankheitsprozessen (z. B. bei Vergiftungen), bei therapeutischen Eingriffen (z. B. bei der Wiederbelebung) oder bei diagnostischen Eingriffen (z. B. bei Herzkatheterisierungen oder Coronar-Angiographien).

In den folgenden Beispielen bedeuten »M« (bzw. »mM«) die Konzentrationen in Mol (bzw. Millimol) pro Liter.

Beispiel 1

Die nach Beispiel Aa) erhaltene CK-MM aus Humanmuskel wird gegen eine mit 0,07 M Trläthanolamin gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 7,0, die 1OmM Mercaptoäthanol und 1OmM MgCl₂ enthalt, dlalysiert. Die Enzymlösung wird durch Ultrazentrifugatlon von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf 2 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit il ml komplettem Freund'schen Adjuvans (Wasser-Mineralölsuspension, die zusätzlich noch 2 mg abgetötete M-Tuberculosebazlllen enthält) emulgiert. Diese Emulsion wird einer Ziege Intramuskulär injiziert. Nach 3 Injektionen gleicher Art im Abstand von 3 Wochen und 3 weiteren Boosterinjektionen jeweils im Abstand von 16 Wochen wird dem Tier 21 Tage

ίο nach der letzten Injektion Blut entnommen. Das nach bekannten Methoden gewonnene Serum wird mit einer Mischung, enthaltend 396 Schaf-Serumalbumin und 0,1% Natriumazld, mit einem 0,1 M Boratpuffer auf pH 8,4 eingestellt und sterilfiltriert. Die erhaltene Lösung, enthaltend Antl-Humanmuskel-CK-MM, wird in 0,5 ml-Portionen in braune Glasflaschen abgefüllt und gefriergetrocknet. Die Antikörper besitzen ein Molekulargewicht von etwa 160 000 bis 180 000.

Beispiel 2

CK-MM aus Humanmuskel wird gegen eine mit 0,1 M Imidazol gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 6,8, die 7,5 mM N-Acetyl-cystein und 25 mM Magnesiumacetat enthält, dlalyslert. Anschließend wird die Enzymlösung durch Ultrazentrifugation von Aggregaten befreit und der Proteingehalt wird mit dem genannten Dialysepuffer auf 0,2 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freund'schen Adjuvans emulgiert. Diese Emulsion wird einem Hammel intradermal injiziert. Nach 3 und 6 Wochen folgen 2 Intramuskuläre Injektionen und 3 weitere Boosterinjektionen, jeweils Im Abstand von 14 Wochen. 19 Tage nach der letzten Injektion wird Blut entnommen. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 1. Man erhält Anti-Humanmuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Molekulargewicht der Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.

Beispiel 3

Die nach Beispiel B erhaltene CK-MM aus Rhesusaffenmuskel wird gegen eine mit 0,15 M Imidazol gepufferte, physiologische NaCl-Lösung pH 6,8, die 25 mM Dithioerythrit und 15 mM Manganchlorid enthält, dialysiert. Nach Entfernung der Aggregate durch Ultrazentrifugation wird der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf 5 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem Freund'schen Ajuvans emulgiert. Injektionen, Blutentnahme und Aufarbeitung erfolgen analog Beispiel 1. Man erhält Anti-Rhesusaffenmuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Sedimentationskonstante der Antikörper etwa 7 S.

Beispiel 4

CK-MM aus Schweinemuskel wird analog Beispiel 2 aktiviert, und die Antigen-Emulsion wird mit komplettem Freund'schen Adjuvans Kaninchen injiziert. Nach 3 Wochen erfolgt eine weitere subcutane Antlgen-Injektion. Die Injektion wird nach weiteren 3 Wochen wiederholt, 19 Tage danach wird Blut entnommen. Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispie! 1. Man erhält Anti-Schweinemuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form. Molekulargewicht der Antikörper etwa 160 000 bis 180 000.

In völlig analoger Weise wird aus Rindermuskel Anti-Rlndermuskel-CK-MM gewonnen (Molekulargewicht etwa 160000 bis 180 000).

Verwendungsbeispiel I

Test I zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von CK-MB in Körperflüssigkelten
a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 10 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer für 10 Bestimmungen, 10 Flaschen Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch und 1 Flasche Anti-CK-MM, erhalten nach Beispiel 1.

Die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch enthält:

Creatlnphosphat-Dinatriumsalz, Hexahydrat 27,24 mg

Glutathlon reduziert ' 6,4 mg

(oder N-Acetyl-cystein · 3,4 mg)

Adenosindlphosphat-Dinatriumsalz, Hexahydrat 1,25 mg

Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat/Dinatriumsalz 1,17 mg

Adenosin-monophosphat, Dlnatriumsalz 8,47 mg

Hexokinase 5 υ

Glucose-ö-phosphat-dehydrogenase 3 U

Glucose 8,32 mg

Magnesiumacetat 4,52 mg

Die Flasche Puffer-Lösung enthält

Triäthanolamln-acetat (in Wasser) 105 mM

l5 48 962

Die lyophilisierten Antikörper werden mit 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die entstehende Antikörperlösung 1st so eingestellt, daß bis ?.u lOOÖU/1 'CK-MM total gehemmt werden. Bei Seren mit extrem hohen Gesamt-CK-Aktlvltäten muß das Serum deshalb auf ca. 1000 U/l vorverdünnt werden. Die Antikörperlösung ist bei + 4° C mindestens 7 Tage haltbar.

b) Ausführung der Aktivitätsbestimmung der CK-MB

bl) Ausführung
In ein Reäktionsgefäß plpettigreh:

-Q₁I ml Serum io

+ 0,1 ml Antlkörpeflösürig

Gut mischen, 5 Minuten bei 25° Inkubieren. Danach werden 0,1 ml dieses Reäktionsgemisches sowie 2,0 ml Puffer-Lösung in eine Flasche mit dem Gemisch von Coenzym, Enzym und Substrat gegeben. Mischen, 5 Minuten bei 25° Inkubieren, danach in eine Küvette gießen, die Extln-;<.lon bei 25° C messen und anschließend die Extinktionsänderung pro Minute bestimmen. Wellenlänge: 334, 340 oder 366 nm; Schicht- 15 dicke: 1 cm.

b2) Berechnung

Die ermittelte CK-Aktlvität der Probe muß

a) mit dem Verdünnungsfaktor 2 und 20

b) mit dem CK-MB-Hybrldfaktor 2 (im Test werden nur die B-Untereinheiten von CK-MB gemessen) multipliziert werden.

Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute (ΔΕ/Minute) wird der Mittelwert gebildet und in die entsprechende Bereehnungsformel eingesetzt:

Messung bei 334 nm: Volumenaktivität-CK-MB = AE/Minutex4x3500U/l Messung bei 340 nm: Volumenaktivität-CK-MB = ΔΕ/Mlnute χ 4χ 3376 U/l

.fei Messung bei 366 nm: Volumenaktlvität-CK-MB = ΔΕ/Minute χ 4 χ 6364 U/l

Verwendungsbeispiel II 30

Test II zur quantitativen Bestimmung der Creatinklnase-MB-Aktivität in Körperflüssigkeiten

a) Zusammensetzung der Testpackung

Die Testpackung ist ausreichend für 30 Aktivitätsbestimmungen. Die Packung enthält 1 Flasche Puffer-Lösung für 30 Bestimmungen und 30 Flaschen eines lyophilisierten Gemisches bestehend aus Coenzym, Enzym, Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel 1.

Die in der Flasche Puffer-Lösung enthaltene Menge Triäthanolamin-acetat entspricht der im Verwendungsbeispiel Ia) angegebenen Menge. Die einzelnen Flaschen mit dem Gemisch bestehend aus Coenzym, Enzym, 40 Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel 1 entsprechen bezüglich der drei zuerstgenannten Komponenten ebenfalls der im Verwendungsbeipiel Ia) angegebenen Zusammensetzung und enthalten zusätzlich Ariil-CK-MM, das bis zu 1000 U/l CK-MM total hemmt.

b) Bestimmung der Aktivität von CK-MB 45

bl) Ausführung

Zum Inhalt einer Flasche Coenzym/Enzym/Substrat/Anti-CK-MM-Gemisch werden 2,0 ml Puffer-Lösung und 0,1 ml Serum pipettiert. Mischen, 5 Minuten bei 25° C inkubieren, dann in eine Küvette gießen und über ₅₀ 5 Minuten die Extinktionen bei 25° C messen. Wellenlänge: 334, 340 oder 366 nm; Schichtdicke: 1 cm.

b-2) Berechnung

Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute (ΔΕ/Minute) wird der Mittelwert gebildet und in die ent- 55 sprechende Berechnungsformel eingesetzt:

Messung bei 334 nni: Volumenaktivität CK-MB = ΔΕ/Minute χ 7 000 U/l Messung bei 340 nm: Volumenaktivität CK-MB = ΔΕ/Minute χ 6 752 U/l Messung bei 366 nni: Volumenaktivität CK-MB = ΔΕ/Minute χ 12 728 U/l 60

Verwendungsbeispiel III
Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivität und der CK-MB-Aktivität

a) Zusammensetzung der Testpackung Die Zusammensetzung der Testpackung entspricht derjenigen von Verwendungsbeispiel Ia).

b) Bestimmung der CK-Gesamtaktivität und der CK-MB-Aktivität
bl) Ausführung

In die Flasche Coenzym-Enzym-Substrat-Gemisch werden 2,0 ml Puffer-Lösung und 0,1 ml Serum bzw. Serumverdünnung plpettlert. Mischen, 5 Minuten bei 25° C Inkubieren, danach in eine Küvette gießen und über 2 Minuten die Extinktionsänderung (ΔΕ1) bei 25° C bestimmen. Anschließend wird 0,1 ml Antikörperlösung zugefügt, sofort gemischt und nach 3 Minuten erneut die Extinktionsänderung (ΔΕ2) bei 25° C bestimmt. Wellenlänge: 334, 340 oder 366nm; Schichtdicke: 1 cm.

b2) Berechnung
Die CK-Gesamtaktlvltät errechnet sich wie folgt:

Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt = ΔΕΙ/Minute χ 3500 U/l

Messung beä 340 p.m.: Volumenaktivität CK-Gesamt = ΔΕΙ/Minute χ 3376 U/l
Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CK-Gesamt = ΔΕΙ/Minute χ 6364 U/i

Die CK-MB-Aktivität ergibt sich nach folgenden Berechnungsformeln:

Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-MB = AE2/Minute χ 7 350 U/l
Messung bei 340 nm: Volumenaktivität CK-MB = AE2/Minutex 7 090 U/I
Messung bei 366 nm: Volumenaktivität CK-MB = AE2/Minute χ 13 364 U/I

Verwendungsbeispiel IV

Hemmung der Aktivität von CK-MM, CK-MB und CK-BB durch Anti-Human-CK-MM.
Zu einem bezüglich seiner CK-Eigenaktivltät inaktivierten Humanserum werden reine CK-MM, CK-MB oder CK-BB gegeben, und die CK-Aktivltäten der einzelnen Proben werden bestimmt. Anschließend wird 0,1 ml Probe mit 0,1ml Anti-CK-MM-Lösung (hergestellt z.B. nach Beispiel 1) versetzt. Es wird gemischt und 5 Minuten bei 25° C inkubiert. Danach erfolgt eine Bestimmung der CK-Restaktivität auf bekannte Art. Die Ergebnisse zeigt folgende Tabelle:

Restaktivitäten von CK-Isoenzymen nach Inkubation mit inhibierendem Anti-Human-CK-MM (Mittelwerte ± 1 s aus jeweils 5 fach-Bestimmungen) (s = Standardabweichung)
35

Isoenzym Zugesetzte Aktivität Restaktivität nach

(U/l) Inkubation mit Antl-CK-MM
(U/l)

⁴⁰ CK-MM 98 ± 1,9

1043 ± 22

CK-MB 103 ± 2,0

410 ± 7,8

« CK-BB 197 ± 3,8

Innerhalb der Meßgenauigkeit werden die Aktivitäten von CK-MM zu 100%, von CK-BB zu 0% und von CK-MB (entsprechend dem Anteil von 50% M-Untereinheiten) zu 50% gehemmt. Die Ergebnisse sind über einen weiten Aktivitätsbereich der zugesetzten Isoenzym-Aktivitäten konstant.

Verwendungsbeispiei V

Bestimmung von CK-MB-Aktivitäten bei Patienten mit und ohne Herzinfarkt mit Testpackung nach Beispiel Ia)

CK-Aktivitäten verschiedener Patientenkollektive

Fallzahl Mittelwerte

Gesamt-CK CK-MB
⁶P (U/l) (U/l)

Patienten mit erhöhten CK-Aktlvitäten 48 480 < 1,7

ohne Herzinfarkte
Patienten mit Herzinfarkten 5 510 44

Die Tabelle zeigt, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper schnell und eindeutig ein Hinweis auf einen Herzinfarkt erhalten werden kann.

0,3 0,5	+1 +1	2,1 2,5
53 206.5	+1 +1	1,7 6,2
199		4,1

Herstellung der Ausgangsmaterialien

Beispiel A
Herstellung von CK-MM

a} 1,2 kg tiefgefrorener, menschlicher Skelettmuskel werden bei Raumtemperatur aufgetaut und maschinell zerkleinert. Das Gewebe wird in 2,51 kalten 0,05 M Tris/HCI-Puffer pH 8,0 [Tris-(hydroxymethyl}-amlnomethan-HCl-Püffer], der 0,01 M KCl, 1 mM EDTA (Äthylendiamintetraesslgsäure) und 1 mM Dithicery-QiHt enthält, suspendiert und mit einem Mixer homogenisiert. Das Homogenat wird unter Eiskühlung 45 Minuten gerührt und anschließend 60 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. Der klare Überstand (2,6801) wird einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung bei pH 8,0 in den Grenzen 40-75% Sättigung unterworfen. Der 0,75 s-Nlederschlag wird in 0,04 M Trts/HCl-Puffer pH 8,0 aufgenommen und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Zur Adsorption von Myoglobin und sauren Ballastproteinen werfen 500 g feuchter basischer Ionenaustauscher auf .Basis eines vernetzten Dextrans, äquilibriert gegen den gleichen Puffer, zugesetzt. Nach 30 Minuten wirf der Austauscher abgesaugt und zweimal mit je 400 ml 0,05 M Tris/HCI-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, ausgewaschen. Filtrai und Waschwasser werfen vereinigt und mit Ammoniumsulfat auf 0,75 s gebracht. Der Niederschlag wird abzentrifugjert, in 100 m! 0,04 M Tris/HCI-Puffer mit pH 8,0 gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert, bis kein Ammonlumsuifat mehr nachweisbar ist. Das klare Dialysat wird auf einer Säule mit elhem basischen Ionenaustauscher auf Basis eines vernetzten Dextrans (6 χ 60 cm) mit dem gleichen Puffer äquilibriert. Die Säule wird mit Startpuffer solange gewaschen, bis das Eluat proteinfrei ist. Danach wird das Enzym mit 0,04 M Tris/HCI-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, 1 mM EDTA und I mM Dithloerythrit, von der Säule eh !ert. Fraktionen mit einem Enzymgehalt von mindestens 20 U/ml werfen vereinigt, mit Ammoniumsulfat auf 80% gesättigt, und das präzipitierte Enzym wirf äbzentrlfugiert. Zur Endreinigung wird es nochmals einer Chromatographie im selben System unterworfen, jedoch unter Verwendung eines kleineren Säulenvolumens. Aus den vereinigten aktiven Fraktionen wird das Enzym mit 0,8 s Ammoniumsulfat gefällt, in 50 ml 0,04 M Trls/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM Dithioerythrit, konzentriert gelöst, steril-filtriert und wieder mit Ammonlumsuifat auf 0,8 s gebracht. Man erhält so eine bei 4° C stabile Enzymsuspension von CK-MM mit einer spezifischen Aktivität von 26-30 U/mg, gemessen mit Creatin als Substrat bei 25° C.

Volumen: 86 ml; Aktivität: 316 U/ml; Protein: 11,8 mg/ml. Ausbeute: ca. 3096 (bezogen auf den Organextrakt).

Beispiel B
Analog Beispiel A wirf CK-MM aus Muskelgewebe folgender Tiere isoliert: Rhesusaffe, Schwein, Rind.

Claims

Patentansprüche:

1. Antikörper gegen die Untereinheit M von Creatfnklnase-Isoenzymen mit einem Molekulargewicht zwischen 130 000 und 210 000, dadurch gekennzeichnet, daß sie die enzyrnatische Aktivität der Untereinheit M auch in Gegenwart von Creatinkinase-Substraten vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener Creaönklnase-MB zu inaktivieren.

2. Verfahren zur Herstellung der Antikörper nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Tiere mit aktivierter Creatinkinase-MM impft und die Antiseren sowie die Antikörper in a.n sich bekannter Weise gewinnt.

in

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Tiere mit aktivierter menschlicher

Creatinkinase-MM impft.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivierung der Creatinkinase-MM durch Zusatz von SH-Gruppen-stabilisierenden und -aktivierenden Substanzen, wie N-Acetylcystein, Mercaptoäthanol, Glutathion, Dithloerythrit, Dithiothreit und/oder S-(2-Amlnoüthyl)-lsothiouroniumbromid-hydrobromid, vornimmt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man pro mg Creatinkunase-MM 10 bis 500 mH der SH-Gruppen-stabilisierenden und -aktivierenden Substanz zusetzt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivierung außerdem in Gegenwart von zweiwertigen Metallionen vornimmt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man pro mg Crcatinkinase-MM 50 bis 500 mH zweiwertiger Metallionen zusetzt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweiwertige Metallionen Magnesiumionen zusetzt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Ziegen mit aktivierter Creatinkinase-MM Impft.

10. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 1 zur Bestimmung der Aktivität von Crcallnkinase-MB neben Creatlnkinase-MM.