DE2548868A1 - Testverfahren auf schwangerschaft - Google Patents
Testverfahren auf schwangerschaftInfo
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Description
Mein Zeichen
C 264-14/Ku
L . . J
Inr Zeichen Ihre Nachricht vom 899 Lindau (Bodensee)
Rennerle 10 Postfach 3160
22. Oktober 1975 Betreff: Anmelder: Carter-Wallace, Inc., New York, N.Y. Ioo22/USA
Testverfahren auf Schwangerschaft - Zusatz zu P 25.11.698.7 -
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung
für die Bestimmung des menschlichen HOrmons Chorion-Gonadotropin CHCG), Luteinisierungshormon (LH) und Prolaktin (PRL) und spezieller
ein fundamentalneues Verfahren und Anordnung zum Bestimmen der Schwangerschaft bei der Frau.
Tests für die Bestimmung der Schwangerschaft sind allgemein basiert
auf der Bestimmung von HORmonen, welche durch die entwickelnde Plazenta hergestellt werden, wie beispielsweise gonadotropische
Hormone, die ähnlich jenen sind, die durch die vordere Hypophyse hergestellt werden und Steroidhormone, ähnlich jenen, des Eier-
-2-
609825/08 49
o.„nnni«i- Postscheckkonto:
SSCL-Un*««*.«»™
BayerJlypotheken-aWechsel -BankLindau(B) Nr. 278920
Stockes und der Nebenniere. Heute verwendete Schwangerschaftstests
sind beinahe ausschließlich auf einer Untersuchung auf das plazentale
Hormon menschliches Choriongonadotropin (HCG) basiert. Dieses Hormon wird in KörperfLässigkeiten (Blutserum und Urin)
nur während der Schwangerschaft festgestellt, mit der Ausnahme verschiedener
anderer, sehr seltener Hormon erzeugender Konditionen des Körpers. Die Internationale Einheit (I.U.) von menschlichem
Choriongonadotropin wurde 1938 eingeführt und wird als die spezifische
gonadotropische Aktivität von 0,1 mg eines getrockneten
Standards definiert, gehalten an dem National Institut of Health, London, England.
Die frühesten Tests auf Schwangerschaft waren basiert auf biologischen
In-Vivo-Verfahren für die Bestimmung der Anwesenheit von
HCG. Z.B. der früheste Test,der Aschheim-Zondek-Test,war basiert
auf der Fähigkeit von HCG, das Subcutan in Mäuse injiziert war, um Corpora Lutea herzustellen. Der Friedman -Test ist ein anderer
biologischer Test, in welchem eine Urin-Probe der verdächtigten Schwangerschaft in die Ohrvene eines erwachsenen, weiblichen
Kaninchens injiziert wird, welches 3 bis 4 Wochen isoliert gewesen ist und 48 Stunden nach der Injektion werden die Ovarien auf
rupturierte hämorrhagische Follikeln untersucht, welche eine
positive Reaktion anzeigen. Ein 1943 durch Kupperman entwickelter, weniger bekannter Test umfasst die Injektion von Urin des Patienten
in eine weibliche Ratte mit anschliessender Inspektion des Ovars auf Zeichen von Hyperämie. Während die 2 Stunden, die not-
000825/0840 -
wendig sind zum Ausführen dieses Testes beträchtlich kürzer sind,
als die 48 Stunden, die für den Friedman-Test erforderlich sind, und die annähernd 5 Tage, die für den Aschheim-Zondek-Test erforderlich
sind, ist dieser Test nicht so zuverlässig, da er eines geübten Technikers bedarf, um ein leicht gelbes, negatives Ovar
von einem geröteten, positiven Ovar zu unterscheiden, um einen Höhengrad von GEnauigkeit zu erreichen. Ein durch Galli und Mainini
in den späten 4o-er Jahren entwickelter Test benötigt auch nur etwa 2 Stunden, um den Test auszuführen; dieser Test umfasst jedoch
die Injektion des Urins eines Patienten in Frösche mit der anschliessenden BEobachtung nach Ausstossen von Sperma,und diese
Tiere sind verhältnismässig unempfindlich , verglichen mitKaninchen,
Mäusen und Ratten.
All die obigen,biologischen Tests leiden an schwerwiegenden Nachteilen
einschließlich der Verfügbarkeit von Tieren , der Notwendigkeit, eine große Kolonie von Tieren zu halten, und verhältnismässig
langer Zeiträume des Untersuchens, das häufige Ergeben von falschen
positiven und negativen Ergebnissen,und am wichtigsten der Tatsache,
daß ein positiver Test mit nur 95% Zuverlässigkeitsgrad nur nach einem Zeitraum von 25 bis 3o der Ovulation folgenden Tagen erreicht
werden kann.
Eine zweite, während der zeitigen 6o-er Jahre entwickelte Generation
von Schwangerschaftstests sind gekennzeichnet als immunologische oder immunochemische Verfahren. Da HCG ein Protein-Hormon ist, wirkt es
antigen in einer heterologen Gattung. Wenn demgemäss HCG durch
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geeignete Techniken in ein geeignetes Testtier injiziert wird, am typischsten ein Kaninchen, wird ein Antikörper zu HCG in dem
Tier erzeugt. In zeitigen Tests, die dieses Prinzip verwenden, wurde versucht, die Antigen-Antikörper direkt Präzipitinreaktion
zu verwenden, nach welcher ein sichtbares Präzipitat als Ergebnis der Kombination von HCG und seinem Antikörper gebildet würde,
um das Vorhandensein dieses Hormons zu ermitteln. Üblicher Verfahren umfassten sogenannte indirekte Verfahren der Bestimmung, wie beispielsweise der Latex-Partikel-Objektträger-Test von Brody und
Carlstrom und Hämagglutinations- und Inhibitions-Test von
Wide und Gemzel. In dem ersteren Verfahren wird ein Antiserum dem Urin eines Patienten zugesetzt, worauf ein Latex-Träger
folgt, welcher mit HCG beschichtet worden ist. Wenn die Urinprobe einer schwangeren Frau HCG enthält, werden die Antikörper in dem
Antiserum neutralisiert und werden deshalb nicht mit dem HCG reagieren, das auf den Träger geschichtet ist, um Agglutination
zu erzeugen. In dem letzteren Testverfahren wid ein ähnliches Prinzip verwendet, ausgenommen, daß der Indikator HCG enthält,
das mit roten Blutzellen konjugiert oder mit roten Blutzellen
formalinisiert ist. Der erste Test wird in einem Zeitraum von nur etwa 2 Minuten ausgeführt, wohingegen der zweite etwa 2 Stunden
benötigt. Entweder der Urin oder das Blut eines Patienten werden für diese Testverfahren verwendet.
In einem jüngst entwickelten Schwangerschaftstestverfahren, basiert
auf einer Modifikation des basischen , immunologischen Mechanismus
M C _
werden radiologische Anordnungen verwendet, um das Vorhandensein von HCG in dem Blut (oder Urin) des Patienten zu ermitteln und/oder
zu messen. Siehe z.B. Goldstein et al in Fert.Steril. , Band 23,
Seite 817 (1972). In diesen Radioimmunerprobungs-Tests wird der
Antikörper in Berührung mit einem Gemisch der Körperflüssigkeit eines zu testenden Patienten und einem bekannten Betrag von HCG gebracht,
markiert mit einem radioaktiven Isotrop , und das HCG in der Testprobe und dem markierten HCG kämpfen um Wechselwirkung mit dem
HCG-Antikörper. Der Antikörper wird dann von der Flüssigkeit getrennt und jede Fraktion wird radiologisch analysiert, um die jeweiligen
Proportionen des markierten und nicht markierten HCG zu bestimmen,
welche an die Antikörper gebunden wurden, und die Konzentration von HCG in der Probe kann aus dieser Information berechnet werden, da
die Proportion des bezeichneten und nicht bezeichneten HCG in derselben Proportion in beiden Fraktionen sein wird. Die Radioimmununtersuchungstechniken
haben eine wichtige Begrenzung des immunochemischen Schwangerschaftstestes überwunden, nämlich jene der Empfindlichkeit.
Radioimmununtersuchungstechniken sind mehrere tausend Mal empfindlicher als die oben beschriebenen, indirekten Tests,
und erlauben deshalb eine Feststellung der Schwangerschaft viel zeitiger, als die 25 bis 3o der Ovulation folgenden Tage, die mit
dem Latex-Partikel-CTjektträger-Test und dem Hämagglutinations-Test
erforderlich sind.Aber auch, wenn die Schwangerschaft nach dem lo.
oder 12. der Ovulation folgende Tag mit einem 95%-Zuverlässigkeits-Grad
durch das Radioummununtersuchungsverfahren festgestellt wird, haben diese Tests den Nachteil, daß sie mehr Zeit zum Ausführen erfordern,
typischerweise etwa 24 - 48 Stunden.
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Jedoch der schwerwiegendste Nachteil bei allen vorher bekannten Schwangerschaftstesttechniken umfasst die häufige Indikation von
falschen positiven und negativen Ergebnissen. In dem Fall des immunochemischen Schwangerschaftstest ist diese Schwierigkeit
der nichtspezifischen Immunreaktion bezüglich der nichtspezifischen
Antikörper-Antigenreaktionen zuzuschreiben. Z.B., die Anwesenheit
eines üblichen Hormons, nichtspezifische Alpha-Untereinheit unter
Follikel stimulierendem HOrmon (FSH), luteinisierendem HOrmon
(LH), HCG und Thyreoid stimulierendem Hormon (TSH), und Homplogin in der Amino-Säure-Folge der HOrmon-spezifischen Beta-Untereinheiten
haben weitere Schwierigkeiten beim Herstellen spezifischer Antisera zur Verwendung in den immunochemischen Techniken verursacht.
Diese Schwierigkeiten werden in Radioimmununtersuchungsverfahren in Folge des hohen Empfindlichkeitsgrades dieser Technik
verstärkt. Dieser zuletzt erwähnte Nachteil ist teilweise umgangen worden durch Herstellen von Antisera, spezifisch auf Beta-Untereinheit
von HCG;jedoch dieses Verfahren erfordert die Verwendung von wertvollem Material, Immunisierung, Auswahl und Reindarstellung,
um spezifische Antikörper zu erreichen, welche Verfahren zeitraubend , teuer und sehr beschwerlich sind. Trotz dieser Vorkehrungen
ist das Ziel der annähernd loo%-igen Zuverlässigkeit in der Feststellung der Schwangerschaft durch Radioimmununtersuchung nicht
erreicht worden. ·
Ferner besteht ein schwerwiegender Bedarf nach einer Anordnung
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um ektopische Schwangerschaften im Zeitigstmöglichen Augenblick
festzustellen. Solche Schwangerschaften weisen negative Hämagglutinationen
oder Latex-Objektträger-Tests bei 4o bis 60% aller Patienten
auf, selbst nach 25 bis 3o der Ovulation folgenden Tagen, die erforderlich sind, um diese Tests ausafuhren. Der Grund dafür
betrifft die Annahme, daß die immunochemischen Schwangerschaftstesttechniken
für den Nachweis einer Schwangerschaft sorgen, nur nachdem die Implantation des befruchteten Ovars eingetreten ist.
Wie oben beschrieben, leiden alle bisher bekannten Schwangerschaftstestverfahren
an diesem Nachteil, daß sie nicht bis nach der Nidation wirksam sind. Ein Test, welcher das Vorhandensein einer Schwangerschaft
während des Zeitraumes zwischen der Befruchtung des Eies und der Implantation des befruchteten Eies feststellen könnte,
würde unschätzbar sein in der Behandlung von z.B. befürchtetem Abort bei Frauen, die gewöhnlich zu früh gebähren, Fällen die
künstliche Insemination umfassen und im Zusammenhang mit neuen empfängnisverhütenden Verfahren, welche eine Schwangerschaft vor
der Implantation wirksam beenden.
Das Vorhandensein spezifischer Rezeptoren fir die verschiedenen HORmone ist lang in Zielfällen von sowohl Menschen und Tieren verdächtigt
worden, und Forscher haben Erfolg innerhalb der letzten 5 Jahre gehabt, beim Erkennen und Direktstudieren bestimmter dieser
Rezeptoren und ihrer Wechselwirkung mit vielen entsprechenden Hormonen. Frühere,durch den Erfinder der vorliegenden Erfindung unternommene
Studien haben das Vorhandensein eines Rezeptors für
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6Q9825/0S43
HCG in dem Korpus-Luteum von schwangeren oder pseudo-schwangeren
Ratten vorgeschlagen. Gonadotropine, Kapitel 21, 1972, JOhn Wiley
& Sons. Diese früheren Studien gaben jedoch keine Indikation davon, ob ein ähnlicher Rezeptor in Menschen oder anderen Tieren
vorhanden ist, ob der in Ratten gefundene Rezeptor Art-spezifisch oder spezifisch selbst für HCG ist, ob er ein zuverlässiger Indikator
für HCG in Körperflüssigkeitsproben sein würde, oder ob er
stabil über einen ausgedehnten Zeitraum ist.
Prolaktin (PRL) stellt ein Hormon dar, von welchem viele Jahre
nicht angenommen wurde, in Menschen vorhanden zu sein. Seine Anwesenheit in Menschen wurde in den zeitigen 7o-er Jahren bestätigt.
Die Anwesenheit von PRL-Rezeptoren in mammärem Gewebe ist dokumentiert
wo.rden und von dem Hormon wird angenommen, eine Rolle bei Brust-Karzinom, Hypophyse-Tumoren, Laktationsstörungen, Hypothyroidismus
und anderen Störungen zu spielen. Es werden soviel wie 84 verschiedene Funktionen von PRL angenommen, umfassend komplexe
Wechselwirkung mit anderen Hypophyse-Gonadal- und Adrenal-Hormonen möglicherweise in der Rolle als ein Zwischenregulator für diese
anderen Hormone. Eine luteotropische als auch eine luteolytische Rolle von PRL während des Estues-Zyklus der RatteVLst ebenfalls
vorgeschlagen worden, und es gibt einen Beweis, der in den letzten Jahren bezüglich von STudien der Ratte entwickelt worden ist.
Die spezifische Bindung von PRL an das Ratten-Ovar ist neulich, in
der Literatur vorgeschlagen worden, aber kein spezifischer Rezeptor ist identifiziert worden. Turkington et el., Rec. Prog.Horm.Res.,
29:417 (1.97.3). Studien verschiedener Forscher haben vorgeschlagen,
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daß PRL geringe Funktion in der Beibehaltung von Corpus-Luteum
im Menschen aufweist. Hwang et al., Proc.Nat. Acad.Sci., 68:19o2 (1971); Midgley et al., Proc. IV Int. Cong. Endocrinal,
Int. Cong. Series Nr. 273, Excerpta Medica, Amsterdam, 1972.
Hinsichtlich der oben bezeichneten Krankheiten,von welchen bekannt
ist, das Hormon PRL zu umfassen, wird häufig gewünscht, den PRL- '
GEhalt in einer Testprobe zu bestimmen, und/oder zu überwachen, die von einem Patient , z.B. einer Probe von Körperflüssigkeit
erhalten wird. In einigen Fällen sind nur kleine Proben verfügbar, z.B. pädiatrische Fälle und deshalb ist erwünscht, einen sehr
spezifischen Test zu haben, welcher nur eine sehr kleine Probe und nur einen kurzen Zeitraum zum Ausführen erfordert. Spezifizität
ist erwünscht, um von anderen Hormonarten zu differenzieren, welche in der Probe vorhanden sein mögen, und dies trifft insbesondere
in Fällen zu, wo es erwünscht sein mag, gleichzeitig zwei oder mehr verschiedene Hormone zu bestimmen oder zu messen. Es besteht
z.Zt. keine wirklich spezifische Anordnung zum Herstellen einer solchen Bestimmung.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
für die Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropins (HCG),luteinisierendem HOrmon (LH), Prolaktin (PRL) und HCG-ähnliche
Materialien in einer wässrigen Probe vorzusehen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in dem Vorsehen,
eines Schwangerschaftstestverfahrens, welches annähernd
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loo% Zuverlässigkeit im Feststellen von Schwangerschaft herstellt.
Es ist ebenfalls eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Feststellung von ektropischer Schwangerschaft
und befürchtetem Abort vorzusehen, worin der Schwangerschaftszustand innerhalb 6-8 des Beginns folgenden Tagen festgestellt
wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in dem Vorsehen, eines Schwangerschaftsfeststellungsverfahrens, gemäss
welchem eine Schwangerschaft so zeitig wie 6-8 der Ovulation folgenden Tage mit beinahe loo % Zuverlässigkeit festgestellt
werden kann.
Es ist außerdem eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung zum Bestimmen des Vorhandenseins des HOrmons HCG
in einer wässrigen Probe vorzusehen, insbesondere für den Zweck des Feststeilens von Schwangerschaft bei der Frau durch Untersuchen
einer Probe von Körperflüssigkeit.
Eine andere Aufgabe der Erfindung liegt in dem Vorsehen eines Verfahrens zum Messen des GEhaltes von PRL in einer wässrigen Probe
speziell in einer Probe von Körperflüssigkeit.
Es ist ebenfalls eine Abgabe der Erfindung, ein Verfahren und
eine Anordnung zum gleichzeitigen Bestimmen von HCG oder LH
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608625/OBA9
und PRL in einer wässrigen Probe vorzusehen, insbesondere einer
sehr kleinen Probe von Körperflüssigkeit.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in dem
Vorsehen des besonderen Rezeptors, der in dem oben angegebenen Radiorezeptor-Erprobungsverfahren verwendet wird.
Es ist ebenfalls eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen des spezifischen REzeptors vorzusehen,
der in dem oben angeführten RAdiorezeptoruntersuchungsverfahren verwendet wird.
Beim Erreichen der obigen Aufgaben ist gemäss der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren für die Bestimmung von menschlichem
Choriongonadotropin (HCG), luteinisierendem Hormon (LH) und HCG-ähnlichem Material und/oder Prolaktin (PRL) in einer wässrigen
Probe vorgesehen worden, die die Arbeitsgänge des Berührens einer solchen Probe mit einem Mittel umfasst, das in der Lage ist,
teilweise das Hormon zu binden, das einer Anordnung der Anzeige vorsieht, ob eine solche Bindung stattgefunden hat, und das Beobachten
der Anzeigeanordnung, um das Vorhandensein des HORmons in der Probe zu bestimmen, worin ein besonders verbesserter Aspekt
das Bindemittel umfasst, das ein Plasma-Membranen-Extrakt von dem Korpus-Luteum eines Tieres ist, welches den Rezeptor für das
Hormon HCG und/oder PRL besitzt. Ein in diesem Verfahren verwendetes Indikator-System kann eines von jenen sein, die herkömmlicherweise
in einem ähnlichen immunochemischen Verfahren
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zum Bestimmen von Proteinen und/oder Polypetiden verwendet wird.
Z.B. kann der Indikator ein Material sein, welches mit dem Hormon behandelt worden ist, so daß das Vorhandensein des in Frage kommenden
Rezeptors der Indikator sich verfärben wird, gefärbt wiä, agglutiniert, ausfällt oder eine andere sichtbare Indikation
(z.B. Fluorezens) der Anwesenheit oder Abwesenheit des Hormons in der getesteten Flüssigkeit gibt, oder vorzugsweise die genaueren
radiologischen Meßtechniken verwendet werden. Beim Anwenden dieses Verfahrens für die Bestimmung der Schwangerschaft
bei Frauen wird eine Blut- oder Urinprobe in Berührung mit dem oben beschriebenen, spezifischen Rezeptor gebracht, und
die Anwesenheit oder Abwesenheit von HCG in der Probe wird bestimmt, basiert auf dem Betrag von bindenden Belegen durch das
Indikator-System.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
wird ein Verfahren für das Bestimmen von HCG in einer wässrigen Probe vorgesehen, vorzugsweise dem Blutserum oder Urin eines
Patienten, der eine vermutete Schwangerschaft hat, enthaltend das in-Berührung-bringen eines hochspezifischen Rezeptors für
das Hormon HCG, welcher ein Plasma-Membranen-Extrakt von dem Korpus-Luteum eines Tieres ist, das den Rezeptor für dieses
Hormon besitzt, mit der wässrigen Probe, die eine dazu gesetzte Menge von HCG aufweist, welche mit einem radioaktiven Isotop
markiert worden ist. In diesem Verfahren sind das in der Probe
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SQ982S/0849
2548888
vorhandene, mögliche HCG und der Teil des radioaktivmarkierten
HCG an den REzeptor gebunden. Der REzeptor mit seinem gebundenen HCG wird dann von der wässrigen Probe getrennt und die
Radioaktivität einer oder beider der abgeschiedenen Fraktionen wird gemessen, um die Konzentration von HCG in der wässrigen
Probe zu bestimmen, wobei diese Konzentration eine Funktion der gemessenen Radioaktivität ist. Es wird bevorzugt, den Rezeptor
von dem Korpus-Luteuin einer Kuh, eines Schafes, eines Pferdes,
oder eines Hausschweines zu erhalten, insbesondere von einem Tier, welches schwanger ist und am bevorzugtesten einem Tier,
während des ersten Vierteljahres der Schwangerschaft.
Eine weitere Ausfuhrungsform enthält ein Verfahren zum Bestimmen
des Hormons Prolaktin (PRL) in einer wässrigen Probe, wieder vorzugsweise einer Körperflüssigkeit, umfassend die Vorgänge
des Gehörens der Probe mit einem hochspezifischen Rezeptor für PRL, wobei dieser REzeptor auch ein Plasma- Membranen-Extrakt
von Korpus-Luteum eines Tieres ist, das diesen Rezeptor besitzt, und Vorsehen einer Menge von PRL in der Probe, die mit radioaktivem
Isotrop bezeichnet ist. Die übrigen Vorgänge sind jenen obigen zum Bestimmen von HCG angegebenen identisch. Dieses Verfahren
kann als eine Indikation von Schwangerschaft bei einer Frau oder zum Anzeigen anderer Störungen verwendet werden, die
das Vorhandensein von Prolaktin einschliessen.
Gemäss der Erfindung ist auch ein Verfahren zum gleichzeitigen
Bestimmen zweier oder mehrerer verschiedener Hormone vorgesehen,
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die in einer einzigen wässrigen Probe enthalten sind. In dieser Ausfuhrungsform sind die Vorgänge ähnlich jenen, zum Messen
einziger Hormone, ausgenommen, daß die wässrige Probe mit einem oder mehreren Mitteln in Berührung gebracht wird, die in der
Lage sind, wahlweise jedes der zu bestimmenden Hormone zu binden, die eine getrennte und unterscheidbare Anordnung zum
Anzeigen vorsehen, ob Bindung für jedes Hormon stattgefunden hat, und beobachten, jeden der Indikatoren, um das Vorhandensein
von jedem HOEmon zu bestimmen. Das Bindemittel ist ein Plasma-Membranen-Extrakt von einem Körperorgan, einer Art, von welcher
bekannt ist, in dem Organ einen spezifischen Rezeptor für jedes
der zu messenden Hormone zu besitzen. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Plasma-Membranen-Extrakt des Korpus-Luteum eines
Säugetieres, welches Rezeptorstellen für sowohl HCG als auch
PRL besitzt. Die bevorzugte Anzeigeanordnung enthält verschiedene radioaktive Isotope, z.B. verschiedene Isotrope von Jod,
125 131 3 14
beispielsweise I, I, H und C . Mit solch einem Indikator HCG und PRL kann gleichzeitig gemessen werden durch in-Berührungbringen des REzeptors mit der Probe und verschieden bezeichnetem, HCG und PRL , so daß ein Teil der bezeichneten und nichtbezeichneten Hormone an den REzeptor gebunden sind, das Trennen des gebundenen und nichtgebundenen Hormons von der Probe und Zählen der Radioaktivität von jeder Isotopart , um das Vorhandensein der jeweiligen Hormone in Proportion zu der gemessenen Radioaktivität zu bestimmen.
beispielsweise I, I, H und C . Mit solch einem Indikator HCG und PRL kann gleichzeitig gemessen werden durch in-Berührungbringen des REzeptors mit der Probe und verschieden bezeichnetem, HCG und PRL , so daß ein Teil der bezeichneten und nichtbezeichneten Hormone an den REzeptor gebunden sind, das Trennen des gebundenen und nichtgebundenen Hormons von der Probe und Zählen der Radioaktivität von jeder Isotopart , um das Vorhandensein der jeweiligen Hormone in Proportion zu der gemessenen Radioaktivität zu bestimmen.
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609825/0849
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist
ein Mittel zur chemischen Rezeptorbestimmung des HORmons HCG vorgesehen, welches in im wesentlichen reiner Form die spezifische
Fraktion von Plasma-Membranen-Extrakt von dem Korpus-Luteum eines Tieres enthält, das den Rezeptor für HCG besitzt,
wobei die spezifische Fraktion eine ist, welche in der Lage ist, wahlweise biologisch aktives, menschliches Choriongonadotropin
zu binden.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
ist ein Verfahren für die Herstellung einer Reagenz für chemische Rezeptorbestimmung des Hormons HCG vorgesehen, enthaltend
die Vorgänge des Hersteilens eines fein vereinigten Gewebehomogenats aus Korpus-Luteum-Gewebe eines Tieres, welches den
Rezeptor für HCG besitzt, das Trennen der Plasma-Membranen von dem Homogenat und Wählen der Plasma-Membranen-Fraktion,
die in der Lage ist, wahlweise biologisch aktives , menschliches Choriongonadotropin zu binden.
Das. in Frage kommende Testverfahren ist auch für das. Bestimmen
der Schwangerschaft bei Tieren geeignet. Es mag demgemäss verwendet
werden, um Schwangerschaft bei einer der Tierarten festzustellen, worin der spezifische Rezeptor der Erfindung gefunden
wird, d.h. Säugetiere und möglicherweise ausgewählte, Nichtsäugetiere.
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609825/0849
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung enthält eineAnordnung
zum Bestimmen von menschlichem Choriongonadotropin (HCG), luteinisierendem
Hormon (LH) oder HCG-ähnlichem Material in einer wässrigen Probe, cu.it.uulcend (a) eine erste Reagenz und eine
zweite Reagenz; (b) wobei die erste Reagenz in im wesentlichen reiner* Form die spezifische Fraktion von Plasma-Membranen-Extrakt
aus dem Korpus-Luteum einer Art enthält, die den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin aufweist, das in der Lage ist,
teilweise biologisch aktives, menschliches Choriongonadotropin zu binden; (c) wobei die zweite Reagenz enthält bezeichnetes
menschliches Choriongonadotropin , das in der Lage ist, Strahlung abzugeben, die erste Reagenz beabsichtigt ist mit der Probe in
Berührung gebracht zu werden, die das zu messende Hormon enthält, und mit der zweiten Reagenz, um einen Teil des bezeichneten und
nicht bezeichneten Hormons an den Rezeptor zu binden; (d) eine Anordnung zum Messen des Betrages des an den REzeptor gebundenen
bezeichneten Hormons, wobei die davon abgegebene Strahlung eine Funktion der Konzentration des Hormons in der wässrigen Probe
ist. Diese Ausführungsform nimmt vorzugsweise die Form einer
Schwangerschaftstestausrüstung an.
Gemäss der Erfindung ist auch eine Anordnung für das Bestimmen
von Prolaktin (PRL) in einer wässrigen Probe vorgesehen, enthaltend (a) eine erste Reagenz und eine zweite Reagenz ; (b) wobei die
erste Reagenz in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion Von Plasma-Membranen-Extrakt aus dem Korpus-Luteum
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809826/084 9
einer Art enthält, die den REzeptor für Prolaktin aufweist,
der in der Lage ist, teilweise biologisch aktives Prolaktin zu binden; (c) wobei die zweite Reagenz markiertes Prolaktin
enthält, und das in der Lage ist, Strahlung abzugeben, die erste Reagenz beabsichtigt ist, mit der das Hormon enthaltenden Probe
in Berührung gebracht , um gemessen zu werden und mit der zweiten Reagenz, um einen Teil des bezeichneten und nichtbezeichneten
HOrmons an denREzeptor zu binden; (d) eine Anordnung zum Messen des Betrages des bezeichneten HORmons, das an den
Rezeptor gebunden ist, wobei die davon abgegebene Strahlung eine Funktion der Konzentration des HORmons in der wässrigen
Probe ist.
Schließlich ist in einer anderen Ausführungsform der Erfindung
eine Anordnung für das Bestimmen einer Anzahl von Hormonen in einer wässrigen Probe vorgesehen, enthaltend (a) eine
erste Reagenz und eine Anzahl von zweiten Reagenzchen, gleich der Anzahl zu bestimmender Hormone; (b) wobei die erste Reagenz
in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion von Plasma-Membranen-Extrakt aus einem Körperorgan einer ARt enthält,
die den spezifischen Rezeptor in dem Organ aufweist, zum wahlweisen Binden jedes der Hormone in biologisch aktiver
Form ; (c) wobei die zweiten Reagenzchen jedes derzu bestimmenden Hormone in einer bezeichneten Form enthält, die in der
Lage ist, Strahlung abzugeben, die abgegebene Strahlung verschieden für jedes bezeichnete HOrmon ist, die erste Reagenz
609825/0849 ~l8~
beabsiehtigt ist, mit der Probe in Berührung gebracht zu werden,
die das zu messende Hormon enthält, und mit den zweiten Reagenzchen,
um einen Teil der bezeichneten und nxchtbezexchneten Hormone an den Rezeptor zu binden; (d) eine Anordnung zum
Messen des Betrages bezeichneter Hormone, die an den Rezeptor gebunden sind, wobei die abgegebene Strahlung von jedem bezeichneten
Hormon eine Funktion der Konzentration des jeweiligen Hormons in der wässrigen Probe ist. In dieser Ausführungsform
ist die erste Reagenz vorzugsweise der Plasma-Membranen-Extrakt eines Säugetieres und die zweiten Reagenzchen enthalten HCG
und PRL, die mit verschiedenen Isotopen bezeichnet sind.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung hervorgehen, wenn mit der beiliegenden Zeichnung
angesehen.
Es zeigt:
Fig. 1 eine Logit-Log-Li nearisation der konkurrierenden Inhibitionsreaktion
der Radiorezeptor-Untersuchung von HCG1, die als Berechnungs-Narm für das Verfahren der
vorliegenden Erfindung dient;
Fig. 2 den Computer-Aus gang1 der Logit-Log- übertragung der
Norm für die Radiorezeptor-Untersuchung von HCGj und
-19-
009825/0049
Fig. 3 ein Vergleich der Plasma-Pegel von HCG , während zwei
normaler (HD,RS) und einer abgeleiteten, normalen intrauterinen Schwangerschaft in S.L. mit HCG-Pegeln bei Io
Patienten mit ektropischer Schwangerschaft,
Fig. 3a Logit-Log-Umsetzung von HCG-Verdünnungskurven bei verschiedenen Spezies.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist ein neuartiges und sehr
spezifisches Verfahren zur Bestimmung des Hormons menschliches Choriongonadotropin (HCG) und/oder Prolaktin (PRL) offenbart
worden. ImWiderspruch zu früheren biologischen Tests auf HCG, welche sich als sehr unpraktisch erwiesen haben und jüngst
entwickelter immunochemischer Tests, welche auf dem Prinzip von
Antigen-Antikörperbindung basiert, aber nicht ausreichend zuverlässig
sind, ist das vorliegende Verfahren auf der Verwendung eies hochselektiven Rezeptors für HCG basiert. Der Rezeptor
wird von dem Zielgewebe eines geeigneten Tieres isoliert , wohingegen
in dem Fall von immunochemischen Verfahren ein Antiserum
aus dem Blut eines geeigneten Tieres hergestellt wird, welchem das Hormon injiziert worden ist, um Antigen-Antikörper-Reaktion
her zus te1len.
Vor der vorliegenden Erfindung hat es keinen anerkannten Grund zur Bestimmung von PRL bei Menschen gegeben, und somit keine
Betonung geeignete Vorgänge zu Erfindung . Die Erfindung ist auf der Offenbarung eines spezifischen Rezeptors für dieses
Hormon basiert. Die Verwendung eines spezifischen Rezeptors
-2o-
60982S/0849
-2ο-
isoliert von dem Zielgewebe eines Tieres, welches diesen spezifischen
Rezeptor besitzt, überwindet offensichtlich vollständig den Nachteil der nichtspezifischen Reaktionen, welche häufig
im Zusammenhang mit immunochemischen Verfahren auftreten. In den meisten Fällen benötigt die spezifische Rezeptorbindung
die natürliche Konfiguration eines HORmons in seiner biologisch aktiven Form. Wenn demgemäss der rezeptor-chemische
Testvorgang mit anzeigenden Radiountersuchungstechniken kombiniert wird, ergibt sich ein Radiorezeptor-Untersuchungsverfahren,
welches den Empfindlichkeitsgrad der Radioimmununtersuchungstechniken besitzt, und gleichzeitig den Grad der Spezifizität
von Tierexperiment, und deshalb zeigt dieses Verfahren größere erhaltende Genauigkeit, gegenüber allen bestehenden immunologischen
und biologischen HORmon-Tests, insbesondere Te&s auf Schwangerschaft.
Weil ferner der Rezeptor die biologisch aktive Form des HORmons zum Binden benötigt, würde die endogene Synthese eines metabolisch
schadhaften HCG, welches normalerweise eine positive Reaktion gemäss dem immunochemischen Testverfahren geben würde, von welchem
aber angenommen wird, von bestehender Schwangerschaft nicht in der Lage zu sein, würde keinen Anlass zu einem falschen positiven
Test gemäss dem Testverfahren der vorliegenden Erfindung geben.
Wie in der Einleitung aufgezeigt, ist das HORmon Prolaktin vorge-
-21-
S09825/0849
schlagen worden, eine Funktion in dem Estrus-Zyklus der Ratte
zu haben, ist aber zur gleichen Zeit nicht identifiziert worden, eine Rolle in den ovariellen oder reproduktiven Vorgängen der
Menschen zu haben. Als eine Baäs für diese Erfindung ist offenbart
worden, daß eine Zunahme in dem Pegel von PRL in der Frau während der Schwangerschaft besteht. Ferner ist offenbart worden,
daß ovarielles Gewebe von mehreren Arten einschließlich der Kuh und Menschen spezifische RezeptorsteIlen für das HORmon
PRL ausser Rezeptorstellen für HCG enthält.
Somit ist es außer dem Vorsehen eines allgemein anwendbaren Vorgehens für die Bestimmung von PRL im Zusammenhang mit den
verschiedenen oben erwähnten Krankheiten es auch möglich, das Verfahren der Eründung für das Bestimmen oder vorzugsweise
der Hilfe in der Bestimmung von Schwangerschaft zu verwenden. Eine festgestellte Zunahme in dem PRL -Pegel bei einer Frau,
die vermutlich schwanger ist, ergibt eine weitere Indikation zusammeitmit der Bestimmung von HCG gemäss der Erfindung, daß
Schwangerschaft tatsächlich besteht. Dieser zusätzliche Grad von Bestätigung ist von großem Wert, insbesondere in Fällen,
die abnormale Schwangerschaft oder vermuteten Abort umfassen. Es wird angenommen, daß PRL eine wichtige Rolle in der fötalen
Entwicklung spielt, und demgemäss sieht ihre Bestimmung
weitere Information zu der durch eine Bestimmung von HCG erhaltenen vor.
-22-
609825/0849
In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es möglich, gleichzeitig sowohl HCG als auch PRL zu bestimmen,
da festgestellt worden ist, daß derselbe REzeptor Rezeptorstellen für beide dieser HORmone besitzt. Dies ist eine besonders
unerwartete Offenbarung hinsichtlich der Tatsache, daß Rezeptorstellen für PRL in dem Korpus-Luteum eines Tieres bisher nicht
bestätigt worden sind, und Rezeptor-Stellen für HCG nur in der Ratte gezeigt worden sind. Gleichzeitig weist die Aufdeckung
offensichtliche Vorteile bei Schwangerschaftsuntersuchung auf, hinsichtlich der oben angegebenen Rolle von PRL bei der
Schwangerschaft. Eine einzige Körperflüssigkeitsprobe und ein einziger Testvorgang sehen die vollständigste und genaueste
Indikation von Schwangerschaft vor.
Diese gleichzeitige Bestimmungstechnik ist nicht auf die HOrmone
HCG und PRL begrenzt. Z.B. ist bekannt, daß das mammäre Gewebe Rezeptorsteilem für mehr als ein HOrmon enthält, z.B. östrogen ,
Prolaktin und Oxidocin und deshalb ist die Technik der Erfindung gleich anwendbar auf gleichzeitige Bestimmungen dieser HORmone
unter Verwendung eines Rezeptors, der von Brustgewebe erhalten wird.
Es ist auch geniäss der vorliegenden Erfindung offenbart worden,
daß die Radiorezeptor-Untersuchungstechnik die Erkennung der
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609825/0849
Schwangerschaft so zeitig, wie eine der Ovulation folgenden
Woche ermöglicht. Dies stellt in der Tat einen bedeutsamen Fortschritt auf dem Gebiet der Schwangerschaftserkennungstests
dar, da bisher der SchwangerSchaftszustand nicht früher
als etwa am Io. oder 12. der Ovulation folgenden Tag nachgewiesen
werden konnte. Dies Ergebnis ist umso bedeutender, wenn sich vor Augen geführt wird, daß die große Vielzahl von Schwangerschaftstests
heute nicht durch das Radioimmununtersuchungsverfahren ausgeführt wird, welches die Bestimmung so zeitig
wie Io oder 12 der Ovulation folgenden Tage erlaubt, sondern eher mittels der Hämagglutinations- oder Latex-Objektträger-Tests
, welche wie oben angegeben, eine Bestimmung derSchwangerschaft nur nach etwa 25 bis 3o der Ovulation folgenden Tage
erlauben.
Radioiinmununtersuchungstests erfordern wenigstens 24 Stunden Laboratoriumszeit, und typischerweise etwa 48 Stunden Testzeit,
gekoppelt mit beschwerlichen und teuren Vorgängen zum Herstellen ausreichend spezifischen Antikörper oder Antiserum. Andererseits
beträgt die Zeit, die erforderlich ist, um den Testvorgang gemäss der vorliegenden Erfindung auszuführen,nicht mehr als etwa
1 Stunde und typischerweise nur etwa 1/2 Stunde. Die praktischen
Vorteile von solch einem SendangerSchaftstestverfahren f welches
die Feststellung des Schwangerschaftszustandes vor der Implantation
des befruchteten Eies in das endometriale Gewebe erlaubt, sind oben kurz besprochen worden und diese Vorteile als auch,
die wichtigen Nutzen in Form von Grundforschung auf dem Gebiet
609825/0849 -24-
der menschlichen Fortpflanzung, die sich aus der vorliegenden
Erfindung ergeben, gehen im FAchgebiet Bewanderten leicht hervor.
Hinsichtlich der fundamentalen Ähnlichkeiten in dem Bindemechanismus
des derzeitigen rezeptor-chemischen Testmechanismus und dem wohlbekannten immunochemischen Testmechanismus ist es
möglich, die vorher entwickelten Indikationsmechanismen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zu verwenden.
Demgemäss mag das Indikatorsystem aus einem Indikatormaterial bestehen, welches mit HCG behandelt worden ist, so daß in der
Anwesenheit des REzeptors das Indikatormaterial· sich verfärben wird, gefärbt wird,agglutiniert, ausfällt oder eine andere
sichtbare oder chemische Indikation der Anwesenheit oder Abwesenheit von HCG in der wässrigen Probe oder der getesteten
Körperflüssigkeit. Aus dem vorhergehenden ist jedoch offensichtlich,
daß die wirksamsten Ergebnisse erhalten werden, wenn eine Rradiologische Untersuchungstechnik als Indikatorsystswn
verwendet wird. Demgemäss. stellt die Radiorezeptoruntersuchungsaus führungaf orm der vorliegenden Erfindung deutlich
die bevorzugteste Ausführungsform dar. Trotzdem soil· verstanden
werden, daß die vorliegende Erfindung nicht in dem Vorsehen eines besonderen Indikationssystems zur Verwendung in dem in
Frage kommenden Verfahren liegt, sondern eher in der fundamentalen und neuartigen Verwendung der Tezeptor-chemischen
Techniken und eines spezifischen Rezeptors, um das Vorhandensein von HCG und/oder PRL zu bestimmen.
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Angesichts des extremen Grades der Spezifizität und Sensibilität des Radiorezeptoruntersuchungsverfahrens der vorliegenden
Erfindung ist es möglich, eine zufriedenstellende Bestimmung auf einer extrem kleinen Probe herzustellen. Z.B. bei der
Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung als ein Test auf SchwangerscHit ist es möglich, den Test unter Verwendung
von nur etwa 0,1 ml. oder weniger des von dem Patienten entnommenen Blutes zu verwenden. Diese Entnahme von dem Patienten
kann mittels eines einfachen Nadelstiches in dem Ende eines Fingers ausgeführt werden. Ferner ist das Verfahren
der Erfindung wirksam, das Vorhandensein von HCG in einer wässrigen Probe zu bestimmen, und demgemäss kann entweder Blutserum
oder ane Urinprobe von einem Patienten geeigneterweise verwendet werden.
Der in dem Testvorgang gemäss der vorliegenden Erfindung verwendete
spezifische Rezeptor wird von ovariellem Gewebe erhalten. Wie oben dargelegt, ist der Rezeptor bedeutend selektiver für
HCG und HCG-ähritLchen Materialien oder PRL als ein HCG oder
PRL -Antikörper, da der REzeptor die ursprüngliche Konfiguration des Hormons in seiner biologisch aktiven Form zur Bindung
benötigt. FoijLich gibt es keine Möglichkeit der nichtspezifischen
Immunreaktion. Bei allen Tieren, welche diesen spezifischen Rezeptor besitzen, ist es leicht, in dem ovariellen
Gewebe erkennbar, welches das Zielgewebe des HORmons darstellt. Während der Rezeptor von einem Säugetier isoliert werden mag,
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609825/0849
und möglicherweise von bestimmten Nichtsäugetieren wird bevorzugt,
den REzeptor von den Ovarien verhältnismässig großer Tiere zu erhalten, wie beispielsweise Kühe, Schafe, Schweine,
Pferde und dergleichen, hinsichtlich der Tatsache, daß diese Tiere einen proportioneil größeren Betrag von ovariellem Gewebe
aufweisen, und ferner eine leichte Zufuhr von solchem Gewebe besteht, aufgrund der Tatsache , daß diese Tiere für
deren Fleisch kommerziell geschlachtet werden. Es ist feägestellt worden, daß bis zu 2oo Schwangerschaftstests von einem
einzigen Kuhovar ausgeführt werden können. Die Ovarien , z.B.
von Ratten sind so klein , um diese Art von Tieren als Quelle unpraktisch zu machen. Wie im folgenden besprochen, ist das
Testverfahren der Erfindung auch auf Tiere anwendbar, welche den Rezeptor besitzen und deshalb sieht die positive Bewertung
der Schwangerschaft in einer gegebenen Art auch ein Verfahren
zum überprüfen von Tieren auf das Vorhandensein des Rezeptors
vor.
Vorzugsweise ist das Tier , von welchem der Rezeptor erhalten
wird, in einem schwangeren Zustand zur Zeit des Schlachtens, da zu dieser Zeit der Betrag des ovariellem Gewebes und die
Anzahl von Rezeptorstellen ein Maximum beträgt. Das erste Quartal der Schwangerschaft hat sich als die vorteilhafteste
Zeit zum Erhalten des Gewebes erwiesen.
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Der spezifische REzeptor der Erfindung wird durch Trennen von
reinen Plasma-Membranen aus dem ovariellen Gewebe erhalten, worauf
die Bewertung der verschiedenen Plasma-Membranen-Fraktionen durch
Testen gegen isotopisch markiertem HCG oder PRL folgt, und Wählen der Fraktion, welche die größte Bindung für das HORmon zeigt.
Der Rezeptor ist äußerst stabil und kann für lange Zeiträume gespeichert werden, oder wird selbst in einem zweiten oder
anschliessenden Testverfahren wiederverwendet. Der Plasma-Membranen-Rezeptor ist nach Lyophilisation für Schwangerschaftstests stabil.
Das genaue Verfahren zum Erhalten des REzeptors wird im folgenden ausführlicher beschrieben.
Da das Testverfahren der Erfindung nicht artspezifisch ist, kann es auch verwendet werden, um Schwangerschaft bei einem
der Tiere zu ermitteln, von welchen festgestellt worden ist, den spezifischen REzeptor der Erfindung zu besitzen. Obwohl
somit der REzeptor sehr spezifisch für HCG beim Menschen und LH bei Menschen und Tieren ist, ist es auch in der Lage, HCG-ähnliche
Proteine wahlweise zu binden, welche bei Tieren die Rolle entsprechend dem HCG beim Menschen spielen, d.h. sie entsprechen
dem Choriongonadotropin beim Menschen. Dasselbe gilt für PRL. Der Vorteil besteht darin,.daß übliche Laboratoriumstesttiere,
wie beispielsweise Affen, Hunde, Kaninchen, Mäuse etc. durch dieses
Verfahren getestet werden können, wohingegen separate Antikörper
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für jedes Tier benötigt wurden, gemäss den iinmuno chemischen
Testverfahren.
Markieren von HCG oder PRL- mit einem radioaktiven Isotop kann
auf die übliche Weise mit einem geeigneten Isotop ausgeführt werden, was für diesenZweck gewählt wird, z.B. aus I ,
14 3
C , H und dergleichen. Ein besonders geeignetes Isotop ist
C , H und dergleichen. Ein besonders geeignetes Isotop ist
125 ein radioaktives Isotop von Jod, wie beispielsweise I hinsichtlich der Tatsache, daß Markieren mit diesem Isotop
verhältnismässig einfach ist, und viele Laboratorien , die Ausrüstung besitzen, die notwendig ist, um dieses Isotop
zu messen.
In dem Fall der gleichzeitigen HOrmonbestimmung durch die Rezeptoruntersuchungstechnik
der Erfindung ist es notwendig, jedes zu bestimmende Hormon mit einem unterscheidbaren Isotop zu markieren,
so daß die Mess^ung der gebundenen und/oder nichtgebundenen Hormonfraktionen eine getrennte Indikation für jedes zu bestimmende
Hormon versehen wird . Wenn z.B. eine gleichzeitige Bestimmung von HCG und PRL ausgeführt wird, können gereinigte Proben dieser
zwei Hormone mit I bzw. I markiert werden und leicht verfügbare Zählvorrichtungen können dann verwendet werden, um jedes
Isotop getrennt zu zählen.
Um die vorliegende Erfindung vollständiger zu beschreiben, sind im
folgenden verschiedene spezifische Verfahren zum Herstellen der
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609825/08A9
Testreagenzchen und Anwendung der Radiorezeptoruntersuchung
als auch spezifische Beispiele von klinischen Bestimmungen angegeben, wobei sich versteht, daß die spezifischen Vorgänge beabsichtigt
sind, lediglich veranschaulichend und in keiner Weise begrenzend zu sein.
I. Radioisotopisches Markieren von Hormon
Hochgereinigtes HCG (enthaltend 12.ooo I.U./mg) wurde für
125
den Test verwendet. Das HCG wurde mit I markiert durch Verwenden von Lactoperoxidase , hergestellt aus Milch (RZ
= o.78; Sigma Company, St. Louis , Missouri). Zwei mCi von
I in 2o ul von o,l M Natrium-Acetat-Puffer eines pH-Wertes
von 6.ο wurden in einem Reaktionsfläschchen mit 25 ug von
HCG gemischt. Eine Teilmenge von 5o ng Lactoperoxidase in 2o ul und 2oo ng von H^C^ in Io ul von Wasser wurden dann
dem Fläschchen zugesetzt. Drei Teilmengen von loo ng von H^O« wu-zden- in Intervallen von fünf Minuten zugesetzt.
Nach 2o Minuten wurde die Reaktion angehalten, durch das Zusetzen von o,5 ml von o,15 MNaCl enthaltend ein Prozent
Rinderserumalbumin (BSA) eines pH-Wertes von 7,o.Das markierte Hormon wurde dann von freiem Jod durch Gel-Filtration auf
eine 1 X 3o cm-Säule von Sephadex G-loo getrennt, abgeglichen
mit o,15 MNaCl enthaltend 1% BSA, eines pH-Wertes von 7,o.
Die spezifische Aktivität des markierten HCG wurde durch Ausfällen mit Trichloressigsäure bestimmt. Fünf ul des
-3o-
609825/0849
-3o-
unbearbeiteten Reaktionsgemisches wurde auf 5 ml mit o,o5 M Phosphat-Puffer eines pH-Wertes von 7,5 verdünnt, enthaltend
o,l % BSA. Zu einer 2oo ul Teilmenge dieser Lösung wurden zugesetzt
4oo ul Trichloressigsäure zu einer endgültigen Konzentration von lo% Trichloressigsäure. Die ausgefällten Proteine
wurden durch Zentrifugieren wiedergewonnen. Die mit dem ausfällbaren Material verbundene Radioaktivität wurde als gebundenes
Protein angesehen, und wurde bei der Berechnung der spezifischen Aktivität des markierten Hormons verwendet. Das unbe&eitete
Reaktionsgemisch wurde durch Gel-Filtration gereinigt, durch eine 1 χ 3o cm-Säule von Sephadex G-5o, abgeglichen mit 1%
BSA in o,9% NaCl. Die spezifische Aktivität des verwendeten
HCG bei der Radiorezeptoruntersuchung betrug 2o - 3o uCi/ug. Die biologische Aktivität des markierten HCG , das bei dem Test
verwendet wurde, bestimmt durch ovarielle Ascorbin-Säure-Entleerungsuntersuchung
betrug 8,923 I.U./mg mit 95% Vertrauens-
to
grenzen von 5,826-12.25o I.U./mg.
HPRL wurde durch das Verfahren von Hunter and Greenwood mit
kleineren Modifikationen jodiert: Zu 5o ul von o,5 m Phosphat-
125
Puffer pH-Wert 7,5 wurden zugesetzt 1 mCi von Na I (New England Nuclear, Boston Massachusetts) , 5 ug hPRL und
7o ug von Chloramin-T, ¥oxauf nach 15 Sekunden Natrium-Metabisulfit
folgte. Einhundert mg Iobids (Hycel Reagents, Houston
Texas) wurden dem unbearbeiteten , jodierten Gemisch zugesetzt,
-31-
609825/0849
125
um nichtreagiertes I zu absorbieren. hPRL wurde auch enzymatisch
jodiert durch Lactoperoxidase (Sigma Chemical Company,
St. Lous, Missouri). Reinigung wurde durch Gel-Filtration auf einer Sephadex G-loo-Säule (o,7 χ 18 cm) erreicht. Die spezifische
Aktivität und Reinheit des markierten PRL wurde durch
125
Chromatoelektrophorese bestimmt. I-hPRL in der Lage speziell mamkres Gewebe von milchgebenden Ratten zu binden, wurde für die Bindestudien mit partiell gereinigtem, ovariellem Homogenat verwendet.
Chromatoelektrophorese bestimmt. I-hPRL in der Lage speziell mamkres Gewebe von milchgebenden Ratten zu binden, wurde für die Bindestudien mit partiell gereinigtem, ovariellem Homogenat verwendet.
II. Herstellen von Rezeptor
Alle Verfahren bei dem Herstellen von Plasma-Membranen wurden in einem Eisbad oder bei 4 C ausgeführt. Frische Rindovarien
von zeitiger Schwangerschaft (1. Quartal: Fötus-Länge vom Kopf bis STeiss bis zu 22 cm)r wurden von dem Schlachthaus
erhalten und in flüssigem STickstoff bis zur Verarbeitung gelagert. In einem typischen Experiment wurden loo g Gewebe von etwa
25 großen Korpora-Lutea mit einer scharfen Stahlklinge in kleine Stücke geschnitten, und gemahlen in 5oo ml von Io mM. Tris-HCL Puffer
eines pH-Wertes von 7,8, enthaltend ein mM von MgCl2 ,
ein MM-Dithiotreitol, lo'.ooo I.U. von Trasylol (FBA Pharmaceuti-
σ> cals) pro Liter und o,25 M Sucrose. Das Homogenat wurde durch
O0 2 Schichten von Käsetuch gefiltert und die größeren Partikel
tr» wurden in 5oo ml. des Puffers wieder aufbereitet. Das Gewebe
° wurde ferner homogenisiert, durch Io bis 15 Hübe in einem Teflon-
u> Glas-Homogenisiergerät, Typ C mit Zwischenraumgröße von o,12 bis
o,17 mmf bei 4° C. Das Homogenat wurde zentrifugiert bei 65o xg
-32-
548868
für 2o Minuten in einer Sorvall-gekühlten Zentrifuge (RC B, Rotor GSA) , um intakte Zellen, Zellabbruch und Kerne zu entfernen. Der 65o χ g Überstand wurde in derselben Zentrifuge
2o Minuten lang bei I3.ooo g erneut zentrifugiert.Der Überstand
wurde diesmal abgeschüttet und das Kügelchen wurde mit Hilfe des Teflon-Glas-Homogenisiergerätes in 5o bis 7o ml von Tris-HCl-Puffer
erneut suspendiert. Diese Suspension wurde in denKern eines TI-14 zonalen Rotors (Model Beckman Spinco L3-5o)
eingegeben, der bei 3.ooo U/min läuft und 5oo ml eines linearen Sucrose-Gradients (LKB Ultrograd 11.3oo Pumpe) enthält von
3o% (w/v ) zu 5o% (w/v) Sucrose und I2o ml Kissen von 5o%
Cw/v) Sucrose (PUmpquote 2o ml/min.). Eine Auflage von 2o ml wurde nach der Probe eingegeben. Nach 2 Stunden Zentrifugieren
bei 45.ΟΟΟ U/min, wurde die Zentrifuge verzögert und der Rotor-GEhalt
mit 55% Sucrose bei 2o ml/min, ersetzt. Die Plasma-Membranen wurden von dem Rotor in der Reihenfolge der zunehmenden
Partikeigrösse ersetzt und Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt und unverzüglich gefroren, bis auf Bindung und enzymatische
Aktivität untersucht. Membranen wurden während dreier Monate ohne sichtbaren Verlust der Bindefähigkeit gefroren gehalten.
Eine Teilmenge der Fraktionen wurde zur Elektronenmikroskop^ vor dem Frieren genommen. Die in der Suspension enthaltene
Sucrose störte nicht die Bindung des markierten HCG.
Teilmengen von ovariellem Homogenat und geeignete Teilmengen
von verschiedenen Fraktionen erhalten aus dem kontinuierlichen Sucrose-Dichte-Gradient wurden gelöst in IMNaOH,enthaltend
o,l % Natrium-Dodecyl-Sulfat, um den Proteingehalt durch das
6 0 9825/0849
Verfahren von Lowry (J.Biol.Chem.,BaHd. 193, Seite 265, 1951)
zu bestimmen unter Verwendung von Rinderserum-Albumin als die Norm. Teilmengen der verschiedenen Fraktionen wurden auch kombi-
125
niert mitHCG markiert mit I ,und der Grad der Bindung wurde in
jedem Fall gemessen. Auf der Basis der Proteinkonzentration zeigten die Plasma-Membranen enthaltend den spezifischen Rezeptor für
das markierte HCG, eine lo-fach größere Bindung als das unbearbeitete
, ovarielle HOmogenat.
Jede Fraktion wurde auch auf Verunreinigung analysiert durch Untersuchen
ihrer enzymatischen Aktivität. Jede Fraktion wurde auf 51 Nucleodiase-Aktivität untersucht, durch das Verfahren von
Song et al (J.Biol. Chem., Band 262, Seite 694, 1967) und das freigesetzte anorganische Phosphat wurde gemessen durch das Verfahren
von Fiske et al (J.Biol. Chem., Band 66, Seite 375, 1925). Cytochrom C Reductase wurde untersucht gemäss dem Verfahren von
Cooperstein et al (J.B±±. Chem., Band 189, Seite 665, 1951).
Als eine weitere Nachprüfung bezüglich der Reinheit der Plasma-Membranen
wurden die einzelnen Fraktionen der Elektronenmikroskopie unterzogen. Eine Teilmenge von jeder Proteinfraktion wurde 24 Stunden
in 6,25% Glutaraldehyd in o,o67 M Kakodylat-Puffer eines pH-Wertes
von 7,3 gemischt. Die Proben wurden 5 Minuten in gekühltem o,25 M Kakodylat oder Phosphat-Puffer gewaschen, enthaltend ein
Prozent OsO. eines pH-Wertes von 7,3 für 2 STunden. Anschliessend wurden alle Proben dihydriert durch Fliessenlassen durch eine ge eichte
Reihe von Alkohol und eingebettet in entweder Epon oder Araldit. Abschnitte von 0,06 bis o,o9 um wurden geschnitten und
609825/0849 "34-
in einer 4%-igen wässrigen Uranylacetat-Lösung gebeizt und durch
ein Phillips Em-3oo-Elektronenmikroskop fotografiert.
Eine Fraktion, die die höchste Bindung mit dem markierten HCGzeigte,
eine niedrige Enzym-Aktivität und reine Plasma-Membranen entläLt,
wie durch Elektronenmikroskopie dargestellt, wurde bei einer Sucrose-Dichte von 1,16 (ca. 35% w/v), elutiert. Geeignete
Teilmengen dieser Fraktion wurden in flüssigem STickstoff gelagert, und als der liEzeptor verwendet.
III. Verfahren der RÄ.diorezeptoruntersuchung
Die RAdi ore ζ ep torunter suchung wurde in Io χ 75 ml Polystyrol-Rohren
gemäss dem in Tabelle I angegebenen Protokoll ausgeführt.
Probe
Verdünnungsmittel"
Plasma-Membranen-Protein: 4o ug
Blindprobe -loo ul HCG3 Cng/ml)
3.ο loo ul
6.2 loo ul
12.5
25. ο
5o.o
loo ul loo ul loo ul
609825/084
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul
loo ul loo ul loo ul loo ul loo ul
-35-
loo.o
loo ul
Plasma (Verdünnt 1:2 bis
1 : 5o ) loo ul
loo ul
loo ul
loo ul loo ul
Io mM Tris-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 7.2 , enthaltend
ο,Ι % BSA, 1 mM CaCl2 und 2o I. U. Trasylol pro Rohr.
Ungefähr (1.5 ng = 5o.ooo cpm).
12.ΟΟΟ I.U. pro mg (7).
Das Protokoll zur gleichzeitigen Radiorezeptoruntersuchung von hPRL und hCG. ist in Tabelle Ia dargestellt.
| nicht markiertes Hormon | hCG | l5 | Plasma- _ Membranen |
markiertes mon |
Hör- | f | Kontroll- Plasma |
| hPRL | lOO J | 125I-hPRL | 13lI-hCG | ||||
| 1OO/415 | o,2 | lOO J4I | lOO jU-1 | loo uu 1 | 5o 1 | ||
| loo.o | O7 4 | 49 | |||||
| 5o.o | 5 /08 | ||||||
| 60982 | \ | \ | -36- | ||||
254888-8
| 25.ο | ο.8 |
| 25.5 | 1.6 |
| 6.3 | 3.2 |
| 3.2 | 6.3 |
| 1.6 | 12.5 |
| ο.8 | 25.ο |
| ο.4 | 5ο.ο |
| ο.2 | loo.ο |
Wiederholte Verdünnung,beginnend bei loo ng in loo 1 , ausgeführt
in Inkubations-PUffer.
Etwa loo g Protein von Plasma-Membranen isoliert aus schwangerer
Kuh, Korpora-Lutea.
1 2R ι ο -ι
I-hPRL (6.Ο-7Ο.ΟΟΟ cpm/Rohr) und OJ-I-hCG (25-3o.ooo cpm/Rohr)
ausgeführt in Inkubations-Puffer.
Plasma aus vollstänixg hypophysektonisierten Versuchstieren,
die nicht feststellbare Pegel von hPRL und hLH in jeweiligen Radioimmununtersuchungen zeigen.
5 Inkubations-Puffer: Io mM Tris-Puffer,, pH-Wert 7.2 enthaltend
125/0 84 9 ' ~37~
-37-1 mM MgCl2 , CaCl2 , ο.1% (w/v) BSA, und 5ο IU von Trasylol.
In Tabelle I wurde die Inkubation 3o Minuten lang bei 37° C in einer Dunaboll-Wasserbad-Schüttelvorrichtung ausgeführt.
Ein ml von gekühltem Verdünnungsmittel wurde dann jedem Rohr zugesetzt. Die InhAte der Rohre wurden in einem Wirbelmischgerät
gemischt und 2o Minuten lang bei 3.ooo xg in einer gekühlten Sorvall-Zentrifuge (Modell RC2B; Rotor Typ HS-4) zentrifugiert.
Der Überstand wurde abgesaugt und die Kügelchen in einem Packard-
125 Autogamma-Zähler mit einem 51% Wirkungsgrad für I gezählt.
Die Standard-Kurven und die hormonelle Konzentration in den
Plasma-Proben wurde durch einen parallel arbeitenden IBM-Computer unter Verwendung von Logit-Log-Umsetzungen berechnet.
Durch den Bereich der Untersuchung,um somit die Augenscheinlichkeit
der REproduzierbarkeit der Untersuchung vorzusehen. Die Plasma-Probe von einer schwangeren Frau zeigte Dosenreaktion, identisch
der HCG-Norm, das die Gütigkeit der Untersuchung bestätigt. Es bestand ein vollständiger Mangel an Querreaktion mit hochgereinigten
Herstellungen von FSH, PRL und HPL als auch Plasma von hypothyreotischen Patienten, Mcromegalen und Frauen während
postpartualer Laktation, um dadurch eine hohe SpezLfizität der
Radiorezeptoruntersuchung anzuzeigen. Die Radiorezeptoruntersuchung unterschied nicht zwischen HCG und LH; jedoch eine Radioimmun-
125
untersuchung , die I markiertes FSH und LH und HCG und Antikörper zu ihren HOrmon-spezifischen Beta-Untereinheiten verwendet,
haben gezeigt, daß es während zeitiger Schwangerschaft keinen
Anstieg in den Plasma-Pegeln von LH und FSH gibt. Somit beeinträchtigt
der Mangel an Unterscheidung zwischen HCG und LH nicht die
-38-
609825/0349
Bestimmung von Schwangerschaft, wenn die Radiorezeptoruntersuchung
verwendet wird.
125
Bindung von I-hPRL an ovarielles Homogenat.
Bindung von I-hPRL an ovarielles Homogenat.
Ein Reaktionsgemisch, enthaltend loo ul von Inkubations- Puffer,
enthaltend Io IU Trasylol (FBA Pharmaceuticals, New York, New York), 5o ul von Rezeptor-Herstellung Äquivalent zu l-3oo ug
125
von Protein und loo ul von I-hPRL (SA; 5o-7o uCi/ug)
von Protein und loo ul von I-hPRL (SA; 5o-7o uCi/ug)
wurden bei 37° C 2 Stunden lang bei der Abwesenheit oder in der Anwesenheit von 1 ug von nichtmarkiertem Rinder-PRL inkubiert.
Am Ende der Inkubation wurde 1 ml von eiskaltem Puffer zu allen Rohren zugesetzt und die Rohre wurden bei 5.ooo U/min 2o Minuten
lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt. Die Kugel-
I*
chen, die rezeptorgebundene Hormone enthalten, wurden in einem
125
Automamma-Zähler mit einem 51%-igen Wägungsgrad für I
(Packard Instrument Company, Downers Grove, Illinois) gezjiählt.
Spezifische Bindung wurde als der Unterschied von Bindung in den Rohren mit und ohne nichtmarkiertem PRL berechnet.
125
Spezifische Bindung von I-hPRL an Plasma-Membrane von Finder Korpora-Lutea war ein sättigbarer Prozess. Die Sättigung wurde demonstriert durch Inkubation von Plasma-Membrane von Rinder-Korpora-Lutea (15o ug Protein) bei 37° C für 2 Stunden
Spezifische Bindung von I-hPRL an Plasma-Membrane von Finder Korpora-Lutea war ein sättigbarer Prozess. Die Sättigung wurde demonstriert durch Inkubation von Plasma-Membrane von Rinder-Korpora-Lutea (15o ug Protein) bei 37° C für 2 Stunden
125
in 25o ul Volumen mit variierenden Konzentrationen von I-hPRL.
-39-
609825/0849
Bindungskapazität /mg von Protein und Kd,berechnet durch Scatchard-Analyse
von Daten, erhalten von der Sättigungskurve , betrugen 1.4 χ lo~13 m und Kd = 1.4 χ lo"12.
125
Spezifische Bindung von I-hPRL an ovaiielle Homogenate nahm zu als eine Punktion des Betrages von zugesetzten Homogenaten und wurde durch den Zusatz von l.ug nicht-markiertes Rind-PRL an die Inkubationsgemische verhindert. Unter Verwendung von loo ug von
Spezifische Bindung von I-hPRL an ovaiielle Homogenate nahm zu als eine Punktion des Betrages von zugesetzten Homogenaten und wurde durch den Zusatz von l.ug nicht-markiertes Rind-PRL an die Inkubationsgemische verhindert. Unter Verwendung von loo ug von
125
Homogenat , etwa 2o - 3o% des I-hPRL wurde in der Abwesenheit von nichtmarkiertem PRL gebunden.
Homogenat , etwa 2o - 3o% des I-hPRL wurde in der Abwesenheit von nichtmarkiertem PRL gebunden.
Bei 37° C war die Bindung während der ersten 3o Minuten schnell; danach nahm die Bindung langsam zu , um bei 2 Stunden ein Gleichgewicht
zu erreichen. Bei o° C wurde geringe Bindung beobachtet, selbst nach 18 Stunden Inkubation.
125
Um die Spezifizität von I-hPRL-Bindung an ovarielle Homogenate zu demonstrieren, wurden menschliches Wachstumshormon (hGH), menschliches Follikel stimulierendes Hormon (hFSH), menschliches luteinisierendes Hormon (hLH)/ Rindsprolaktin (bPRL), Ovinprolaktin toPRL) und menschliches Chorionsomatomammotropin (hCS) bei ver-
Um die Spezifizität von I-hPRL-Bindung an ovarielle Homogenate zu demonstrieren, wurden menschliches Wachstumshormon (hGH), menschliches Follikel stimulierendes Hormon (hFSH), menschliches luteinisierendes Hormon (hLH)/ Rindsprolaktin (bPRL), Ovinprolaktin toPRL) und menschliches Chorionsomatomammotropin (hCS) bei ver-
125 schiedenen Konzentrationen inkubiert. Keine Verschiebung von I-hPRL
gebunden an Rezeptor-Protein wurde beobachtet durch hFSH und hLH.
125
hCS und hGH waren in der Lage, Rezeptor-gebundenes I-hPRL zu verschieben,
jedoch die Potenz von hGH-Präparat beim Verschieben von
125
Rezeptor-gebundenem I-hPRL betrug annähernd o,5 bis 1 % von hPRL. Rind- und Ovin-PRL-Präparate wurden dargestellt, im wesentlichen
Rezeptor-gebundenem I-hPRL betrug annähernd o,5 bis 1 % von hPRL. Rind- und Ovin-PRL-Präparate wurden dargestellt, im wesentlichen
125 von ähnlicher Potenz beim Konkurrieren mit I-hPRL zu sein.
8 0 9825/08 A 9 -4o-
Ein Mangel an Konkurrenz durch FSH und PRL für Rezeptorbindung demonstriert PRL Spezifizität für die Rezeptorstelle hCs, welche
sowohl strukturelle als auch biologische Ähnlichkeiten zu PRL aufweist, zeigte eine Querreaktion; jedoch die Querreaktionsfähigkeit
von o,5bis 1 % beobachtet mit dem hGH-Präparat ist übereinstimmend mit der berichteten Verunreinigung von hGH auf einen
sehr ähnlichen Grad.
IV. Klinische Tests
loo Patienten , die überfällig für die ersten erwarteten Menstruationen
und potentielle Kandidaten für Miniabort waren, hatten Blutproben für die Radiorezeptoruntersuchung gezogen und 24 Stunden
urin für den Agglutinationstest gesammelt (Pregnosticon-Dri-Dot-Test).
Physikalische und Beckenprüfung , Wechsel in der Gebarmuttergröße und - Konsistenz und anderer Symptome einer möglichen Schwangerschaft
wurden bewertet. Wenn die Radiorezeptoruntersuchung positiv war, wurde ungeachtet eines positiven oder negativen Pregnosticon-Teebs
ein Miniabort ausgeführt. Alle Proben wurden dem pathologischen Laboratorium geschickt, um das Vorhandensein von Schwangerschaft
zu bestätigen. Drei Patienten abortierten Spontan und drei , die ektopische Schwangerschaft entwickelten, werden getrennt besprochen.
Die Blutproben wurden mit 2.5oo U/min bei 4o° C 15 Minuten lang
zentrifugiert, und das Plasma oder Serum wurde bis zum Verwenden
bei -2o° C gespeichert.
Die Radiorezeptoruntersuchung für HCG im Blut wurde 77 mal für 72 Patienten ausgeführt, um das Vorhandensein zeitiger Schwanger-
-41- 609825/08 A 9
schaft festzustellen. Die Genauigkeit des Tests wurde durch Vergleichen
dessäben mit dem Pregnosticon-Dri-Dot-Test bestimmt, das Vorhandensein
von Schwangerschaft wurde durch diehistopathologische Prüfung
von endometrialen Proben bestätigt, die bei wahlweisem oder spontamen
Abort erhalten wurden .Die üblichen klinischen Kriterien , z.B. der
vergrößerte Uterus oder das Aussetzen der Menstruation sah weitere Klarheit vor, um die Genauigkeit der Radiorezeptoruntersuchung zu
bestätigen.
41 Patienten zeigten eine negative RAdiorezeptoruntersuchung und 1 falsches, positives Pregnosticon-Ergebnis war mit dieser Gruppe
verbunden. Alle 41 Patienten wurden durch weitere, klinische Beobachtungen
als nichtschwanger bestätigt.
In 14 Fällen von Abort bestätigte die pathologische Diagnose des extrahierten Gewebes das Ergebnis der RAdiorezeptoruntersuchung.
7 der 14 Miniaborte , die desituales oder plazentales Gewebe demonstrierten, welches die Schwangerschaft bestätigten, hatten
eine positive Radiorzeptoruntersuchung, aber negativen Pregnosticon-Test.
Der Pregnosticon-Test war auch nicht empfindlich genug, um die zeitige
Schwangerschaft festzustellen, wohingegen die Radiorezeptoruntersuchung in der Lage war, eine Schwangerschaft so zeitig wie vier
der Ovulation folgenden Tage festzustellen und bewies einen großen
Wert in Fällen von befürchtetem Abort. Vier zeitig befürchtete Aborte
innerhalb der ersten 7 Wochen der Schwangerschaft demonstrierten positive Reaepjtitoruntersuchungen, aber zur gleichen Zeit negativen
609825/0849
-42-
Pregnosticon-Test. Die Patienten abortierten in jedem Fall spontan,
die Uterin-Inhalte wurden zurückgewonnen und zeigten chorionisches
Gewebe. In den vier Schwangerschaften , welche in spontanem Abort endeten, setzte das Verfärben Io - 14 Tage fort, und der Uterus
war für die Dauer der Schwangerschaft nicht ausreichend vergrößert, was eine Abnormali tat im Wachstum und der Entwicklung des Embrios
und der Plazenta deutet.
Von 2o Patienten, die die Schwangerschaftsklinik besuchten, wurden
täglich während des menstrualen Zyklus für die Bestimmung von FSH und LH durch Radioimmununtersuchung Blutproben entnommen.
Auf der Basis von BBT , Plasma-Pegel von FSH und LH urinäre Ausscheidung
von östrogen und Progesteron und charakteristische Änderungen in der servikalen Schleimhaut als Anzeichen von Ovulation
wurde diesen Frauen mitgeteilt, schwanger zu werden.Die Blutproben
von 4 dieser Frauen, die schwanger wurden, wurde analysiert , um die Pegel von HCG durch die Radiorezeptoruntersuchung nachzuweisen,
und die Pegel von FSH und LH durch Radioimmununtersuchung an dem Tag der Ovulation und während der zeitigen Schwangerschaft. Der
Tag der Ovulation bei diesen 4 schwangeren Frauen wurde anschliessend durch FSH und LH-BeStimmung in dem Blut bestätigt. Eine Gesamtzahl
von 15 normalen Schwangerschaften wurde während des Zeitraumes getestet,der die OVulation und zeitige Schwangerschaft umfasst.
Eine Zusammenfassung aller behandelten Patienten wird in Tabelle II
vorgelegt.
-43-
609825/08
Nummer den aussetzenden Men- Raiorezeptor- Agglutinations·
struationen folgende untersuchung Test -Urin Tage Blut
| Miniaborte | 8- | 11 | 14 | - 33 |
| 3 | 6- | 14 | O | - 42 |
| 8 | 1- | 11 | ||
| 5* | normale Schwan gerschaften |
|||
| 8 | ||||
| 7 |
mögliche ektopische S chwangerschaften
1 14
spontaner Abort 3 5 ·' 17
nichtschwanger 43 ο - 4o 1
5 Micht-Schwangerschaften wurden zweimal berichtet.
609825/0849
2548888
Das Folgende sind zusätzlich fallhistorische Zusammenfassungen,
welche dazu dienen, den Wert der Radiorezeptoruntersuchungstechnik weiter zu veranschaulichen.
Eine 23 Jahre alte Para III, Gravida IV wurde acht der ausbreitenden
menstrualen Periode folgenden Tage gesehen. Der Pregnosticon-Urin-Test
war negativ, und die Radiorezeptoruntersuchung positiv. Ein am folgenden Tag ausgeführter Miniabort demonstrierte plazentales
Gewebe.
Eine 2o Jahre alte Nulligravida hatte eine intrauterine Vorrichtung
eingesetzt, und neun Monate später darin die Menstruationen neun Tage zu spät; die Radiorezeptoruntersuchung war positiv. Diese
Untersuchung war zwei Tage später wieder positiv, und ein Miniabort zeigte chorionisches Gewebe. Zwei an denselben TAgen ausgeführte
Pregnosticon-Tests waren negativ.
Eine 28 Jahre alte Nulligravida mit einem 28-Tage-Zyklus war
17 Tage zu spät mit den Menstruationen; die Radiorezeptoruntersuchung war positiv und der Pregnosticon-Test war negativ. Mehrere
Tage später trat ein spontaner Abort ein. Drei Monate später wurde sie wiedergesehen, 5 Tage nach der ersten ausbleibenden Menstrual-Periode;
wieder war die RAdiorezeptoruntersuchung positiv, und der Pregnosticon-Test war negativ. Der Uterus hörte auf zuzunehmen,
schwarze Verfärbung begann und hielt an, bis ein spontaner Abort
wieder eintrat, vier Wochen nach dem ausbleibenden Zyklus.
—45—
60 98 2 5/08A9 '
Gewebeuntersuchiong des zweiten Aborts zeigte eine amniotische
Tasche, ohne Fötus.
In einem anderen Fall wurde eine 3o Jahre alte Gravida I gesehen, 12 Tage nach einem ausgebliebenen Zyklus. Zu dieser Zeit war
die Raiorezeptoruntersuchung positiv und der Pregnosticon-Test
war negativ. Nach 2 Wochen unregelmässiger Färbung und fraglicher Uterin-Vergrößerung trat spontaner Abort ein.
Bei 2 Patienten, bei welchen ektlfopische Schwangerschaft vermutet
wurde, zeigte eine eine positive Radiorezeptoruntersuchung und die andere einen negativen Test. Der Ersteren wurde bestätigt, eine
nichtrupturierte Eileiter-Schwangerschaft zu haben. Beide hatten negative Pregnosticon-Tests. Das Folgende ist eine kurze Darstellung
der ektxopischen Schwangerschaft: Eine 4o Jahre alte Para I, Gravida I ließ einen menstrualen Zyklus aus, und unmittelbar danach
entwickelten sich schwache, untere Abdominal-Schmerzen und vaginale Flecke, welche 2 Wochen lang anhielten. Der Hämagglutinations-Inhibitions-Rohr-Test
war an dem der Aufnahme folgenden Tage negativ. Die Radiorezeptoruntersuchung am 2. Tag war positiv. Am 3. Tag
zeigte Kürettage kein Vorhandensein der Schwangerschaft; Cul-De-Sac-Punktur
war negativ, Laparoskopie zeigte eine nichtrupturiert gelassene ektopische Schwangerschaft, welche an der folgenden
Laparotomie entfernt wurde.
-46-
60 98 25/0849
13 Patienten wurden wegen befürchteter , ektxopischer Schwangerschaft
insKrankenhaus eingeliefert. Die letzte, menstruale Periode reichte von 23 bis 76 Tagen vor der Einlieferung. Niedriger,
abdominaler Schmerz, Amenorrhöe,häufige vaginale Verfärbung und
eine adnexale Masse waren die üblichen Feststellungen. Plasma-Proben wurden von jedem Patienten vor dem chirurgischen Eingriff
erhalten, und in einem Fall an vier getrennten Tagen für die Radiorezeptoruntersuchung
von HCG . Herkömmliche Hämagglutinations- oder Latex-Tests wurden auf Urin-Proben zur selben Zeit durchgeführt.
Die Ergebnisse der Schwangerschafts-Tests und pathololischen Feststellungen werden in Tabelle III dargelegt.
VERGLEICH VON SCHWANGERSCHAFTSTESTS UND PATHOLOGISCHEN FESTSTELLUNGEN
BEI DREIZEHN BEFÜRCHTETEN EKT^OPISCHEN SCHWANGERSCHAFTEN
Radiorezeptor- Agglutinationsuntersuchung Test
Pathologie Eileiter ektopische
Schwangerschaft
Tage nach den letzten Menstruationen
7 positiv
3 positiv
1 negativ
2 negativ
7 nega/tiv
3 positiv
1 positiv
2 negativ
7 positiv
3 positiv
1 negativ
2 negativ
21,23,24,36 41,51,76
29,61,65
unbekannt
3o,48
609825/0849
-47-
Tabelle III gibt die Ergebnisse an, erhalten durch die Radiorezeptoruntersuchung
und HämagglutineÜons-Test in den 13 befürchteten
ektopischen Schwangerschaften und außerdem die Zeit von den letzten Menstruationen und die histologischen Eileiter-Feststellungen.
7 von Io ektopischenSchwangerschaften hatten eine positive Radiorezeptoruntersuchung
und negativen Hämagglutinations-Schwangerschafts-Test. Ein falscher, positiver Hämagglutinations-Test und
keine falsche, positive Radiorezeptor-Untersuchungen wurden erhalten. Es gab einen weiten Bereich für die Dauer der Schwangerschaft,
reichend zwischen 23 und 76 Tage nach der letzten ausgebliebenen Periode.
Die Logit-Log-Umsetzung von Standard HCG dosenempfindlicher Kurve ergab eine Empfindlichkeit von o,3 ng oder 3 mIU/HCG/ml (Fig. 2).
In dieser Fig. ist TSH der erläuternde Text für Plasma von hypothyreotischen
Patienten; HGH, Plasma von akromegalen Patienten; PRL, Plasma von Frauen mit paeff-partualer Laktation. mlU vom
2. Internationalen Bezugspräparat Äquivalent dem entsprechenden ng von HCG sind auf der Ordinate angegeben. Verschiedene Verdünnungen
der Plasma-Probe von einer schwangeren Frau ergab eine Neigung parallel zu der von HCG, das die Gültigkeit der Untersuchung
angibt. Es gab keine Querreaktion mit FSH, TSH, HGH , und HPRL in der Untersuchung. Es gab eine 98 - Io2%-ige Rückgewinnung
von HCG, zugesetzt zu den Plasma-Proben von bekannter , hormoneller Konzentration. Die Intra- und Inter-Untersuchungsvariation bei den
Schätzungen von hormonellen Pegeln von Plasma-Behältern betrug
-48-
809828/0849
6% bzw. 11%. Jedoch die»Radiorezeptoruntersuchung unterschied nicht
zwischen LH und HCG. Dieser Nachteil wird umgangen durch die Beobachtungen 1), daß weder LH noch FSH anstieg, während zeitiger
Schwangerschaft , bestimmt durch spezifische Beta-Untereinheit
Radioimmununtersuchung von-FSH, LH und HCG in dem Blut bestimmt
wurde, 2) daß die Normgrößen denselben Betrag von Plasma enthalten,
das von nichtschwangeren Frauen während lutealer Phase erhalten
wurde, enthaltend niedrige Pegel von LH, 3) daß alle unbekannten Proben mit einemPlasma-Becken von nichtschwangeren Frauen verglichen
werden und verschiedene Verdünnungen von Plasma-Becken von schwangeren
Frauen rotinemässig analysiert werden, mit jeder Untersuchung
für Genauigkeits- und Qualitäts-Kontrolle und 4) schließlieh,dass
während zeitiger Schwangerschaft die HCG-LH-Pegel zwei bis dreimal
höher sind, als basale LH-Pegel bei nichtschwangeren Frauen während der lutealen Phase.
In Fig. 3 werden die HCG-Pegel bei Io ektopischen Schwangerschaften
mit normaler intrauteriner Schwangerschaft bei 2 Patienten verglichen (H.D., R.S.) und 1 induzierten Ovulation und Schwangerschaft
(S.L.) mit lo.ooo IU von HCG , welches mit Radiorezeptoruntersuchung
überwacht wurde. Die Plasma-Pegel von HCG während zeitiger induzierter oder natürlicher Schwangerschaft darin ähnlich.
Der Tag der Schwangerschaft war basiert auf der von den Patienten berichteten letzten menstrualen Periode. Bei einem der
Io Patienten (Δ ... .^ ) , wurde die RAdiorezeptoruntersuchung
an den Tagen 21„24,3o und 42 der Schwangerschaft ausgeführt.
-49-
609325/0849
Die positiven Radiorezeptoruntersuchungen an den Tagen 21 und wurden mit negativen Pregnosticon-Tests in Verbindung gebracht.
Der Beginn des HCG-Anstieges , folgend auf die LH-Spitze wurde zuerst in den Blutproben festgestellt, die zuerst am der Ovulation
folgenden Tag 6 bis 8 erhalten wurden,und es mag zeitiger der
Befruchtung folgend sein. Drei der ektopischen Schwangerschaften hatten Untersuchungen ausgeführt vor den ersten ausbleibenden
Menstruationen und die Pegel von HCG bei 4 waren in dem Bereich der normalen Schwangerschaft. Die anderen 6 ektopischen HCG -Pegel
waren niedriger als die normalen. Diese Beobachtungen legten nahe, daß die zeitigen Nidationen in dem Eileiter , bevor der Ruptur
und Hämorrhagie normale Mengen von HCG schaffen könnten. Später jedoch , wenn HämorrhagieιzunehmendeAusscheidung und verminderte
Blutzufuhr eintrat, sank die HCG - Ausscheidung ab.
Wie in Fig. 3 dargestellt, betrug in den vorliegenden Fällen von 13 befürchteten ektopischen Schwangerschaften das HCG 22 und 35 ng
/ml oder o,26 bzw. o,42 IU in 2 der 13 Fälle. Die Ermittlung von
HCG auf diesem niedrigen Pegel unterstützte die richtige Handhabung des Patienten zu einem zeitigen Stadium. Die übrigen Patienten
hatten Beträge von kleiner als loo ng /ml. Die Pegel von HCG an den
Tagen 2l,24,3o und 42 der Schwangerschaft (Fig. 3) wurden von demselben Patienten erhalten. Der anfängliche Test war begleitet von
einem negativen Pregnosticon-Test ; wohingegen beide Tests auf 3 anschliessende Bestimmungen positiv waren. An dem 64. Tag war
wegen einer rupturierten , rechten ektopischen Schwangerschaft abdominale Intervention erforderlich.
-5o-
60 98 25/0849
Claims (49)
- -51-Patentansprücheij Verfahren zur Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropins CHCG,)luteinisierendem HOrmon (LH) oder HCG-ähnlichem Material, in einer wässrigen Probe , umfassend die Vorgänge vom in-Bertihrungfaringen der Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, wahlweise das HOrmon zu binden, Vorsehen einer Anordnung zum Anzeigen, ob die Bindung stattgefunden hat und Beobachten der anzeigenden Anordnung , um das Vorhandensein des HORmons in der Probe zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel in der Lage ist, wahlweise das HORmon zu binden,das ein Plasma-Membranen-Extrakt von dem Korpus-Luteum einer Art ist, die den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin besitzt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzeigeanordnung eine RAdiountersuchungs-Meßanordnung enthält.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß die RAdiountersuchungs-Meßanordnung radioisotopisch markiertes, menschliches Choriongonadotropin enthält.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3,dadurch gekennzeichnet, daß die Vorgänge des Vorsehens und Beobachtens der anzeigenden Anordnung das in-Berührung-bringen des Rezeptors und der Probe in^ der Anwesenheit von radioisotopisch markiertem , menschlichen Choriongonadotropin enthält, wodurch ein Teil des markierten HOrmohs609825/0849 _52_und ein Teil des nichtmarkierten HORmons , das in der PRobe vorhanden ist, an den Rezeptor gebunden werden, das Trennen der rezeptorgebundenen Hormone von den ungebundenen Hormonen in der wässrigen Probe und das Messen der RAdioaktivität wenigstens des abgeschiedenen R2!eptors oder der wässrigen Probe , um die Konzentration des HORmons aus einerFunktion der gemessenen RAdioaktivität zu bestimmen.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4,dadurch gekennzeichnet, daß das radioisotopisch markierte HOrmon mit einem Isotop von der Gruppe markiert ist, die aus I, I, H und C besteht.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeic h-125
net, daß das Isotop I ist. - 7. Verfahren nach Anspruch 4,dadurch gekennzeic hn e t , daß die Probe eine Körperflüssigkeit einer Frau ist, vonder erwartet wird, schwanger zu sein, und wodurch die Erkenntnisse des Verfahrens eine Bestimmung des schwangeren Zustandes vorsehen.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7,dadurch gekennzeic hn e t , daß die Körperflüssigkeit aus Blutserum oder URin gewählt wird.
- 9. Verfahren nayich Anspruch 8, dadurch gekenhzeichn e t , daß die Körperflüssigkeit Blutserum ist.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9,dadurch gekennzeic hn et , daß das Blutserum in einem Betrag von etwa o,l ml verwendet wird.-53- 609825/084 9
- 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der REzeptor von dem Korpus-Luteum eines Säugetieres erhalten wird.
- 12. Verfahren nach Anspruch 11 ,dadurch gekenn' ze ichn e t , daß der Rezeptor von dem Korpus-Luteum einer Kuh , eines Schafes, eines Schweines oder eines Pferdes erhalten wird, keine Ratte.
- 13. Verfahren nach Anspruch 12,dadurch gekennzeichnet , daß der REzeptor von dem Korpus-Luteum einer Kuh erhalten wird.
- 14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der REzeptor durch ein Verfahren erhalten wird, das die Vorgänge des Hersteilens fein verteilten Gewebehomogenates von Korpus-Luteum -Gewebe enthält, das Ausscheiden der Plasma-Membranen von dem Homogenat und Wählen derPlasmamembranen-Fraktion, die in der Lage ist, wahlweise biologisch aktives, menschliches Choriongonadotropin zu binden.
- 15. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß der REzeptor von dem Ovar einer schwangeren Frau eiferten wird.
- 16. Verfahren nach Anspruch 15,dadurch gekennzeichnet , daß sich die Frau in dem ersten Quartal der-54-60 93 25/0849-54-Schwangerschaft befindet.
- 17. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet , daß die Probe eine Körperflüssigkeit eines weiblichen Säug=bieres ist, wodurch die Ergebnisse des Verfahrens eine Bestimmung des Zustandes der Schwangerschaft vorsehen.
- 18. Verfahren nach Anspruch 17,dadurch gekennzeichnet , daß die Körperflüssigkeit aus Blut oder Urin gewählt ist.
- 19. Reagenz für reζeptor-chemische Bestimmung des Hormons menschliches Choriongonadotropin , gekennzeichnet d u r c h die spezifische Fraktion von Plasma- Membranen-Extrakt in im wesentlicher reiner Form einer Art, die den Rezeptor für das Hormon menschliches Choriongonadotropin aufweist, wobei die Fraktion in der Lage ist, biologisch aktives , menschliches Choriongonadotropin wahlweise zu binden.
- 20. Verfahren füijdie Herstellung einer Reagenz für rezeptorchemische Bestimmung des HOrmons menschliches Choriongonadotropin, gekennzeichnet du rch die Arbeitsgänge des Hersteilens eines fein verteilten Gewebehomogenats von Korpus-Luteum-Gewebe einer Art, die den Rezeptor für menschliches-55-609825/0849Choriongonadotropin aufweist, das Abscheiden der Plasma-Membranen von dem HOmogenat und Auswählen der Plasma-Membranen-Fraktion, die in der Lage ist, biologisch aktives , menschliches Choriongonadotropin wahlweise zu binden.
- 21. Anordnung zur Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropins (HCG), luteinisierendem HORmon (LH) oder HCG-ähnlichem Material in einer wässrigen Probe, gekennzeichnet, durcha) eine erste Reagenz und eine zweite Reagenz;b) die erste Reagenz enthält in im wesentlichen reiner Formdie spezifische Fraktion des Plasma-Membranen-Extrakts von dem Korpus-Luteum einer Art, die den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin aufweist, das in der Lage ist, biologisch aktives , menschliches Choriongonadotropin wahlweise zu binden;c) die zweite Reagenz markiertes, menschliches Choriongonadotropin enthält, das in der Lage ist, Strahlung abzugeben, die erste Reagenz beabsichtigt wird, mit der Probe in Berührung gebrachtzu werden, die das zu messende Hormon enthält und mit der zweiten Reagenz um einen Teil des markierten und nichtmarkierten HOrmons an den Rezeptor zu binden;d) Anordnung zum Messen des Betrages des markierten HORmons, das. an den Rezeptor gebunden ist, wobei die davon abgegebene Strahlung-56-60982 5/0849eine Funktion der Konzentration des HORmons in der wässrigen Probe ist.
- 22. Anordnung nach Anspruch -21, dadurch gekenn zeichnet , daß sie in der Form einer Ausrüstung ist.
- 23. Verfahren zum Bestimmen des Hormons Prolaktin (PRL) in einer wässrigen Probe, gekennzeichnet durch das in-Berührung-bringen der Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, das HORmon wahlweise zu binden, wobei das Mittel ein Plasma-Membranen-Extrakt von dem Korpus-Luteum einer Art ist, die den Rezeptor für Prolaktin besitzt, das Vorsehen einer Anordnung zum Anzeigen, ob die Bindung stattgefunden hat, und Beobachten der anzeigenden Anordnung, um das Vorhandensein des HOrmons in der Probe zu bestimmen.
- 24. Verjähren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die anzeigende Anordnung eine Radiountersuchungs-Meßanordnung enhäfc.
- 25. Verfahren nach Anspruch 24,dadurch gekenn-z ei c h η e t , daß die Radiountersuchungs-Meßanordnung radioisotopisch markiertes Prolaktin enthält.
- 26. Verfahren nach Anspruch 25,dadurch gekennzeichnet , daß die Arbeitsgänge des Vorsehens und Beobachtens der anzeigenden Anordnung das in-Berührung-bringen des Rezeptors und der Probe in der Anwesenheit von radioisotopisch markiertem Prolaktin enthält, wodurch ein Teil des in der Probe vorhandenen-58 - 609825/0849S7markierten Hormons und ein Teil des nichtmarkierten HOrmons an den Rezeptor gebunden werden, das Trennen der rezeptorgebundenen Hormone von den ungebundenen Hormonen in der wässrigen Probe und das Messen der Radioaktivität wenigstens des getrennten Rezeptors oder der wässrigen Probe um die Konzentration des Hormons als eine Funktion der gemessenen Radioaktivität zu bestimmen.
- 27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß das radioisotopisch markierte Hormon mit einem Isotop aus der Gruppe markiert ist, die aus I, I, 3H und14C besteht.
- 28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzei ch-125
net , daß das Isotop I ist. - 29. Verfahren nach Anspruch 26,dadurch gekenn-z ei c h η e t , daß die Probe eine Körperflüssigkeit einer Frau ist, von der vermutet wird, schwanger zu sein und wodurch die Ergebnisse des Verfahrens eine Bestimmung des Schwangerschaftszustandes vorsehen.
- 30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet , daß die Körperflüssigkeit aus Blutserum oder Urin gewählt wird.-59-60982b/0849-JS-9- $*
- 31. Verfahren nach Anspruch 3o,dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Blutserum ist.
- 32. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor von dem Korpus-Luteum eines Säugetieres erhalten wird, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Kuh, einem Schaf, einem Schwein und einem Pferd besteht.
- 33. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß der Rezeptor durch ein Verfahren erhalten wird, das die Arbeitsgänge des Hersteilens eines fein zerbröckelten Gewebehomogenats von Korpus-Luteum-Gewebe enthält, das Trennen der Plasma-Membranen von dem Homogenat und Wählen der Plasma-Membranen-Fraktion, die in der Lage ist, biologisch aktives PRL wahlweise zu binden.
- 34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichn e t , daß der Rezeptor von einer schwangeren Frau in dem ersten Quarial der Schwangerschaft erhalten wird.
- 35. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung einer Anzahl von Hormonen in einer einzigen wässrigen Probe, gekennzeichnet durch das in-Berührung-bringen der Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, jedes der HORmone in der Probe wahlweise zu binden, wobeijdas Mittel ein Plasma-Membranen-Extrakt von einem Körperorgan einer At ist, welches den spezifischen Rezeptor für jedes der Hormone in dem Organ besitzt, Vorsehen einer getrennten unterscheidbaren Anordnung für jedes zu bestimmende Hormon,60982 5/0849 ~6o~-6*9-zum Anzeigen, ob die Bindung stattgefunden hat, und BEobachten jeder der anzeigenden Anordnung, um das Vorhandensein von jedemder Hormone zu bestimmen.
- 36. Verfahren nach Anspruch 35,dadurch gekennzeichnet , daß die auf der Probe zu bestimmenden Hormone menschliches Choriongonadotropin (HCG) und Prolaktin (PRL) enthalten, und worin das Bindemittel einen Plasma-Membranen-Extrakt von dem Korpus-Luteum einer Art enthält, die den REzeptor für HCG und PRL besitzt.
- 37. Verfahren nach Anspruch 36,dadurch gekennzeichnet, daß die anzeigende Anordnung eine Radiountersuchungs-Meßanordnung enthält.
- 38. Verfahren nach Anspruch 37,dadurch gekennzeichnet, daß die Meßanordnung radioisotopisch markiertes HCG und ein verschieden radioisotopisch markiertes PRL enthält, wobei die Isotope zum Markieren von HCG und PRL verschieden sind.
- 39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet , daß die Arbeitsgänge des Vorsehens und Beobachtens der Anzeigeanordnung das in-Berührung-bringen des REzeptors und der Probe in der Anwesenheit des radioisotopisch markierten HCG und des radioisotopisch markierten PRL enthalten, wodurch ein Teil von jedem der in der Probe enthaltenen markierten HOrmone und ein Teil der nichtmarkierten HOrmone an den Rezeptor gebunden werden, Trennen der rezeptorgebundenen Hormone von den nichtgebundenen60982B/0849 "61"Hormonen in der wässrigen Probe und Messen der Radioaktivität für\jedes der Isotope von wenigstens dem abgeschiedenen Rezeptor oder der wässrigen Probe, um die Konzentration jedes der HORmone als eine Funktion der gemessenen Radioaktivität zu bestimmen.
- 40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet , daß radioisotopisch markiertes HCG und PRL mit zwei verschiedenen Isotopen von Iod markiert werden.
- 41. Verfahren nach Anspruch 4o, dadurch gekennz ei c h η e t , daß die Isotope I und I sind.
- 42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet , daß die Probe eine Körperflüssigkeit einer Frau ist.
- 43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet , daß die Flüssigkeit Blutserum oder Urin ist.
- 44. Verfahren nach Anspruch 36,dadurch gekennzeichnet , daß der Rezeptor von dem Korpus-Luteum eines Tieres ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Kuh, einem Schaf, einem Schwein und einem Pferd besteht.
- 45. Verfahren nach Anspruch 36,dadurch gekennze ichn e t , daß der Rezeptor durch ein Verfahren erhalten wird, enthaltend die Arbeitsgänge des Hersteilens eines fein verteilten Gewebehomogenats, vom Korpus-Luteum-Gewebe, Abscheiden der Plasma-609825/0849 . ~62'Membranen von dem HOmogenat und Wählen der Plasma-Membranen-Fraktion, die in der Lage ist, biologisch aktives PRL und HCG teilweise zu binden.
- 46. Verfahren nach Anspruch 45,dadurch gekennzeichnet , daß der Rezeptor von einer Frau im ersten Quartal der Schwangerschaft erhalten wird.
- 47. Anordnung für die Bestimmung von Prolaktin (PRL) in einer wässrigen Probe, gekennzeichnet d urcha) eine erste Reagenz und eine zweite Reagenz;b) wobei die erste Reagenz in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion des Plasma-Membranen-Extrakts von dem Korpus-Luteum einer Art enthält, die den Rezeptor für Prolaktinaufweist, das in der Lage ist, biologisch aktives Prolaktin wahlweise zu binden;c) wobei die zweite Reagenznarkiertes Prolaktin enthält, das in der Lage ist, Strahlung abzugeben, die erste Reagenz beabsichtigt Bt, mit der Probe in BErührung gebracht zu werden, die das zu messende Hormon enthält und mit der zweiten Reagenz , um einen Teil des markierten und nichtmarkierten HORmons an den Rezeptor zu binden;d) eine Anordnung zum Messen des Betrages des markierten HORmons, das an den Rezeptor gebunden ist, wobei die davon abgegebene Strahlung eine Funktion der Konzentration des HORmons in der wässrigen Probe ist.εζ
- 48. Anordnung zum Bestimmen einer Anzahl Hormone in einer wässrigen Probe, gekennzeichnet, durcha) eine erste Reagenz und eine Anzahl von zweiten Reagenzchen, gleich der Anzahl zu bestimmender HORmone ;b) wobei die erste Reagenz in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion von Plasma-Membranen-Extrakt aus einem Körperorgan einer Art enthält, die den spezifischen Rezeptor in dem Organ aufweist, zum wahlweisen Binden jedes der HORmone in biologisch aktiver Form;c) wobei die zweiten Reagenzchen jedes der zu bestimmenden HORmoae. in einer markierten Form enthalten, die in der Lage sind, Strahlung abzugeben, die abgegebene Strahlung fürjjedes markierte Hormon verschieden ist, die erste Reagenz beabsichtigt ist, mit der Probe in Berührung gebracht zu werden, die das zu messende HORmon enthält und mit den zweiten Reagenzchen, um einen Teil der markierten und nichtmarkierten Hormone an den REzeptor zu binden;d) eine Anordnung zum Messen des Betrages der markierten HORmone, die an den Rezeptor gebunden sind, wobei die abgegebene Strahlung von jedem markierten HOrmon eine Funktion der Konzentration des jeweiligen HORmons in der wässrigen Probe ist.
- 49. Anordnung nach Anspruch 48,dadurch gekennzeichnet, daß die erste Reagenz einen Plasma-Membranen-60982b/0B4Extrakt von .dem Korpus-Luteum eines Säugetieres enthält, und worin die zweiten Reagenzchen radioisotopisch markiertes, menschliches Choriongonadotropin und Prolaktin enthalten, wodurch die Anordnung in der Lage ist, gleichzeitig HCG und PRL anzuzeigen.60 98 25/0849
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